KR100445547B1 - 면역내성유발방법및유발제 - Google Patents
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Abstract
특정 면역관용원에 결합된 점막결합 분자를 함유하는 면역내성-유발제를 기술한다. 또한, 불필요한 개개의 면역반응의 원인이 되는, 합텐을 포함하는, 특정 항원 개개에 대하여 면역내성을 유발시키는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 상기 개개에 대해 본 발명에 따른 면역내성-유발제를 면역적으로 효과적인 량으로 점막 경로에 의해 투여하는 방법을 포함한다.
Description
본 발명은 면역-내성 유발제에 관한 것으로서, 특히 특정 면역관용원에 결합된 점막-결합분자를 함유하는 에이전트에 관한 것이며, 합텐을 포함하는 특정 항원 개개에 대한 면역내성을 유발하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경 및 종전기술의 설명
척추동물 유기체로 주입함에 의하여, 합텐을 포함하는 항원(Ag)이라 칭하는 이종물질의 도입은 상기 Ag와 상호작용할수 있는 특정 항체(B 림프구의 산물)의 생산 및/또는 작동물질 T림프구의 개발 및 상기 Ag와 마주치는 자리에서 림포카인이라 칭하는 가용성 매개체의 생성에 의해 특징지워지는 면역반응의 유발을 초래할 수 있다. 항체 및 T림프구는 적대적인 Ag에 대항하여 보호하는 본질적인 역할을 확실히 행하면서도, 또한 숙주조직의 파괴의 원인이 되는 손상과정에 관여할수도 있다. 상기는 항체 및/또는 T림프구가 그 자신의 조직 및 그 손상의 Ag와 반응하는 자가면역 질병의 경우이다. 또한, 상기는 어떤 환경적인 물질에 대한 지나친 면역반응으로 특징지워지는, 조직파괴의 원인이 되는 염증반응의 결과를 초래할 수 있는 알레르기 반응의 경우이다. 더구나, 상기는 어떤 감염(예를들어, 결핵, 주혈흡충증) 또는 이종입자(예를들어, 석면)의 도입과 같은 이종물질의 비효과적인 제거의 결과로서 발생된 만성염증 반응의 경우이다. 또한, 상기는 동종이식체로의 도입에 따른, 그리고 그 거부반응의 원인이 되는 면역증식성 반응의 경우이다.
동종이식 거부반응, 자가면역 질병, 감염 미생물 또는 환경적 항원에 대한 조직파괴적 알레르기반응과 같은 바람직하지 못한, 즉 조직을 손상시키는 면역반응으로 일어난 질병에 대항하는 효과적인 치료를 개발하는데 있어서 주요 목적들 중 하나는 나머지 면역체계에 영향을 끼치지 않고 유해한 면역과정의 강도를 허용가능한 수준으로 특별히 억제하거나 감소시키는 것이다.
면역내성의 문제는 자기 몸체성분("자가항원) 또는 임의의 소정 이종물질에 대한 파괴적 면역반응이 없다고 확실시되는 모든 메카니즘을 다룬다.
면역내성을 유도하는 방법으로서 가장 오랫동안 인정된 방법은 경구투여인데, 이는 웰스라는 사람에 의해 계란 단백질에 대해 입증되었다(Wells, H. 1911. Studies on the chemistry of anaphyaxis III. 분리된 단백질, 특히 계란의 단백질을 사용하여 실험됨. J. Infect. Dis. 9 : 147). "경구 내성"(초기에 Ag의 경구투여의 효과로 기록되었기 때문에)으로서 종종 언급되는 현상은 동물이 투여하거나 흡입하여 항원이 무반응성이 된 사실 또는 전신성(全身性) 경로, 예를들어 주사에 의해 도입된 상기 항원에 재-노출되었을 때 전신성 면역반응을 전개하는 능력이 감소된 사실로 특징지워진다. 광범위한 용어로, 점막상에 또는 장, 폐, 구강, 생식기, 코 및 눈과 같은 점막조직내에 항원을 적용하는 것은 전신성 면역내성의 징후를 유도시킬 수 있다.
상기와는 반대로, 비점막 조직, 예를들어 전신성 면역으로서 언급된 피부나 혈액으로 항원을 도입시키는 것은 종종 상술된 특성을 갖는 면역반응의 결과를 초래하며, 전신성 면역반응으로 언급된다.
이 징후는 저감반응(低減反應; hyporesponsiveness)이 상기 피드 또는 흡입된 Ag의 주입에 따라 일어날수는 있지만 구조적으로 관계가 없는 Ag(점막 부위에서 종전에 만난적이 없다는 전제하에)의 주입후에는 일어나지 않는 것으로 기록된 감각으로 점막 과정에 의해 도입된 Ag의 고도의 특이적인 징후이다.
상피성 장세포 및 페이어스 패치 엠(Peyer's patch M) 세포를 포함하는 세포들이 장-관련 림프세포(lymphoid tissue)내에서 분화됨에 의하여 섭취된 항원이 흡수되고 진행된다고 믿어진다(Owen, R. L., and P. Nemanic. 1978. 포유류 장관의 항원 진행구조: an SEM study of lympho-epithelial organs. Scanning Electron Microsc. 2: 367-378.). 또한, 흡입된 항원이 기도 상피내에서 유사한 형태의 세포에 의해 흡수된다고 믿어진다(Richardson J. Bouchard R and Ferguson CC. 1976. 호흡상피에 의한 외인성 단백질의 섭취 및 수송. Lab. Invest. 35: 307-314).
장 및 폐 점막의 국소 미소환경내에서 보조세포를 지닌 항원 및 기원이 같은 헬퍼 T세포 및/또는 B림프구의 상호작용에 이어, 면역반응이 계속해서 일어날 수 있으며, 그 특성은 항원의 성질, 보조세포의 형태 및 포함된 림프구, 및 숙주의 유전적 배경을 포함한 여러 요인들에 의해 영향을 받을수 있다. 그러나, 항원의 경구섭취 또는 흡입도 말초성 면역내성의 상태를 발달시키는 결과를 초래할수 있으며, 면역이 비-점막 조직에서 반응한다는 사실에 의해 특징지워지는 상태는 비록 항원이 초기에 소화관 점막에 부닥친다 할지라도 또는 호흡점막이 장관외 주사에 의한 것과 같은 비-점막 경로에 의해 유기체내에 재도입된다 할지라도 발달될수 없다. 상기 징후는 초기에 섭취되거나 흡입된 항원의 절묘하게 특이적인 성질때문인 까닭에, 다른 항원에 대한 전신성 면역반응의 발달에 영향을 미치지 않으며, 그 사용은 관련된 또는 비-점막 조직에서 마주치는 특이적 항원에 대한 다루기 힘들고 악화된 면역반응의 발달을 초래하는 질환을 방지하고 가능한 치료하기 위한 점점 관심을 끄는 전략이 되었다.
점막적으로 유도된 전신성 내성의 징후는 항체의 생성 및 상기 Ag에 대한 세포-매개된 면역반응의 발달과 같은, Ag의 전신성 도입으로 유발될 수 있는 것으로 알려진 모든 형태의 면역반응을 포함할 수 있다. 그러므로, 점막적으로 유도된 면역내성은 화학적 약에 대한 알레르기성 반응의 강도를 방지 또는 감소시켜주기 위한 전략으로서 제안된바 있다(Chase, MW. 1946. 감작제의 사전 투여에 의한 실험적 약 알레르기의 억제. Proc. Soc. Exp. Biol. 61: 257-259). 또한, 전신성으로 도입된 가용성 단백질 항원 및 적혈구의 경구투여에 의하여 실험용 동물 및 인간에서의 적혈구와 같은 특별한 항원에 대한 면역반응의 강도를 방지 또는 감소시키는 것이 가능할 수 있었다(Thomas HC and Parrot DMV 1974. 경구투여에 의한 가용성 단백질 항원들에 대한 내성의 유발. Immunology 27: 631-639; Mattingly, J. and Waksman B. 1978. 항원의 경구투여후 면역 억제. 면양 적혈구의 경구투여 및 그 전신성 이입후 쥐의 페이어스 반점에서 발견된 특이적 억제자 세포. J. Immunol. 121: 1878; Bierme, S. J.; Blanc, M.; Abbal, M.; Fournie, A. 1979. 극도로 면역된 모체에 대한 경구 Rh 치료. Lancet, 1:605-606).
점막적으로 유도된 전신성 내성의 징후는 이종물질 뿐만아니라 자가항원 예를들어 숙주조직으로부터 유도된 성분들에 대한 면역반응을 감소 또는 억제하는데활용될 수 있다. 따라서, 장관(섭취함에 의해) 또는 호흡점막(항원의 분무주입 또는 비강내 점적주입에 의하여)상에 자가항원을 점막 침착시킴에 의하여 다양한 동물계에 있어서 실험적으로 유도된 자가면역 질환의 강도를 감소시킬 수 있다. 따라서, 콜라겐 타잎 II(콜라겐의 현저한 형태는 관절 연골에서 발견됨)의 경구투여는 실험적 자가면역 관절염의 강도를 억제 또는 감소시키는 것으로 보여지는데, 상기 질환은 프런드의 완전한 아쥬반트(Freund's complete adjuvant)와 함께 콜라겐 타잎 II를 주입하거나 또는 마이코박테륨 결핵(상기 아쥬반테의 성분)을 주입함에 의하여 설치류의 어떤 균주내에서 유발시킬 수 있다(Thompson, HSG and Staines, NA. 1986. 타잎 II 콜라겐의 위장으로의 투여는 쥐에서 코라겐-유발 관절염의 시작 및 격렬한 통증을 지연시킴. Clin. Exp. Immunol. 64:581; Nagler-Anderson, C., Bober LA, Robinson, ME, Siskind GW, Thorbecke GJ. 1986. 가용성 타잎 II 콜라겐의 위장내 투여에 의한 타잎 II 콜라겐-유발 관절염의 억제. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83;7443; Zhang, JZ, Lee, CSY, Lider, O. and Weiner HL. 1990. 타잎 II 콜라겐의 경구투여에 의한 루이스 쥐에서의 아주반트 관절염의 억제. J. Immunol. 145:2489-2493). 유사하게는, S-항원, 동물에 주입한 경우 포도막 망막염의 형태를 유발할수 있는 망막 자가항원을 경구투여함에 의하여 자가면역 포도막 망막염(uveoretinitis)의 실험적 형태를 억제할 수 있다(Nussenblatt RB, Caspi, RR, Mahdi R, Chan, CC, Roberge, R., Lider, O., Weiner, HL. 1990. S-항원을 경구로 사용하여 내성을 유발시킴에 의한 실험적 자가면역 포도막 망막염을 유발하는 S-항원의 억제. J. Immunol. 144:1689-1695). 실험적 자가면역 뇌염, 정제된 마이엘린 기본 단백질 또는 아쥬반테와 함께 조제 척수 균등액을 주입함에 의하여 설치류의 어떤 균주내에서 유발될 수 있는 만성적으로 재발되는 탈수질 장애는 동물이 경구(섭취) 경로 또는 호흡(분무) 경로에 의해 MBP 또는 MBP 단편들을 부여받을 경우 부분적 또는 완전히 억제될 수 있다(Bita DM and Whitacre CC. 1988. 마이엘린 기본 단백질의 경구투여에 의한 자가면역 뇌척수염의 억제. Cell Immunol. 112:364; Higgins PJ and Weiner HL. 1988. 마이엘린 기본 단백질 및 그 단편들을 경구투여함에 의한 실험적 자가면역 뇌염의 억제. J. Immunol. 140:440-445; Weiner HL, Al-Sabbagh A and Sobel R. 1990. Antigen driven peripheral immune tolerance: 마이엘린 기본 단백질을 분무 투여함에 의한 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 억제. FASEB J(Abstr.) 4(7):2102). 더구나, 인슐린의 경구투여는 쥐에 있어서 자가면역 당뇨병을 억제하는 것으로 보고된바 있다(Zhang ZJ, Davidson L, Eisenbarth G and Weiner HL. 1991. 돼지 인슐린의 경구투여에 의한 비만이 아닌 당뇨병 쥐에 있어서 당뇨병의 억제. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:10252-10256). 보다 최근에는, 실험적 자가면역 중증근무력증의 억제가 아세틸콜린 수용체의 경구투여후 성취된바 있다(wank ZY, Qiao J and Link H. 1993. 아세틸콜린 수용체의 경구투여에 의한 실험적 자가면역 중증근무력증의 억제. J. Neuroimmunol. 44: 209-214).
또한, 쥐에 있어서 주혈흡충란의 소장 투여가 간장 및 장관의 육아종증 반응의 발달을 방지해 주거나 강도를 감소시켜 줄 수 있다고 알려진바 있는데, 상기 반응은 기생충 주혈흡충이 체내 침입하는 동안 주혈흡충란의 주변에 발달되는 만성 T세포-매개의 염증성 면역반응이다(Weinstock JV, Blum AM and Kassab JT. 1985. 소장이 주혈흡충란에 노출됨에 의한 쥐의 만손주혈흡충증에서 육아종 변조의 유발. J. Immunol. 135: 560-563).
거의 비슷한 방법으로, 항원의 경구투여는 집안 먼지 성분이나 목초 꽃가루에 존재하는 물질과 같은 통상의 알레르겐에 대한 알러지반응을 방지 및/또는 치료하도록 제안된바 있다(Rebien W, Puttonen E, Maasch HJ, Stix E and Wahn U. 1982. 목초 꽃가루 추출물을 사용하여 경구 및 피하의 면역치료에 대한 임상학 및 면역반응. A prospective study. Eur. J. Pediatry 138:341-344; Wortmann F. 1977. 꽃가루 알러지 또는 집안 먼지 천식을 가진 어린이의 경구 과민성감퇴화. Allergol et Immunopathol. 5:15-26).
상기 예들은 자가항원과 마찬가지로 이종물질의 점막투여가 특이적인 면역내성을 유도하기 위한 편리한 방법을 제공한다고 제시하지만, 인간에게 있어서 대규모 치료를 위한 응용가능성 및 가축병치료 약제가 실질적인 문제의 한계로 남아있다.
게다가, 임상학적으로 폭넓게 응용될 수 있게 하기 위하여서는, 질병의 진행정도가 이미 확고해진 환자들 및/또는 잠재적으로 조직-손상 면역세포가 이미 나타난 환자들에게도 점막으로-유도된 면역내성이 효과적이어야한다. 이는 자가면역 질환, 알러지성 상태, 또는 잠복기가 긴 미생물에 대한 만성 염증 반응을 겪고 있거나 겪기 쉬운 환자들에 있어서 내성 유발의 전략을 고려해볼 경우 특히 중요하다. 점막으로 내성을 유발하는 최근의 프로토콜은 전신성 면역 감작의 이미 확고해진상태의 발현을 억제하는데 있어서 제한된 성공을 거두었다(Hansson DG, Vaz NM, Rawlings LA and Lynch JM. 1979. 단백질 항원을 섭취시킴에 의한 특이적인 면역반응의 억제. II. Effects of prior passive and active immunization. J. Immunol. 122:22612266).
가장 중요하게는, 감염 병원체에 대한 면역반응을 유발시키는 것을 목표로 삼은 점막 백신에서 유추하여, 대부분의 항원을 점막에 적용함으로써 전신성 면역내성을 유발하는 것은 상당한 량의 면역관용원/항원 요구되며, 오랜 기간동안 반복적으로 투여되는 면역관용원/항원은 오랜 기간동안 반복적으로 투여되지 않는한 비교적 그 지속기간이 짧다. 대부분의 항원이 점막조직내로 들어가기 전에 광범위하게 퇴화되며 또는 불충분한 량으로 흡수된다는 것이 가장 가능하다고 생각되는 설명이다. 따라서, 공지된 점막-결합특성( 점막-결합특성의 예는 다음 표 I 에 열거되어 있으며, 또한 Mirelman D. 1986. microbial lectins and agglutinins, Properties and biological activity, pp. 84-110, Wiley, New York. 문헌과 같은 리뷰에서 찾아 볼 수 있다)을 지닌 분자만이, 전신성 면역내성을 유발하지 않고 경구 경로와 같은 점막경로에 의해 투여될 경우, 국소 및 전신성 면역반응을 유발할 수 있다고 폭넓게 가정된다(de Aizpurua HJ and Russell-Jones GJ. 1988. 경구 접종. 경구투여에 대한 면역반응을 유발시키는 단백질류의 동정. J. Exp. Med. 167:440-451). 주목할만한 예로는 이제까지 알려진 가장 효능있는 점막 면역원중의 하나인 콜레라톡신(Elson CO and Ealding W. 1984. 콜레라 독소을 사용하여 쥐의 점막을 자극시킨 후 일반화된 전신성 및 점막 면역. J. Immunol. 132:2736)이 있으며, 경구 경로에 의해 관련없는 항원과 함께 동시에 투여할 경우 상기 항원에 대한 전신성 면역내성의 유발을 방지할수도 있다(Elson CO and Ealding W. 1984. 콜레라 독소는 쥐에서 경구 내성을 유발하지 않으며 관련없는 항원에 대한 경구 내성을 파기한다. J. Immunol. 133:2892).
이들 관찰을 바탕으로 하여, 콜레라 독소 또는 그 점막-결합 단편 콜레라 독소 B 서브유니트와 같은 점막-결합분자에 결합된 항원의 점막 투여는 전신성 내성 보다는 오히려 국소적 및 전신적인 면역반응을 유발하는 전략으로서 제안된바 있다(Mckenzie SJ and Halsey JF. 1984. 점막 면역반응을 자극하기 위한 캐리어 단백질로서 콜레라 독소 B 서브유니트. J. Immunol. 133:1818-1824; Nedrud JG, Liang X, Hague N and Lamm ME. 1987. 구강/코 연합 면역법은 쥐를 센다이 바이러스 감염으로부터 보호한다. J. Immunol. 139: 3484-3492; Czerkinsky c, Russell MW, Lycke N, Lindblad M and Holmgren J. 1989. 콜레라 독소 B 서브 유니트에 결합된 연쇄상구균성 항원의 경구투여는 타액선 및 점막의 조직에서 강한 항원반응을 유발한다. Infect. Immun. 57:1072-1077; de Aizpurua HJ and Russell-Jones GJ. 1988. 경구 접종. 경구 섭취에 대한 면역반응을 유발하는 단백질류의 동정. J. Exp. Med. 167:440-451; Lehner T, Bergmeyer LA, Panagiotidi C, Tao L, Brookes R, Klavinskis LS, Walker P, Walker J, Ward RG et al. 1992. 재결합체 원숭이 면역결핍 바이러스성 단백질에 대한 전신성 및 면역성의 유발. Science 258(5036):1365-1369).
본 발명의 설명
점막-결합분자에 결합된 항원의 점막투여가 국소적 및 전신적인 면역반응을 유발하는 확고한 견해에 대항하여, 본 발명자들은 놀랍게도 다양한 점막(구강, 비강내, 질, 직장) 경로로 투여된 항원이 점막-결합분자에 결합될 경우 상기 항원에 대한 전신적인 면역내성의 유발이 향상된다는 사실을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 특정 면역관용원예 결합된 점막-결합분자를 함유하는 면역내성 유발제에 관한 것이다.
여기서, "면역내성"이란 용어는 특이적 내성이 있는 항원(들)에 대한 숙주의 면역 반응성에 있어서의 감소로서 정의된다. 내성이 있는 이러한 항원은 본 발명의 명세서에 기술되며, 이를 면역관용원이라 칭하는데 확립된 전문용어와 일치된다.
본 발명의 한 구체예에 있어서, 상기 점막-결합분자는 세균독소, 세균채, 바이러스성 부착 단백질 및 식물성 렉틴의 점막-결합 구조로부터 유도된 점막-결합분자로부터 선택된다. 세균독소의 상기 점막-결합구조는 콜레라 독소 및 대장균의 열-불안정성 장독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 점막-결합구조는 독소의 결합 단편, 특히 콜레라 독소 또는 대장균의 열-불안정성 장독소의 B 서브유니트이다.
본 발명의 면역 내성-유발제에서 사용될 수 있는 점막-결합분자의 등급 및 유형의 예는 다음 표 I에 열거되어 있다.
실시예 I
점막-결합분자의 등급 및 유형의 예
A. 세균독소 및 그 결합 서브유니트 또는 단편들
예: 콜레라 독소, 콜레라 B 서브유니트;
대장균 열-불안정성 장독소(LT), LT B 서브유니트;
백일해균 독소, 서브유니트 S2, S3, S4 및/또는 S5;
디프테리아 독소(DT), DT B 단편;
시가 독소, 시가-류 독소 및 서브유니트
B. 세균체
예: 대장균; K88, K99, 987P, F41, CFA/I, CFA/II,
(CS1, CS2 및/또는 CS3), CFA/IV (CS4, CS5 및/또는 CS6), P 섬모등;
콜레라균 독소-공동조절된 섬모(TCP), 만노스-감성 혈구응집소(FSHA)등;
백일해균 사상(絲狀) 히그글루티닌(heagglutinin);
C. 바이러스성 부착 단백질
예: 인플루엔자 및 센다이 바이러스 혈구응집소
HIV gp120;
D. 동물성 렉틴 및 렉틴류 분자
예: 면역글로블린;
칼슘-의존(C-형) 렉틴;
가용성 락토스-결합(S-형) 렉틴;
셀렉틴;
콜렉틴;
헬릭스 포마티아 혈구응집소
E. 식물성 렉틴
예: 콘카나발린 A
맥아 어그글루티닌(agglutinin)
피토헤마그글티닌(Phytohemagglutinin)
아브린(Abrin)
리신(Ricin)
본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 본 발명의 면역내성-유발제에서 점막-결합분자에 결합되는 특정 면역관용원은, 개개에 있어서 불필요한 면역반응의 원인이 되는, 합텐을 포함하는, 특정 항원으로부터 선택되어진다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 항원은 단백질, 펩티드, 탄화수소, 지질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
불필요한 면역반응은 전신성 항체 생성 및/또는 지효(遲效)-형 과민증과 관련 될 수 있는 것으로 언급되었으며, 종종 자가면역 장애, 알러지성 장애, 조직 혹은 세포이식 거부반응 및/또는 급성이나 만성 염증반응 또는 장애와 관련된다.
본 발명에 따른 면역내성-유발제에 있어서, 특정 면역관용원 및 점막-결합분자는 직접적 또는 간접적으로 서로 결합된다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 면역관용원 및 상기 점막-결합분자는 스페이서 분자, 합텐을 포함하는 상기 면역관용원/항원을 함유하는 보호 부형제, 또는 융합된 유전자 혹은 뉴클레오티드 배열의 발현으로 부터 유도된, 상기 스페이서 분자 및 합텐을 포함하는 상기 면역관용원/항원의 잡종분자로 이루어진 군의 일원의도움을 빌려, 간접적으로 서로 결합된다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 스페이서 분자는 상기 면역관용원 또는 면역관용원-함유 부형제 및 상기 점막-결합분자의 어느것 한가지나 모두에 대해 결합 친화력을 갖는 분자들로 부터 선택된다. 이러한 스페이서 분자의 특정 예로는 항체가 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 스페이서 분자는 GM1 강글리오사이드, 갈락토실-N-아세틸-갈락토스아미닐-(시아릴)-갈락토실글루코실세라마이드의 콜레라톡신 결합구조로 부터 유도된다.
특정 면역관용원이 본 발명의 면역내성-유발제에 있어서 점막-결합분자에 결합되어 있는 방법은 상기 면역관용원 및 상기 분자가 그들 각각의 기능을 수행할 수 있는 한 그리 중요하지 않다. 따라서, 이들은 단순한 화학적 절차에 의하여 직접 서로 결합되어질 수 있다. 항체 및 합성 펩티드를 포함하는 기타 단백질들과 마찬가지로 지질, 합텐, 탄화수소, 핵산에 대한 콜레라 독소(CTB)의 B 서브유니트 또는 대장균의 열 불안정성 장독소(LTB)와 같은 단백질을 결합시키는 화학적 절차는 당 분야에 매우 잘 공지되어있다(예를들면, Carlsson J et al 1978. Biochem. J. 173:723-737; Cumber JA et al. 1985. Methods in Enzymology 112:207-224; Walden P et al. 1986. J. Mol Cell Immunol. 2: 191-197; Godon RD et al. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:308-312; Avrameas S and Ternynck T. 1969. Immunochemistry 6:53; Joseph KC, Kim SU, Stieber A, Gonatas NK. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2815-2819; Middlebrook JL. and Kohn LD (eds). 1981. 독소와 호르몬의 수용체-매개 결합 및 내면화. Academic Press, New York, pp 311-350). 또한, 면역관용원은 CTB(또는 LTB) 유전자(Sanchez J, Svennerholm A-M andHolmgren J. 1988. 콜레라 독소 B 서브유니트에 대한 비-독소 열-안정성 장독소-관련 데카-펩티드 항원의 유전자 융합. FEBS letters 241:110-114)에 유전자적으로 융합시킬 수 있으며, 그런 다음 상기 결과로 얻어진 정체불명의 유전자를 박테리아, 이스트, 또는 비루스와 같은 적당한 발현 시스템에서 발현시킨다. 또는 그대신, 내성 유발제가 핵산 배열(DNA 또는 RNA)의 단편 또는 점막-결합분자에 화학적으로 결합된 다음 점막 경로에 의하여 투여된후 숙주 점막조직으로 부터 세포량을 취하여 성숙된 단백질에 대응 유전자를 전사 및/또는 번역하도록 하여 이익을 가져다 주는 면역관용원을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다(Rohrbaugh ML and McGowan JJ. 1993. HIV-1 감염의 치료 및 예방법에 대한 유전자-전이. Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol 685, pp 697-712; Nabel GJ and Felgner PL, 1993. 면역치료 및 예방접종에 대한 직접적인 유전자-전이. Trends in Biotechnology Vol 11 No. 5, pp 211-215; Robinson HL, Hunt LA, Webster RG. 1993. 혈구응집소-발현 플라스미드 DNA를 사용한 면역법에 의한 치명적인 인플루엔자-바이러스 도전에 대한 보호. Vaccine 11:957-960; Martinon F, Krishnan S, Lenzen G, Magne R, Gomard E, Guillet JG, Levy JP and Meulien P. 1993. Eur. J. Immunol. 23:1719-1722). 다시 또다른 대체 표현 형태는 면역관용원 또는 그 핵산 전구체를 리포솜 또는 등가량의 생물분해성 소포와 같은 보호 부형제내에 혼입하는 것으로 이루어질 수 있는데, 상기 생분해성 소포상에는 점막-결합분자가 면역관용원의 효력을 향상시키기 위하여 점막면에 면역관용원-함유 부형제의 효과적인 결합을 허용하도록 부착 되어있다.
또한, 본 발명은 불필요한 개개의 면역반응의 원인이 되는, 합텐을 포함하는, 특정 항원 개개에 대하여 면역내성을 유발시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 개개에 대해 본 발명에 따른 면역내성-유발제를 면역적으로 효과적인 량으로 점막 경로에 의해 투여하는 방법을 포함한다. 개개에 있어서 불필요한 면역반응의 원인이 되며, 본 발명의 면역내성-유발제에서 특정 면역관용원을 형성할수 있는 특정 항원의 예는 다음과 같다:
합성 펩티드 또는 대응 핵산 유전자 정보를 포함하는 인슐린 또는 그 단편들, 및 본 발명의 면역내성 유발제는 인슐린에 대한 면역반응을 방지 또는 억제하기 위하여, 따라서 자가면역 당뇨병을 방지 또는 치료하기 위하여 점막 경로에 의해 투여될수 있다;
합성 펩티드 또는 대응 핵산 유전자 정보를 포함하는 마이엘린 기본 단백질 또는 그 단편들,
및 본 발명의 에이전트는 마이엘린 기본 단백질에 대한 면역반응을 방지 또는 억제하기 위하여, 따라서 다발성 경화증의 방지 또는 치료에 사용될 수 있다;
한가닥 또는 두가닥의 DNA,
및 본 발명의 에이전트는 전신성 남창 홍반성의 방지 및/또는 치료를 위해 셀프 DNA에 대한 면역반응을 억제시키기 위하여 투여될 수 있는데, 상기 질환의 면역 특징은 셀프 DNA에 대한 자가-항체의 생성에 있다;
합성 펩티드 또는 대응 핵산 유전자 정보를 포함하는 항체 또는 그 단편들, 및 본 발명의 에이전트는 상기 항체에 대한 면역반응을 방지하기 위하여 사용될 수있다; 항체는 IgG 분자 또는 그 단편들일 수 있으며, 그런다음 면역관용원으로서 모든 IgG 또는 그 단편들을 함유하는 면역내성-유발제는 셀프 IgG 분자와 반응하는 류마토이드 요소라 불리우는 자가항체의 존재로 특징지워지는 류마토이드 관절염 및 그에 관련된 상태를 갖는 환자들의 경우와 같이 IgG 분자에 대한 면역 반응을 방지 또는 감소시키도록 점막 경로에 의해 투여될 수 있다;
합성 펩티드 또는 대응 핵산 유전자 정보를 포함하는 감마 글로블린 또는 그 단편들,
및 본 발명의 에이전트는 감마 글로블린을 정맥내 주사하기 전과 같은 이점이 있는 상황에서 상기 감마 글로블린에 대한 면역반응을 방지 또는 감소시키도록 점막 경로에 의해 투여될 수 있다;
합성 펩티드 또는 대응 핵산 유전자 정보 또는 이식 항원을 발현하는 세포를 포함하는 상기 이식 항원 또는 그 단편들,
및 본 발명의 에이전트는 상기 이식항원에 대한 면역반응을 방지 또는 감소시키기 위하여, 따라서 동종이식의 거부반응을 방지하고 또는 생존을 연장시키기 위하여 점막 경로에 의해 투여될 수 있다;
호그위드 꽃가루와 같은 알러지 물질,
및 본 발명의 에이전트는 상기 알러지 물질에 대한 면역반응을 방지 및/또는 감소시키기 위하여, 따라서 알러지를 방지 또는 치료하도록 점막 경로에 의해 투여될 수 있다;
합성 펩티드 또는 대응 핵산 유전자 정보를 포함하는 세균독소 또는 그 단편들,
및 본 발명의 에이전트는 감염 및 조직 손상의 결과일수 있는 전신성 자리에서 부닥치는 상기 독소에 대한 면역반응을 방지하도록 점막 경로에 의해 투여될 수 있다; 상기 상황의 예로는 내독소(그램 음성 박테리아에 의해 생성된 리포폴리삭카라이드의 군) 및 포도상구균 장독소와 같은 어떤 외독소의 전신적인 투여에 의하여 유발된 패혈증류 독소 쇼크 신드롬이다. 이러한 상황에서는, 본 발명의 에이전트에 있어서 점막-결합분자에 결합된 상기 독소 또는 그 단편을 점막 투여가 조직 손상 면역반응의 발달을 피하도록 사용될 수 있다.
실험
본 발명은 점막-결합분자로서 CTB 및 LTB, 및 항원/면역관용원으로서 면양의 적혈구(SRBC) 및 인간의 감마-글로블린(HGG)을 사용하여 실험되었다. 본 발명이 SRBC 또는 HGG에 대한 내성 유발에 대하여 한정된 방법이 없는 반면에, 이들 항원은 특별하고 가용성인 항원의 모델로서 각각 선택되었는데, 그 이유는 이들이 항체 형성 및 세포-매개 면역반응 모두에 관하여 가장 특징적인 경구 면역관용원들이기 때문이며, 상기 후자의 반응은 고전적인 지효형 과민증(DTH) 반응으로 유형화된다. 이들 형태의 면역반응은 자가면역 질환, 알러지 반응, 이식 거부 및 기타 감염 상태의 발달을 함축한다. 또한, 본 발명은 CTB에 결합될 경우의 마이엘린 기본 단백질을 경구투여의 경로에 의하여 사용하여 실험적 자가면역 뇌염을 억제하는 방법을 함축하며, CTB에 결합된 동종 쥐의 흉선세포를 경구투여의 경로에 의하여 사용하여 동종이식 생존을 연장시키는 방법을 함축한다.
다음 실험은 본 발명을 예증할 목적으로 제공되는 것이지 본 발명의 범주를 한정하려는 것은 아니다.
물질 및 방법
쥐: Animal Care Facility of the Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Goteborg, Sweden. 으로부터 근친 Balb/c 암컷쥐를 구했다. 태어난지 6-8주된 쥐가 사용되었다.
점막-결합분자 CTB 및 LTB의 정제:
재조합 콜레라 독소 B 서브유니트(CTB)는 콜레라 독소 유전자로 지효된 비브리오 콜레라의 돌연변이체 균주에서 생성되었으며, CTB 서브유니트를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션시켰다(Sanchez J. and Holmgren J. 1989. 백신 발전을 위한 기초로서 비브리오 콜레라에 있어서 콜레라 독소 B 서브 유니트의 과-발현을 위한 재조합 시스템. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:481-485). 대장균 열-불안정성 장독소(LTB)의 재조합 B 서브유니트는 콜레라 독소 유전자로 지효된 비브리오 콜레라의 돌연변이체 균주에서 유사하게 생성되었고, 대장균 LTB를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션시켰다(Hirst T. R, Sanchez J. Kaper J. B., Hardy S. J. S. and Holmgren J. 1984. 대장균의 열-불안정성 장독소를 암호화한 플라스미드를 품은 균주에서 연구된 비브리오 콜레라에 의한 독소 분비의 메카니즘. Proc. Natl. Acad. Csi. USA 81:7752-7756). 이들 발현 시스템에 있어서, CTB 및 LTB는 분비된 단백질과 같은 박테리아 성장 배양액으로 부터 회수된다. 박테리아 배양물을 20분동안 분당 8000rev에서 원심분리하고, 상등액을 수집하여 희석 염산을 사용하여 pH4.5로 조절하였다. 23℃에서 2시간동안 헥사메타포스페이트(최종농도는 2.5g/l)를 사용하여 침전시킨후에, 분당 8000rev에서 원심분리하였다. 그런다음, 펠렛을 pH 8.0의 0.1M 인산나트륨 완충액에 용해시키고, pH 7.2의 0.01M 포스페이트-완충염수에 대해 투석시켰다. 그런다음, 투석물을 분당 15,000rev에서 원심분리하여 불용성의 잔류물질을 제거하고, 상등액을 0.22㎛의 여과기(Millipore, Bedford, MA)를 통해 여과시킴에 의하여 추가로 정제하였다. 최종적으로, 세파덱스 G-100(Pharmacia, Sweden)의 칼럼을 통해 스탠다드 겔 필터 크로마토그라피함으로써 CTB 및 LTB를 정제하였다.
인간의 감마-글로블린(HGG)의 정제:
(NH4)2SO4(최종농도는 40% vol:vol) 용액을 사용하여 연속적 침전을 시킴에 의하여 인간의 혈청의 울혈로부터 HGG를 정제한 다음, 미리 포스페이트-완충염수(0.2M 인산나트륨, NaCl 0.1M, pH 8.5)로 평형화시킨 세파크릴 S-300 HR(Pharmacia, Sweden)의 컬럼상에서 겔 여과 크로마토그라피시켰다. 이 결과 얻어진 HGG 프레파라트를 15mg/ml로 희석시켰다.
CTB-정합 면양 적혈구(SRBC-CTB)의 제조방법:
면양 적혈구(CTB)를 사용할 때까지 4℃하의 알제비어스 용액내에서 저장하였고, SRBC는 분당 3000rev에서 10분동안 원심분리함에 의하여 포스페이트-완충염수(PBS)(0.01M 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.4)를 사용하여 3회 세척한 다음, PBS내에서 5×109SRBC/ml의 세포밀도로 재현탁시켰다. SRBC에 대한CTB의 결합을 용이하게 하기 위하여, 먼저 SRBC를 GM1 강글리오사이드에 결합시켰다. 300nmol/ml GM1 강글리오사이드(Sigma Chemical Co., St Louis, Mo)를 함유하는 PBS용액을 1:2(vol:vol)의 비로 압축 SRBC에 첨가되었고, 37℃의 진탕 워터 배스내에서 2시간동안 항온배양되었다. PBS로 3회 세척하여 과도한 GM1을 제거하고, GM1-코팅된 적혈구를 PBS내에서 5×109SRBC/ml의 밀도로 재현탁시킨 다음, 재조합 CTB(Sanchez J. and Holmgren J. 1989. 백신 발전을 위한 기초로서 비브리오 콜레라에 있어서 콜레라 독소 B 서브유니트의 과-발현을 위한 재조합 시스템. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:481-485)(최종농도는 50㎛/ml)와 혼합시켰다. GM1-코팅된 적혈구에 대해 CTB이 결합되도록 37℃의 진탕 워터 배스내에서 2시간동안 항온배양시킨후, 적혈구 현탁물을 PBS로 2회 세척하여 비세포 바운드 CTB를 제거하고, PBS의 1×1010/ml의 세포밀도에서 재현탁시켰다. CTB분자가 GM1-결합된 SRBC에 결합되고 여전히 추가의 GM1분자에 결합되어있는 것을 확인하기 위하여, 플라스틱 웰상에 고정시킨 GM1을 사용하여 고체상 적혈구흡착 분석시험을 수행하였다. 적혈구 현탁물의 한 등분을 0.1%(중량/부피) 보빈 혈청 알부민(BSA)(Sigma)으로 보충된 PBS내에서 1%(압축 vol/vol)의 최종농도로 희석시키고, 플라스틱 마이크로티터 플레이트(Costar)의 GM1-코팅된 U-형 웰에 첨가한 다음, 상기 웰을 적혈구흡착의 외관에 대하여 시험하였다. 분석시험의 한정성은 GM1으로 코팅되지 않은 대조용 웰에서의 적혈구흡착의 부재 및 투여 의존 방법 적혈구흡착현상을 방지하는 적혈구와 함께 항온배양하는 동안 GM1-코팅된 웰에 대한 세포가 없는 CTB의 첨가에 의하여설정되었다.
LTB-접합 면양 적혈구(SRBC-LTB)의 제조방법:
CTB에 SRBC를 결합시키기 위하여 상술된 바와 같이 재조합 LTB(50㎍/ml)에 GM1-코팅된 SRBC(5×109GM1-SRBC/ml)을 접합시켰다.
CTB-접합된 인간의 감마-글로블린(HGG-CTB)의 제조방법:
N-숙신이미딜 (3-(2-피리딜-디티오) 프로피오네이트(SPDP)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 CTB 및 HGG를 각각 1:5 및 1:10의 비율로 각각 결합시켰다(Carlsson, J., H. Drewin, and R. Axen. 1978. 단백질 티올화반응 및 가역 단백질-단백질 콘쥬게이트 반응. N-숙신이미딜 3-(2-피리딜-디티오) 프로피오네이트: 새로운 헤테로바이펀셔날 리에이전트. Biochem. J. 173: 723-737.1). SPDP를 HGG에 첨가하고, 이 혼합물을 23℃에서 30분동안 교반과 함께 항온배양하였다. 아세테이트 완충액(0.1M 아세트산 나트륨, 0.1M NaCl, pH 4.5)으로 평형화시킨 세파덱스 G-25(Pharmacia, Sweden)의 컬럼상에서 겔 여과시킴에 의하여 과도한 SPDP를 제거하였다. SPDP-유도된 HGG를 23℃에서 20분동안 디티오쓰레이톨(DTT)(최종농도는 50mM)를 사용하여 환원시키고, 이 결과 얻어진 프레파라트롤 포스페이트-완충염수(0.2M 인산나트륨, NaCl 0.1M, pH 8.5)로 평형화된 세파덱스 G-25의 칼럼을 통과시켜 과도한 DTT 및 SPDP-유도된 HGG의 환원중에 방출된 피리딘-2-티온을 제거하였다.
CTB를 포스페이트-완충염수(0.2M 인산나트륨, NaCl 0.1M, pH 8.5)에서2mg/ml로 희석시키고 HGG에 대해 상술된 바와 같은 SDPD를 사용하여, 그러나 5:1(SPDP:CTB)의 비율로 유도체화시켰다. 이 결과로 얻어진, SPDP-유도된 HGG를 동일 완충액에서 평형화시킨 세파덱스 G-25의 칼럼을 통과시켜 반응하지 않고 남은 과도한 SPDP를 제거하였다.
SPDP-유도된 HGG 및 CTB를 동일 몰량의 비로 혼합하고 23℃에서 16시간동안 항온배양시켰다. 이 결과로 얻어진 CTB-HGG 콘쥬게이트를 세파크릴 S-300의 칼럼에 통과시켜 겔 여과시킴에 의하여 정제하여 자유 CTB 및/또는 HGG를 제거하였다. 이 결과로 얻어진 콘쥬게이트는 GM1강글리오사이드 결합력을 함유하며, 고체상 캡쳐 시스템으로서 GM1(Sigma, St Louis, MO)을 사용한 ELISA 및 검출제(이하에 열거)로서 CTB 및 HGG에 대한 단클론성 및 다클론성 항체에 의해 CTB 및 HGG 혈청학적 반응성 모두를 보유(Svennerholm, A.-M., and J. Holmgren. 1978. 강글리오사이드 면역흡착제 효력검정(GM1-ELISA)에 의한 대장균 열-불안정성 장독소의 동정. Curr. Microbiol. 1: 19-23) 하는 것으로 확인되었다. 콘쥬게이트 및 정제된 CTB- 및 HGG-SPDP 유도체의 2배 희석액 1회분을 GM1강글리오사이드로 미리 코팅시킨 폴리스티렌 웰 및 HGG에 대한 토끼의 다클론성 IgG 항체로 코팅시킨 웰에서 항온배양시킨 다음, 양고추냉이의 페록시다제(HRP)와 콘쥬게이트된 토끼의 ant-HGG 또는 쥐의 단클론성 anti-CTB 항체를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS에서 적당히 희석시키고, 효소기질을 연속적으로 적용시켜 HGG 및 CTB가 결합된 고체상을 검출하였다. SPDP 유도체화된 항원의 공지된 량을 사용하여 눈금이 그어진 표준곡선을 참고로 하여 자유 및 결합된 HGG 및 CTB의 량을 측정하였다. 평균적으로, 상술된 SPDP 콘쥬게이션 절차 및 정제화 프로토콜은 자유 HGG의 하찮은 량과 10%이하의 자유 CTB를 함유하는 프레파라트를 산출한다.
면역법 프로토콜:
SRBC을 사용한 면역법:
1차 전신적인 면역법: 107SRBC를 함유하는 피로겐이 들어있지 않는 염수 40㎕를 쥐의 왼쪽 뒷발바닥에 주사하였다.
2차 전신적인 면역법: 1차 면역을 실시한 5일후에, 108SRBC를 함유하는, 피로겐이 들어있지 않는 염수 40㎕를 왼쪽 뒷발바닥에 주사함에 의하여 쥐를 시험하였다.
HGG를 사용한 면역법:
면역하기 전에, 63℃에서 30분동안 가열시킴에 의해 HGG를 응집시켰다. 1차 전신성 면역법: 프로인트스 컴플리트 아쥬반테(Difco, St Louis, MO)내에서 에멸젼화시킨 응집 HGG(500㎍) 0.1ml을 쥐에게 순응시키고, 쥐의 측복부에 피하주사함에 의하여 투여시켰다.
2차 전시적인 면역법: 1차 면역 5일후에, HGG 1mg을 함유하는, 피로겐이 들어있지 않는 염수 40㎕를 왼쪽 뒷발바닥에 주사함에 의하여 쥐를 시험하였다.
경구 내성 유발 프로토콜:
SRBC를 사용한 1차 전신성 면역을 실시하기 전 또는 그후 여러번, SRBC 또는SRBC-CTB를 1회 복용 또는 매일 연속적인 복용으로 쥐에게 투여시켰다. 각 복용물은 2.5×109SRBC 또는 0.5ml의 PBS중의 SRBC-CTB로 이루어졌으며, 베이비 카테터 급식관을 사용한 위장내 경로에 의하여 투여되었다. 대조용 동물에게는 0.5ml의 PBS만이 복용되었다.
HGG에 대한 내성을 유발하기 위하여, HGG를 사용하는 1차 전신성 면역을 실시하기 1주일전에, 언컨쥬게이티드 HGG 또는 CTB-콘쥬게이티드 HGG의 단일 경구 복용량을 위장내 튜브에 의해 쥐에게 투여시켰다. 언컨쥬게이티드 HGG 1mg과 5mg 및 CTB-콘쥬게이티드 HGG 60㎍의 복용량을 시험하였다.
지효-형(delayed-type) 과민증(DTH) 반응의 측정:
SRBC에 대한 DTH:
SRBC를 사용하여 2차 전신성 면역을 실시하기 전 즉시 그리고 실시 2, 4, 24, 및 48시간 후에 다이얼 게이지 칼리퍼(Oditest, H. C. Koplin, Schluchtern, Essen, Germany)를 사용하여 오른쪽 발바닥의 두께를 측정하였다. 시험후 여러시간 얻어진 것들로부터 시험하기 전에 얻어진 값을 서브스트랙트(substract)함에 의하여 각 개개의 동물들에 대한 DTH 반응의 강도를 측정하였다.
HGG에 대한 DTH:
오른쪽 발바닥에 주입된 HGG에 대한 DTH 반응의 강도를 SRBC에 대해 상술된 바와 같이 측정하였다.
혈청 항체반응의 측정:
혈청 anti-SRBC 항체반응:
SRBC를 사용하여 왼쪽 발바닥에 투여된 1차 전신성 면역을 하기 전 즉시, 그리고 2차 전신성 면역 2주후, 혈액의 샘플을 개개의 쥐 꼬리 정맥으로부터 채집하고, 60분동안 실온에서 클로트시켰다. 혈청을 56℃에서 45분동안 가열시켜 불활성화 보체로 만든다음, 직접적 및 비직접적 적혈구응집반응 효력검정법에 의하여 SRBC에 대한 항체 수준을 분석시험하였다. 직접적인 적혈구응집반응을 위하여, 0.1%(중량/부피)의 보빈 혈청 알부민(PBS-BSA)으로 보충된 PBS중의 혈청 샘플의 2배 희석액 1회분을 마이크로티터플레이트의 U-바닥 웰에서 제조하였다. PBS-BSA중의 0.5%(압축된 vol:vol) SRBC의 현탁물 15 마이크로미터를 모든 웰에 가하고, 이 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온배양하고 이어 4℃에서 하룻밤 동안 항온배양시켰다. 그런다음, 웰들을 적혈구응집반응에 대하여 실험하였다.
SRBC에 결합된 비-적혈구응집 항체를 감지하기 위하여, 쥐의 IgG 및 쥐의 IgA(최종 희석 1:50)에 대한 열-비활성된(45분동안 56℃) 토끼의 항혈청의 혼합물을 함유한 PBS 25㎕를 직접적인 적혈구응집반응 효력검정에서 음성인 혈청 희석액에 대응하는 웰에 첨가하였다. 그런다음, 이 플레이트를 진탕시켜 SRBC를 재현탁시키고 4℃에서 2시간동안 평온하게 항온배양시켰다. 그런다음, 웰을 적혈구응집반응에 대하여 실험하였다. 항-마우스 항혈청(비직접적인 적혈구응집반응 효력 검정에서)의 첨가 즉시 또는 그후에 SRBC의 적혈구응집반응의 원인이 되는 임의의 소정 쥐 혈청의 최고 희석액의 레시프로콜을 측정하였으며, 상기 쥐 혈청의 anti-SRBC 항체 역가로서 정의하였다.
혈청- anti-HGG 항체반응:
HGG에 대한 혈청 IgM 및 IgG 항체 수준을 고체상 캡처 시스템으로서 HGG로 코팅된 폴리스티렌 마이크로 웰 및 검출제로서 쥐의 IgG 및 쥐의 IgM(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)에 대한 HRP-콘쥬게이티드 친화성 정제된 염소 항체를 사용하여 표준 고체상 ELISA를 측정하였다. 쥐 혈청의 5배 희석용액 1회분을 0.05% 트윈 20이 함유된 PBS내에서 제조하고, 23℃의 HGG-코팅된 웰내에서 2시간동안 항온배양하였다. 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS를 사용하여 5회 세척한 후에, 쥐의 IgM 또는 IgG에 대해 적당히 희석된 HRP-항체를 첨가하였다. 2시간 후에, 이 프레이트를 PBS로 헹구어내고, pH 가 5.0이고 H2O2를 함유하는 시트레이트-포스페이트 완충액에 용해된 ABTS 태블렛(Southern Biotechnology Associates)으로 이루어진 크로모겐 기질을 첨가함에 의하여 효소활성이 결합된 고체상이 들추어졌다. 자동화된 스펙트로포토메터(Titerscan, Flow Laboratories)를 사용하여 30분뒤에 흡수치를 모니터하였다. 쥐 혈청의 anti-HGG 항체 역가는 혈청 대신에 완충액에만 노출된 대조용 웰의 것에 비해 적어도 2배의 흡수치를 부여하는 최고의 희석액의 레시프로콜로서 정의되었다.
시험관내 림프구 중식 효력 검정:
2차 전신성 면역을 실시한 1 - 2주후에 얻어진 림프절을 이스코브스 매개물(Gibco Europe, U. K.)내에서 잘게 다진다음, 나일론-망 스크린을 통하여 압착시켜 단일 세포 현탁물을 산출하였다. 이 세포들을 2회 세척하고, 5% 열-비활성태아의 소 혈청(FBS), L-글루타민(1%), 프루브산 나트륨(1%), 불필수 아미노산(1%), 2-머캅토에탄올(5×105M) 및 겐타마이신(20㎍/ml)으로 보충된 이스코브스 매개물내에서 2×106M로 재현탁시켰다. 사전에 적정시킨 SRBC의 량을 함유하는 편평한 바닥의 마이크로티터(Nunc, Denmark) 웰에 림프절 세포를 첨가하여 총 200ml의 부피로 만들었다. 그런다음, 이 플레이트를 5%의 CO2가 들어있는 공기중에서 3일동안 37℃에서 항온배양시켰다. 이 배양물을3H-티미딘(2.0mCi/mM, Amersham, Stockholm)을 사용하여 최후 16시간동안 펄스시키고, 개개의 웰을 자동화된 세포-수확기(Inotech, Basel, Switzerland)를 사용하여 수확한다음, 아르곤-활성 신틸레이션 카운터(Inotech)를 사용하여 방사선동위원소-뉴클레오티드 혼합을 측정하였다.
3H-티미딘 혼합의 수준을, 림프절 세포 + SRBC의 자극 인덱스(S. I.)/ 림프절 세포만의 CPM으로서 계산해내었다.
실시예 1
콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 지효-형 과민증(DTH)의 이른 반응 및 늦은 반응이 예방되었다:
SRBC를 사용한 1차 전신성 면역전, 쥐의 왼쪽 뒷발바닥에 SRBC-CTB, SRBC만, 또는 염수를 1-8주간 투여하였다. 상기 주입 5일후에, DTH 반응을 유도해 내도록 오른쪽 뒷발바닥을 시험하였다. SRBC만이 투입된 쥐에서 유도된 DTH 반응의 강도를염수만이 투입된 대조용 쥐에서 기록된 것과 비교하였다(표 2). 대조해 보면, 점막-결합분자 CTB에 콘쥬게이트된 SRBC가 투입된 쥐에서 기록된 DTH 반응은 기록된 모든 시간에서 상당히 감소되었다. 따라서, SRBC로 시험한 2시간후, 즉 대조용(염수만 투입된) 동물에서 볼 수 있는 DTH 반응의 이른 피크에 대응하는 시간에서, SRBC-CTB의 단일 복용량이 사전에 투입된 쥐에게서는 발바닥의 팽창이 없었다. 더구나, 24시간 사전-시험에서 피크가 나타난 쥐에서의 늦은 DTH 반응은 SRBC만이 투여된 동물들과 마찬가지로 대조용 동물들에게 투여된 염수에 비하여 상당히 감소되었다.
실험의 제 2세트에 있어서, SRBC-CTB 또는 SRBC를 단일복용 또는 매일 연속적인 복용량으로 쥐에게 투여하였다. 최후의 경구투여한 1주일후에, 상기에서와 같이 왼쪽 발바닥에 SRBC를 전신성 주입한다음 5일후에 오른쪽 발바닥에 주입함에 의하여 동물들을 초회항원자극을 받게하고 시험하였다. CTB에 콘쥬게이트된 SRBC를 단일 투여하여 달성되는 것과 비교할만한 수준으로 24시간 DTH 반응을 억제하기 위하여서는 3-4주동안 매일 SRBC를 경구투여해야 할 필요성이 있다는 사실을 알게되었다(표 3). 그러나, 4주동안 SRBC를 20회 만큼의 연속적으로 투여하면, 일찍이 DTH 반응이 발달되는 것에 대해 실패한, CTB에 콘쥬게이트된 SRBC의 단일 복용량이 투여된 동물들에게서 볼 수 있는 상황과는 대조적으로, DTH 반응의 이른 상(2-4시간)의 발달에 영향을 미치지 못한다는 사실을 지적하고자 한다.
실시예2
콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 DTH의 이른 반응 및 늦은 반응이 쥐에서 억제되었다:
CTB-콘쥬게이트된 항원의 점막 투여가 상기 항원에 대해 사전에 전신적으로 감작된 동물에게서 DTH 반응을 억제하는지 어쩐지를 측정하기 위하여, 쥐의 왼쪽 뒷발바닥에 먼저 SRBC를 주사하여 1차적인 전신성 면역의 상태를 유발시켰다. 4일후에, 이 동물들에게 CTB에 콘쥬게이트된 SRBC, SRBC만, 또는 염수의 단일 경구 복용량을 투여하였다. 후자의 투여 2일후에, 이 동물들의 오른쪽 발바닥에 SRBC를 2차 주사하여 DTH 반응을 유발시켰다. 상기 전신성 면역후에 후자의 DTH 반응을 여러번 모니터하였다. SRBC만이 투여된 쥐들에게서 염수만이 투여된 대조용 동물들에서 볼 수 있는 것들과 별차이 없는 DTH 반응이 발달되는 반면에, CTB에 콘쥬게이트된 SRBC가 투여된 쥐들에게서는 SRBC에 대한 이른 및 늦은 DRH 반응이 상당히 감소되었다. 그러므로, CTB에 콘쥬게이트된 SRBC의 경구투여가 SRBC에 대해 사전에 전신적으로 감작된(초기항원자극을 받은)동물들에게서조차 전신적으로 주입된 SRBC에 대한 이른 및 늦은 DTH 반응 모두의 억제를 유발할수 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 림프구 증식의 억제:
CTB-콘쥬게이트된 항원의 경구투여가 상기 항원에 대한 림프절 세포의 증식 반응을 감소시키는 결과를 초래하는지 어쩐지를 판단하기 위하여, 쥐에게 CTB-콘쥬게이트된 SRBC의 단일 복용량을 투여한 다음, SRBC(생체내 면역에 1차적인 전신성)를 왼쪽 발바닥에 주입하였다. 1주일후에, 시험관내에서 동종항원(SRBC)에 노출된다음 증식에 대한 림프절 세포의 능력을 시험하였다. 염수만이 투입된 대조용 동물들 및 SRBC만의 단일 복용량이 투입된 동물들과 비교하여볼 때, CTB에 콘쥬게이트된 SRBC가 투여된 동물들로부터의 림프절 세포는 SRBC로 배양된 경우 증식반응을 감소시켰다(표 4). 상기 감소는 마이토젠 콘카나발린 A에 대한 림프절 세포의 증식반응이 SRBC-CTB, SRBC 또는 염수만이 투여된 동물들에서와 비교될 수 있는 만큼 투여된 항원의 특이성이다(표 4).
실시예 4
콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 혈청 항체반응의 억제:
CTB-콘쥬게이트된 항원의 경구투여가 전신적으로 투여된 항원에 대한 항체 반응을 감소시키는 결과를 초래하는지 어쩐지를 판단하기 위하여, 쥐에게 SRBC-CTB, SRBC만, 또는 염수의 단일 복용량을 1-8주 투여한 다음, SRBC를 왼쪽 뒷발바닥에 주입하여 1차적인 전신성 면역을 시켰다. 상기 주입 5일후에, 오른쪽 발바닥을 시험하였으며, 1주일후 꼬리정맥으로부터 혈액을 채집하였다. SRBC에 대한 혈청 항체 수준을 직접적 및 비직접적 적혈구응집반응 효력검정에 의해 판단하였다. 표 5에서 알수있는 바와같이, SRBC에 대한 혈청 항체반응은 염수만이 투입된 동물들 및 SRBC만의 단일 복용량이 투입된 동물들에 비할 때 SRBC-CTB의 단일 복용량이 투입된 동물들에서 감소되었다. CTB에 콘쥬게이트된 SRBC를 단일 투여하여 성취되는 것과 비교할만한 수준으로 전신적으로 투여된 SRBC에 대한 혈청 항체반응을 억제하기 위하여서는 3주동안 매일 SRBC를 경구투여해야 할 필요성이 있다는 사실을 알게되었다(표 5).
실시예 5
대장균 열-불안정 장독소 B 서브유니트(LTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 DTH의 이른 반응 및 늦은 반응의 억제:
다른 점막-결합분자, 대장균 열-불안정 장독소 B 서브유니트(LTB)에 콘쥬게이트된 SRBC의 점막투여가 전신적으로 투여된 SRBC에 대한 DTH 반응을 또한 억제하는지 어쩐지를 판단하기 위하여, SRBC를 발바닥에 1차 주입하기 1주일전에 SRBC-CTB의 단일 복용량 또는 염수를 쥐에게 투여하였다. 비교 목적을 위하여, 추가의 군인 쥐들에게 SRBC-CTB를 주입하였다. 상기 1차 주입 5일후에, DTH 반응을 유도해 내도록 반대쪽 뒷발바닥에 SRBC를 사용하여 시험하였다. 24시간 사전-시험에서 SRBC-LTB가 투여된 쥐에서 기록된 DTH 반응은 염수가 투여된 대조용 동물들에 비해 상당히 감소되었다(표 6). 그러나, 이른(2-4시간) DTH 반응은 SRBC-LTB이 투입된 쥐에서 감소되지 않았다. 이는 2-4시간 사전-시험에서 없었던 SRBC-CTB가 투여된 쥐에서 기록된 DTH 반응과 대조적인 것으로, SRBC-CTB에서는 24-48시간에서 상당히 감소되었었다(표 6). 이러한 관찰은 LTB에 콘쥬게이트된 SRBC의 경구투여가 전신적으로 주입된 SRBC에 대한 늦은 DTH 반응의 억제를 유발하지만, 이러한 반응의 이른 성분에는 영향을 미치지 못한다는 사실을 제시해준다.
실시예 6
콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 컨쥬게이트된 HGG의 경구투여에 의한 인간의 감마-글로블린(HGG)에 대한 이른 및 늦은 지효-형 과민증(DTH) 반응의 억제:
CTB-콘쥬게이트된 항원의 점막투여가 가용성 단백질 항원에 대한 DTH 반응을 억제하는지 어쩐지를 판단하기 위하여, CTB에 콘쥬게이트된 HGG, HGG만, 또는 염수를 단일 복용량만큼 쥐에게 투여하였다. 이들은 피하에 주사된 프로인트스 컴플리트 아쥬반테중의 HGG를 사용하여 1차적인 전신성 면역을 시키기 1주일 전에 쥐들의 결리된 군에 주어졌다. 상기 주입 5일후에, DTH 반응을 유도해 내도록 오른쪽 뒷발바닥에 HGG를 사용하여 시험하였다. HGG 만을 1mg 투입한 쥐에서 유도된 DTH 반응의 강도를 시험후 측정된 모든 시간에서 염수만을 투입한 대조용 쥐에서 유도된 것과 비교할수 있었다(표 7). HGG 5mg을 투여한 쥐에서는 24-48시간에서 DTH 반응이 감소되는 결과를 초래하였지만, 이들 반응의 이른(2-4시간) 상의 강도에는 영향을 미치지 못하였다. 대조적으로, CTB에 콘쥬게이트된 HGG를 15㎍만큼 적게, 즉 300배 이상 더 적은 량의 HGG를 투입시킨 쥐에서 모니터된 DTH 반응은 유사한 효과를 가지며, 24시간에서 대조용(염수 투여) 동물에 있어서의 대응반응보다 상당히 더 낮았지만, 이른(2 및 4시간) 시간에서는 그렇지 못했다. 그러나, CTB에 콘쥬게이트된 HGG 66㎍을 투입한 쥐에서는 기록된 모든 시간에서 DTH 반응을 상당히 감소시키는 결과를 얻었다. 따라서, 이른(2-4시간) 및 늦은(24-48시간) DTH 반응은 CTB에 콘쥬게이트된 HGG 66㎍이 투입된 쥐에서 사실상 폐기되었다. 이러한 관찰은 점막-결합분자 CTB에 콘쥬게이트된 가용성 단백질 항원의 적은 량의 경구투여가 상기 단백질 항원을 사용한 연속적 전신성 주입에 대한 이른 및 늦은 DTH 반응 모두의 억제를 유발할수 있다는 사실을 증명해주었다.
실시예 7
CTB에 콘쥬게이트된 마이엘린 기본 단백질의 경구투여에 의한 실험적 자가면역 뇌염의 억제.
마이엘린 기본 단백질(MBP)의 정제:
Deibler 등에 의해 기술된 바와 같이, MBP는 기니아 피그의 척수 및 뇌로부터 얻었다(Deibler GE, Martenson RE, Kies MW. 1972. 여러 가지 포유동물종의 중앙 신경조직으로부터 마이엘린 기본 단백질을 대규모로 제조하는 방법. Prep. Biochem. 2: 139-165). 거의 20kD에서 단일 밴드를 나타내는 표준 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드에 의하여 MBP의 순도를 판단하였다. CTB에 HGG를 콘쥬게일시키는 방법에 대해 기술한 바와 유사한 조건하에서 SPDP절차에 의해 CTB에 MBP를 결합시켰다. 콘쥬게이트된 물질에 있어서 MBP의 존재는 FCA중의 MBP로 면역시킨 쥐로부터의 혈청을 사용하여 GM1-ELISA에 의하여 확인되었다. 콘쥬게이트내에서 MBP 및 CTB의 상대비는, 고체상 포착제로서 anti-MBP 및 GM1을 사용한 표준 고체상 샌드위치 ELISA(MBP를 위한) 및 GM1-ELISA(CTB를 위한)에 의해 평행하게 효력검정된 CTB 및 MBP의 정제된 프레파라트, 및 포착된 MBP 및 CTB 각각을 감지하기 위한 HRP-콘쥬게이트된 쥐의 anti-MBP 항혈청 및 쥐의 anti-CTB 단클론성 항체와 비교하여 판단되었다.
걸험적 자가면역 뇌염(EAE)의 유발:
EAE를 유발하기 위하여(Kies MW, Mwrphy JB, Alvord EC. 1960. 뇌염활성을 지닌 기니아 피그 단백질의 분획. Fed. Proc. 19:207), 태어난지 8-10주(몸무게는 170-240g)된 암컷 루이스 쥐(Zentrallnstitut fur Versuchstierzucht, Hannover,German)에게 프로인트스 컴플리트 아쥬반테(FCA)(Difco, Detroit, MI, USA)중에서 에멀젼화시킨 기니아 피그 MBP 총 100마이크로그램을 에테르 마취하에서 양쪽 발바닥에(즉, 발바닥에 약 50마이크로그램) 주사하였다. 상기 주입후에, 이 동물들에게 30일동안 매일 다음과 같이 수행하였다. 하루에 매일 두 번씩, 임상학적 증상의 외관에 대하여 검사하였으며, 이들의 몸무게를 측정하였다. 표준 임상학적 등급 시스템을 사용하여 질환 강도를 판단하였다(Miller A, Lider O, AlSabbagh A, Weiner HL. 1992. 마이렐린 기본 단백질의 경구투여에 의한 실험적 자가면역 뇌척수염의 억제. V. Hierarchy of suppression by myelin basic protein from different species. J. Neuroimmunol. 39:243-250):
등급 0 : 질환 없음
등급 1 : 흐느적거리는 꼬리
등급 2 : 온화하게 마비된 뒷다리
등급 3 : 탈구되고 극도로 마비된 뒷다리
등급 4 : 네 개의 발바닥 모두에 영향을 미치는 완전한 마비
등급 5 : 사망
경구 내성 프로톨콜:
MBP를 발바닥에 주사함에 의하여 EAE를 유발하기 전에, 격리된 동물들에게 다음과 같은 양생법을 부여하였다:
제 1군: MBP를 발바닥에 주사하기 -7일전(주사후에는 0일로서 언급됨)에 0.6M의 비카보네이트 완충액중의 MBP 20마이크로그램 및 CTB 100마이크로그램에 해당하는 MBP-CTB 0.1ml을 제공하였다;
제 2군: MBP를 발바닥에 주사하기 -11, -9, -7, -5, 및 -3일전에, MBP(Whitacre CC, Gienap IE, Orosz CG, Bitar D. 1991. 실험적 자가면역 뇌염에서의 경구내성. III. Evidence for clonal anergy. J. Immunol. 147: 2155-63)의 단백분해 감성을 최소화하기 위하여 MBP 5mg 및 대두유 트립신 억제자(STI) 10mg을 함유하는 0.6M 비카보네이트 완충액 0.5ml을 5회 연속 주입하였다;
제 3군 : 제 2군에 대해 한정된 시간표에 따라 5회 연속적으로 염수(대조용) 0.5ml을 주입하였다;
제 4군 : 제 2군에 대해 한정된 시간표에 따라 5회 연속적으로 대두유 트립신 억제자(STI) 만(대조용)을 10mg 주입하였다.
CTB에 콘쥬게이트된 MBP의 경구투여에 의한 EAE의 억제:
5마리의 성숙된 암컷 루이스 쥐로 구성된 군에게 그 뒷발바닥을 통하여 FCA에서 에멀젼화시킨 MBP 또는 FCA만을 주사하였다. MBP+FCA를 발바닥에 주사하기 11, 9, 7, 5, 및 3일전에 대두유 트립신 억제자(STI)(제 4군)를 미리 투입시킨 대조용 동물에 있어서, 주사 한 12-14일에 신경계 증상이 최대로 발발하였으며, 모든 동물들이 극도의 마비상태로 전개되었다(표 8). 단일 복용량으로 투여된 CTB에 콘쥬게이트된 MBP 20마이크로그램만큼이나 적은 량으로 투입된 동물(제 1군)들은 아무런 증상을 나타내지 않거나(4-5마리)또는 온화한 증상(다른 쥐에서 오른쪽 뒷다리 부전마비에 관련된 일시적인 꼬리 부전마비)을 전개하였다(표 8). 5회 연속적으로 STI와 함께 MBP의 5밀리그램을 투입시킨 동물들은, 즉 MBP 총 25mg 또는 제 1군의 동물들보다 1250배 더 많은 복용량이 투여된 동물들은 극도의 EAE 질환의 발달(제 2군)로부터 역시 보호되었다(표 8). 따라서, EAE질환(제 2군)의 경구투여(표 8). 따라서, CTB에 콘쥬게이트된 MBP의 소량의 경구투여는 EAE를 억제할 수 있다.
실시예 8
콜레라 독소 B 서브유니트(CTB)에 콘쥬게이트된 동종흉선세포의 경구투여에 의한 쥐의 동종이식 생존의 연장.
CTB를 사용한 쥐의 흉선세포의 콘쥬게이션:
쥐의 림프구에 대한 CTB의 결합을 향상시키기 위하여, C57BL/6 쥐(주요 조직적합성 컴플렉스(MHC) 헤플로타잎 H-2b)로부터의 흉선세포를 먼저 GM1 강글리오사이드로 유도체화하는데, 이스코브스 최소 필수 매개물(IMEM) 총 0.5ml 부피내에서 GM1 강글리오사이드 10나노몰과 함께 5×107흉선세포를 37℃에서 2시간동안 혼합함에 의하여 수행되었다. 그런다음, 피로겐이 들어있지 않은 무균 염수를 사용하여 세포를 3회 세척하여 결합되지 않은 GM1을 제거한 다음, CTB 25 마이크로그램과 함께 최종부피 0.5ml로 37℃에서 3시간동안 추가로 항온배양하였다. 최종적으로, 세포를 염수로 세척하여 결합되지 않은 과도한 CTB를 제거하고, 사용할때까지 얼음상에서 보관한다. 이들 GM1 및 CTB의 농도는, 다양한 량의 GM1으로 유도되고 테트라메틸 로드아민-라벨디드 CTB(List Biological Laboratories Inc., Campbell, CA, USA)의 다양한 농도에 노출된 쥐의 흉선세포의 유량 세포 계산분석법에 의하여 판단되는 바와같이 흉선세포의 최대 포화를 달성하는데 필요되었다.
이소의 쥐 심장이식:
제공자 심장은 뉴본(출생후 36시간 이내) C57BL/6 쥐로부터 수집되었고, 심실 격막을 따라 절개되었다. 심장의 각 반쪽은 6주에서 8주된 늙은 Balb/c 쥐(MHC 하포로타잎 H-2d)의 한쪽 귀 또는 양쪽 귀 모두의 배면부상의 피하낭에 삽입하였다. 비교 목적을 위하여, Balb/c 피이식자 쥐의 격리된 군에게 선천성 Balb/c 뉴본 쥐로부터의 심장을 수용시켰다. 텍트로닉스 심장경을 사용하여 이식 조직의 전기적 활성을 측정함에 의하여 이식 기능을 매일 평가하였다. 심근 수축의 완전한 정지가 일어나는 날로서 거부시간이 규정되었다.
경구내성 프로톨콜:
동종이식전 및/또는 여러시간후에, 성숙된 Balb/c 쥐의 피이식자들에게 베이비 카테터 투입관을 사용하여 피로겐이 들어있지 않은 다음과 같은 것을 함유하는 염수 0.5ml 부피를 투입하였다:
- 뉴본 C57BL/6 쥐로부터 비콘쥬게이트된 흉선세포가 이식 3일전 및 이식 1일 및 4일후 주어졌다;
- 뉴본 C57BL/6 쥐로부터 비콘쥬게이트된 흉선세포가 이식 7, 4, 및 1일전 주어졌다;
- 뉴본 C57BL/6 쥐로부터 CTB-콘쥬게이트된 흉선세포가 이식 7, 4, 및 1일전 주어졌다:
- 뉴본 C57BL/6 쥐로부터 CTB-콘쥬게이트된 흉선세포가 이식전 즉시(30-60분)주어졌다;
- 또는 오직 염수만
콜레라 독소 B 서브유니트(CTB)에 콘쥬게이트된 동종 흉선세포의 경구투여에 의한 쥐의 이소 심장 동종이식의 생존의 연장:
H-2 유전자좌에서 조직부적합한 뉴본 C57BL/6 제공자 쥐로부터 이소의 심장 이식을 수용받은 Balb/c 쥐들은 평균 8일에 그 이식을 거부하였다(표 9). 대조적으로, H-2 조직부적합한 심장이식을 수용한 쥐들은 2달 이상 기능적 이식조직을 유지하였다. 심장 동종이식을 실시하기전(-7, -4, 및 -1일전) 및/또는 실시한후(-3, +1, 및 +4일) 제공자 쥐와 동일한 종의 뉴본 H-2 조직부적합한 쥐로부터 흉선세포의 경구투여는 연장되지 않으며, 어떤 예에 있어서 피이식자로서 Balb/c 쥐에서의 이식 생존이 감소되었다(표 9). 대조적으로, 동종이식전(-7, -4 및 -1일) CTB에 콘쥬게이트된 흉선세포를 3회 경구투여시키면 심장이식의 생존을 실질적으로 증가(평균 56%)시켰다(표 9). 더구나, 동종 심장이식의 피이식자 쥐에 있어서 이식이 이식 생존을 연장(평균 39%)시키기 전에 CTB-콘쥬게이트된 C57BL/6 흉선 세포의 단일 경구 복용을 잠시 부여하였다(표 9). 이들 실험의 결과들은 CTB와 콘쥬게이트된 조직부적합한 림프구의 경구투여는 동종이식의 생존을 연장시킨다는 사실을 증명한다.
표 2. 콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의경구투여에 의한 지효-형 과민증(DTH)의 이른 반응 및 늦은 반응의 방지
* 는 시험군(군당 6마리의 동물들) 및 염수만이 투여된 동물들(7마리의 쥐)로 구성된 대조용 군에서 측정된 값들 간에 상당한 차이가 있음을 나타낸다: *, p < 0.05 및 ** p < 0.01 (Student't test)
표 3. 면역 쥐에 있어서 콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 이른 및 늦은 DTH 반응의 억제
* 는 시험군(군당 6마리의 동물들) 및 SRBC로 감작되었지만 시험전에 염수만이 투여된 동물들(7마리의 쥐)로 구성된 대조용 군에서 측정된 값들 간에 상당한 차이가 있음을 나타낸다:
*, p < 0.05 및 ** p < 0.01 (Student't test)
표 4. 콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 림프구 증식의 억제
*는 SRBC-CTB가 투입된 시험용 동물들 및 SRBC만이 투입되거나 염수만이 투입된 동물들 간에 상당한 차이(p < 0.01 (Student't test))가 있음을 나타낸다.
표 5. 콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 SRBC의 경구투여후 SRBC에대한 혈청 항체반응의 억제
* 는 SRBC-CTB가 투입된 시험용 동물들(n=6마리의 쥐) 및 SRBC만이 투입(n=6마리의 쥐)되거나 염수만이 투입(n=5마리의 쥐)된 동물들 간에 상당한 차이(p < 0.001 (Student't test))가 있음을 나타낸다.
표 6. 대장균 열-불안정 장독소 B 서브유니트(LTB)에 결합된 면양 적혈구 세포(SRBC)의 경구투여에 의한 늦은 지효-형 과민증 반응의 억제
* 는 시험군(군당 7마리의 쥐) 및 염수만이 투여된 대조용 동물들(n=6마리의 쥐)간에 상당한 차이가 있음을 나타낸다: *, p < 0.05 및 ** p < 0.01 (Student't test).
표 7. 콜레라 독소의 B 서브유니트(CTB)에 결합된 인간의감마-글로블린(HGG)의 경구투여에 의한 이른 및 늦은 지효-형 과민증 반응의 억제
∮ 표는 프런드 컴플리트 아쥬반테에 있어서 열-응집된 HGG 0.5mg을 피하주사하여 감작시켰다.
표는 염수내에서 HGG 1mg을 오른쪽 발바닥에 주사함에 의하여 시험되었다.
* 는 시험군( 1-IV 군, 군당 6마리의 쥐) 및 염수만이 투여된 대조용 동물들(V군, n=6마리의 쥐) 간에 상당한 차이가 있음을 나타낸다: *, p < 0.05 및 ** p < 0.01 (Student't test).
표 8. 루이스 쥐에 있어서 CTB에 콘쥬게이트된 마이엘린 기본 단백질의 경구투여에 의한 실험적 자가면역 뇌염(EAE)의 억제
a) 임상학적 등급 ≥ 2
표 9. 콜레라 독소 B 서브유니트(CTB)에 콘쥬게이트된 동종흉선세포의 경구투여에 의한 쥐의 이소의 심장 동종이식 생존의 연장.
a 숙성된 Balb/c 피이식자 쥐에게 5×107뉴본 흉선세포만을 또는 CTB(쥐당 25 마이크로그램)에 콘쥬게이트된 5×107뉴본 흉선세포를 지시된 날에 투입시키고 0 날에 심장이식을 수용시켰다.
b 이식 생존에 있어서 상대 증가는 다음과 같이 계산되었다:
[(흉선세포가 투입된 쥐의 평균 거부시간 - 염수가 투입된 대조용 쥐의 거부시간 ) / 염수가 투입된 대조용 쥐의 평균 거부 시간 ] × 100
상기 실시예로부터 분명히 알 수 있는 바와같이, 본 발명의 면역내성-유발제는 전신성 면역반응의 유발을 억제하고 발현을 방지하는데 효과적이다. 또한, 항원/면역관용원의 절대량 및/또는 경구적으로 유발된 내성의 프로토콜을 보고함에 의하여 요구되는 복용의 횟수가 최소화된다. 상기 실시예로부터 언급된 바와같이, 본 발명의 면역내성-유발제는 지효-형 과민증 반응의 이른 및 늦은 상, 자가면역질환(실시예 8) 및 동종이식의 거부(실시예 9)와 관련된 염증성 면역반응의 발달을 방지 또는 지연시키는데 사용될 수 있다.
Claims (30)
- 대장균(Escherichia coli)의 콜레라 독소 및 열불안정성 장독소의 B-서브유니트(B subunit)로부터 선택되고 특정 항원/관용원에 결합된 점막 결합 분자를 포함하는 작용물질(agent)을, 상기 특정 항원/항체에 대한 면역 내성을 유발하기 위한 점막용 약제(mucosal medicament)의 제조를 위해 사용하는 면역 내성 유발방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 특정 관용원은 개체내에서 불필요한 면역 반응을 일으키는 특정 항원으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 불필요한 면역 반응은 전신성 항체 생성과 관련이 있는 것인 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 불필요한 면역 반응은 지연형 과민성 반응과 관련이 있는 것인 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 불필요한 면역 반응은 자가면역 질환, 알레르기 질환, 조직 또는 세포 이식편 거부 반응, 및/또는 급성 또는 만성 염증 반응 또는 질환과 관련이 있는 것인 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 항원은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 및 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 자가면역 당뇨병인 것인 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 자가면역 뇌염인 것인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 항원/관용원 및 상기 점막 결합 분자는 서로 직접 또는 간접적으로 결합되는 것인 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 항원/관용원 및 상기 점막 결합 분자는 스페이서 분자(spacer molecule), 상기 관용원/항원을 함유하는 보호 운반체(protective vehicle), 및 융합 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 유도되는 상기 스페이서 분자와 상기 관용원/항원의 혼성 분자로 구성된 군에서 선택된 요소(member)의 도움으로 서로 간접적으로 결합되어 있는 것인 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 상기 항원/관용원 또는 항원/관용원 함유 운반체와 상기 점막 결합 분자중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 대한 결합 친화성을 갖는 분자로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 항체인 것인 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 GM1 강글리오시드, 갈락토실-N-아세틸갈락토스아민일-(시알릴)-갈락토실글루코실세라미드의 콜레라-독소 결합 구조이거나 또는 상기 콜레라-독소 결합 구조로부터 유도되는 것인 방법.
- 대장균의 콜레라 독소 및 열불안정성 장독소의 B-서브유니트로부터 선택되고 특정 자가항원/관용원에 결합된 점막-결합 분자를 포함하는 면역 내성 유발제.
- 제 14항에 있어서, 상기 특정 자가항원/관용원은 개체내에서 불필요한 면역 반응을 일으키는 특정 항원으로부터 선택되는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 15항에 있어서, 상기 불필요한 면역 반응은 전신성 항체 생성과 관련이 있는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 15항에 있어서, 상기 불필요한 면역 반응은 지연형 과민성 반응과 관련이 있는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 15항에 있어서, 상기 불필요한 면역 반응은 자가면역 질환, 알레르기 질환, 조직 또는 세포 이식편 거부 반응, 및/또는 급성 또는 만성 염증 반응 또는 질환과 관련이 있는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 14항에 있어서, 상기 자가 항원/관용원은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 및 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 18항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 자가면역 당뇨병인 것인 면역 내성 유발제.
- 제 18항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 자가면역 뇌염인 것인 면역 내성 유발제.
- 제 14 항에 있어서, 상기 자가 항원/관용원 및 상기 점막 결합 분자는 서로 직접 또는 간접적으로 결합되는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 22항에 있어서, 상기 자가 항원/관용원 및 상기 점막 결합 분자는 스페이서 분자, 상기 관용원/항원을 함유하는 보호 운반체, 및 융합 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 유도되는 상기 스페이서 분자와 상기 관용원/항원의 혼성 분자로 구성된 군에서 선택된 요소의 도움으로 서로 간접적으로 결합되어 있는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 22항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 상기 항원/관용원 또는 자가 항원/관용원 함유 운반체와 상기 점막 결합 분자중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 대한 결합 친화성을 갖는 분자로부터 선택되는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 22항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 항체인 면역 내성 유발제.
- 제 22항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 GM1 강글리오시드, 갈락토실-N-아세틸갈락토스아민일-(시알릴)-갈락토실글루코실세라미드의 콜레라-독소 결합 구조이거나 또는 상기 콜레라-독소 결합 구조로부터 유도되는 것인 면역 내성 유발제.
- 제 6항에 있어서 상기 항원은 인슐린 또는 인슐린의 단편인 것인 방법.
- 제 6항에 있어서 상기 항원은 마이엘린계 단백질 또는 마이엘린계 단백질의 단편인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 항원은 인슐린 또는 인슐린의 단편인 것인 면역 내성 유발제.
- 제19항에 있어서, 상기 항원은 마이엘린계 단백질 또는 마이엘린계 단백질의 단편인 것인 면역 내성 유발제.
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