KR100450817B1 - Ｄｎａ 마이크로어레이 스팟의 품질관리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNA 마이크로어레이 스팟의 품질관리방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 DNA칩 기판에 부착시킬 DNA 스팟팅 용액을 형광물질을 부가하여 제조한 후 스팟팅함으로써 DNA칩을 제조하여 그 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널을 포착하는 것을 포함하는 DNA칩의 품질관리방법에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 마이크어레이의 품질관리방법에 따르면 DNA칩의 DNA 스팟에서 DNA 프로브와 함께 DNA칩 고체기판에 공유결합으로 부착시킨 형광물질로부터의 신호를 감지함으로써 DNA칩의 마이크로에레이의 품질관리를 하므로, 기존의 DNA 스팟을 염색하는 방법에 의한 품질관리방법에 비하여 염색 및 탈색의 조작을 거칠 필요가 없다.

Description

ＤＮＡ 마이크로어레이 스팟의 품질관리방법{Quality control method of DNA microarray spots}

본 발명은 DNA 마이크로어레이 스팟의 품질관리방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 DNA칩 기판에 부착시킬 DNA 스팟팅 용액을 형광물질을 부가하여 제조한 후 스팟팅함으로써 DNA칩을 제조하고， 그 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널을 포착하는 것을 포함하는 DNA칩의 품질관리방법에 관한 것이다.

DNA 마이크로어레이란 실리콘, 표면개질유리，폴리프로필렌, 활성화 폴리아크릴아미드와 같은 고체 표면에 염기서열이　알려진 작게는 수 개, 크게는 수백 개의 염기　크기의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브(probe)를 수백 내지 수십만 개의 정해진 위치에 부착시켜 미세집적(microarray)시킨 것을 통칭한다.　이러한 DNA 마이크로어레이에 의해 DNA칩에 분석하고자 하는 표적 DNA（target DNA)를 결합시키면,　DNA칩에 부착되어 있는 프로브들과 표적 DNA 단편상의 염기서열의 상보적인 정도에 따라 각기 다른 혼성화 결합(hybridization) 상태를 이루게 되는데, 이를 광학적인 방법　또는 방사능 화학적 방법 등을 통해 관찰 해석함으로써 표적 DNA의 염기서열을 분석할 수 있다（sequencing by hybridization; SBH)．

DNA 마이크로어레이를 이용하여 제조한 DNA칩은 DNA 분석 시스템의 소형화를　이루어 극미량의 시료만으로도 유전자 분석이　가능하며 표적 DNA 상의 여러　군데의 염기서열을 동시에 규명할 수 있어 저렴할 뿐만 아니라 신속하게 유전 정보를 제공할 수 있다. 또한，DNA 마이크로어레이를 이용하여 제조한 DNA칩은　방대한양의 유전 정보를 단시간 내에 동시에 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 유전자간의 상호 연관성까지 규정할 수 있게 되어 앞으로는 유전병 및 암의 진단, 돌연변이의 탐색, 병원균의 검출, 유전자 발현 분석 및 신약 개발 등 폭넓은 분야에서 응용될 수 있으리라고 예상된다. 또한, 미생물이나 환경오염의 감지기로 이용하여, 해독물질에 대한 유전자를 찾아내어 유전자 재조합 기술을 적용함으로써, 해독물질을 대량 생산하거나 의약용 농작물, 저지방 함유 육류의 생산에도 응용할 수 있는 등 거의 대부분의 생물관련 산업에 이용되어 혁명적인 발전을 가져다 줄 수 있다.

DNA 마이크로어레이는　사용된　프로브의 종류에 따라　올리고칩(oligo chip)과 cDNA 칩으로 구분하기도 하고, 제작된 방법에 따라 포토리쏘그래피 칩과 핀 방식의 스폿팅 칩(spotting chip), 잉크젯 방식의 스폿팅 칩으로 분류하기도 한다. 마이크로어레이의 제작 방법은 고정화되는 프로브의 종류에 따라서 다양하고 복잡한 화학적인 과정을 거친다. 유리표면의 작은 면적에 극소량의 DNA probe가 고정화 되기 때문에 부착된　프로브간의 정량적 변동(spot to spot variation)과 칩간의 변동(chip to chip variation)에 의해 상당한 오차가　발생되어 혼성화를 통하여 얻어지는 결과가 일관성이 없다는 것은 치명적인 단점으로 지적되어 왔다.

이러한 문제점을　해결하기　위하여 혼성화　결합（hybridization）에 들어가기 전에 DNA chip을 품질관리하는 방법들이 개발되어 이용되고 있다.

스탠포드 대학의 Brown 등은 유리표면에 스팟팅 되는 DNA 프로브와 함께 존재하는 염에 의해 광선이 산란되는 것을 레이저 스캐너에 의하여 포착하여 DNA 프로브 스팟팅의 균일성과 유리 표면의 손상의 유무를 검사하는 방법을 개발하였다.　이 방법은 스팟팅 직후에만 간단하게 DNA 스팟을 검사하는 방법으로 이용될 수 있는 반면에 다음 작업인 고정화와 세척 이후에는 DNA 스팟에 존재하는 염이 제거되므로 DNA 칩 제작이 끝난 후의 DNA 스팟의 질(quality)을 검사할 수 없는 문제점이 있다.

최근에는 DNA 프로브에 결합할 수 있는 형광물질을 이용하여 유리 표면 위의 DNA 스팟을 염색하는 방법이 개발되었다(Battaglia C, Salani G, Consolandi C, Rossi Bernardi L, De Bellis G. Analysis of DNA Microarrays by Non-Destructive Fluorescent Staining Using SYBR Green II, Biotechniques. 2000 Jul; 29:78-81). 이것은 단일가닥 DNA(ssDNA)에 높은 친화도로 결합하는 형광물질인 SYBR Green II를 DNA 칩에 처리하여 유리 표면에 부착된 DNA 프로브를 레이저 스캐너에 의하여 감지하는 방법이다. DNA probe에 결합된 형광물질은 세척에 의하여 완전히 제거되는 것으로 보고되어 있다. 이 방법은 상기한 Brown 등이 개발한 방법에 비하여 DNA칩의 제작이 끝난 후에 DNA 마이크로어레이를 검사할 수 있는 장점은 있으나 검사를 위하여 염색과 탈색의 조작을 하여야 하기 때문에 DNA 마이크로어레이를 여러차례 세척하는 작업이 필요한 단점이 있다. 또한 세척 후에도 유리표면에 남을 수 있는 형광물질이 혼성화에 영향을 끼칠 가능성이 있는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, DNA칩 기판에 부착시킬 DNA 스팟팅 용액을 형광물질을 부가하여 제조한 후 스팟팅함으로써 DNA칩을 제조하여 그 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널을 포착함으로써 품질관리를 하는 경우, 염색 및 탈색의 과정을 거칠 필요가 없이 DNA 스팟의 질(quality)과 크기를 비파괴적인 방법으로 검사할 수 있음을 확인하고 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 염색 및 탈색의 과정을 거칠 필요가 없이 본 발명 DNA 스팟의 질(quality)과 크기를 비파괴적인 방법으로 검사할 수 있는 DNA 마이크로어레이 스팟의 품질관리방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명에서 스팟팅 용액을 제조 시 부가하여 제조함으로써 핵산 프로브의 DNA칩 고체기판에 결합 시 동시에 부착되는 형광물질의 개략적인 구성을 나타낸다.

도 2a는 실시예 1에서 스팟팅 용액을 제조 시 부가하여 제조함으로써 핵산 프로브의 DNA칩 고체기판에 결합 시 동시에 부착되는 형광물질로서 사용한 4'-(아미노메틸)플루오레세인의 구조식이다.

도 2b은 실시예 2에서 스팟팅 용액을 제조 시 부가하여 제조함으로써 핵산 프로브의 DNA칩 고체기판에 결합 시 동시에 부착되는 형광물질로서 사용한 FITC의 구조식이다.

도 3은 실시예 1에서　올리고뉴클레오티드 프로브를 부착시킨 마이크로어레이 스팟이 표적핵산과 혼성화하기 전의 스캐닝 결과(품질관리 과정, QC Test) 및 표적핵산에 의한 혼성화 후의 스캐닝 결과(Use Test)를　나타낸 것이다.

도 4는 실시예 2에서 cDNA를 부착시킨　마이크로어레이 스팟이　표적핵산과 혼성화하기 전의 스캐닝 결과(품질관리 과정, QC Test) 및 표적핵산에 의한 혼성화 후의 스캐닝 결과(Use Test)를　나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 DNA칩 기판에 부착시킬 DNA 스팟팅 용액을 제조 시 형광물질을 부가하여 제조한 후 스팟팅함으로써 DNA칩을 제조하여 그 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널을 포착하는 것을 포함하는 DNA칩의 품질관리방법을 제공한다.

본 발명은 DNA칩　기판에 DNA를 스팟팅 한 이후에 형광물질을 부착시켜 DNA칩의 품질을 관리하는 종래의 방법과는 달리, DNA칩 기판에 부착시킬 DNA 스팟팅 용액의　제조 시 형광물질을 함께 부가하여 제조함으로써 DNA 프로브가 DNA칩 기판에 부착할 때 형광물질을 함께 기판 표면에 공유결합으로 고정화시켜서, DNA칩을 제조한 뒤 스팟에서 발생하는 형광을 스캐닝 하여 DNA 스팟의 균일여부를 비파괴적으로 검사한다.

상기 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널의 균일 정도는 스팟의 직경 또는 형광의 강도（intensity), 스팟의 모양 등으로부터 판정할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 형광물질은 형광신호를 내는 형광그룹(dye group)과고체 기판과 공유결합을 만드는 관능기(functional group)로 구성되어 있다.

본 발명에서 스팟팅 용액의　제조시 부가하여 제조함으로써， 핵산 프로브가 DNA칩 고체기판에 결합하는　것과　동시에 부착되는 형광물질의 개략적인 구성을 도 1에 나타내었다.

형광신호를 내는 형광그룹은 DNA칩 제조 후의 혼성화에 이용되는 표적 DNA의 라벨링에 쓰이는 형광물질군과 형광 파장에서 서로 간섭이 없는 것으로 FITC, 플루오레세인, Cy3, Cy5, 또는 텍사스레드 등의 형광 그룹이 이용된다.

고체 기판과 공유결합을 하는 관능기는 DNA 마이크로어레이의 유형에 따라서 아민, 알데하이드, 폴리-라이신과 같은 고체 기판표면의 관능기와 공유결합을 할 수 있는 것이어야 하며 아민, 아이소사이오사이네이트(isothiocyanate), 활성화 에스테르(activated ester)등의 관능기가 이용된다.

상기와 같은 방법으로 제조된 DNA칩의 DNA 스팟을 품질관리 하는 방법은 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 예컨대 형광그룹이 FITC 또는 플루오레세인인 경우 아르곤 이온 레이저에 의해 488nm 파장에서 여기시키고 520nm 파장의 필터를 이용하여 얻는 방출신호를 분석함으로써 이루어진다.

본 발명의 방법에서는 DNA 칩 제조 시 DNA 프로브와 함께 부착한 형광물질이, 이후에 DNA 칩을 형광표지의 표적물질과 혼성화 한 이후에 생성되는 형광강도에 영향을 미치지는 지 여부가 문제가 된다. 그리하여 하기의 실시예 1, 2 각각의 경우에 DNA 칩 제조 시 DNA 프로브와 함께 부착한 형광물질이 차후 혼성화 한 이후의 형광강도에 영향을 미치는지 여부에 대한 실험을 한 결과 거의 영향을 미치지않는 것으로 나타났다.

본 발명의 방법에 의한 DNA 마이크로어레이의 품질관리방법은 DNA 마이크로어레이뿐만 아니라 RNA 마이크로어레이 및 단백질칩과 같은 다른 유형의 마이크로어레이에도 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

(실시예)

올리고뉴클레오티드 프로브를 부착시킨 DNA칩과 cDNA를 부착시킨 DNA칩 각각을 제조하는 경우에 있어서, 상기에서 설명한 DNA 마이크로어레이의 스팟의 품질관리방법에 따라 수행하여 본 발명의 품질관리방법이 유용한지 여부를 알아보았다.

〔실시예 1〕

올리고뉴클레오티드 프로브를 부착시킨 DNA칩의　스팟　품질관리

A. 겔 매트릭스를 이용한 DNA 올리고뉴클레오티드 칩의 제작

두 가지 올리고뉴클레오티드 프로브(PM（perfect match) : 5'-TGTAGACACGCACCTCCGTG-3', MM（mismatch) : 5'-TGTAGACACCCACCTCCGTG-3')와 형광물질인 4'-(아미노메틸)플루오레세인을, 겔　매트릭스　용액에 첨가하고 교반하여　37℃에서 14시간 동안　방치함으로써　매트릭스-DNA 콘쥬게이트를　제조한　다음,　이를　스폿팅　용액으로　사용하였다(참조 : 대한민국 특허출원 제 2001-53687호). 상기 스폿팅 용액을 아민기를 갖도록 표면 처리된 유리 표면 위에스폿팅한 후 4시간 동안 37℃의 습식 챔버(wet chamber)에 방치하였다. 이어서　배경 노이즈의　제어（background control)에 필요한 공정, 즉 표적핵산이　유리표면에　부착하지　않도록　하기　위해　스폿팅 되지　않는　위치의　유리표면의 아민기가　음전하를　띄도록　반응을　다음과 같이 실행한다. 5g의 석시닉안하이드라이드(succinic anhydride)를 315ml 1-methyl-2-pyrrolidinone(NMP)에 녹인 다음 35ml Sodium borate를 첨가하고 교반된 용액을 15분동안 유리에 처리한 뒤에 증류수로 세척하고 건조기에 보관하였다.

상기 실험에서 사용한 형광물질인 4'-(아미노메틸)플루오레세인의 구조식은 도 2a와 같다.

B. Cy3의 형광에 의한 혼성의 민감도 측정

상기 DNA 마이크로어레이에 혼성화된 형광표지　표적물질에 의해 방사된 형광 시그널을 스켄어레이 스캐너(ScanArray Scanner)를 사용하여 레졸루션 10㎛ 픽셀(pixel)로 검출하였고(GSI Lunonics), 프로브 어레이 세포 강도, 뉴클레오티드 염기-콜(base-call), 서열 측정 및 리포트를 진 픽스 칩 소프트웨어(GenePix software)상에서 사용 가능한 기능에 의해 생성시켰다(엑손).

상기의 방법으로 수행한 겔 매트릭스를 이용한 DNA 마이크로어레이 스팟의 표적핵산과 혼성화하기 전의 DNA칩 제조 후의 스캐닝 결과(품질관리 과정, QC Test) 및 표적핵산에 의한 혼성화 후의 스캐닝 결과(Use Test)를　도 3에　나타내었다．

도　3에서 DNA 스팟의 QC Test의 스캐닝은 아르곤-이온 레이저에 의하여488nm 파장에서 여기시키고 520nm 파장의 필터를 이용하여 방출신호를 얻은 것이고 Use test의 스캐닝은 550nm 파장에서 여기시키고 570nm 파장의 필터를 이용하여 방출신호를 얻은 것이다. Use test에서 사용된 표적　핵산은 HNF-1α유전자　엑손 4구간의 codon263에 해당하는　뉴클레오티드 C(cytosine) 베이스를 중앙에 위치하고 5' 말단에 Cy3가 붙은 20 뉴클레오티드 시퀀스이다(5'-Cy3-CACGGAGGTGCGTGTCTACA-3').

도 3에서　보여진 DNA 스팟은 완전 매치(perfect match)에 해당하는 probe와 미스 매치(mismatch)에 해당하는 probe를 각각　아홉 스팟씩　스폿팅하였고 스폿　크기（spot size)는 170±15㎛ 이고, 스폿간의 간격은 375 ㎛로 조절하였다.

C. 결과

표　1에서　보듯이，Use test에서　4'-(아미노메틸)플루오레세인과 함께 고정화된 스팟의 강도(intensity)는 dye가 없는 spots의 강도와 값의 차이가 크게 나타나지 않았다. 이것은 4'-아미노메틸 플루오레세인의 dye가 표적 핵산에 의한 혼성화에 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다.

겔 매트릭스를 이용한 DNA 마이크로어레이 스팟의 QC 테스트와 use 테스트에서의 스팟 직경 및 강도

4'-(아미노메틸)플루오레세인	QC Test	Use Test
	PM	MM	PM	MM
0μM	538	458	36034	18438
1μM	770	699	35153	17545
2μM	1306	1178	34765	18661

〔실시예 2〕

cDNA칩의　스팟　품질관리

A. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 probe로 사용할 유전자 증폭

글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH)를 생산하는 재조합 유전자를 DNA 핵산추출 키트(QAIGEN)를 이용하여 분리하였다. 분리된 재조합 유전자를 이용하여 다량의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 유전자만을 증폭하기 위해서, 모든 중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 100㎕로 수행하였다.

순수한 재조합 GAPDH DNA 50ng, 열안정성 DNA 폴리머라제;2.5U, 200μM dNTP:(dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 50mM Tris-HCl, 40mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 100pmol의 센스 프라이머(5'-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3')와 100pmol의 안티센스 프라이머(5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3')를 이용하였다. 모든 PCR조건은 94℃ 변성(denaturation)을 30초; 55℃ 어닐링(annealing)을 60초; 72℃에서의 신장(extension)을 90초로 하는 것을 1주기로 하여 35회 반복 시행하였고, 예비변성(Pre-denaturation)과 최종 신장(Last-extension)은 각각 94℃에서 5분, 72℃에서 5분간 수행하였다. 이때 합성된 앰플리콘은 DNA 핵산 추출 키트(QAIGEN)을 이용하여 순수하게 분리하였으며, 글래스 기판 위에 찍을 프로브로 사용하였다.

B. 증폭된 GAPDH 유전자의 스팟팅 : cDNA 마이크로어레이의 제작

두개의 튜브 각각에서 상기 증폭된 유전자의 최종 농도가 0.25mg/ml이 되도록 50% DMSO에 섞어주며, 한 튜브에는 FITC dye를 섞어 최종농도가 8μM이 되도록　하였다. 각각의 튜브를 볼텍싱하여 상기에서 증폭된 유전자와 DMSO, 및 FITC dye가 골고루 잘 섞이도록 하였다. 이후 잘 섞어진 시약을 384 웰 플레이트로 옮겨 담아 스팟팅을 준비하였다. 상기　스팟팅　용액을 아민기를　갖도록　표면 처리된　유리　표면　위에　20x4의 배열로 스팟팅한 후，　4시간 동안 80 ℃에서 열을 가하였다. 배경 노이즈의　제어（background control)에 필요한 공정， 즉　표적　핵산이　유리　표면에 부착하지　않도록　하기　위해　스팟팅되지　않은　위치의　유리　표면　아민기가　음전하를　띄도록　반응을　다음과 같이 실행하였다. 5g의 석시닉안하이드라이드(succinic anhydride)를 315ml 1-메틸-2-피롤리디논(NMP)에 녹인 다음 35ml Sodium borate를 첨가하고 교반된 용액을 15분 동안 유리에 처리한 뒤에 증류수로 세척하고 건조기에 보관하였다.

상기 실험에서 사용한 형광물질인 FITC의 구조식은 도 2b와 같다.

C. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 형광 표지 표적물질의 제조

형광 표지 표적물질을 제조하기 위해 상기에서 DNA 핵산추출키트를 이용하여 분리한 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 생산 재조합 유전자를 이용하였으며, 분리된 재조합 유전자를 이용하여 다량의 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 유전자만을 증폭하기 위해서 모든 중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 50㎕로 수행하였다.

순수한 재조합 GAPDH DNA 50ng, 열안정성 DNA 폴리머라제;2.5U, 200μM dNTP:(dATP, dGTP, dCTP), 65μM dTTP, 130μM Cy3-dUTP, 50mM Tris-HCl, pH8.3의40mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 100pmol의 센스 프라이머(5'-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3')와 100pmol의 안티센스 프라이머(5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3')를 이용하였다. 모든 PCR조건은 상기에서와 동일한 조건에서 실시하였다. 이때 합성된 앰플리콘은 겔 익스트랙션 추출 키트(QAIGEN)을 이용하여 순수하게 분리하였다. 정제된 GAPDH DNA는 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하고, 혼성실험을 효율적으로 수행할 수 있도록 농도를 50ng/㎕로 일정하게 조절하였다．　형광 표지의 표적DNA는　GAPDH 유전자를 상기　PCR 반응동안 Cy3-dUTP를 첨가하여 Cy3-라벨링된 것으로서 600 bp로 구성되어 있다.

D. cDNA 마이크로어레이와　형광표지 표적물질의 혼성화

혼성화 반응을 위해 상기에서 제조한 cDNA칩을 4XSSC, 0.1% SDS, 10mg/ml BSA 용액을 이용하여 50℃에서 45분간 미리 혼성화 시키며, 이소프라판올과 순수한 물을 이용하여 세척하였다. 이후 상기 DNA 칩을 원심 분리기에 넣고 500rpm에서 3분간 원심분리하여 물기를 제거하였다.

이후 상기에서 제조한 형광표지　표적 DNA 1㎍을 이용하여 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 3분간 얼음에 방치한 다음 3XSSC, 0.1% SDS, 0.5mg/ml 이스트 tRNA, 30㎍/ml 헤링스펌(herring sperm) DNA와 혼합하여 상기 칩에 떨어뜨렸다. 　이후 커버 글래스를 덮어 용액이 잘 퍼지도록 한 후 50℃에서 하룻밤 혼성화 시켰다.　슬라이드는　 ０．１XSSC（１．５mM sodium citrate, 15mM NaCl, pH 7.0), 0.1% SDS용액으로　５분간　１회，０．１XSSC으로　５분간　２５℃에서　２회　세척하였다．위　과정이　종료되면，　상기와　동일하게 원심분리기를　이용하여　물기를제거하였다.

E. Cy3의 형광에 의한 혼성의 민감도 측정

상기 실시예　１에서와　동일한　방법으로　혼성의 민감도를　측정하였다．

상기의 방법으로 수행한 cDNA 마이크로어레이 스팟의 표적핵산과 혼성화하기 전의 DNA칩 제조 후의 스캐닝 결과(품질관리 과정, QC Test) 및 표적핵산에 의한 혼성화 후의 스캐닝 결과(Use Test)를　도 4에　나타내었다．

도　4에서 QC Test의 스캐닝은 아르곤-이온 레이저에 의하여 488nm 파장에서 여기시키고 520nm 파장의 필터를 이용하여 방출신호를 얻은 것이고 Use test의 스캐닝은 550nm 파장에서 여기시키고 570nm 파장의 필터를 이용하여 방출신호를 얻은 것이다.

도 4에서 보여진 DNA 스팟은 80 스팟씩　스팟팅한 것이며 스팟의　크기（spot size)는 170±15 μM 으로 하였고, 스팟 간의 간격은 375 μM로 조절하였다.

F. 실험결과

상기 도 4의 실험결과를 정리하여 하기의 표 2에 형광물질을 사용하지 않은 경우, 형광물질로서 FITC를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우에 대하여 형광강도를 나타내었다.

표　2에서　보듯이，Use test에서　FITC와 함께 고정화된 스팟의 강도는 dye가 없는 스팟의 강도와 크게 값의 차이가 나타나지 않았다. 이것은 FITC dye가 표적 핵산에 의한 혼성화에 영향을 주지 않는 것을 보여준다.

GAPDH의 PCR 산물을 이용한 cDNA 마이크로어레이 스팟의 QC test와 use test의 형광강도 결과

	QC Test	Use Test
	스팟직경	강도	스팟직경	강도
DNA 프로브	-	-	148	9359
DNA 프로브+ FITC	165	18905	150	9852

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 DNA 마이크어레이의 품질관리방법에 따르면 DNA칩의 DNA 스팟에서 DNA 프로브와 함께 DNA칩 고체기판에 공유결합으로 부착시킨 형광물질로부터의 신호를 감지함으로써 DNA칩의 마이크로에레이의 품질관리를 하므로, 기존의 염색하는 방법에 의한 품질관리방법에 비하여 염색 및 탈색의 조작을 거칠 필요가 없다.

또한 상기의 실험결과로도 알 수 있듯이 DNA 프로브와 함께 DNA칩 고체기판에 공유결합시킨 형광물질이 이후 DNA칩의 형광표시 표적물질과의 혼성화 후에 측정하는 형광광도에 영향을 거의 미치지 않음으로써 형광물질이 혼성화에 영향을 끼칠 위험이 있는 기존 방법의 문제점을 해결하였다.

그러므로 상기의 방법으로 제작된 DNA 마이크로어레이는 어떠한 염색의 단계 없이 정확하게 품질관리를 할 수 있으며, 그렇게 제조된 DNA칩은 이후의 혼성화 등의 사용에 있어 안정적인 결과를 낳을 수 있다.

또한 기존의 품질관리방법과는 달리 형광물질이 DNA 프로브와 함께 유리표면의 반응기와 공유결합을 하므로 DNA 프로브의 시퀀스와 길이에 관계없이 동일한 크기의 형광신호가 나오므로 정확한 DNA 스팟의 상대적인 비교분석이 가능하다.

Claims (5)

1. DNA칩 기판에 부착시킬 DNA 스팟팅 용액에，혼성화후　검출(detection)에 사용되는 형광물질의　여기/방출　파장과는 상호 간섭(spectral interference)이 없는 특정 파장에서 여기／방출（excitation/emission）되는 형광물질을 부가한　다음，기판에　스팟팅함으로써 DNA칩을 제조하여，그 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널을 포착하는 것을 포함하는 DNA칩의 품질관리방법.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널의 균일 정도로부터 DNA칩의 품질을 판정하는 것을 특징으로 하는 DNA칩의 품질관리방법.
4. 제 ３ 항에 있어서, 상기 스팟으로부터 발생되는 형광 시그널의 균일 정도는 스팟의 직경, 모양 또는 형광의 강도로부터 판정하는 것을 특징으로 하는 DNA칩의 품질관리방법.
5. 제 1 항, 제 3 항, 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,　상기　형광물질은　FITC, 플루오레세인, Cy3, Cy5，텍사스레드　또는 탐라(Tamra)인　것을 특징으로 하는 품질관리방법.