CN104561290A - 一种基于混合探针基因芯片检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种基于混合探针基因芯片检测方法，利用两种不同荧光标记对制备的基因芯片有效性进行控制，将目的探针中掺入较短第一荧光基团标记的质量控制探针制备成点样溶液，将点样溶液机械点样于修饰了手臂分子的基片上形成探针斑点，然后将第二荧光基团标记的待测序列与目的探针杂交，检测斑点发出的荧光信号，其中第一荧光基团标记检测目的探针是否固定在芯片基片上，第二荧光基团标记检测待测目的的序列信息。同时使用两种荧光能快速、简便地检测目的探针是否固定在基片上，从而排除因目的探针未固定而出现假阴性的实验结果。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片质量控制方法，具体涉及一种基于混合探针基因芯片检测方法。
背景技术
基因芯片技术作为近年来快速发展的一项生物高新技术，为解决怎样研究基因在生命过程中所担负的功能提供了光辉的前景。基因芯片技术是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品序列信息。
与传统核酸印迹杂交方法相比，基因芯片同时将大量根据靶基因的特征及检测要求预先设计好的探针固定在支持物表面，一次杂交可检测和分析样品中多种靶基因的相关信息，解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，使基因芯片技术具有了高通量、多参数同步分析，快速全自动分析，高精确度分析，高灵敏度分析的特点。但用荧光标记的PCR产物与匹配探针杂交对未知DNA序列片段进行检测的方法本身也存在缺陷：
1）基因芯片荧光检测主要依赖于检测结果的荧光强度，没有荧光强度或者荧光强度弱的即判断为阴性，但在阴性的结果中无法确定是否是探针固定上；2）多种基因芯片技术平台得到的研究结果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成为目前基因技术研究的热点，尤其是应用型基因芯片尚无一些准确、高效地有效性检测方法，其应用的推广尚有困难。因此发展一种准确、高效地有效性检测方案来检测探针是否固定成为一种迫切的需要。
基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探针、支持物制备的有效性控制、探针在支持物上的固定效率即基因芯片制备的有效性控制，以及基因芯片检测时的有效性控制、检测结果的标准化等一系列问题。本专利主要针对的是制备有效性的基因芯片。
制备有效性基因芯片的传统方法有以下几种：1）利用荧光DNA染料对单链DNA探针染色，根据荧光DNA染料强度来估计芯片的有效性；2）利用目的探针3点样液和带荧光1质量控制探针4点样液分别点样于修饰了手臂分子6的基质7上，形成各自的斑点，然后使目的探针3在目斑点处与带有同种或异种荧光2的待测DNA序列5杂交，根据质量探针点样位置是否发荧光，估计芯片的有效性，根据目的探针点位置是否发荧光，判定待测DNA序列信息，如图１所示。但是以上的这些方法都无法直接、有效地评价芯片制备的质量。
这些传统基因芯片质量控制的方法可减少了基因检测中假阳性结果出现的可能性，在一定程度上提高了检测结果的准确性，但通常传统基因芯片的缺陷是其自身质量无法得到较好的控制，本发明提出了一种基因芯片有效性控制方法，能够对基因芯片的有效性进行控制，大大提高其检测的可靠性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于混合探针基因芯片检测方法，能较直接地检测探针是否固定在基片上，以排除因探针缺失而造成的阴性结果出现的可能性，提高了基因芯片检测的准确性和可靠性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明基于混合探针基因芯片检测方法，包括以下几个步骤：
步骤一：样品制备
制备含有目的探针的溶液，和第一荧光基团标记的质量控制探针的溶液；并将上述目的探针的溶液和第一荧光基团标记的质量控制探针的溶液充分混合，制备成点样溶液。
步骤二：基因芯片制备
将上述混合后的溶液点样于修饰了手臂分子的基片上形成N个探针斑点，N为自然数，经过固定并清除未固定的探针，完成基因芯片的制备。
步骤三：通过检测质量控制探针的信号检测目的探针通过手臂分子固定在基片上
检测上述所有探针斑点发出的荧光信号，若在第一荧光基团的激发波长下检测到荧光，则表示质量控制探针通过手臂分子固定在基片上，同时说明目的探针通过手臂分子固定在基片上，从而判定基因芯片质量合格。
否则，若任一个探针斑点中在第一荧光基团的激发波长下未检测到荧光，表示质量控制探针未通过手臂分子固定在基片上，判定为基因芯片质量不合格。
本发明基于混合探针基因芯片检测方法，还包括以下步骤：
步骤四：杂交
将第二荧光基团标记的待测序列与质量合格的基因芯片上所述的探针斑点中的目的探针进行杂交，杂交后，目的探针中的探针和待测序列结合形成杂交产物。
步骤五：确定待测序列的序列信息
对所述杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针与待测序列互补，并确定待测序列的序列信息。
若在第二荧光基团的激发波长下未检测到荧光，则表示不能确定目的探针与待测序列互补，也不能确定待测序列的序列信息。
所述的目的探针和质量控制探针为脱氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
所述的基片为玻璃片、硅胶晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、微型磁珠或者管盖。
所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团可为Cy3、Cy5、Fitc、FAM或者Rhodamine，但是所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团使用时不相同，并且在检测时两种荧光基团的荧光发射峰要大于40nm的差异，防止两者在检测时由于吸收峰重叠而无法正确得出结果。
所述的第一荧光基团和第二荧光基团为生物素-亲和素与标记物质结合的标记复合物。
所述的标记物质为荧光蛋白、铁蛋白、胶体金、荧光素或化学发光物质。
本专利所提的目的探针是一段已知的核酸或核酸类似物序列片断，并在核酸或核酸类似物链上修饰了活性基团，可通过化学反应固定在被修饰手臂分子的基底上；质量控制探针是一段已知的、较短的核酸或核酸类似物序列片断，一端修饰了活性基团，可通过化学反应固定在被修饰手臂分子的基底上，另一端标记了发光基团或标记复合物；待测序列是一段未知的核酸或核酸类似物序列片断，末端标记了发光基团或标记复合物；手臂分子是多个碳原子组成两端均含有活性基团的小分子有机化合物，一端活性基团可与基底发生化学反应，另一端活性基团可与修饰了活性基团的核酸或核酸类似物链发生化学反应。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1）传统的检测，只是把一定浓度的质量控制探针固定在目的探针的周围，质量控制探针与目的探针分开点样于基片上，没有考虑到目的探针与待测DNA序列的杂交通常位于固相表面，有一定程度的空间阻碍，若目的探针浓度过高，导致目的探针固定不上去，而本发明是将质量控制探针和目的探针充分混合后再固定，为目的探针与待测DNA序列的提供足够的杂交空间位置，这样大大方便了待检测的DNA序列与目的探针杂交。
2）本发明目的探针与较短荧光基团标记的质量控制探针混合，因目的探针、质量控制探针有着相同的活性基团，又与手臂分子有着共同的化学结合方式，固定在基片上，所以通过检测第一荧光基团，确定质量控制探针的固定于基片上，可间接确定目的探针固定在基片上，保证了芯片制作的质量，这种方式也达到实时监测整个芯片的有效性。
3）本发明通过检测第一荧光基团，确定基因芯片的质量，提供了可靠的阴性判定方法，这种阴性结果，不会因为探针固定效率而改变，因为探针固定效率低时，第一荧光基团的信号会非常低甚至没有信号，同时也能排除基因芯片杂交实验结果分析中假阳性错判，而对于存在检测杂交信号弱而检测杂交信号强，也可以得到真阴性结果，从而解决了因基因芯片质量问题对实验结果干扰问题。
4）本专利发明了一种基于混合探针基因芯片检测方法，应用于基因芯片制备中能够大大提高基因检测结果的准确性及可靠性。同时，不仅可以为基因芯片的制造者提供质量控制的方法提高生产质量，又可以为基因芯片的使用者在使用之前对芯片做出评价，简单有效地查出实验中可能出现的问题，从而减少了实验中的分析过程，提高了实验效率。
附图说明
图1是现有技术中检测基因芯片有效性的方法的结构示意图；
图2是本发明基于混合探针基因芯片检测方法的整体结构示意图；
图 3 是本发明基于混合探针基因芯片检测方法的局部放大结构示意图。
图中：1、第一荧光基团，2、第二荧光基团，3、目的探针，4、质量控制探针，5、待测DNA序列，6、手臂分子，7、基片。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
本发明基于混合探针基因芯片检测方法，包括以下几个步骤：
1、样品制备
如图2、3所示，制备含有目的探针3的溶液，和第一荧光基团1标记的质量控制探针4的液；并将上述目的探针3的溶液和第一荧光基团标记1标记的质量控制探针4的点样溶液充分混合，制备成点样溶液。
2、基因芯片制备
将上述混合后的溶液点样于修饰了手臂分子6的基片7上形成N个探针斑点，N为自然数，经过固定并清除未固定的探针，完成基因芯片的制备。
3、通过检测质量控制探针4的信号检测目的探针3通过手臂分子6固定在基片7上
检测上述所有探针斑点发出的荧光信号，若在第一荧光基团1的激发波长下检测到荧光，则表示质量控制探针4通过手臂分子6固定在基片7上，同时说明目的探针3通过手臂分子6固定在基片7上，从而判定基因芯片质量合格。
否则，若任一个探针斑点中在第一荧光基团1的激发波长下未检测到荧光，表示质量控制探针4未通过手臂分子6固定在基片7上，判定为基因芯片质量不合格。
4、杂交：
将第二荧光基团2标记的待测序列5与质量合格的基因芯片上点样的探针斑点中的目的探针3进行杂交，杂交后，目的探针3中的探针和待测序列5结合形成杂交产物。
5、确定待测序列5的序列信息：
对所述杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团2的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针3与待测序列5互补，并确定待测序列5的序列信息。
若在第二荧光基团2的激发波长下未检测到荧光，则不能确定目的探针3与待测序列5互补，无法确定待测序列5的序列信息。
通过在目的探针3中混入较高浓度的较短荧光基团1标记的质量控制探针4，优势是可以为原有目的探针3与待测序列的提供空间位置，方便待测序列5与目的探针3结合，并由多个待测序列5分别与相对应的目的探针3结合在同一修饰基片中构成一种可以用于控制质量的基因芯片。
通过在荧光基团1的激发波长下检查探针是否固定于基片上，再在荧光基团2的激发波长下检测待测片段序列5；若在荧光基团1的激发波长下没有检测到荧光则表示探针未固定，若这时能检测到荧光而在荧光基团2的激发波长下没有检测到荧光则表明结果为阴性，若两次都检测到荧光则结果为阳性，说明芯片质量合格，待测序列5与目的探针3互补，进一步判断待测序列的序列信息。
实施例1：转基因大豆检测基因芯片
1、样品制备
将转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'的溶液，和采用Cy5作为第一荧光基团1标记质量控制探针5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-3'的溶液，将上述两个点样溶液充分混合，制备成点样溶液。
2、基因芯片制备
将上述混合后的点样溶液点样于醛基片上，醛基片是经硅烷、戊二醛处理的玻璃片制备成末端修饰了醛基的基片，在醛基片上形成N个探针斑点，N为自然数，经过固定并清除未固定的探针，完成基因芯片的制备。
3、通过检测质量控制探针5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-3'的信号检测转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'通过醛基固定在玻璃片上
检测上述所有探针斑点发出的荧光信号，若在Cy5的激发波长633 nm下检测到荧光，则表示质量控制探针5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-3'通过醛基固定在玻璃片上，同时说明转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'能够通过醛基固定在玻璃片上，从而判定基因芯片质量合格。
否则，若任一个探针斑点中在Cy5的激发波长633 nm下未检测到荧光，表示质量控制探针5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-3'未通过醛基固定在玻璃片上，芯片质量不合格。
4、杂交：
将上游引物5'-CTG CTC CAC TCT TCC TTT-3'、下游引物5'-AGA CTC TGT ACC CTG ACC T-3'，及转基因大豆基因组、Tak酶作用下，经PCR扩增得到Cy3标记的待测序列5，将上述Cy3标记的待测序列与质量合格的基因芯片上点样的探针斑点转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'进行杂交，杂交后，转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'和待测序列结合形成杂交产物。
5、确定待测序列5的序列信息
对杂交产物进行荧光信号检测，若在Cy3的激发波长533 nm下检测到荧光，则确定转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'与待测序列5互补，并确定了待测序列5含有序列5'-CAG ATT GTC CTT ACC CGC GTT CAG-3'。
若在Cy3的激发波长533 nm下未检测到荧光，则表示转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'未通过醛基固定在玻璃片上，不能确定转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'与待测序列５互补，从而无法确定待测序列５的排布信息。
Claims (8)
1.一种基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下几个步骤：
步骤一：样品制备
制备含有目的探针（3）的溶液，和第一荧光基团（1）标记的质量控制探针（4）的溶液；并将上述目的探针（3）的溶液和第一荧光基团标记（1）标记的质量控制探针（4）的点样溶液充分混合，制备成点样溶液；
步骤二：基因芯片制备
将上述混合后的溶液点样于修饰了手臂分子（6）的基片（7）上形成N个探针斑点，N为自然数，经过固定并清除未固定的探针，完成基因芯片的制备；
步骤三：通过检测质量控制探针（4）的信号检测目的探针（3）通过手臂分子（6）固定在基片（7）上；
检测上述所有探针斑点发出的荧光信号，若在第一荧光基团（1）的激发波长下检测到荧光，则表示质量控制探针（4）通过手臂分子（6）固定在基片（7）上，同时说明目的探针（3）通过手臂分子（6）固定在基片（7）上；
否则，若任一个探针斑点中在第一荧光基团（1）的激发波长下未检测到荧光，表示质量控制探针（4）未通过手臂分子（6）固定在基片（7）上。
2.根据权利要求1所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤四：杂交
将第二荧光基团（2）标记的待测序列（5）与质量合格基因芯片上所述的探针斑点中的目的探针（3）进行杂交，杂交后，目的探针（3）中的探针和待测序列（5）结合形成杂交产物；
步骤五：确定待测序列（5）的序列信息
对所述杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团（2）的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针（3）与待测序列（5）互补，并确定待测序列（5）的序列信息；
若在第二荧光基团（2）的激发波长下未检测到荧光，则表示不能确定目的探针（3）与待测序列（5）互补，无法确定待测序列（5）的序列信息。
3.根据权利要求2所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的目的探针（3）和质量控制探针（4）为脱氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
4.根据权利要求2所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的基片（7）为玻璃片、硅胶晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、微型磁珠或者管盖。
5.根据权利要求2所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的第一荧光基团（1）和所述的第二荧光基团（2）不相同，且上述两种荧光基团的荧光发射峰大于40nm。
6.根据权利要求5所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的第一荧光基团（1）和所述的第二荧光基团（2）为Cy3、Cy5、Fitc、FAM或者Rhodamine。
7.根据权利要求5所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的第一荧光基团（1）和第二荧光基团（2）为生物素-亲和素与标记物质结合的标记复合物。
8.根据权利要求7所述的基于混合探针基因芯片检测方法，其特征在于所述的标记物质为荧光蛋白、铁蛋白、胶体金、荧光素或化学发光物质。
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