KR100447624B1

KR100447624B1 - 홍화로부터 분리한 대식세포 활성화 다당류 및 그제조방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR100447624B1
Application number: KR10-2001-0059879A
Authority: KR
Inventors: 홍범식; 양한철; 조홍연; 신동훈; 전우진
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2004-09-07
Anticipated expiration: 2021-09-27
Also published as: KR20030028009A

Abstract

본 발명은 홍화로부터 분리한 대식세포 활성을 가지는 다당류, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 홍화의 냉수추출물을 에탄올 침전시킨 후 한외여과하여 분자량 30만 Da 이상의 고분자 물질을 수득하고, 상기 물질을 음이온 교환수지 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 하여 제조한 고분자 다당류는 대식세포 활성화능이 높아 면역증강제로서 뛰어난 효과가 있는 한편, 홍화의 한외여과한 수추출물은 항암활성을 가지고 있어, 암환자나 면역저하 환자용의 기능성 식품 및 약학적 조성물로 사용할 수 있다.

Description

홍화로부터 분리한 대식세포 활성화 다당류 및 그 제조방법 및 그 용도{Polysaccaride from the safflower having macrophage activity, the process for preparation thereof and a use thereof }

본 발명은 홍화(Carthamus tinctoriusL.)로부터 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍화의 냉수추출액으로부터 고분자 다당류를 정제하고 이를 유효성분으로 함유하는대식세포 활성제용 조성물 및 홍화의 수추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 조성물에 관한 것이다.

면역계에서 대식세포는 선천성 면역과 적응성 면역의 두 면역계 모두에 관여하는 면역세포로써(Playfair, J.H.L. 1992. Immunology at a glance. 5th ed. Blackwell Scientific Publications. London) 체내로 유입된 외부물질의 소화와 연속적인 분해 및 가공에 의한 임파구에로의 항원제공, 전체 면역계를 조절해 줄 수 있는 사이토카인(cytokine)과 같은 특정물질의 분비 및 생체에 침입한 항원을 죽일 수 있는 능력을 지닌 산화질소(NO) 등의 생성과 같은 기전을 통해서 면역계를 활성화시키는 세포성 면역계의 중요한 면역세포이다.

한편, 대식세포는 여러 자극물질에 노출되거나 외부자극 등에 의해 활성화되면 활성도에 따라 염증 대식세포와 활성화된 대식세포로 나눌 수 있다. 염증 대식세포는 티오글리콜레이트와 같은 염증유발 물질에 노출되었을 경우를 말하며 이때는 식세포작용, 표면부착능, 프로스타글란딘 분비증가, 플라스미노겐 활성화 효소, 엘라스타아제, 콜라게나아제 등 여러 효소의 단백질 합성능 증가의 기능적 변화를 나타내고, 세포의 크기와 여러 가지 세포분비물이 증가하게 된다(Hibbs, J.B., Taintor, R.R., Vavrin, I. and Rachlin, E.M. 1988. Nitric oxide : A cytotoxic activated macrophage effector molecule. Biochem. Biophys. Res. commun.,157, 87).

인터페론-감마(IFN-γ), 암세포자살인자-알파(Tumor Necrosis Factor-α) 등의 사이토카인류와 그람음성균의 지다당류 등에 의해 활성화된 대식세포는 항암작용, 항미생물작용 등을 가지게 되는데 특히 암세포에 대한 세포 독성작용의 기전에 있어서 활성화된 대식세포에 의해 분비된 사이토카인(암세포자살인자-알파, 인터류킨-1, 인터류킨-6, 인터류킨-8, 인터류킨-12)들과 과산화수소, 산화질, 세포질 용해 프로테아제 등이 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 물질로서 제시되어져 왔다(Thomas, P.M. and Edginton, S. 1984. Human monocyte-mediated tumor cytotoxicity. J. Immunol.,132, 1980).

이와 같이 렉틴류나 고분자의 단백 다당체 및 다당류에 의해 활성화된 대식세포는 체내에서 1차적으로 종양발생을 억제하며 암세포의 전이를 억제하고 종양세포와 정상세포를 구별하는 뛰어난 능력도 가지고 있다. 대식세포가 인지하는 표적구조는 아직 불분명하나 종양세포 파괴과정은 세균에 대한 식균작용과는 달리 종양세포와 접촉하여 리소좀 효소 등을 방출함으로써 표적 종양세포를 용해시키는 순서로 이루어진다. 그러나 활성화되지 않은 대식세포는 세포독성이 미약하여 활성화 과정을 거쳐야지만 비로소 종양세포에 대하여 증가된 사멸능력을 지니게 된다. 이러한 사실은 대식세포의 활성화를 가져오는 면역요법이 효과적인 치료법이 될 수 있다는 것을 의미한다.

천연물로부터의 대식세포 활성화 물질들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 이들은 주로 저분자보다는 고분자 획분에서 그 활성을 나타내는 것으로 밝혀지고 있다. 고분자 대식세포 활성화 물질 중에는 항암효과를 나타내는 다당류들이 많이 보고되고 있는데 다당류에 의한 대식세포 활성화와 항종양 활성의 상관 관계는 숙주 매개 면역 반응이 관여하여 종양 발생에 의해 손상된 면역 기능을 회복 또는 증강시킴으로써 나타나는 현상으로 이해되고 있다(Chihara, G., Hamuro, J., Maeda, Y., Arai, Y., and Fukuok, F. 1970. Nature, 225, 7 ; Hamuro, J., Jadding, H. and Bitter-suermann, D. 1978. Immunol., 34, 695). 예로 표고버섯(Lentinus deodes)으로부터 분리한 렌티난(lentinan)과 구름버섯(Coliolus versicolor)의 크레스틴(krestin)의 경우 현재 일본에서 항암제로 시판되고 있으며 화학 요법제가 암세포에 대한 특이성이 낮아 숙주에 대해서 부작용을 나타내는 반면 이들 다당류들은 종양치료에 있어서 부작용이 나타나지 않는 것으로 보고되고 있다.

최근에 그람양성균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸과 그 유도체들이 다양한 면역 조절 작용을 유도하고 상호보완의 역할을 할 수 있을 뿐만 아니라 대식세포를 활성화한다고 보고되고 있으며(Heumann, C., Barras, C., Severin, A., Glauser, M.P. and Tomasz, A. 1994. Gram-positive cell walls stimulate synthesis of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 by human monocytes. Infect. Immunol., 62, 2715) 스트렙토코커스 뮤턴스의 다당 중에서 단핵구를 활성화하여 암세포자살인자-알파, 인터류킨-1의 분비를 유도하는 주된 성분은 람노오스이며 이것의 리셉터도 밝혀졌다(Benabdelmoumene, S., Dumont, S., Petit, C., Poindron, P., Wachsmann, D. and Klein, J.P. 1991. Activation of human monocytes byStreptococcus mutansserotype polysaccharide, Immunoglobulin G Fc receptor expression and tumor necrosis factor and interleukin-1 production. Infect. Immunol., 59, 3261). 또한 만노오스를 함유한 다당류, 베타-1,4-결합-디만뉴로닉에시드(β-1,4-linked D-mannuronic acid), 베타-1,3 글루칸(β-1,3 glucan), 디카르복시-글루코만난(dicarboxy-glucomannan)과 같은 다당류 종류가 항암작용 및 단구와 대식세포의 사이토카인 분비를 촉진한다고 보고되고 있다(Otterlei, M., Sundan, A., Skjak-Brak, G., Ryan, L. and Smidsrod, O. 1993. Similar mechanisms of action of defined polysaccharides and lipopolysaccharides: Characterization of binding and tumor necrosis factor alpha induction. Infect. Immunol., 61, 1917). 렌티난과 같은 담자균류의 항암 효과, 항체 활성과 대식세포 활성 등이 보고되어 있으며 또한 도꼬마리 추출물의 면역 억제 작용, 당귀 추출물의 면역계 증강에 의한 비림포사이트(B lymphocyte) 증식 효과 등의 면역 증강 주성분이 단백 결합 다당이거나 다당류로 알려져 있다.

상기와 같이, 대식세포 활성화능을 갖는 다당류는 항암 및 면역증강제로 기능성 식품 및 보조요법제의 소재로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 식품소재로 사용되는 전통차 및 죽류용 식물소재의 기능성 식품으로의 이용가능성을 연구하던 중 홍화의 냉수추출물에서 높은 대식세포 활성화능이 있음을 확인하고 냉수 추출물로부터 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 정제하는 한편, 홍화의 조다당류가 고형암을 억제하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 홍화 냉수추출물로부터 대식세포 활성화 다당류의 추출·정제하는 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 홍화 냉수추출물로부터 정제된 다당류 및 이의 대식세포 활성화제 및 항암제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 홍화의 냉수추출물을 에탄올 침전시킨 후 한외여과하여 분자량 30만 Da 이상의 고분자 물질을 수득하고, 상기 물질을 음이온 교환수지 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 하여 고분자 다당류 정제하고, 상기 정제된 고분자 다당류의 면역증강제로서의 용도를 규명하는 한편, 한외여과한 홍화의 수추출물의 항암활성을 측정함으로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 실시예1의 홍화 수추출물을 에탄올 침전한 다음 한외여과하여 얻은 30만 Da의 고분자 물질(CT-3)을 음이온 교환수지 크로마토그래피한 결과이다.

도 2는 음이온 교환수지 크로마토그래피하여 얻은 분획중 대식세포활성능이 가장 높은 CT-3IIa-1 분획을 겔 여과 크로마토그래피한 결과이다.

도 3은 홍화 수추출물을 에탄올 침전한 다음 한외여과하여 얻은 30만 Da의 고분자 물질(CT-3)의 Sarcoma-180 고형암 모델에서의 저지율을 측정한 결과이다.

본 발명은 홍화의 냉수추출물에 포함된 활성 다당류를 분리하고자 각기 다른 분자량을 갖는 한외 여과막을 이용하여 분리를 실시한 결과 30만 이상의 분자량을 갖는 분획에서 높은 대식세포활성을 나타냄으로써 활성본체가 고분자 다당류임을 확인하였다.

상기의 고분자 다당류를 정제하기 위해서 30만 이상의 분자량을 갖는 획분을 증류수에 용해한 후 음이온 교환수지 크로마토그래피에 주입하였다. 0.1 몰농도 염화나트륨 용액에서 대식세포 활성화능을 갖는 다당류가 용출되었음을 확인하고, 상기 분획을 분자량 100만 이하 물질의 분리능을 갖는 수지를 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 0.2 몰농도 염화나트륨 용액에서 분리된 활성물질을 획득하였다. 이를 분자량 100만 이하 물질의 분리능을 갖는 수지를 이용하여 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 겔 여과 크로마토그래피에서 분리된 다당류는 분자량이 38만 정도인 고분자 다당류로 확인되었다.

한편, 홍화의 냉수추출물을 에탄올 침전시킨 후 한외여과하여 분자량 30만 Da 이상의 고분자 물질이 Sarcoma-180 고형암 모델의 실험동물에서 고형암을 저지하는 효과가 있음이 확인되었다.

상기와 같이 홍화에서 분리한 다당류는 대식세포 활성화능을 가지고 있으며, 홍화의 한외여과한 수추출물은 고형암을 억제하는 효과가 있으므로 면역증강제 및 항암제로서 기능성 식품 및 보조요법제의 소재로 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 홍화의 수추출물로부터 분리정제된 다당류는 통상적인 방법에 의하여 정제, 캅셀제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 단위 투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화하여 대식세포활성화용 조성물 또는 항암제용 조성물로 사용할 수 있다.

또한 상기 다당류를 유효성분으로 함유하는 조성물은 목적하는 바에 따라 1회 투여량 체중 1kg 당 10 mg 내지 30 mg으로 일일 수회 나누어 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 홍화 냉수추출물 및 이로부터 대식세포 활성화능을 가지는 다당류의 정제

제1단계: 홍화의 냉수추출물의 제조

홍화 1kg을 세절하고 20L의 증류수를 가하여 분쇄, 교반한 후 원심분리(5000 xg, 30분)하고 상등액을 농축, 동결건조하였다. 동결건조된 시료를 증류수로 용해하여 100℃에서 2시간 동안 환류추출한 후, 원심분리(5000 xg, 30분)하여 다시 농축, 동결건조하였다. 동결건조된 시료를 메탄올로 다시 5회 환류추출하여 메탄올 가용 획분을 제거하고 잔사는 증류수에 재용해시킨 후 75% 에탄올을 가하여 침전분획을 실시하였다. 원심분리(5000 xg, 30분)를 통하여 에탄올 가용 획분을 제거하고 침전물을 회수하여 증류수에 재용해시킨 후 투석, 농축 및 동결건조를 통하여 냉수추출의 고분자 조획분을 조제하였다.

제2단계: 음이온 교환수지(DEAE-Toyopearl 650M) 컬럼에 의한 다당류의 정제

홍화 냉수추출물로부터 대식세포 활성화 다당류를 정제하기 위하여 75% 에탄올침전을 통하여 얻어진 침전물질을 증류수에 용해하고 한외여과막(cut-off size; 30 만 Da, Viskase Sales 사)을 이용하여 분자량 30만 이상의 고분자 물질(이하 'CT-3'로 약칭한다.)을 얻었다. 이를 증류수에 용해한 후 증류수로 평형화된 음이온 교환수지(DEAE-Toyopearl 650M, Cl^-form) 컬럼(4.0 × 33 cm)에 습윤겔 1 ㎖당 1 ㎎의 시료를 주입하고 분당 3.0 ㎖ 유속의 증류수, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5,1.0, 2.0 몰농도 염화나트륨 용액으로 각각 분획당 8 ㎖씩 용출하였다(도 1).

제3단계: 겔여과 크로마토그래피에 의한 다당류의 정제

상기 제 2단계에서 용출된 분획중 0.1 몰농도 염화나트륨 용액에서 용출된 물질이 대식세포활성능이 가장 높게 나타나 이를 투석, 감압농축, 동결건조한 후 0.2 몰농도 염화나트륨 용액로 평형화된 겔 여과 크로마토그래피(Sepharose CL-6B) 컬럼(2.5 × 85 cm)에 습윤겔 1 ㎖당 0.1 ㎎의 시료를 주입하여 분당 0.2 ㎖ 유속의 0.2 몰농도 염화나트륨 용액으로 각 분획당 3 ㎖씩 용출하였다. 용출된 피크 중에서 두 번째 피크를 분리하였다(도 2).

실시예 2: 음이온 교환수지 크로마토그래피하여 분리한 다당류의 대식세포 활성화능 측정

제2단계의 음이온 교환수지 크로마토그래피를 통해서 분리된 분획들 중 증류수에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅰ'로, 0.1M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱa', 0.2M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱb', 0.3M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱc', 0.4M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱd', 0.5M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱe', 1M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱf' 및 2M NaCl에서 용출된 분획을 'CT-3Ⅱg'로 각각 명명하고, 대식세포 활성화능을 측정하였다.

상기 CT-3Ⅰ, CT-3Ⅱa, CT-3Ⅱb, CT-3Ⅱc, CT-3Ⅱd, CT-3Ⅱe, CT-3Ⅱf, CT-3Ⅱg의 대식세포 활성화능을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 Suzuki 등의 방법(Suzuki, I., Tanaka, H., Kinoshita, A., Oikawa, S., Osawa, M. and Yadomae, T. 1990. Effect of orally administered β-glucan on macrophage function in mice. Int. Soc. Immunopharmac.12, 675)을 사용하여측정하였다.

먼저, 대식세포의 리소좀 포스파타아제의 활성측정을 이용하여 실시하였는데 그 방법은 다음과 같이 진행되었다. 즉, 5-10주령 웅성 ICR(5주령, (주)대한실험동물센타) 쥐의 복강에 1 ㎖의 티오글라이콜레이트 배지액을 주입한 뒤 48-72 시간 후에 RPMI-1640 배지로 쥐의 복강을 세척한 후 대식세포를 복강으로부터 회수했다. 회수된 대식세포를 RPMI-1640 배지(Gibco 사, U.S.A)로 두 번 세척하고 세포수가 1×10⁶세포/㎖이 되도록 RPMI-1640 배지에 재 분산시켰다. 이 분산액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 180 ㎕씩 분주한 후 배양기(37℃, 5% 이산화탄소)에서 2 시간 동안 배양하여 대식세포 세포가 각각의 웰 플레이트의 기벽에 부착하여 단층을 형성하도록 하였다. 두 시간 후 플레이트에 비흡착된 세포들은 세척·제거하고 10% 소의 태반 혈청(fetal bovine serum)을 함유한 RPMI-1640 배지를 각 웰에 180 ㎕씩 분주하고 시료 20 ㎕를 가한 후 배양기(37℃, 5% 이산화탄소)에서 24 시간 재 배양하여 대식세포를 활성화시켰다. 이렇게 활성화된 대식세포의 단층에 0.1% 트리톤 X-100(25 ㎕)을 가하여 대식세포의 세포막을 용해시켰다. 이 때 분비된 리소좀의 포스파타아제에 기질로서 100 mM 파라-니트로페닐 포스파타이트(150 ㎕) 및 0.1 몰농도 구연산 완충액(50 ㎕)을 혼합하여 1 시간 동안 산성상태에서 반응시킨 후 0.2 몰농도 보레이트 완충액을 가하여 반응을 정지시키고 ELISA reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도로부터 하기 계산식(Ⅰ)에 의해 포스파타아제의 활성을 환산하여 대식세포의 활성도로 표시하였다.

실험결과, 표1에 나타난 바와 같이, 0.1M 염화나트륨 용액에서 용출된 분획(CT-3Ⅱa)이 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 대조구 대비 220%의 높은 대식세포 활성화능과 15.5%의 높은 수율을 나타내었는데 이는 낮은 정제도에서도 고활성을 갖는 것으로 보조요법제로의 사용 가능성을 제시한다.

음이온 교환수지 크로마토그래피 획분의 대시세포 활성화능과 수율

획분	활 성(%)	수 율(%)
CT-3Ⅰ(0 M)	190	3.5
CT-3Ⅱa (0.1 M)	220	15.5
CT-3Ⅱb (0.2 M)	120	12.3
CT-3Ⅱc (0.3 M)	190	8.0
CT-3Ⅱd (0.4 M)	180	3.5
CT-3Ⅱe (0.5 M)	200	1.8
CT-3Ⅱf (1.0 M)	170	2.9
CT-3Ⅱg (2.0 M)	130	1.7

실시예 3: 겔 여과 크로마토그래피 의해 정제한 다당류의 대식세포 활성화능 측정

상기 실시예 2에서 가장 높은 대식세포 활성화능을 나타낸 CT-3Ⅱa을 겔 여과 크로마토그래피를 실시하여 분리된 세 분획을 'CT-3Ⅱa-1-1', 'CT-3Ⅱa-1-2' 'CT-3Ⅱa-1-3'을 명명하고, 대식세포 활성화능과 수율을 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.

측정한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 세가지 분획중 CT-3Ⅱa-1-2가 1 ㎎/㎖의 농도에서 대조구 대비 250% 활성과 35.6%의 수율을 나타내었다.

겔 여과 크로마토그래피 획분의 활성과 수율

	활성(%)	수율(%)
CT-3Ⅱa-1-1	220	30.1
CT-3Ⅱa-1-2	250	35.6
CT-3Ⅱa-1-3	190	15.6

실시예 4: 홍화에서 분리한 당류의 특성조사

상기 실시예3의 CT-3Ⅱa-1-2에 대한 분자량을 측정하기 위하여 표준물질로 덱스트란 T-2000(분자량: 2 ×10⁶), T-500(분자량: 5 ×10⁵), T-70(분자량: 7 ×10⁴), T-10(분자량: 1 ×10⁴) 그리고 갈락토오스를 사용하여 고속액상 크로마토그래피(Waters model 2690; Shodex OHpak KB-805 (0.8 × 30 cm) 컬럼과 refractiveindex detector 부착)를 실시하였다. 그 결과, 정제된 다당류는 분자량이 38만Da 정도의 다당류로 확인되었다.

한편, CT-3Ⅱa-1-1, CT-3Ⅱa-1-2와 CT-3Ⅱa-1-3 다당류 분획의 탄수화물, 우론산, 단백질 함량을 페놀황산법, m-하이드록신비페닐법, 로오리법으로 측정하였고, 당조성을 분석은 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

우선, 2.0 M TFA(trifluoroacetic acid)로 121℃에서 1.5시간 동안 시료(500 ㎍)를 가수 분해시킨 후 NaBH₄를 이용하여 중성당을 alditol로 환원시킨 후, 에탄올을 흡착시킨 Sep-pak C₁₈cartridge로 메틸화된 시료를 회수하였다. 메틸화 다당 중에서 산성당은 THF에 용해되어 있는 LiB(C₂H₅)3D (Super-Deutride, 1 ㎖, 상온, 1시간)로 환원시킨 후, 다시 Sep-pak C₁₈cartridge로 회수하였다. 이를 1.0 M TFA로 121℃에서 2시간동안 가수 분해한 후에 NaBD₄로 환원시켜 아세틸화 반응을 수행한다. 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트(alditol acetate)는 GC-MS로 분석하였다. 메틸화된 알디톨 아세테이트들은 fragment ion와 relative retention time으로 확인하였고, peak는 peak areas와 flame ionization detector(FID)의 response factor로 측정하였다.

탄수화물 우론산 단백질 함량 및 다당류의 당 조성 분석결과

	CT-3IIa-1-1	CT-3IIa-1-2	CT-3IIa-1-3
수율 (%)	6.4	6.5	4.8
함량 (%)
탄수화물	47.2	58.8	47.6
우론산	6.4	6.5	4.8
단백질	9.3	13.8	19.1
당조성(mol. %)
람노스(Rha)	5.8	15.1	6.8
푸코오스(Fuc)	1.0	2.2	2.8
아라비노오스(Ara)	12.6	20.6	31.2
크실로오스(Xyl)	trace^e)	2.5	4.7
만노오스(Man)	9.4	3.7	4.8
갈락토오스(Gal)	35.5	32.0	26.6
글루코오스(Glc)	29.4	15.4	18.2
갈락투론산(GalA)	2.1	3.8	1.1
글루쿠론산(GlcA)	4.2	4.7	3.8

실시예 5: 홍화에서 분리한 다당류의 항암활성조사

상기 실시예 1에서 제조된 높은 대식세포 활성을 나타낸 'CT-3'의 항암활성을 Sarcoma-180 고형암 모델을 이용하여 하기와 같이 실시하였다.

홍화로부터의 대식세포 활성화 물질(CT-3)을 0(식염수), 5, 10, 50, 100 mg/kg의 농도로 식염수에 용해하였으며, 종양 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받아 ICR 쥐(5주령, (주)대한실험동물센타)의 복강에서 2주일 간격으로 이식하여 보존하고 있는 sarcoma-180 세포를 이용하였으며 쥐 복강 내에서 2주일 간 배양한 sarcoma-180 세포를 복수와 함께 취하여 분리해 낸 후 빙냉하에서 주사용 생리 식염수로 수회 세척하여 적혈구를 분리 제거한 후 세포수가 310⁶cells/㎖가 되도록 조정하여 마리 당 0.1 ㎖씩 오른쪽 서혜부에 피하 이식하고 24시간 후부터 시료를1일 1회씩 10일간 복강 투여하여 측정하였다. 증식 저지율은 하기식 (Ⅱ)에 나타낸 바와 같이, 생리식염수를 투여한 대조군과 비교하여 고형암 증식 저지 백분율(percent of inhibition ratio: I.R, %)로 계산하였다.

실험결과 도3에 나타난 바와 같이, Sarcoma-180 고형암 모델(분양처)을 이용하여 항암 효과를 분석한 결과 10 ㎎/㎏의 용량에서도 50% 이상의 저지 효과를 나타내었다.

이러한 결과들로부터 홍화에서 정제한 대식세포 활성화 다당류는 분자량이 38만 Da정도의 고분자 물질로 대식세포를 활성화시키며 항암효과를 갖는 것으로 사료된다. 이는 기능성 식품 또는 약물로의 이용시 매우 유용할 뿐만 아니라 암환자나 면역저하환자 식이로도 유용할 것으로 예상된다.

이상 상기 실시예 및 실험예에서 명백한 바와 같이, 본 발명은 홍화 냉수추출물로부터 분리한 대식세포 활성화 다당류 및 그의 정제방법을 제공한다. 본 발명의 대식세포 활성화 다당류는 에탄올 75%의 분획화, 음이온 교환수지 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 통한 일련의 공정으로 홍화 냉수추출물에서 순수 분리한다. 이렇게 분리한 대식세포 활성화 다당류는 고분자의 다당류로 고형암 실험에서와 같이 항암효과를 갖고 있으므로 면역질환이나 암 등에 약물로 이용할 수 있고 기능성 식품으로의 이용도 유용하다.

Claims

홍화 수추출물에서 메탄올 가용 획분을 제거하고 에탄올 침전시키는 공정;

상기 침전물을 증류수에 용해하고 한외여과를 통해 분자량 30만 이상의 용액을 수득하는 공정;

상기 수득한 용액을 음이온 교환수지 컬럼에 주입하고 0.1 몰농도 염화나트륨(NaCl) 용액으로 용출시켜 분획을 얻는 공정; 및

상기 수득한 분획을 겔 여과 크로마토그래피를 통해 정제하는 공정을 포함하여 제조되는 다당류로서,

람노오스, 푸코오스, 아라비노오스, 크실로오스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성되는 다당류를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대식세포 활성화에 의한 면역증강용 조성물.
홍화 수추출물에서 메탄올 가용 획분을 제거하고 에탄올 침전시키는 공정;

상기 침전물을 증류수에 용해하고 한외여과를 통해 분자량 30만 이상의 용액을 수득하는 공정;

상기 수득한 용액을 음이온 교환수지 컬럼에 주입하고 0.1 몰농도 염화나트륨(NaCl) 용액으로 용출시켜 분획을 얻는 공정; 및

상기 수득한 분획을 겔 여과 크로마토그래피를 통해 정제하는 공정을 포함하여 제조되는 다당류로서,

람오노스, 푸코오스, 아라비노오스, 크실로오스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성되는 다당류를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고형암 치료용 조성물.
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