KR100387302B1 - 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 효소 - Google Patents

Abstract

SDS-DAGE에서의 분자량 약 57000∼67000 달톤 및 등전점 전기영동법에서의 등전점(pI) 약 4.1∼5.1이고, 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 재조합형 효소를 제공한다.

효소반응 조건에 따라 이 효소는 말토오스에 작용시킬 경우 약 70w/w%의 트레할로오스를 생성하는 반면 트레할로오스에 작용시킬 경우 약 20w/w%의 말토오스를 생성한다. 상기 효소에 대해 코우드하는 DNA와 자체 복제가능한 벡터를 함유한 재조합형 효소를 숙주에 도입하여 제조된 형질전환체에 의해 트레할로오스의 대규모 제조가 용이하게 된다.

Description

말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 효소

본 발명은 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 신규한 재조합형 효소, 이 재조합형 효소를 코우드 하는 DNA, 복제 가능한 재조합 DNA, 형질전환체, 이 재조합형 효소의 제조방법 및 말토오스의 효소적 변환방법에 관한 것이다.

트레할로오스는 글루코오스 2 분자가 이들의 환원성 그룹으로 연결된 이당류인데 박테리아, 진균류, 조류(藻類), 곤충류 등에 극히 소량으로 존재하고 있다. 트레할로오스는 분자내에 환원성 잔기가 전혀 없으므로 아미노산 등의 존재하에 가열하더라도 불필요한 갈변 반응을 일으키지 않기 때문에 불필요한 착색이나 열화(劣化)를 일으킬 우려가 없이 유리하게 식품의 감미부여가 가능하다. 그러나 트레할로오스는 종래의 방법으로서는 필요한 양으로 쉽사리 제조및 수 없으며 실제로 식품의 감미부여에 사용되는 일이 드물다.

종래의 방법은 대개 두가지로 나누어 지는데, 즉 그 한가지는 미생물의 세포를 사용하는 방법이고 다른 한가지는 당류에 효소를 작용시키는 다중 효소계를 이용하는 방법이다. 전자의 방법은 일본국 특허공개 제 154,485/75호에 개시되어 있는 바와 같이 박테리아, 효모등의 미생물을 영양배지중에서 생장시켜 수득한 배양액으로부터 트레할로오스를 채취하는 방법이다. 후자의 방법을 일본국 특허 공개 제216.695/83호에 개시되어 있는 바와 같이 기질인 말토오스를 준비하고, 말토오스 -포스포필라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 다중 효소계를 말토오스에 작용시켜 생성된 트레할로오스를 반응계로부터 회수하는 방법이다. 전자의 방법에서는 비교적 용이하게 미생물을 생장시킬 수 있겠으나 배양물을 건조 고형분 기준(d.s.b.)으로 트레할로오스를 많아야 15w/w% 정도 함유하고 있다는 문제가 있었다. 후자의 방법에서는 트레할로오스를 비교적 용이하게 분리할수는 있지만 효소반응 그 자체가 두가지의 상이한 효소의 평형 반응이고 평형점이 항시 글루코오스 포스페이트 생성쪽으로 기울어지기 때문에 효소를 기질에 대해 상당히 높은 농도로 작용시켜 트레할로오스 수율을 증가 시킨다는 것은 이론적으로 어렵다.

이러한 사정을 고려하여 본 발명자들은 말토오스를 직접 트레할로오스로 변환하는 효소에 대해 예의 검색한 결과, 일본국 특허출원 제 199,971/88호 명세서에 개시된 바와 같이 피멜로박터 sp. R48을 비롯한 여러가지 미생물이 말토오스에 작용하여 트레할로오스를 생성하는 아주 신규한 효소를 생산한다는 것을 발견하였다. 이것은 대량으로 저렴하게 입수할 수 있는 말토오스를 원료로 하여 트레할로오스를 제조할 수 있다는 것을 의미하며, 이러한 효소를 이용함으로써 트레할로오스와 관련된 상기 목적을 완전히 해결할 수 있다. 그러나 이들 미생물은 효소의 생산성아 불충분하므로 트레할로오스를 공업적 규모로 생산하기 위해서는 비교적 대규모의 미생물 배양을 해야만 한다.

재조합 DNA 기법은 근년에 와서 현저한 발전을 하고 있다. 현재 이 효소를 코우드하는 유전자를 일단 분리하여 그 염기 배열을 해명할 수 있다면 이 효소를 코우드하는 DNA를 가진 재조합 DNA를 제조하여 이것을 미생물 또는 식물과 동물의 세포속에 도입한 다음 생성된 형질전환체를 배양함으로써 전(全) 아미노산 배열이 밝혀지지 아니한 효소까지도 필요한 양으로 쉽사리 제조할 수 있다. 이러한 사정하에 시급히 요망되고 있는 것은 말토오스로부터 트레할로오스를 생성하는 효소를 코우드하는 유전자를 발견하여 그 염기 배열을 밝혀내는 것이다.

본 발명의 한가지 목적은 말토오스에 작용하여 트레할로오스를 생성하는 재조합형 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합형 효소를 코우드하는 DNA를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 DNA를 함유한 복제가능한 재조합 DNA를 제공함에있다.

본 발명의 추가적인 목적은 이러한 재조합 DNA를 도입한 형질전환체를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 추가적인 목적은 이러한 형질전환체를 사용한 재조합형 효소의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합형 효소에 의하여 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제1목적은 아래의 물리화학적 성질을 가진 재조합형 효소에 의하여 달성된다.

(1) 작용

말토오스에 작용하면 트레할로오스를 생성함.

트레할로오스에 작용하면 말토오스를 생성함.

(2) 분자량

소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 측정할 경우 분자량 약 57,000∼67,000 달톤.

(3)등전점 (pI)

등전점 전기영동법으로 측정할 경우 약 4.1∼5.1.

본 발명의 제2목적은 이러한 재합형 효소를 코우드하는 DNA에 의하여 달성된다.

본 발명의 제3목적은 DNA와 자체 복제가능한 벡터를 함유해서 되는 복제 가능한 재조합 DNA에 의하여 달성된다.

본 발명의 제4목적은 복제가능한 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 얻는 형질전환체에 의하여 달성된다.

본 발명의 제5목적은 형질전환체를 영양배지에서 배양하여 재조합형 효소를 생성시키고, 수득한 배양물로부터 재조합형 효소를 채취하는 재조합형 효소의 제조방법에 의해 달성된다.

본 발명의 제6목적은 말토오스에 재조합형 효소를 작용시켜 트레할로오스를 생성시키는 공정단계를 포함하는 말토오스의 효소적 변환방법에 의해 달성된다.

본 발명에 의한 재조합형 효소는 말토오스에 작용하면 트레할로오스를 생성한다.

본 발명의 DNA는 자체 복제가능한 벡터에 DNA를 삽입하여 복제가 가능한 재조합 DNA를 생성시킨 다음, 수득한 재조합 DNA를, 본래 재조합형 효소를 생성할수는 없지만 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주속에 도입하여 형질 전환체를 생성함으로써 본 발명의 재조합형 효소의 생산을 발현한다.

본 발명의 재조합 DNA는 본래 본 발명의 재조합형 효소를 생산하지 않지만 비교적 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주에 DNA를 도입하여 형질전환체를 생성시키고, 이 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 본 발명의 재조합형 효소의 생산을 발현한다.

본 발명에 의한 형질전환체는 배양시 재조합형 효소를 생산한다.

본 발명에 의한 재조합형 효소는 본 발명의 제조방법에 의하여 비교적 용이하게 필요한 양을 제조할 수 있다.

본 발명의 효소적 변환밥법에 의하여 말토오스를 비교적 용이하게 트레할로오스로 변환할 수 있다.

아래에 피멜로박터 sp. R48이 생산하는 효소의 물리화학적 성질을 해명하기 위해 실시한 실험에 대해 설명한다.

실험 1 : 효소의 정제

실험 1-1 : 효소의 제조

500ml 삼각 플라스크에 2.0w/v% 글루코오스, 0.5w/v% 폴리펩톤, 0.1w/v% 효모 추출물, 0. 1w/v% 인산수소 2 나트륨, 0.06w/v% 인산 2수소 칼륨, 0.05w/v%황산 마그네슘 7 수화물, 0.5w/v% 탄산 칼슘 및 물을 함유한 액체배지(pH 7.2) 100ml 씩을 각각 넣고 이들 플라스크를 115℃에서 30분간 오토클레이브 처리하여 멸균시켰다. 플라스크를 냉각하고 피멜로박터 sp.R48의 종배양액을 각 플라스크내의 액체 배지에 식균한 다음 200rpm의 회전 진탕조건하에 27℃에서 24시간 배양하였다. 이어서 신선한 동일한 액체 배지 201씩을 301 자아 퍼멘터(jar fermenter)에 넣고 멸균시킨 다음 위에서 얻은 배양액 1v/v%을 각각의 액체 배지에다 식균하고 통기, 교반 조건하에 pH 6.0∼8.0 및 27℃에서 약 40시간 배양하였다.

배양종료후 배양물의 효소활성을 측정한 결과, 약 0.55단위/ml 의 효소가 생성되어 있었다. 배양물의 일부를 원심분리하고 상청액을 회수하여 그 효소 활성을 측정한 결과, 약 0.05단위/ml의 효소활성이 나타났다. 더욱이 분리한 균체에 5mM 인산 완충액(pH 7.0)을 가해 원래의 배양물과 동일한 액량으로 한후 효소활성을 측정한 결과, 약 0.5 단위/ml의 효소활성이 나타났다.

명세서중에서 효소활성은 다음의 방법으로 측정한 값으로 나타낸 것이다. 즉 말토오스를 20w/v% 함유한 10mM 인산 완충액(pH 7.0) 1ml을 시험관에 넣고 적당한 농도로 희석한 효소액 1ml을 가한 다음 25℃에서 60 분간 배양하여 효소 반응시킨 다음, 100℃에서 10분간 가열하여 효소반응을 정지시킨다. 이어서 반응 혼합물의 일부를 50mM 인산 완충액(pH 7.5)으로 11 배로 희석하고 그 중 0.4ml을 취하여 시험관에 넣고, 여기에 트레할라아제를 1단위/ml 함유한 용액을 0.1ml 가하여 45℃ 에서 120 분간 인큐베이트한 후 반응물중의 글루코오스 함량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량하였다. 한편, 100℃에서 10 분간 가열하여 실활시킨 효소액과 트레할라아제액을 사용하는 계(系)를 만들어 상기와 마찬가지로 처리한 것을 대조 (control)로 하였다. 상기와 같이하여 정량된 글루코오스 함량으로부터 트레할로오스의 생성량을 추정할 수 있다. 이 효소 1 단위는 상기 조건하에서 1분당 1μmol의 트레할로오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.

실험 1-2 : 효소의 정제

실험 1-1에서 제조한 배양물을 원심분리하여 수득한 습균체(wet cell) 약 0.5kg을 10mM 인산 완충액(pH7.0) 중에 현탁시키고 통상의 방법에 따라 파쇄한 후 원심분리하여 조(粗) 효소액 약 4.5 1을 얻었다. 이 조 효소액에 황산 암모늄을 30w/v% 포화로 되게 가하고 4℃ 에서 4 시간 방치하여 염석한후 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액에 황산암모늄을 80w/v% 포화되게 가하고 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 생성된 침전물을 원심 분리하여 회수하고 소량의 IOmM 인산 완충액(pH7.0)에 용해하여 IOmM 인산 완충액(pH 7.0)에 대해 24 시간 투석하였다. 투석내액을 원심분리하여 얻은 상청액을 미리 1OmM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화 시켜둔 이온교환 크로마토그래피용 칼럼 " DEAE-TOYOPEARLR "(일본국의 Tosoh 사제)에 부하하고 OM로부터 0.4M로 상승하는 염화 나트륨의 직선 농도 기울기하에서 칼럼에 10mM 인산 완충액(pH 7.0)을 통액하였다. 용출액으로부터 목적으로 하는 효소 활성을 가진 획분을 채취하고 한데 모아 1M 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대해 10 시간 투석한 후 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액을 미리 1M 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화 시켜둔 소수(疎水) 크로마토그래피용 칼럼 " BUTYL-TOYOPEARLR "(일본국의 'Tosho'사제)에 부하하고 1M로부터 OM로 저하하는 황산 암모늄의 직선 농도 기울기하에서 칼럼에 10mM 인산 완충액(pH 7.0)을 통액하였다. 용출액으로부터 목적으로 하는 효소 활성을 가진 획분을 채취하고 한데모아, 미리 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화 시켜둔 이온 교환 크로마토 그래피용 칼럼 " MONO Q HR5/5 "(스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology)에 부하하여 0 M로부터 0.5 M로 상승하는 염화 나트륨의 직선 농도 기울기하에서 칼럼에 10mM 인산완충액(pH 7.0)을 통액하여 용출액으로부터 효소 활성을 가진 획분을 채취하였다. 이와 같이 하여 정제한 효소의 비활성은 약 17 단위/mg 단백질이었고 수득량은 배양물 1 l 당 약 46 단위이었다. 통상의 방법으로 이 정제효소를 7.5w/v % 폴리 아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과, 활성효소를 가진 단일의 단백질 밴드가 나타났는데, 이것은 이 정제 효소가 극히 고순도인 것을 뜻한다.

실험 2 : 효소의 물리화학적 성질

실험 2-1 : 작용

기질로서 말토오스 또는 트레할로오스를 5w/v% 함유하는 수용액에 실험 1-2에서 제조한 정제효소를 기질 Ig당 2단위 가하고 20℃, pH 7.0에서 24시간 인큐베이트하였다. 이 반응 혼합물의 당조성을 분석하고자 반응 혼합물을 진공건조하여 피리딘에 용해하고 통상의 방법으로 트리메틸실릴화한후 가스 크로마토 그래피 처리하였다. 이 분석에 사용된 장치와 조건은 다음과 같다 : 장치 : 일본국 Shimadzu 제작소판매의 가스 크로마토그래프 " GC-16A ", 칼럼 : 스테인레스강제 칼럼(내경 3mm, 길이 2m)에 충전한 2% "SILICONE OV-17/CHROMOSOLB W " (일본국 GL Science 사판매), 검출기 : 수소염 이온화 방식, 캐리어 가스 : 질소가스(유량 : 40ml/분), 칼럼 온도 : 160∼320℃ (승온 속수 7.5℃/분). 아래의 표 1에 반응 혼합물의 당조성이 나와 있다.

[표 1]

표 1 에서 알 수 있는 바와 같이 정제효소는 말토오스를 기질로 하여 작용 시켰을때 트레할로오스 약 73w/w%와 말토오스 약 5w/w%를 생성한 반면, 트레할로오스를 기질로 하여 작용시켰을때 말토오스 약 17w/w%와 글루코오스 약 3w/w%를 생성하였다. 이들 사실은 정제효소가 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 변환시키는 활성이 있으며, 더욱이 말토오스 분자중의 α-1,4 결합과 트레할로오스 분자중의 α,α-1,1 결합을 가수분해하는 활성이 있음을 시사하고 있다. 이러한 효소작용은 아직 보고된 바 없으며 아주 신규한 효소작용 메카니즘을 가지고 있는 것이라 추정된다.

실험 2-2 : 분자량

문헌[U.K.Laemmli, Nature, Vol.227, pp. 680∼685(1970)]에 보고된 방법에 따라 정제효소를을 소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 전기영동 처리하여 약 57,000∼67,000 달톤에 해당되는 위치에서 단 하나의 단백질 밴드를 얻었다. 이 실험에 사용된 마아커(marker) 단백질은 미오신(MW = 200,000 달톤), β-갈락토시다아제(MW = 116,250 달톤), 포스포릴라아제 B (MW = 97,400 달톤), 혈청 알부민 (MW = 66,200 달톤) 및 오브알부민(MW = 45,000 달톤) 이었다.

실험 2-3 : 등전점

정제효소를 등전점 전기영동법으로 측정한 결과 그 등전점은 약 4.1∼5.1 이었다.

실험 2-4 : 최적 온도

통상의 방법으로 정제효소를 10mM 인산 완충액(pH 7.0) 중에서 60 분간 항온처리했을 때의 최적온도는 도 1 에 있는 바와 같이 약 20℃ 이었다.

실험 2-5 : 최적 pH

통상의 방법으로 정제효소를 10mM 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 탄산 나트륨-탄산수소 나트륨 완충액의 각기 상이한 pH 에서 25℃ 에서 60 분간 항온처리하여 실험했을 때의 최적 pH 는 도 2에 있는 바와 같이 약 7.0∼8.0 이었다.

실험 2-6 : 열적 안정성

통상의 방법으로 정제효소를 50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 중에서 60분간 항온처리하여 실험했을때 제3에 있는 바와 같이 약 30 까지 안정하였다.

실험 2-7 : pH 안정성

통상의 방법으로 정제효소를 50mM 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 탄산나트륨-탄산수소 나트륨 완충액의 상이한 pH 에서 20℃ 에서 60 시간 항온처리하여 실험했을 때 도 4에 있는 바와 같이 pH 약 6.0∼9.0 부근까지 안정하였다.

실험 2-8 : N 말단을 가진 아미노산 배열

정제효소의 N 말단을 가진 아미노산 배열을 기상 단백질 시서 " MODEL 470A " (미합중국의 Perkin Elmer 사제)로 분석한 결과 이 효소는 배열번호(SEQ ID NO : 1)에 있는 바와 같은 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

실험 2-9 : 부분 아미노산 배열

실험 1-1에서 얻은 정제효소 적당량을 취하여 10mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 대해 4℃ 에서 18시간 투석한 다음 10mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)과 혼합하여 효소 1ml당 약 1mg의 농도의 용액으로 하였다.

수득한 용액중 약 1ml을 시험관에 넣고 10㎍의 리실 엔도펩티다아제와 혼합하고 30℃에서 22시간 항온처리하여 효소를 부분적으로 가수분해하였다. 수득한 가수분해물을 16v/v% 수성 아세토니트릴 함유 0.1v/v% 트리플루오로아세테이트로 미리 평형화 시켜둔 역상 고속 액체 크로마토그래피용 칼럼 " μBONDAPAK C18 " (일본국의 Japan-Millipore 사판매)에 가한 다음 아세토니트릴의 농도를 16v/v%에서 부터 44v/v%로 증가시키면서 아세토니트릴 함유의 0.1v/v% 트리플루오로아세테이트를 0.9ml/min의 유속으로 상기 칼럼에 공급하여 공급 개시후 약 46 분에서 용출하는 펩티드 단편을 가진 획분을 회수하였다. 펩티드 단편을 함유한 획분을 한데모아 감압 건조하고 50v/v% 수성 아세토니트릴 함유의 0.1v/v% 트리플루오로아세테이트에 용해하였다. 실험 2-8 에서와 마찬가지로 펩티드 단편을 분석한 결과 배열번호 (SEQ ID NO : 4)에 있는 아미노산 배열을 가지고 있음을 확인하였다.

이러한 물리화학적 성질을 가진 효소는 아직까지 알려진바가 없으므로 이것은 신규 물질이라는 결론을 얻었다. 피멜로박터 sp. R48의 경우에 있어서 이것은 일본국의 Okayama 시의 토양으로부터 분리한 미생물로서 1993년 6월 3일 자로 기탁 (기탁기관 : 일본국의 이바라키, 츠쿠바시의 National Institute : of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science apd Technology) 되어 수탁번호 FERM BP-4315로 접수되어 보관되어 있다. 본 출원인이 출원한 일본국 특허출원 제199,971/93호에는 이 미생물의 균학적 성질이 상세히 개시되어 있다.

본 발명자들은 실험 2-8 및 2-9에서 확인된 N 말단을 가진 아미노산 배열과 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브 (probe)로 사용하여 피멜로박터 sp. R48의 염색체 DNA를 예의 검색한 결과 5' 말단에서 시작하는 아래의 배열번호 SEQ ID NO : 2에 있는 바와 같은 염기 배열을 가진약 1,700 염기쌍으로 된 DNA 단편을 수득하였다. 그리고 그 염기배열을 해독한 결과 이 효소는 568개 아미노산으로 구성되어 있으며 배열번호(SEQ ID NO : 1)에 있는 바와 같은 N 말단에서 시작하는 아미노산 배열을 가지고 있음이 확인되었다.

배열번호(SEQ ID NO : 1 및 2)에 나와 있는 염기배열과 아미노산 배열을 확인하는데 사용된 순차적인 실험단계를 요약하면 아래와 같다.

(1) 공여체 미생물의 배양액으로부터 효소를 분리하여 고도로 정제한 다음 N 말단 아미노산 배열을 결정하였다. 이 정제 효소를 프로테아제로 부분 가수분해하고 가수분해물로부터 펩티드 단편을 분리하여 그 아미노산 배열을 결정하였다.

(2) 별도로 공여체 미생물의 세포로부터 염색체 DNA를 분리하여 정제한 다음 제한효소로 부분 소화하여 약 2,000∼6,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소로 미리 절단해둔 플라스미드 벡터에다 DNA 리가아제로 연결하여 재조합 DNA를 얻었다.

(3) 이 재조합 DNA를 에쉐리히아 콜리(Escherichia coli) 종(種)의 미생물에 도입하여 형질전환체를 얻고, 위에 나온 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프로우브로 사용하는 콜로니 하이브리다이 제이션 방법으로 상기 형질전환체로부터 이 효소를 코우드하는 DNA를 가진 목적의 형질전환체를 선택하였다.

(4) 형질전환체로부터 재조합 DNA를 얻어 프라이머로 어니일링한 다음 DNA 폴리머라아제를 작용시켜 프라이머를 연장시키고, 수득한 상보(相補) 체인 DNA의 염기배열을 디데옥시 체인 종결법으로 결정하였다. 그리고 그 결정된 염기배열로부터 추정되는 아미노산 배열과 위에 나온 아미노산 배열을 비교해 본 결과 염기배열이 이 효소를 코우드한다는 것을 확인하였다.

다음의 실험 3 및 4에서 상기 (2) 항 내지 (4) 항을 상세히 설명하는데, 이들 실험에 사용된 수법 그 자체는 이 기술분야에서 공지의 것인데, 예컨대 문헌[J. Sumbruck et al. in " Molecular Cloning A Laboratory Manual ", 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)] 에도 상세히 기재되어 있다.

실험 3 : 피멜로박터 sp. R48 유래의 DNA를 함유하는 재조합 DNA 및 형질 전환체의 제조

실험 3-1 : 염색체 DNA의 제조

피맬로박터 sp. R48의 종배양액을 박토 영양 육즙 배지(bacto nutrient broth medium)(pH 7.0)에 식균하고 27℃ 에서 24 시간 동안 회전 진탕기에서 배양하였다. 세포를 배양액으로부터 원심분리하여 제거하여 TES 완충액(pH 8.0) 중에 현탁시킨 다음 리소자임을 0.05w/v% 가하여 혼합한후 37℃ 에서 30 분간 배양하였다. 수득물을 -80℃에서 1 시간 동결시키고 TSS 완충액(pH 9.0)을 가하여 혼합하고 60℃ 로 가열한 다음, TES 완충액과 페놀의 혼합액과 혼합하여 수득한 용액을 얼음으로 급냉한 후 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액에 2배 체적의 차거운 에탄올을 가하고 침전한 미정제 염색체 DNA를 회수하여 SSC 완충액(pH 7.1) 중에 현탁시켜 리보뉴클레아제 7.5㎍과프로테아제125㎍을 가해 혼합한 다음 37℃에서 1시간 배양하였다. 이어서 이 반응액에 클로로포름과 이소아밀 알코올의 혼합액을 가하여 목적으로 하는 염색체 DNA를 추출하고 차거운 에탄올과 혼합한 다음 염색체 DNA 함유 침강물을 채취 하였다. 여기서 얻은 정제 염색체 DNA 를 SSC 완충액 (pH 7.1)에 용해하여 약 1mg/ml의 농도로 한 다음 이 용액을 -80℃에서 동결시켰다.

실험 3-2 : 재조합 DNA pBRM8 과 형질전환체 BRM8의 제조

실험 3-1에서 제조한 정제 염색체 DNA 약 1ml을 시험관에 넣고 제한 효소인 Sau 3AI 약 35 단위를 가해 혼합하여 37℃ 에서 약 20 분간 효소반응시켜 염색체 DNA를 부분 분해한 다음 수크로오스 밀도 기울기 초원심 분리법에 의해 약 2,000 ∼6,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 회수하였다. 별도로 플라스미드 벡터인 블루우스크립트 II SK(+) 1㎍을 시험관에 넣고 제한 효소인 Bam HI을 작용시켜 플라스미드 벡터를 완전히 소화시킨후 DNA 단편 10㎍ 및 T4 DNA 리가아제 2 단위와 혼합하여 4℃ 에서 하룻밤 방치함으로써 DNA 단편을 벡터 단편에다 결찰시켰다. 수득한 재조합 DNA에 Epicurian Coli XLI-Blue(일본국의 Toyobo 사 판매의 컴피턴트 셀) 30㎕을 가하고 얼음 냉각 조건하에서 30 분간 방치한 다음 42℃ 로 가열하고 나서 SOC 육즙을 가해 혼합하여 37℃에서 1시간 항온처리함으로써 재조합 DNA를 대장균속에 도입하였다.

수득한 형질전환체를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50㎍/ml 함유의 한천판(pH 7.0)에 식균하고 37℃ 에서 18 시간 배양한 다음 한천판 위에 나일론 필름을 얹어 이 위에 한천판에 생성된 약 6,000 콜로니를 고정시켰다. 위치 6∼11에 있는 아미노산 배열, 즉 Glu-Glu-Pro-Glu-TrP-Phe에 근거하여 배열번호(SEQ ID NO : 6)에 있는 프로우브 1의 염기 배열을 화학적으로 합성하여 32P로 표지한 다음 나일론 필름위에 고정된 형질전환체의 콜로니로 하이브리다이제이션 한후 프로우브 1과 강력한 하이브리다이제이션을 나타낸 5종류의 형질 전환체를 선택하였다.

이 5종류의 형질 전환체로부터 통상적인 방법으로 목적으로 하는 재조합 DNA를 선택하고 5∼10 위치에 있는 아미노산 배열, 즉 Met-Leu-Glu-Ala-Met-Ala로 나타내어지는 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한, 배열번호(SEQ ID NO : 7)에 있는 염기 배열을 가진 프로우브2 로 문헌[E.M. Southern in Journal of Molecular Biology, Vol. 98, pp, 503∼517(1975)]에 기재된 방법에 따라 재조합 DNA를 하이브리다이제이션한 다음 프로우브 2에 의해 강력히 하이브리다이제이션된 재조합 DNA 를 선택하였다. 이렇게 해서 선택한 재조합 DNA 와 형질전환체를 각각 " pBRM8 " 및 " BRM8 " 로 명명하였다.

형질전환체 BRM8을 앰피실린 100㎍/ml 함유하는 L-육즙(pH 7.0)에 균하고 37℃에서 24시간 동안 회전 진탕기에서 배양한 다음 원심분리에 의해 배양액으로부터 세포를 채취하여 알칼리법으로 처리하여 세포로 밖으로 재조합 DNA를 추출하였다. 수득물을 통상의 방법으로 정제하고 분석한 결과, 재조합 DNA pBRM8은 약 7,600 염기쌍으로 구성되어 있고 도 5에 있는 바와 같이 이 효소를 코우드하는 약 1,700 염기쌍으로 된 DNA가 제한효소 Sma I에 의한 절단부위에 근접한 하류쪽에 위치하고 있음이 확인되었다.

실험 3-3 : 형질전환체 BRM8에 의한 재조합 효소의 제조

500ml 용량의 플라스크에 2.0w/v% 글루코오스, 0.5w/v% 펩톤, 0.1w/v% 효모 추출물, 0.1w/v% 인산수소 2 칼륨, 0.06w/v% 인산 2 수소 나트륨, 0.05w/v% 황산 마그네슘 7 수화물, 0.5w/v% 탄산 칼슘 및 물로 된 액상 배지를 100ml 씩을 넣고 각 플라스크를 115℃ 에서 30 분간 가열하여 멸균하고 냉각한후 앰피실린 50㎍/ml을 가한 다음 실험 3-2에서 수득한 형질 전환체 BRM8을 식균하여 37℃에서 24시간 회전 진탕기에서 형질전환체를 배양하였다. 수득한 배양액을 초음파 파쇄기로 처리하여 세포를 파쇄하고, 수득한 현탁액을 원심분리하여 불용성물질을 제거하였다. 수득한 상청액에 대해 효소활성을 측정한 결과, 이 배양액 1 l 에서 약 850 단위의 효소를 함유하고 있었다.

대조로서 대장균 XLI-블루우 또는 피멜로박터 sp. R48의 종배양액을 앰피실린 무함유의 신선한 동일 액상 배지에 접종하고, 피멜로박터 sp. R48M-11의 배양의 경우에는 이것을 27℃ 의 배양온도에서 위와 마찬가지로 배양하여 처리하였다. 수득물의 활성을 분석한 결과, 피멜로박터 sp. R48 배양액 1 l에서 약 410 단위의 효소를 함유하고 있었는데, 그 수율은 형질 전환체 BRM8 보다 유의(有意)하게 저하되어 있었다. 숙주로 사용된 대장균 XLI-블루우는 효소를 생성하지 않았다.

이어서 형질 전환체 BRM8에 의해 생성된 효소를 실험 1-2과 마찬가지로 정제하여 그 물리화학적인 성질과 성상을 조사한 결과, 이것은 실질적으로 피멜로박터 sp. R48과 동일한 물리화학적 성질을 가지고 있었는데, 즉 SDS-PAGE 에서 약 57,000∼67,000 달톤의 분자량과 등전점 전기영동에서 약 4.1∼5.1의 등전점을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 이 결과로부터 본 발명의 효소는 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있으며 따라서 그 수율은 상당히 증가함을 알수 있다.

실험 4 : 상보 체인 DNA 제조 및 그 염기배열과 아미노산 배열의 결정

실험 3-2의 방법으로 제조한 재조합 DNA pBRM8 2㎍을 시험관에 넣고 2M 수산화 나트륨 수용액과 혼합하여 변성시킨 다음 적당량의 차거운 에탄올과 혼합하고 수득한 템프레이트(template) DNA 함유 침강물을 채취하여 감압건조하였다. 이 템플레이트 DNA에 아래의 배열번호(SEQ ID NO : 8)로 나타내어지는 화학 합성된 프라이머 1 50pmole/ml와 20mM 염화마그네슘 및 20mM 염화나트륨 함유의 40mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 10㎕을 가하고 이 혼합물을 65℃에서 2 분간 항온처리하여 어니일링시킨후 이 혼합물에, dATP, dGTP 및 dTTP를 각각 함유하는 수용액 2㎕와, 7.5 μM, [α-32P] dCTP(2 mCi/ml)0.5 ㎕, 와, 0.1M 디티오트레이톨 1㎕ 및 1.5 단위/ml T7 DNA 폴리머라아제 2㎕을 혼합한 다음 25℃ 에서 5 분간 항온처리하여 5' 말단으로부터 3' 말단 까지 프라이머 1을 연장시킴으로써 상보 체인 DNA를 생성시켰다.

상보체인 DNA를 함유하는 반응생성물을 4 부분으로 나누어 각각에다 dNTP 80 μM과 ddATP, ddCTP, ddGTP, 또는 ddTTP 8 μM을 함유하는 50mM 염화나트륨 수용액을 2.5 ㎕ 가하고, 수득한 혼합물을 37℃ 에서 5 분간 항온 처리한 다음 20mM EDTA, 0.05w/v% 브로모페놀 블루우 및 0.05w/v% 크실렌 시아놀을 함유하는 98v/v% 포름아미드 수용액 4㎕을 가하여 반응을 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 끊는 워터 배드(water-bath)에서 3 분간 가열한 후, 그 중의 소량을 6w/v% 폴리아크릴아미드 겔에 가하여 약 2000 볼트의 일정 전압으로 겔을 활성화시켜 전기영동 처리함으로써 DNA 단편을 분리한 다음 통상의 방법으로 겔을 고정시키고 건조하고 나서 자동방사선 사진법으로 처리하였다.

방사선 사진에서 분리된 DNA 단편을 분석한 결과 상보 체인 DNA에는 SEQ ID NO : 5에 있는 바와 같은 약 1700 염기쌍으로 구성된 염기배열을 가지고 있음이 밝혀졌다. 이 염기배열로부터 추정할 수 있는 아미노산 배열은 SEQ ID NO : 5에 나와 있는 바와 같은데, 이 아미노산 배열을 실험 2-8 또는 2-9에서 밝혀진 N 말단 아미노산 배열 또는 부분 아미노산 배열과 비교한 결과, 실험 2-8의 N 말단 아미노산 배열은 배열번호(SEQ ID NO : 5)의 1∼20 위치에 있는 아미노산 배열에 상응하였으며, 실험 2-9의 부분 아미노산 배열은 183∼193 위치에서의 아미노산 배열에 상응한 것임이 확인되었다. 이 결과로부터 이 효소는 SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 가지고 있고 피멜로박터 sp. R48의 효소는 SEQ ID NO : 2에 있는 염기 배열을 가진 DNA에 의해 코우드되는 것임을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명자들은 장기간에 걸친 연구의 결과로서 말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 효소를 발견하였으며, 이 효소는 종래의 효소와는 다른 독특한 물리화학적 성질을 가지고 있다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 응용함으로써 이 재조합형 효소를 제조 하는데 목적이 있다. 이하, 실시예를 참조하면서 본 발명의 재조합형 효소와 그 제조방법 및 용도에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 말하는 재조합형 효소라 함은 재조합 DNA 기술에 의해 제조되며 말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 효소들을 의미한다. 본 발명의 재조합 DNA는 통상적으로 해명된 아미노산 배열을 가지고 있으며, 그 예로서 배열번호(SEQ ID NO : 1)에 나와 있는 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열에 대해 상보적인 아미노산 배열을 들 수 있다. 배열번호(SEQ ID NO : 1)의 아미노산과 상동적인 아미노산 배열을 가진 변이체는 배열번호(SEQ ID NO : 1)에 있는 아미노산 배열중에서 아미노산 하나 이상을 효소의 고유의 작용을 변화시킴이 없이 다른 아미노산으로 치환하여 얻을 수 있다. 동일한 DNA를 사용하고 DNA가 도입되는 숙주와 형질전환체 배양배지의 성분과 조성, 이들의 배양온도 및 pH에 따라 좌우된다하더라도 배열번호(SEQ ID NO : 1)의 아미노산의 N 말단에 인접하여 위치한 아미노산 하나 이상을 결실해 있으나 DNA에 의해 코우드된 효소 본래의 효소활성을 가지거나 DNA 발현후에 숙주의 세포내 효소의 수식에 의해 N 말단에 대해 새로 부가된 아미노산 하나 이상을 가진 개질된 효소를 생산할수도 있다. 이러한 변이체도 그것이 말토오스를 트레할로오스로 변환하고, 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 한 본 발명의 재조합형 효소에 포함된다.

본 발명에 의한 재조합형 효소는 특정의 DNA를 함유한 형질전환체의 배양물로부터 얻을 수가 있다. 본 발명에서 사용하는 형질전환체는 배열번호(SEQ ID NO : 2)에 나와 있는 5' 말단으로부터의 염기배열 또는 이것과 상동적인 염기 배열 또는 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기배열을 적당한 숙주에 도입함으로써 얻을 수 있다. 위에 나온 염기 배열은 코우드하는 아미노산 배열을 바꾸지 않고서도 유전자 축중(degeneracy)을 이용하여 염기 1 개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여도 좋다. 물론 효소 또는 이들의 변이체를 코우드하는 염기 배열중의 염기 하나이상을다른 염기로 쉽사리 치환하여 DNA가 실제로 숙주에서 효소 생산을 발현하도록 할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 DNA는 그것이 전술한 배열을 가지고 있는 한 그것이 천연에서 유래하는 것이거나 인위적으로 합성된 것이가는 관계없이 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명에 의한 DNA의 천연의 공급원의 예로서는 피멜로박터 sp. R48 을 비롯한 피멜로박터속(屬)의 미생물을 들 수 있는데, 이 미생물로부터는 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 얻을 수 있다. 이들 미생물을 영양배지에서 식균하여 호기성 조건하에 약 1∼3 일간 배양한 다음 수득한 세포를 배양액으로부터 회수하여 초음파 처리하거나 리소자임 또는 β- 글루카나아제 등의 세포벽 용해 효소로 처리하여 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 추출한다. 이 경우에 있어서 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를 세포벽 용해효소와 병용할 수 있으며 초음파 파쇄로 세포를 처리할 경우에 있어서는 이들을 소디움 도데실 술페이트(SDS) 등의 계면활성제 존재하에 처리하거나 동결, 해동법으로 처리하여도 좋다. 목적으로 하는 DNA는 수득물을 페놀 추출법, 알코올 침강법, 원심분리법, 프로테아제 처리법 및/또는 리보뉴클레아제 처리법등, 이 기술분야에서 통상적으로 이용되고 있는 방법으로 처리하여 제조한다. 본 발명의 DNA를 인공적으로 합성하자면 배열번호(SEQ ID NO : 1)에 있는 염기 배열을 이용하여 화학적으로 합성하거나, 배열번호(SEQ ID NO : 1)에 있는 아미노산 배열을 코우드하는 DNA를 적당한 자체 복제가장한 벡터에 삽입하여 재조합 DNA를 얻고, 이 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 형질전환체를 얻은 다음 이 형질전환체를 배양하고, 수득한 배양액으로부터 증식된 세포를 분리하고 이 세포로부터 재조합 DNA를 함유한 플라스미드를 채취함으로써 플라스미드 형태로 수득할 수 있다.

이러한 재조합 DNA 는 통상, 재조합 DNA 형태로 숙주에 도입된다. 재조합 DNA는 일반적으로 위에 나온 DNA 와 자체 복제가능한 벡터를 함유하게 되는데, DNA가 입수가능하면 통상 일반적인 방법으로 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 pBR322, pUC18, 블루우스크립트 (Bluescript) II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, TEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터와, λgt.λC, λgt.λB, ρ11, Φ1, Φ105 등의 파아지 (phage) 벡터가 있는데, 이들 플라스미드 벡터와 파아지 벡터 중에서 pBR322, pUC18, 블루운스크립트 II SK(+), λgt.λC 및 λgt.λB 는 본 발명의 DNA를 대장균(Escherichia coli)에서 발현시킬 필요가 있을때 만족스럽게 사용할 수 있는 반면 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, Φ1 및 Φ105 는 바실루스속 미생물에서 DNA를 발현시킬때 만족스럽게 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터 pHV14, TRp7, TEp7 및 pBS7는 재조합 DNA를 두가지 이상의 숙주에서 생장시킬 경우에 유리하게 사용된다.

본 발명에서 본 발명의 DNA를 이러한 벡터속에 삽입할때 이용하는 방법은 이 기술분야에서 일반적으로 통용되고 있는 종래의 방법이어도 좋다. 본 발명의 DNA와 자치복제성 벡터를 함유한 유전자를 제한효소 및/또는 초음파 분쇄기로 먼저 분해한 다음 수득한 DNA 단편과 벡터 단편을 결찰(ligation) 시킨다. DNA 단편과 벡터를 결찰시키자면 필요에 따라 먼저 이들을 어니일링한 다음 생체내 또는 시험관내에서 DNA 리가아제로 처리한다. 이렇게 해서 수득한 재조합 DNA는 적당한 숙주속에도입하여 수득한 형질전환체를 배양함으로써 실질적으로 아무런 제한없이 복제가 가능하다.

본 발명에 의한 재조합 DNA 를 대장균과 바실루스속, 악티노마이세스속 및 효모를 비롯한 적당한 숙주 미생물속에 도입할 수 있다. 숙주로서 대장균을 사용할 경우에 있어서 재조합 DNA와 칼슘 이온 존재하에 숙주를 배양할 수 있고, 바실루스속 미생물을 이용할 경우에는 컴피턴트 셀법(competent cell method)과 콜로니 하이브리다이제이션법(colony hybridization method)을 이용할 수 있다. 필요로 하는 형질전환체를 콜로니 하이브다이제이션법으로 클로닝 하거나 또는 말토오스 혹은 트레할로오스를 함유한 영양배지에서 형질 전환체를 배양한 다음 트레할로오스 또는 말토오스를 생성하는 형질전환체를 선택함으로써 클로닝 할 수 있다.

이렇게 해서 수득한 형질 전환체는 영양배지에서 배양하면 목적으로 하는 효소를 세포외에서 생성한다. 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미네랄이 보충된 액상배지, 필요에 따라서는 소량의 아미노산 및/또는 비타민류가 보충된 액상배지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 탄소원의 예로서는 전분, 전분 가수분해물, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스 등의 당류가 있고, 질소원의 예로서는 암모니아, 암모늄염, 우레아, 질산염, 펩톤, 효모 추출물, 탈지대두, 옥수수 침출액, 육(肉) 추출물 등의 질소함유 무기 및 유기 물질이 있다. 목적으로 하는 효소를 함유하는 배양액은 형질 전환체를 영양배지에서 접종하고 통기교반 하면서 호기성 조건하에 20∼50℃ 및 pH 2∼9에서 약 1 - 6 일 동안 배양함으로써 제조할 수 있다. 이러한 배양액은 그대로 조(粗) 효소제로 사용할 수 있는데, 롱상적으로는 사용하기 전에 초음파파쇄기 및/또는 세포벽 용해효소로 파쇄한 다음 여과 및/또는 원심 분리에 의해 세포와 세포 파쇄물로부터 효소를 분리하여 이 효소를 정제하여 사용한다. 본 발명에서의 효소 정제법으로는 일반적으로 종래의 방법이 포함된다. 배양액으로부터 세포와 세포 파쇄물을 제거하고 원심분리, 염석, 투석, 분별침강, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명의 재조합형 효소는 말토오스 또는 트레할로오스에 작용하여 각각 트레할로오스 또는 말토오스를 생성하는 명확한 활성을 나타내며 종래의 효소에서 발견되지 않은 독특한 작용을 가진다. 트레할로오스는 온화하고도 고품위의 감미를 가지며, 그리고 분자중에 환원성기를 가지지 않으므로 착색이나 변질의 우려가 없이 음식물을 감미부여할 수 있는 큰 잇점이 있다. 본 발명의 재조합형 효소의 이러한 성질을 이용하여 종래 환원성으로 인해 이 분야에서 사용할 수 없었던 말토오스를 환원성이 없고 취급이 용이하며 부가가치가 높은 트레할로오스로 변환시킬 수 있게 된다.

본 발명의 효소변환 방법에 대해 더욱 상세히 설명하면 본 발명에서 말하는 " 말토오스 " 라 함은 통상적으로 말토오스를 함유한 당조성물을 의미하며, 본 발명의 재조합형 효소가 작용하여 트레할로오스를 생성할 수 있는 한 어떠한 원료 또는 제조방법이라도 사용할 수 있다. 트레할로오스를 대량으로 효율적으로 제조하자면 말토오스 함량이 많은 당조성물을 사용하는 것이 바람직한데, 통상, 약 70w/w%이상, 바람직하게는 약 80w/w% 이상의 것이 사용된다. 이러한 당조성물은 이 분야에 있어서 통상 일반적인 방법으로 제조할 수 있는데, 예컨대 일본국 특허공고 제11,437/81호 공보와 특허공고 제17,078/81호 공보에 개시되어 있는 호화전분 또는 액화전분에 β-아밀라아제를 작용시키고, 생성된 말토오스를 분별침전법 또는 투석법으로 분리하는 방법, 와는 일본국 특허공고 제13,089/72호 공보와 특허공고 제3,938/79호 공보에 개시되어 있는 호화전분 또는 액화전분에 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제등의 전분지절 효소가 더불어 β-아밀라아제를 작용시키는 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 의한 효소적 변환방법에 있어서 본 발명의 재조합형 효소의 유효량을 말토오스를 함유하는 수성매체중에 공존시켜 이 혼합물을 일정온도와 pH 에서 유지시키면서 필요로 하는 양의 트레할로오스가 생성할 때까지 효소반응시킨다. 효소반응은 건조 고형분 기준으로 약 0.1w/w% 이하의 비교적 낮은 기질농도에서도 진행하지만, 건조 고형분 기준으로 약 2w/w% 이상의 고농도, 바람직하게는 약 5∼50 w/w%의 기질농도를 사용하면 본 발명에 의한 효소적 변환방법을 공업적 생산 규모로 실시할 수 있다. 반응온도와 pH 는 재조합형 효소를 실활하지 않고 말토오스를 효과적으로 생성하는 범위내로 설정하는데, 즉 약 30℃의 온도, 바람직하게는 약 4∼30℃ 및 pH 약 6∼9, 바람직하게는 pH 약 7∼8의 범위로 설정한다. 재조합형 효소의 양과 반응시간은 효소반응 조건에 따라 적절히 설정한다. 본 발명의 효소적 변환방법에 의해 말토오스를 트레할로오스료 효과적으로 변환시키는데, 그 변환율은 약 80% 이상까지 도달하는 경우도 있다.

본 발명의 효소적 변환방법으로 수득한 반응 혼합물을 그대로 사용할 수 있으나, 통상적으로는 정제한 후 사용한다. 예컨대, 여과와 원심분리에 의해 반응 혼합물로부터 불용물을 제거하고 수득한 용액을 활성탄으로 탈색한후 이온 교환 수지로 탈염, 정제한 다음 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 용도에 따라서는 이 시럽상 제품을 진공건조하고 분무건조하여 고형제품을 얻는다. 실질적으로 트레할로오스만으로 된 제품을 제조하자면 시럽상 제품을 이온 교환수지, 활성탄 또는 실리카 겔 등을 사용하는 크로마토그래피, 효모에 의한 발효, 알칼리에 의한 환원성 당질의 분해 제거 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 처리한다. 비교적 다량의 반응혼합물을 처리하는 방법으로서는 일본국 특허공개제23,799/83호 공보 및 같은 특허공개 제72,598/88호 공보에 개시되어 있는고정상 방식, 이동상 방식 또는 의사(擬似) 이동상 방식 등의 이온교환 칼럼 크로마토그래피가 있는데, 이들 방법에서는 종래 대량 제조가 곤란하였던 트레할로오스 고함유 제품을 대량으로, 또한 공업적 규모로 고수율로 제조할 수 있다. 이렇게 하여 수득되는 트레할로오스 및 트레할로오스를 함유한 당조성물은 당 감미제의 환원성을 기피하는 여러가지 제품에 폭넓은 용도를 가지고 있다. 따라서 예컨대 음식물 일반, 화장품 및 의약품 등의 감미제, 정미 개선제, 품질 개선제, 안정제, 충전제, 부형제 및 보조제로서 만족스럽게 사용할 수 있다.

이하, 몇가지 실시예에 따라 본 발명에 의한 재조합형 효소의 제조방법과 말토오스의 효소적 변환방법을 구체적으로 설명한다.

실시예 A-1 : 재조합형 효소의 제조

500ml 용량의 삼각 플라스크에 2.0w/v% 글루코오스, 0.5w/v% 펩톤, 0.1w/v%효모엑스, 0.1w/v% 인산수소 2 칼륨, 0.06w/v% 인산 2 수소나트륨, 0.05w/v% 황산 마그네슘 7수화물, 0.5w/v% 탄산 칼슘 및 물로 된 영양배지를 100ml 씩 취하고 115℃ 에서 30 분간 가열하여 멸균한 다음 냉각하고 암피실린 50㎍/ml을 가한후 실험 3-2에서 제조한 형질전환체 BRM8을 접종하고 회전진탕 조건하에서 37℃ 에서 24시간 배양하여 종배양액을 얻었다. 이어서 30 l 용량의 자아 퍼어멘터에 상기와 동일조성의 신선한 영양 배지를 18 l 씩 취하고 위와 마찬가지로 멸균후 암피실린을 50㎍/ml 가하여 위에서 얻은 종배양액을 1v/v% 씩 접종한 다음 pH 6∼8로 유지하면서 37℃에서 24시간 통기교반 조건하에 배양하였다. 수득한 배양물을 초음파 처리하여 균체를 파쇄하고 원심분리에 의해 불용물을 제거후 상청액중의 효소활성을 측정한 결과, 배양물 1 l 당으로 환산하여 약 880 단위의 재조합형 효소가 함유되어 있었다. 이 상청액을 실험 1-2의 방법으로 분석한 결과 이 배양물에서 비활성이 약 34 단위/mg 단백질인 재조합형 효소를 약 160 단위/ml 함유한 수용액을 약 5 ml 얻었다.

실시예 B-1 : 재조합형 효소에 의한 트레할로오스 시럽의 제조

감자전분을 농도 10w/w% 되도록 물속에 현탁하고, 이 현탁액을 pH 5.5로 조정후 일본국 Nagase 생화학공업사 판매의 α-아밀라아제제 (劑) " SPITASE HS " 를 전분, 1g 당 2단위 가하고 95℃ 에서 가열하여 전분을 호화 및 액화하였다. 액화액을 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브하여 효소를 실활시키고 50℃ 로 급냉한 후 pH를 5.0으로 조정하여 전분 1g 당 일본국의 林原 생물화학 연구소판매의 이소아밀라아제제(劑)를 500 단위, 그리고 일본국의 Nagase 생화학 공업사 판매의 β-아밀라아제제(劑)를 20 단위 가하고 50℃ 에서 24 시간 반응시켜 고형분당 말토오스를 약 92w/w% 함유하는 당액을 얻었다. 이 당액을 100℃에서 20 분간 가열하여 효소를 실활시키고 10℃ 로 냉각한 후 pH 를 7.0 으로 조정한 다음 실시예 A-1의 방법으로 제조한 재조합형 효소를 전분고형분 1g당 1단위 가하고 96 시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 95℃ 에서 10분간 가열하여 효소를 실활시키고 냉각하여 여과후 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온교환수지로 탈염, 정제하여 농축함으로써 농도 약 70w/w%의 시럽을 원료 전분 고형물당 약 95%의 수율로 얻었다.

트레할로오스를 고형물당 약 69w/w% 함유하는 이 제품은 환원력이 DE (dextrose equivalent) 18.2로서 비교적 낮고, 더욱이 온화한 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 감미제, 정미(呈味) 개량제, 안정제, 충전제, 보조제 초는 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-2 : 재조합 DNA에 의한 트레할로오스 분말의 제조

실시예 B-1의 방법으로 제조한 반응 혼합물을 pH 5.0으로 조정하고, 여기에 일본국의 Nagase 생화학공업사 판매의 글루코아밀라아제제(劑) " GLUCOZYME " 을 전분 고형분 1g당 10단위 가하여 50℃ 에서 24시간 효소 반응시켰다. 이와 같이 하여 수득한 반응 혼합물을 가열하여 잔존 효소를 실활시키고 통상의 방법으로 탈색, 탈염, 정제한후 일본국의 동경유기화학공업사 판매의 Na+ 형 양이온 교환수지 " XT-1016 (가교도 4 %) "을 사용하는 이온교환 칼럼 크로마토그래피 처리하여 트레할로오스 함량을 높였다. 더욱 구체적으로는 물에 현탁시킨 이온교환 수지를 내경 5.4cm의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개에 충전한 후 이 칼럼을 직열로 연결하여 칼럼 전체길이를 20m로 하였다. 칼럼내 온도를 60℃ 로 유지하면서 상기 반응 혼합물을 칼럼에 약 5v/v% 부하한 다음 60℃ 의 온수를 SV(공간속도) 0.15 로 공급하여 분획함으로써 트레할로오스 고함유 획분을 채취 하였다. 이 획분을 통상의 방법으로 농축하고 진공 건조한 다음 분쇄하여 트레할로오스 분말을 원료 고형물당 약 55%의 수율로 얻었다.

트레할로오스를 고형분당 약 97w/w% 함유하는 이 제품은 환원력이 DE 18.2로서 비교적 낮고, 더욱이 온화한 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 감미제, 정미 개량제, 안정제, 충전제, 보조제 또는 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-3 : 재조합형 효소에 의한 결정성 트레할로오스 분말의 제조

실시예 B-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온교환 수지로 탈염하여 농도 약 70w/w% 용액으로 농축하였다. 이 농축물을 결정화기에 넣고 교반하면서 서서히 냉각하여 결정율 약 45%인 매스키트(massecuite)를 얻었다. 이어서 약 85℃ 의 온풍을 분무 건조탑 상부로부터 아래쪽을 향해 송풍하면서 매스키트를 건조탑 상부에 설치된 노즐로부터 약 150kg/cm2의 가압하에 분무건조탑의 아래쪽을 향해 분무하는 한편, 분무건조탑 저부에 설치된 금망 컨베이어 위에 포집한 결정성 분말을, 컨베이어 하부로부터 약 45℃의 온풍을 송풍하면서 분무 건조탑 밖으로 서서히 반출하였다. 그 후, 결정분말을 숙성탑에 보내서 온풍 기류중에서 10시간 숙성하여 결정화와 건조를 완료하였다. 이와 같이 하여 트레할로오스 함수 결정의 분말을 원료 고형분당 약 90%의 수율로 얻었다.

이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않고 취급도 용이하므로 감미제, 정미개량제, 품질 개량제, 안정제, 충전제, 보조제 또는 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

실시예 B-4 : 재조합형 효소에 의한 무수결정성 트레할로오스 분말의 제조

실시예 B-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 실시예 B-3과 마찬가지로 정제한후 증발가마에 넣고 감압하에 끊여 수분함량 약 3.0w/w%의 시럽을 얻었다. 이 시럽을 결정화기에 넣고 종정(種晶)으로서 무수결정 트레할로오스를 고형분당 약 1w/w% 가하고 교반하면서 120℃에서 결정화한 다음 알루미늄제 용기에 옮겨 100℃에서 6시간 숙성하여 블록을 형성하였다. 수득한 블록을 절삭기로 분쇄하고 유동건조하여 수분 약 0.3w/w%의 무수결정 트레할로오스 분말을 원료 고형물당 약 85 % 의 수율로 얻었다.

강력한 탈수작용을 가진 이 제품은 음식물, 화장품, 의약품 혹은 그 제조원료 또는 가공 중간물의 탈수제로서, 더욱이는 온화한 감미를 가진 백색 분말 감미제로서 음식물, 화장품, 의약품을 비롯한 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 말토오스 또는 트레할로오스에 작용할 경우 각각 트레할로오스 또는 말토오스를 생성하는 신규의 효소의 발견에 근거한 것이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 효소를 대규모로, 효율적으로 생산하는 길을 개척하는 것이다. 본 발명의 효소적 변환방법에 의하여 말토오스는 극히 높은 수율로 트레할로오스와 글루코오스 및/또는 말토오스를 함유한 당조성물로 변환된다. 트레할로오스는 온화하고도 고품위의 감미를 가지며 분자중에 환원성기를 가지지 아니하므로 착색과 변질의 우려없이 일반 음식물을 감미부여할 수 있다.

더욱이 본 발메의 재조합형 효소는 전(全) 아미노산 배열이 밝혀진 효소이고 식품 등에 배합사용을 전제로 하는 트레할로오스의 제조시에 안심하고 사용할 수 있는 것이다. 따라서 본 발명은 상기한 바와 같은 현저한 작용효과를 발휘하므로 이 분야에 있어서 공헌하는 바가 실로 다대한 발명이라 할 수가 있다.

도 1은 피멜로박터 sp. R48에 의해 생성된 효소의 최적 온도를 나타내는 그래프.

도 2는 피멜로박터 sp. R48에 의해 생성된 효소의 최적 pH 를 나타내는 그래프.

도 3은 피멜로박터 sp. R48에 생성된 효소의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

도 4는 피멜로박터 sp. R48에 의해 생성된 효소의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

도 5는 본 발명에 의한 재조합 DNA pBRM8의 구조를 나타내는 도면.

Claims (24)

1. 말토오스를 트레할로오스로 변환하고, 역으로 트레할로오스를 말토오스로 변환하는 재조합형 효소로서, 상기 재조합형 효소는, 아래의 SEQ ID NO:1에서의 아미노산 배열을 가진 상기 재조합형 효소를 코우드하는 DNA 배열을 가진 유전자를 발현시킴으로써 재조합형 숙주 미생물로부터 얻어지는 것인 재조합형 효소.
2. 제1항에 있어서, 아래의 물리화학적 성질을 가진 재조합형 효소.

   (1) 분자량

   소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE) 으로 측정할 경우 분자량 57,000∼67,000 달톤

   (2) 등전점 (pI)

   등전점 전기영동법으로 측정할 경우 4.1∼5.1.
3. 제1항에 기재된 재조합형 효소를 코우드하고, 피멜로박터속(Pimelobacter屬)의 미생물에서 유래하며, SEQ ID NO:2의 염기배열과, 이 염기배열에 대해 상보적인 염기배열로 된 군으로부터 선택되는 염기배열을 가진, 분리된 DNA.
4. 제3항에 있어서, 유전자 코우드의 축중에 따라, 아래의 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 2에서의 염기 1 개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환한 DNA.
5. 제3항에 기재된 DNA와 자체 복제가능한 벡터를 함유하는 복제가능한 재조합 DNA.
6. 제5항에 있어서, DNA가 아래의 SEQ ID NO : 2에 있는 5' 말단을 가진 염기배열 또는 이 염기배열과 상동적인 염기배열 또는 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기배열을 가진 복제가능한 재조합 DNA.
7. 제5항에 있어서, DNA가 유전자 축중에 따라, 아래의 SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 2에서의 염기 1개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여 얻는 것인 복제가능한 재조합 DNA.
8. 제5항에 있어서, DNA가 피멜로박터속의 미생물에서 유래하는 복제가능한 재조합 DNA.
9. 제5항에 있어서, 자체 복제가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+)인 복제가능한 재조합 DNA.
10. 제3항에 기재된 DNA와 자체 복제 가능한 벡터를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를 에쉐리히아 콜리종, 바실루스속, 악티노마이세스속 및 효모로 된 군으로부터 선택되는 숙주 미생물에 도입하여 제조되는 형질 전환체.
11. 제10항에 있어서, DNA가 유전자 코우드의 축중에 따라, 아래의 SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 2의 염기배열에서의 염기 1개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여얻는 것인 형질전환체.
12. 제10항에 있어서, DNA가 피멜로박터속의 미생물에서 유래하는 형질전환체.
13. 제10항에 있어서, 자체 복제가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+)인 형질전환체.
14. (가) 제10항 기재의 형질전환체를 영양배지에서 배양하여 재조합형 효소를 생성시키고,

    (나) 생성된 재조합형 효소를 배양물로부터 채취하는 것을 포함하는, 제1항에 기재된 재조합형 효소의 제조방법.
15. 제14항에 있어서, DNA가 아래의 SEQ ID NO : 2 에 있는 5' 말단에서 시작하는 염기배열 또는 이 염기배열과 상동적인 염기배열 또는 이들 염기 배열에 대해 상보적인 염기배열을 가지는 제조방법.
16. 제15항에 있어서, DNA가 유전자 코우드의 축중에 따라, 아래의 SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 바꾸지 않고 SEQ ID NO : 2의 염기배열에서의 염기 1개 또는 그 이상을 다른 염기로 치환하여 얻는 것인 제조방법.
17. 제14항에 있어서, 자체 복제가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+) 인 제조방법.
18. 제14항에 있어서, 숙주가 에쉐리히아 콜리(Escherichia coli) 종(種) 의 미생물인 제조방법.
19. 제14항에 있어서, (나) 단계 공정에서의 채취방법은 원심분리, 여과, 농축, 염석, 투석, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로 된 군으로부터 선택된 1 종 또는 그 이상인 제조방법.
20. 말토오스에 제1항에 기재된 재조합형 효소를 작용시켜 트레할로오스를 생성시키는 공정을 포함해서 되는 말토오스의 효소적 변환방법.
21. 제20항에 있어서, 말토오스를 50w/v% 까지 함유하는 수성 매체중에 유효량의 재조합형 효수를 공존시켜 4∼45℃의 온도 및 pH 5.5∼9.0에서 효소반응시키는 말토오스의 효소적 변환방법.
22. 제20항에 있어서, 건조고형분 기준으로 트레할로오스를 약 80w/w%까지 함유하는 조성물을 생성하는 말토오스의 효소적 변환방법.
23. 말토오스에 제1항에 기재된 재조합형 효소를 작용시켜 트레할로오스를 생성시키는 공정을 포함해서 되는 말토오스의 효소적 변환방법.
24. 제23항에 있어서, 말토오스의 순도가 건조 고형분 기준으로 약 70w/w% 이상인 말토오스의 효소적 변환방법.

    배열표

    (1) 일반정보

    (i) 출원인 : 가부시기 가이샤 하야시바라 세이부츠 가가구 켄큐조

    (ii) 발명의 명칭 : 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 효소

    (iii) 배열의 수 : 8

    (iv) 주소:

    (A) 수신인 : 가부시기 가이샤 하야시바라 세이부츠 가가구 켄큐조

    (B) 가 (街) : 시모이시 1 쪼오메 2 - 3

    (C) 시 : 오카야마

    (E) 국 : 일본국

    (F) 우편번호 (ZIP) : 700

    (v) 컴퓨터 판독형:

    (A) 미디엄 타입 : 플로피 디스크

    (B) 컴퓨터 : IBM PC 호환형

    (C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS

    (D) 소프트웨어 : Word Perfect version 5.0

    (vii) 선출원 데이타 :

    (A1) 출원번호 : JP 156399/94

    (B1) 출원일 : 1994 년 6 월 16 일

    (2) 배열번호 (SEQ ID NO : 1) 의 정보:

    (i) 배열 특징 :

    (A) 길이 : 568 아미노산

    (B) 배열형 : 아미노산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 분자형 : 펩티드

    (vi) 배열 : SEQ ID NO : 1

    (3) 배열번호 (SEQ ID NO : 2) 의 정보:

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 1704 염기쌍

    (B) 배열형 : 핵산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 배열 (SEQ ID NO : 2) :

    (4) 배열번호 (SEQ ID NO : 3) 의 정보:

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 20 아미노산

    (B) 배열형 : 아미노산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 배열 (SEQ ID NO : 3) :

    (5) 배열번호 (SEQ ID NO : 4) 의 정보 :

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 11 아미노산

    (B) 배열형 : 아미노산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 배열 (SEQ ID NO : 4) :

    (6) 배열번호 (SEQ ID NO : 5) 의 정보 :

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 1704 염기쌍

    (B) 배열형 : 핵산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 분자형 : genomic DNA

    (vi) 기원 :

    (A) 생물명 : 피멜로박터 sp.

    (B) 주명 (株名) : R48 (FERM BP-4315)

    (xi) 배열 (SEQ ID NO : 5) :

    (7) 배열번호 (SEQ ID NO : 6) 의 정보 :

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 17 염기쌍

    (B) 배열형 : 핵산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 분자형 : 프로우브

    (xi) 배열 (SEQ ID NO : 6) :

    (8) 배열번호 (SEQ ID NO : 7) 의 정보 :

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 17 염기쌍

    (B) 배열형 : 핵산

    (D) 토폴로지 : 직쇄상

    (ii) 분자형 : 프로우브

    (xi) 배열 (SEQ ID NO : 7) :

    (9) 배열번호(SEQ ID NO : 8)의 정보 :

    (i) 배열특징 :

    (A) 길이 : 17 염기쌍

    (B) 배열형 : 핵산

    (D) 토플로지 : 직쇄상

    (ii) 분자형 : 프라이머

    (xi) 배열 (SEQ ID NO : 8) :