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KR100355423B1 - 고역가바이러스제조방법및레트로바이러스의중개에의한포유류세포의고효율형질도입방법 - Google Patents

고역가바이러스제조방법및레트로바이러스의중개에의한포유류세포의고효율형질도입방법 Download PDF

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KR100355423B1
KR100355423B1 KR1019950705608A KR19950705608A KR100355423B1 KR 100355423 B1 KR100355423 B1 KR 100355423B1 KR 1019950705608 A KR1019950705608 A KR 1019950705608A KR 19950705608 A KR19950705608 A KR 19950705608A KR 100355423 B1 KR100355423 B1 KR 100355423B1
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마르고 알 로버트
토마스 제이 둘
크리스티나 엠 제스보
퀸루
데보라 에이 파르손
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쎌 제네시스, 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 레트로바이러스 패키징 구조체와 패키징 벡터 전사체가 인간세포에서 형질감염에 의해 고효율 발현 플라스미드로부터 생산되는 신규한 레트로바이러스성 패키징 시스템을 제공한다. 고역가의 재조합 레트로바이러스가 감염된 세포에서 생산된다. 본 발명의 방법은 공배양에 의해 T세포와 인간의 조혈간세포를 포함하는 1차 인간세포에 외래유전자를 고효율로 형질도입시키기 위해, 상기 신규의 레트로바이러스 구조체를 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명은 통상의 수단에 의해서는 형질도입이 어려운 세포를 고효율로 형질도입시키고, 고역가 바이러스 상등액을 신속하게 생산하는데 유용하다.

Description

고역가 바이러스 제조방법 및 레트로바이러스의 중개에 의한 포유류 세포의 고효율 형질도입방법
[발명의 분야]
본 발명은 신규의 레트로바이러스 구조체들과, 포유류 세포에서 재조합 레트로바이러스를 일시적으로 생산하는데 있어서의 이들의 용도 및 이러한 구조체들을 포유류 세포에 고효율로 형질도입시키는 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
레트로바이러스 벡터는 인간의 유전자 요법에 있어서 유전자 전달을 위한 1차적인 수단이 되어 왔다 (Miller, Nature 357: 455-460(1992)). 일차 배양에서 설치류, 영장류와 인간의 광범위한 체세포에 재배열되지않은 단일 복사본의 유전자를 전달하는 레트로바이러스 벡터의 능력으로 인해 이들은 상기의 목적에 매우 적합하다. 조류(E)와 쥐(Ψ )의 레트로바이러스에 대한 패키징 신호를 코딩하는 레트로바이러스 전사체내에 존재하는 서열을 확인하고 결실시킴으로써, 감염성 비리온의 생산에 필요한 단백질을 트랜스요소로 공급하는 패키징 세포주의 개발이 가능해졌으나, 패키징 세포주는 자신의 고유 바이러스 게놈 mRNA를 패키징할 수 없게 된다 (Watanabe and Temin, Molec. Cell.Biol. 3(12):2241- 2249 (1983): Mann등, Cell 33:153-159 (1983): and Embretson and Temin, J.Virol. 61(9):2675-2683 (1987)). 레트로바이러스 패키징 세포주를 제조하는데 있어 가장 중요하게 고려해야 할 사항은 재조합 복제가능 레트로바이러스(replication competent retrovirus)가 없는 고역가 벡터 상등액을 생산하는 것인데, 재조합 복제가능 레트로바이러스는 설치류 (Cloyd 등, J. Exp.Med. 151, 542-552 (1980))와 영장류 (Donahue 등, J. Exp.Med. 176, 1125-1135 (1992))에서 T 세포 임파종을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 비록 초기의 쥐의 레트로바이러스 패키징 세포주가 복제가능 레트로바이러스(RCR) (Cone and Mulligan, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 81; 6349-6353 (1984))를 생산하거나 또는 Ψ -게놈을 동시-패키징 (Mann 등, 상기 참조, 1983; Buttimore and Miller, Mol.Cell.Biol. 6(8):2895-2902 (1986))하는 경향이 컸지만, 상당히 감소된 RCR 발생 능력을 가진 제 2세대 패키징계를 제조하는 두가지 방법이 개발되었다. 그중 한가지 방법은 PA317에 의해 구체화되었는데, 제2가닥 합성을 위한 개시부위 인, 3' LTR과 Ψ부위가 결실된 단일 게놈 패키징 구조체를 이용하는 방법이다 (Miller and Buttimore, Molec. cell. Biol. 6(8):2895-2902 (1986)). 이와 같은 변형은 바이러스 벡터와 패키징 게놈 사이에 있을 수 있는 상동성(homology)을 제거함으로써 재조합체를 형성하는 능력을 감소시키게 되고, 그 결과 많은 벡터 시스템을 이용하여 고역가의, 헬퍼(helper)가 없는 바이러스를 생산하게 되었다 (Miller and Rosman, Biotechniques 7(9): 980-990 (1989)). 두 번째 방법은 패키징 기능을 두 개의 게놈으로 나누는 것인데: 하나는 gag와 pol 유전자 산물을 발현시키는 것이고, 다른하나는 env 유전자 산물을 발현시키는 것이다 (Bosselman 등, Molec.Cell.Biol. 7(5):1797-1806 (1987)); Markowitz 등, J. Virol. 62(4): 1120-1124 (1988); Danos and Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci.(USA) 85:6460-6464 (1988)). 이와같은 접근방식은, 패키징 세포에서 RCR을 생산하기 위해 재조합을 해야만 하는 세개의 레트로바이러스성 게놈의 존재로 인한 재조합의 빈도를 상당히 감소시킬뿐만 아니라, Ψ-게놈의 동시패키징 능력과 후속적인 전이능력을 제거했다. 재조합체가 발생하는 경우에, 원하지 않는 유전자 산물내에서 돌연변이 (Danos and Mulligan, 상기 참조) 또는 결실 (Boselman 등, 상기 참조: and Markowitz 등, 상기 참조)이 일어나면 재조합체가 기능을 하지 못하게 된다. 또한, 두개의 패키징 기능 구조체에서 3' LTR이 결실되면 기능적인 재조합체를 형성하는 능력이 더욱 감소된다. 두개의 게놈 패키징계의 발생에 대한 초기시도에서는 낮은 역가의 생산자 클론이 만들어졌지만 (Bosselman등, 전술한 바와 동일), 현재는 고역가의 생산자 클론을 만들 수 있다 (Danos and Mulligan, 상기 참조: and Markowitx 등, 상기 참조).
현재 이용가능한 패키징 세포주는 유전자 치료용으로 인간의 세포에 형질도입시키기에 충분한 역가의 생산자 클론을 만들어내며, 이에 따라 인간에 대한 임상시험도 시작되었다 (Miller, 상기 참조). 그러나, 이들 패키징 세포주에는 두 개의 영역이 결여되어 있다. 첫째, 특별한 용도를 위해 적절한 레트로바이러스 벡터를 디자인하기 위해서는, 여러 가지 벡터 구조체들을 만들어 시험해야 한다. 예를 들어, 벨몬트 등 (벨몬트 등, Molec. and Cell. Biol. 8(12):5:5116-5125 (1988))은 최대 역가 생산자를 만들고, 또한 적정 발현을 제공할 수 있는 벡터를 찾기 위해 16개의 레트로바이러스 벡터로부터 안정한 생산자 세포주를 만들었다. 이러한 구조체중의 일부에 대해; (1) LTR에 의해 유도되는 발현 대 내부 프로모터; (2) 바이러스 또는 세포 유전자로부터 유도된 내부 프로모터의 선택: 및 (3) 선택가능한 마커가 구조체내에 포함되어 있는지의 여부가 조사되었다. 안정한 생산자 세포주를 발생시킬 필요 없이 고역가 바이러스를 신속하게 생산할 수 있는 패키징 시스템은, 여러 가지의 구조체로부터 유도된 고역가 생산자 클론의 확인에 요구되는 약 2개월의 기간이 절약된다는 점에서 매우 유리하다.
둘째로, NIH 3T3 세포와 비교할때, 고역가 양쪽성 레트로바이러스 생산자 세포에 의한 포유류 체세포의 1차 배양의 감염효율은 상당히 다양하다. 쥐의 근원세포 (Dhawan 등, Science 254: 1509-1512 (1991)) 또는 쥐의 모세 내피세포 (Yao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8101-8105 (1991))의 형질도입효율은 NIH 3T3 세포의 형질도입효율과 거의 동일한 것으로 나타났지만, 반면에 개의 간세포의 형질도입효율 (Armentato 등, Proc, Natl. Acad, Sci. USA 87:6141-6145 (1990))은 NIH 3T3 세포에서 발견되는 효율의 단지 25% 수준이었다. 인간의 1차 종양-침윤성임파구("TIL"), 말초혈액 임파구에서 분리한 인간의 CD4+ 와 CD8+ T 세포, 그리고 영장류의 장기(long-term) 재구성 조혈간세포는 NIH 3T3 세포와 비교할 때 낮은 형질도입 효율을 나타내는 극단의 예이다. 정제된 인간의 CD4+ 와 CD8+ 7 세포는 안정한 생산자 클론의 상등액에 의해 6-9% 수준으로 감염된 경우가 보고되었고 (Morecki 등, Cancer Immunol. Immunother, 32: 342-352 (1991)), 영장류 또는 인간의 장기 재구성 조혈간세포는 NIH 3T3 세포에서 1ml 당 106개의 역가를 가진 생산자 세포에 의해 단지 1% 이하가 감염되었다 (Van Beusechem 등, Proc. Nat1. Acad.Sci. USA 89:7640-7644(1992): and Donahue 등, 상기 참조). 레트로바이러스벡터가 neoR유전자를 포함하는 경우에는, 형질도입된 세포가 매우 풍부한 집단은 G418을 이용한 선택에 의해 얻어질 수 있다. 그러나, 선택가능한 마커의 발현은 조혈간세포에서 장기 유전자의 생체내 발현에 악영향을 주는 것으로 밝혀졌다 (Apperly등, Blood 78: 310-317 (1991)).
따라서, 1차배양에서 포유류 세포의 형질도입을 크게 증가시키는 방법이 매우 유리할 것이며, 이와 같은 요구는 현재 충족되지 않았다.
[발명의 요약]
따라서, 본 발명은 신규의 플라스미드를 기본으로 하는 발현 벡터들을 제공하는데, 이러한 벡터들은 일시적인 형질감염에 의해 인간세포에서 고역가의 재조합 레트로바이러스의 신속한 생산에 필요한 레트로바이러스 유전자 산물과 패키징 가능한 레트로바이러스 벡터 전사체의 합성을 가능하게 함으로써, 안정한 생산자 세포주를 생산할 필요성을 제거한다. 또한, 본 발명은 이전에는 레트로바이러스 구조체에 의해 형질도입시키기가 어려운 것으로 설명되었던 포유류 세포에 대한 고효율형질도입방법을 제공한다. 본발명은 또한, 세포계의 구축방법에 대해서도 기재하고 있는데, 이 방법에 따르면, 바이러스 생산을 위해 트랜스요소로 요구되는 레트로바이러스 유전자 산물의 합성을 이끄는 본 발명의 플라스미드에 기초한 발현벡터가 생산세포의 게놈으로 안정하게 삽입된다. 이렇게 안정하게 형질감염된 세포주는 고역가로 재조합 레트로바이러스를 연속적으로 생산하는 안정한 세포주를 만드는데 이용될 수 있다.
상기 레트로바이러스 구조체들은, 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 요구되는 모든 비리온 단백질을 트랜스요소에서 코드화하는 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래된 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 패키징 플라스미드로서, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산할 수 있다. 상기 레트로바이러스 DNA 서열은 바이러스의 바이러스성 5' LTR의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하는 영역을 결여하고 있으며, 헬퍼 게놈을 포장하는데 필요한 psi 기능 서열과 3' LTR을 결여하고 있으나, 바이러스 생산을 필요로 하는 세포 유형에서 효율적인 전사를 이끄는 외래 인핸서 및/또는 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 부위를 코드화한다. 레트로바이러스는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV)와 같은 백혈병 바이러스, 인간의 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV)이다. 외래 인핸서와 프로모터는 인간의 사이토메갈로바이러스(HCMV) 즉시초기(IE) 인핸서와 프로모터, 몰로니 쥐 육종 바이러스(MMSV)의 인핸서와 프로 모터(U3 영역), 라우스 육종 바이러스(RSV)의 U3 영역, 지라 포커스 형성 바이러스 (SFFV)의 U3 영역, 또는 원래의 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV) 프로모터에 결합된 HCMV IE 인핸서일 수 있다. 레트로바이러스 패키징 플라스미드는 플라스미드에 기초한 발현벡터에 의해 코드화되는 두 개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA서열로 구성되는데, 예를 들면, 제1헬퍼 서열은 에코트로픽 (ecotropic) MMLV의 gag와 pol 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하고, 제2헬퍼 서열은 env 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함한다. 숙주범위를 결정하는 Env 유전자는 제노트로피성, 암포트로피성, 에코트로피성, 폴리프로피성(밍크 포커스 형성) 또는 10Al 쥐의 백혈병 바이러스 env 단백질을 코딩하는 유전자에서 유도될 수 있으며, 또한 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) env 단백질, 인간의 면역결핍 바이러스 env (gp160) 단백질, 소포 구강 바이러스(VSV) G단백질, 인간의 T세포 백혈병(HTLV) 타입 I,II env 유전자 생성물, 전술한 env 유전자의 하나이상의 조합에서 유도된 키메라 외피유전자 또는 전술한 env 유전자 생성물의 세포질막과 전달막(transmembrane)을 코딩하는 키메라 외피유전자 및 원하는 표적세포상의 특정의 표면분자에 대한 단일클론 항체로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 레트로바이러스 패키징 플라스미드의 특정 예는 다음과 같다: pIK6.1MMSVampac, pIK6.1MCVampac, pIK6.1gagpolATG, pIK6.1amenv ATc.
본 발명은 변형된 5' LTR을 가진 레트로바이러스 벡터를 포함하는데, 이것은 원하는 세포 유형에서 패키징가능한 벡터 전사체의 효율적인 전사를 가능하게 한다. 또한 본 발명은 외래 유전자를 코딩하는 레트로바이러스 구조체를 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, 패키징 플라스미드와 레트로바이러스 벡터는 인간의 배아 신장세포 예컨데 293 세포(ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, MD)와 같은 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포의 제1집단에 일시적으로 동시형질감염되어, 고역가의 재조합 레트로바이러스를 함유하는 상등액을 생산한다. 본 발명의 또다른 방법에 따르면, 이와 같은 일시적으로 형질감염된 제1집단 세포를 인간의 임파구와 같은 포유류 표적세포와 함께 배양시킴으로써, 외래 유전자에 의해 표적세포가 고효율로 형질도입된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산되는외래 유전자를 발현하는 표적세포를 포함한다. 외래 유전자는 CD4/제타 또는 단일-항체사슬/제타 T세포수용체와 같은 키메라 T세포 수용체일 수 있다.
제 1도는 레트로바이러스 벡터 전사체를 패키징하는데 필요한 단백질을 생산하는데 이용되는 본 발명의 레트로바이러스 패키징 플라스미드를 나타내는 개략도 이다:
pIK6.1MMSYampac, pIK6.1MCVampac, pIK6.1gagpolATG, pIK6.1amenvATG.
제 2A, 2B, 2C 및 2D도는 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 레트로바이러스 구조체에 의해 형질감염된 293 세포의 FACS 프로파일을 나타낸다.
제 3A 및 3B도는 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 감염된 3T3 DNA의 서든블랏 분석에 의해 결정된 형질도입효율을 나타낸다.
제 4도는 실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이, pRTD2.2F3 또는 pTRD2.2F15와 pIK6.1MCVampac에 의해 293 세포를 일시적으로 형질도입시킨 다음, CD8+ T 세포와 함께 293 세포를 배양한 후 FACS에 의해 형질도입효율을 분석하여 얻은 결과를 나타내는 그래프이다.
제 5A, 5B, 5C 및 5D도는 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이, KAT 패키징 구조체를 이용하여 조혈간세포를 형질도입시킨 다음 293 세포와 함께 배양한 후 FACS 분석에 의해 얻은 결과를 나타낸다.
제 6도는 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이, KAT에 의해 형질감염된 293 세포와 CD34+를 함께 배양하여 고효율의 형질도입이 이루어졌는지의 여부를 서던블랏팅에 의해 분석한 결과를 나타낸다.
제 7도는 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이, KAT 시스템에 의해 형질도입된 CE4+ 세포의 형질도입효율과 안정한 PA317 생산자와의 공배양시의 형질도입효율을 서던 블랏팅 분석방법에 의해 비교하여 나타낸 것이다.
제 8A, 8B, 8C, 8D 및 8E도는 실시예 4에 기재되어 있는 바와 같이 KAT pIKT레트로바이러스 구조체를 이용하여 인간의 CD34+ 조혈선조체를 형질도입시킨 다음, pIKT벡터를 이용하여 293 세포를 형질감염시키고 이어서 이들을 함께 배양한 후 얻은 FACS 분석결과를 나타낸다.
본 명세서에 기재된 발명을 좀 더 완전하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 다음과 같은 상세한 설명을 제시한다.
본 발명은 레트로바이러스성 비리온의 생산을 위한 신규의 최적화된 일시적발현 플라스미드(이하 "KAT")를 제공하는데, KAT 플라스미드가 효율적인 일시적 형질감염 및 발현이 가능한 포유류 세포에 형질도입되면, 바이러스 벡터와 패키징 기능 플라스미드의 복제 없이도, 매우 안정한 상태의 레트로바이러스 패키징 기능과 패키징가능한 벡터 전사체가 생산된다. 플라스미드 복제의 부재는 고역가 비리온의 생산을 가능하게 하고 동시에 재조합에 의한 복제가능 레트로바이러스의 생산가능성을 최소화시킨다. KAT 시스템을 이용하게 되면, 패키징 기능과 벡터 플라스미드를 COS 세포에 동시형질감염시키는 경우와 비교할 때 10-30배 더 높은 바이러스 역가가 얻어진다(Landau and Litman, J. Virol. 66(8): 5110-5113 (1992)). 또한,KAT 패키징 기능과 바이러스성 벡터 플라스미드가 SV40 복제 개시점을 포함하고 있기 때문에, 이들은 tsa201과 같은 SV40 T 항원의 발현으로 인해 SV40 개시점-함유 플라스미드의 복제가 가능한 세포계 내로 형질감염될 수 있다(Heinzel 등, J. Virol. 62(10):3738-3746 (1988)). XAT 시스템을 이용하면, 플라스미드 복제의 존재하의 바이러스 역가는 복제 부재하의 바이러스 역가에 비해 3-10배 높다. 복제성 또는 비-복제성 플라스미드 중 어느 것을 사용하든, KAT 시스템은 안정한 생산자 세포주를 발생시킬 필요없이 고역가의 재조합 레트로바이러스 상등액의 신속한 생산을 가능하게 한다.
본 발명의 레트로바이러스 구조체는 또한, 종래의 통상적인 수단에 의한 형질도입이 매우 어려운 1차 인간 세포와 같은 포유류 세포와 함께 배양되는 경우 이들 세포를 고효율로 형질도입시키는데도 이용될 수 있다.
본 발명의 플라스미드는 또한 레트로바이러스 입자의 생산을 위해 트랜스요소로 요구되는 레트로바이러스 단백질: gag, pol 및 env을 구성적으로 생산하는 안정한 세포계를 구축하는데도 이용될 수 있다. 이와 같이 안정한 패키징 구조체는 neo, DHFR*, Gln 합성효소, ADA와 같은 우성 선택가능한 마커와 함께 인산칼슘 형질감염 또는 전기영동에 의해 인간의 세포주로 도입되어 적절한 약물에 의한 선택과정을 거쳐 클론의 분리가 이루어지게된다. 이로써, 이들 세포내로 레트로바이러스 구조체가 도입되면 고역가의 안정한 생산자 클론이 생산될 수 있는 것이다. 이들 세포계는 모두 일시적으로 형질감염된 생산자 세포와 동일한 성질을 가진다. 그러나, 패키징 기능과 바이러스 벡터의 안정한 삽입으로 인해, 이들은 고역가 레트로바이러스를 무한정으로 계속 생산하게 된다.
패키징 기능을 포함하는 플라스미드는 gag 와 pol 유전자를 코딩하는 것과 env유전자 생성물을 코딩하는 것으로 나누어질 수 있다. 두 개의 바이러스 게놈을 포함하는 패키징 세포주가 보고된 바 있으며 (Bosselman 등, Molec. Cell. Biol. 7(5):1797-1806 (1987); Markowitz 등, J.Virol. 62(4):1120-1124 (1988): Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 85:6460-6464 (1988)), 이들은 레트로바이러스 벡터와 패키징 구조체 사이의 재조합에 의한 복제가능 레트로바이러스 (RCR)의 생성기회가 상당히 감소되어 있기 때문에 바람직하다. 본 발명의 플라스미드를 사용하면, 고효율의 일시적인 형질도입 시스템을 생성하는 패키징 세포주가 만들어지게 되며, 또한 안정한 패키징 시스템이 쉽게 만들어지게 되고 두 개의 게놈으로된 패키징 시스템의 안전성도 확보된다. 본 발명의 신규 플라스미드는 전술한 두 개의 게놈으로 된 패키징계에 비해 상당히 개선된 것이다. gag, pol 및 env 유전자를 코딩하는 KAT 플라스미드는, 레트로바이러스 게놈으로부터의 단백질 코딩서열만이 존재하도록 만들어졌다. 본 명세서에 기재된 레트로바이러스 벡터를 이용하면, 3' 말단에 레트로바이러스 벡터와 패키징 게놈 사이에 중복부분이 없게 된다. 돌연변이 (Danos and Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA)85:6460-6464 (1988)) 또는 결실 (Bosselman 등, Molec. Cell. Biol. 7(5): 1797-1806 (1987); Markowitz 등, j.Virol. 62(4)1120- 1124 (1988))을 포함하는 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 전술한 패키징 세포주와 비교할 때, 벡터내의 gag 개시코돈(ATG)을 종료코돈으로 대체시킨 조합 형태의 구조체는 복제가능 레트로바이러스 생산을 완전히 배제한다. 이와 같은 기존의 공지된 패키징 세포주는 패키징 세포주와 바이러스 벡터의 3' 말단에 중복부분을 가지고 있어 잠재적으로 RCR을 생산할 수 있다.
두 개의 게놈 패키징 세포주가 gag, pol플라스미드의 도입에 이어 env-함유 플라스미드의 도입에 의해 만들어진다. env 유전자는 세포 표면 수용체의 인식을 담당한다. 5개의 기능적으로 및 구조적으로 상이한 env 유전자가 쥐의 백혈병 바이러스에서 확인되었고, 유전적으로 구별되는 수용체 (Battini 등, J. of Virol. 66:1460-1475 (1992))를 가지는 것으로 밝혀졌다. 쥐의 백혈병 바이러스 벡터의 숙주범위에 인간이 포함될 수 있는 경우는 에코트로픽 MLV gagpol을 발현하는 세포계내로 암포트로픽 env 유전자를 도입시킬때이다 (Danos and Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988)). 긴팔원숭이 백혈병과 고양이 백혈병 바이러스뿐만 아니라 제노트로픽 10Al MLV 바이러스 역시 숙주범위에 인간이 포함된다. 이들 env 운전자의 cDNA 클론을 이용하면, gag pol계로 하나 이상의 env 유전자가 안정하게 도입될 수 있어서, 레트로바이러스 벡터의 도입에 의해 생산되는 레트로바이러스가 복수개의 유전학적으로 구별되는 수용체를 통하여 표적내로 들어갈 수 있는 패키징계를 만들게 된다. 이는 겉보기 바이러스 역가를 실질적으로 상승시킨다. 본 발명의 벡터는 이러한 형태의 신규 패키징 세포주를 만드는 능력을 제공한다.
벡터를 만들고 세포를 형질감염시키고 감염시키는데 이용되는 기술의 대부분은 당해 기술분야에서 널리 실행되고 있는 것이며, 대부분의 실행자들은 특정 조건과 과정이 명시된 표준자료 (Standard resource material)에 대하여 잘 알고 있다.그러나, 편의를 위해 다음의 문단들이 가이드라인으로 제공될 수 있다.
본 발명의 벡터를 제조하는데는 당해 기술분야에서 잘 알려진 표준결합과 제한효소 기술이 이용된다 (Maniatis 등, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y.(los2)). 분리된 플라스미드, DNA 서열 또는 합성된 올리고뉴클레오티드는 원하는 형태로 절단되고, 정리되고 재결합된다.
부위-특이적 DNA 절단은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 조건하에 적절한 제한효소 (또는 효소들)로 처리함으로써 이루어지고, 이에 대한 상세한 설명은 상업적으로 입수가능한 제한효소의 제조업자에 의해 명시된다 (예를 들어, New England Biolabs, Product Catalog 참조). 일반적으로, 약 1㎍의 플라스미드 또는 DNA 서열이 약 20㎕ 완충액에 존재하는 1유니트 효소에 의해 절단된다. 일반적으로, DNA 기질의 완전한 분해가 보장되도록 과량의 제한효소가 사용된다. 변화를 시킬 수는 있다고 할지라도, 약 37℃에서 약 1 내지 2시간의 배양시간으로 작업할 수 있다. 각각의 배양후에 페놀/클로로포름을 이용한 추출에 의해 단백질을 제거하고, 이어서 에테르 추출을 실시할 수 있으며, 핵산은 에탄올 침전에 의해 수성 분획으로부터 회수한다. 필요하다면, 표준기술을 이용하여 폴리아크릴아미드겔 또는 아가로즈겔 전기영동에 의해 절단된 DNA 단편을 크기별로 분리할 수 있다. 크기분류의 일반적인 설명은 참고문헌(Methods of Enzymology 65:499-560 (1980))에 기재되어 있다.
제한효소에 의해 절단된 단편은, 4종류의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 존재하에 50mM트리스 (pH 7.6), 50mM NaCl, 6mM MgCl2, 6mM DTT 와 5-10μ M dNTP로 된 용액중에서 20℃에서 15-25분간 대장균 DNA 중합효소 I(Klenow)의 거대단편으로 처리함으로써, 그 말단이 비접착성 말단으로 될 수 있다. 4종류의 dNTP가 존재하더라도, 클리노우(Klenow) 단편은 5' 접착성 말단에 채워지지만, 돌출된 3' 단일가닥에 대해서는 그러하지 아니하다. 필요하다면, 접착성 말단의 특성에 따른 제한범위내에서, 선택된 dNTP를 이용하거나 또는 dNTPs중 단지 하나만을 공급함으로써 선택적 수선이 이루어질 수 있다. 클리노우 처리후에, 혼합물에 대해 페놀/클로로포름 추출을 실시하고 에탄올로 침전시킨다. 적절한 조건하에 S1 뉴클레아제 또는 Bal-31로 처리하게 되면 임의의 단일가닥부분의 가수분해가 이루어진다.
결합은 다음의 표준조건과 온도하에 15-50㎕ 용량에서 실시된다: 0℃에서 20mM 트리스-Cl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 33mg/ml BSA, 10mM-50mM NaCl과 40μM ATP, 0.01-0.02(Weiss) 유니트의 T4 DNA 리가아제 ("접착성 말단" 결합용) 또는 14℃에서 1mM ATP, 0.3-0.6(Weiss) 유니트의 T4 DNA 리가아제 ("비접착 말단" 결합용). 분자간 "접착 말단" 결합은 통상적으로 33-100μg/ml 총 DNA 농도 (5-100mM 최종농도)에서 실행된다. 분자간 "비접착 말단" 결합 (통상적으로 링커를 10-30배 초과하여 이용)은 총 1μM 최종농도에서 실행한다.
레트로바이러스 벡터와 KAT 시스템의 패키징 플라스미드는 다음과 같이 제조한다:
신규 레트로바이러스 벡터와 패키징 플라스미드의 생산
KAT 구조체는, 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 요구되는 모든 비리온 단백질을 트랜스 요소에서 코드화하는 백혈병 바이러스 게놈과 같은 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래된 것으로서, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이, 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산하는 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 패키징 플라스미드를 포함한다. 하나의 구체적인 실시예에 있어서, 레트로바이러스 패키징 DNA서열은 바이러스의 바이러스성 5' LTR 의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코딩하는 영역을 결여하며, 3'LTR뿐만 아니라 헬퍼게놈을 패키징하는 역할을 하는 psi 기능 서열이 없으나, 바이러스 생산을 필요로 하는 세포 유형에서 효율적인 전사를 이끄는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하고, SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 외래 인핸서와 프로모터의 전사 개시부위는 5' LTR의 "R" 영역의 5' 말단에서 백혈병 바이러스 게놈에 결합된다.
레트로바이러스는 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스(MMLV), 인간의 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV)일 수 있다. 5' LTR 의 "R" 영역에 결합되는 외래 인핸서와 프로모터는 인간의 사이토메갈로 바이러스(HCMV) 즉시초기(IE) 인핸서와 몰로니 쥐의 육종 바이러스(MMSV)의 인핸서와 프로모터(U3 영역), 라우스 육종 바이러스(RSV)의 U3 영역, 지라 포커스 형성 바이러스(SFFV)의 U3 영역, 또는 원래의 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스(MMLV)프로모터에 결합된 HCMV IE 인핸서일 수 있다.
모든 psi(Ψ)-패키징 플라스미드는 플라스미드 pIK1.1의 유도체이다.pIK1.1은 pMF2 내로 4회 연속삽입시킴으로써 제조되는 포유류 발현벡터인데, 이는 Kpnl과 Sacl 부위가 소실되면서 pSKII (Stratagene, San Diego, CA)의 KpnI과 SacI 부위내로 합성 폴리링커인 5'-HindIII-SphI-EcoRI -AatII-BglI-XhoI-3'가 삽입됨으로써 만들어진다. 첫 번째 단계에서, SV40 T 항원 폴리아데닐화 부위(SV40의 뉴클레오티드 2270 내지 2533, Reddy등, Science 200:494 -502(1978))와 SV40 복제 개시점(SV40의 뉴클레오티드 5725 내지 5578)을 포함하는 NheI-SalI 단편이, BglII, XbaI, NheI, SalI 와 XhoI 부위가 소실되면서, BglII와 XhoI 부위 사이에 세부분 결합방식에 의해 삽입된다. 이들 BamHI-XbaI와 NheI-SalI 단편은, pSV2neo (Southern and Berg, J.Mol.Appl,Gen. 1:327-341 (1982))를 주형으로 하고 각 단부에 BamHI, XbaI, NheI과 SalI 부위를 포함하고 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍 3과 4, 5와 6을 이용하여 PCR에 의해 합성된다. 두 번째 단계에서, 인간의 α 1 글로빈 운전자 제2 엑손(뉴클레오티드 +143~+251)의 스플라이스 수용체를 포함하는 SphI-EcoRI 단편이 SphI과 EcoRI 부위 사이에 삽입된다. SphI-EcoRI 단편은 pπ SVαHP (Treisman 등, Proc, Natl. Acad. Acad.Sci.USA 80:7428-7432(1983)를 주형으로 하고 각 단부에 SphI과 EcoRI 부위를 포함하는 올리고뉴클레이오티드 프라이머 7과 8을 이용하여 PCR에 의해 합성된다. 세 번째 단계에서, 합성 폴리링커인 5'-EcoRI-BglII-NcoI- ApaI-AatII-3'가 EcoRI과 AatII 부위 사이에 삽입된다. 네 번째 단계에서, CMV IE 인핸서/프로모터(뉴클레오티드 -674 ~ -19, Boshart 등, Cell 41:521- 530 (1985))를 포함하는 HindlII-Sacl 단편과 CMV IE 제1엑손/스플라이스 공여자(뉴클레오티드 -19 ~ +170)를 포함하는 화학적으로 합성된 SacI-SphI단편이 HindIII와 SphI 부위 사이에 세부분 결합방식에 의해 삽입된다. HindIII-SacI 단편은 pCDM8(Seed, Nature 329:842 (1987); Seed and Aruffo, Proc. Natl.Acad Sci. USA 84:3365-3369 (1987))을 주형으로 하고 각 단부에 HindIII 와 SacI 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 9와 10을 이용하여 PCR에 의해 제조된다.
Xba I 부위는 -19~+170을 코딩하는 화학적으로 합성된 Sac I/Sph I 올리고뉴클레오티드를, pIK6.1을 만들기 위해 뉴클레오티드 +1~+6 에 Xba I 부위가 도입되어 있는 화학적으로 합성된 Sac I/Sph I 올리고뉴클레오티드로 대체시킴으로써 pIK1.1의 HCMV IE 프로모터의 전사 개시부위에 도입된다. 이로 인해, Hind III-Xba I 카세트로서 임의의 인핸서/프로모터의 삽입이 가능해짐에 따라 원하는 세포 유형에서 원하는 서열을 가능한 최대 수준으로 발현시키게 될 적절한 인핸서와 프로모터의 삽입도 가능해진다. 쥐의 섬유아세포 NIH 3T3(ATCC CRL 1658) 또는 엠. 던니(M. dunni(ATCC CRL2017))에서 최대 발현수준을 얻기 위하여, 완전한 MMSV U3 영역이 2개 프라이머와 주형으로 플라스미드 pN7(Miller 등, Mol. Cell. Biol. 5:431-437 (1985))를 이용하여 PCR에 의해 합성되었다. 2개의 프라이머 중 하나는 Hind III 부위와 U3의 5'의 21개의 뉴클레오티드를 코딩하는 것이며, 다른 하나는 MMLV U3 영역의 3'의 21개의 뉴클레오티드와 Xba I 부위를 코딩하는 것이다. 이러한 PCR 단편을 pIK6.1의 Hind III와 Xba I 부위 사이에 클로닝하여 pIK6.1MMSV를 만들었다. 인간의 세포에서 높은 수준의 발현을 이끌기 위해, HCMV IE 인핸서의 Nco I/Spe I 단편(Boshart 등, 상기 참조)을 분리하여, 합성 올리고뉴클레오티드 Bcl I 링커를 부가하고, 플라스미드 p△HB(Dr. P . Robbins, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA)의 Bam HI 부위에 삽입시킴으로써 pIK6.1MCV를 만들었다. 이 플라스미드를 pMCV로 명명하였다. p△HB는, 3' LTR을 포함하는 바이러스 서열을 지닌 pZIPneoSVX (Cepko 등, 상기 참조)의 ClaI-Eco RI 단편이 pBR322 의 ClaI과 EcoRI 부위내에 클로닝되어 있고 MMLV U3 의 Sau 3AI-Hpa II 인핸서 단편이 제거된 플라스미드이다. MMLV U3와 MMSV U3 사이의 상동성으로 인해, 전술한 PCR 프라이머를 이용하여 pMCV의 U3 단편을 코딩하는 Hind III/Xba I 렁커 단편을 만들었으며, 이것을 pIK6.1에 클로닝하여 pIK6.1MCV를 만들었다. 이들 플라스미드와 pIK6.1은 pIK 폴리링커의 3' 말단의 Apal 부위와 SV40 폴리아데닐화 부위의 Hpa I 부위 사이에 SV40 112개의 뉴클레오티드로 된 폴리아데닐화 부위를 결실시키고, Nhe I 링커를 대체시킴으로써 추가의 변형과정을 거쳐 pIK6.1Nhe, pIK6.1 MMSV. Nhe 와 pIK6.1MCV.Nhe를 만들었다.
pIK6.1MMSVampac과 pIK6.1MCVampac은, U3의 일부분, R과 U5 영역, gag 유전자와 pMOV psi-(Mann등, 상기 참조)의 pol 유전자의 일부를 코딩하는 3813개의 염기로 된 Sac I/Sal 단편과, pCRIPamgag-2 (Dr. O. Danos, Institute Pasteur, Paris, France)에서 유도된, pol/env를 코딩하는 4140개의 염기쌍으로 된 Sal 1-Nhe I 단편을, 각각 pIK6.1MMSV.Nhe 또는 pIK6.1MCV.Nhe의 Sac I과 Nhe I 부위 사이에 삽입함으로써 만들어졌다. pCRIPamgag-2 는 pBR322 플라스미드 기본구조가 플라스미드 pUC19로 대체된 pCRIPamgag의 유도체이다. 그 결과 생성되는 플라스미드는 에코트로픽 MMLV에서 유래된 gag와 pol 유전자와 4070A 암포트로픽 MLV(Chattopadhyay 등, J. Virol. 39(3):777-791 (1981))에서 유래된 외피유전자를 코딩하는데, 제 1A도에 도시되어 있는 바와 같다.
pIK6.1MCVampac의 외피유전자로부터 판독되지 않은 서열 3'를 제거하기 위해, 합성 올리고뉴클레오티드 5'CTGATCTTACTCTTTGGACC3'와 5'GAATTCGCTAGCCTATGGCTCGTACTCTATAG3'와 주형으로서 pIK6.1MCVampac을 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. 생성된 142개의 염기쌍으로 된 PCR 생성물을 ClaI과 NheI을 이용하여 절단하였다. 100개의 염기쌍으로 된 단편을 절단하고 이를 이용하여, pIK6.1MCVampac의 상응하는 172개의 염기쌍으로 된 ClaI-NheI 단편을 대체시켜 pIK6.1MCVampac UT△를 만들었다.
pIK6.1amenvATGUT△는, pIK6.1amenvATG의 172개의 염기쌍으로 된 ClaI-NheI 단편을 pIK6.1MCVampacUT△의 100개의 염기쌍으로 된 ClaI-NHeI 단편으로 대체시킴으로써 만들었다. pIK6.1MCVamenvATGUT△는 pIK6.1amenvATGUT△의 알파 글로빈 스플라이스 수용체와 CMV 프로모터를 포함하는 961개의 염기쌍으로 된 Hind III-Eco RI 단편을 이에 상응하하는 pIK6.1MCV의 896개의 염기쌍으로 된 Hind III-Eco RI으로 대체시킴으로써 만들었다.
pIK6.1MCVgagpolATG는, pIK6.1gagpolATG의 알파 글로빈 스플라이스 수용체와 CMV 프로모터를 포함하는 961개의 염기쌍으로 된 Hlnd III-EcoRI 단편을 이에 상응하는 pIK6.1MCV의 896개의 염기쌍으로 된 Hind III-Eco RI 단편으로 대체시킴으로써 만들었다.
pIK6.1MMSVampac와 pIK6.1MCVampac로 명명된 본 발명의 레트로바이러스 패키징 플라스미드는, American Type Culture Collection (ATCC: 12301 Parklawn Drive, Rockille, Maryland)에 부다페스트 조약에 따라 다음과 같이 기탁되었다.
또 다른 구체적인 실시예에 있어서, 패키징 기능은 예를 들어 두 개의 헬퍼서열같은 플라스미드에 기초한 두 개의 벡터에 의해 코드화될 수 있는데, 이때 제1 헬퍼서열은 에코트로픽 MMLV의 gag와 pol 단백질을 코드화하는 cDNA를 포함하고, 제 2헬퍼서열은 레트로바이러스 env 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함한다. 숙주범위를 결정하는 Env 유전자는 제노프로피성, 암포트로피성, 엑토트로피성, 폴리프로피성(밍크포커스 형성) 또는 10Al 쥐 백혈병 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 인간의 면역결핍 바이러스(gp160) env 단백질; 소포 구강 바이러스(VSV) G단백질; 인간의 T세포 백혈병(HTLV)타입 I과 II env 유전자 생성물; 전술한 env 유전자들의 하나 이상의 조합에서 유도된 키메라 외피 유전자; 또는 원하는 표적세포상의 특정 표면분자에 대한 단일클론 항체와 전술한 env 유전자 생성물의 세포질막과 전달막을 코딩하는 키메라 외피유전자로부터 유도될 수 있다.
본 구체적인 실시예에 따른 플라스미드의 제조방법은 다음과 같다: MMLV gag와 pol 유전자를 코딩하는 pIK6.1gagpolATG는, 먼저 Sca I을 이용하여 pMOVpsi-를 분해하고, Nhe I 합성링커를 부가하여, Afl II를 이용하여 재분해하고, 5.2kb Afl II/Nhe I 단편(MMLV의 뉴클레오티드 644~5869)을 분리함으로써 만들었다. 뉴클레오티드 621에서 ATG가 Nco I 부위로 전환된 MMLV의 뉴클레오티드 621~644(Afl II에서 gag 유전자의 ATG까지)를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드를, pIK6.1Nhe의 SV40 폴리아데닐회 부위의 5' 말단에서 Nco I 부위 폴리링커와 Nhe I 부위 사이에 AflII/Nhe I단편과 함께 결합시켰다.
MLV 4070A Env 유전자를 코드화하는 pIK6.1amenvATG는, Afl 111을 이용하여 pCRIPAMGAG-2(Danos and Mulligan, 상기 참조)를 분해하고, Nhel 또는 HinPl을 이용하여 재분해하여 .325kb HinP 1/Afl 111 단편(MLV 4070A Env 유전자의 뉴클레오티드 37-365;(Ott 등, J Virol. 64(2):757-766 (1990))과 1.7kb Afl III/Nhe 1 단편(MLV 4070A Env 유전자의 뉴클레오티드 365;(Ott 등, 상기 참조)(MLV 4070A Env 유전자의 뉴클레오티드 365에서 pCRIPAMGAG-2의 MMLV 3' LTR의 Nhe I 부위까지의 단편)를 분리하여 만들었다. 뉴클레오티드 37의 ATG가 Nco I부위로 전환된, MLV 4070A Env 유전자의 뉴클레오티드 37-43을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드(HinP1-env 유전자의 ATG)는 pIK.6.1Nhe의 SV40 폴리아데닐화 부위의 5'말단에서 Nhe I 부위와 폴리링커의 Nco I 부위사이에 HinP 1/Af1 III 단편 및 Af1 III/Nhe I 단편과 함께 결합되었다. 이들 플라스미드는 제 1A도에 도시되어 있다.
pIK6.1gagpolATG 및 pIK6.1amenvATG로 명명된 본 발명의 두 개의 게놈 레트로바이러스 패키징플라스미드는 부다페스트 조약에 따라 American Type Culture Collection (ATCC: 123에 Parklawn Drive, Rockville, Maryland)에 하기와 같이 기탁하였다.
레트로바이러스 벡터
단일 게놈 및 이중 게놈 패키징 구조체가 모두 레트로바이러스가 만들어질 세포 유형에서 효율적인 전사를 이끄는 변형된 5' LTR을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 이용한다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 pZen(Johnson 등, The EMBO Journal 8(2):441-448 (1989))을 토대로 한 모델이며 pZIPneoSVX(Cepko 등, Cell 37:1053-1062 (1985))의 새로운 버전으로서, 발현될 유전자 생성물이 neo 카세트 (Cepko 등, 상기 참조)에 의해 통상적으로 점령되는 위치에서 스플라이스 수용체의 하류에 클로닝되어 있다. 또한, MMLV의 Nar I 부위(뉴클레오티드 1038)까지의 바이러스 gag 서열이 부가되어 패키징능력이 개선되고(Armentano 등, J. Virol. 61:11647-1650 (1987)), pZIPneoSVX의 Xho I-Cla I 단편은 결실되어 있다(Cepko등, 상기 참조). pIK1.1으로부터의 EcoR1-Apa I 폴리링커가 스플라이스 수용체의 하류에 삽입됨으로써 pIK 플라스미드로부터의 삽입체가 레트로바이러스 구조체내에 전달될 수 있다. 생성되는 플라스미드는 pRTD1.2로 명명되며, 5'와 3' MMLV LTR을 모두 포함한다. pZ1PneoSVX의 5' LTR U3 영역을 pIKMMSV의 Hind III/Sac I 단편에서 유래된 MMSV U3로 대체시켜 pRTD4.2를 만들었다. pRTD2.2에서, pZIPneoSVX의 5' LTR의 U3 영역을 CMV 즉시초기 인핸서/프로모터를 코딩하는 pIK1.1으로부터의 Hind III/Sac I 단편으로 대체시켜, MMLV (Schinnick 등, Nature 293:543-548 (1980))의 뉴클레오티드 +1∼+32 (Kpn1)에 연결된 HCMV 프로모터의 뉴클레오티드 19(SacI)∼ +1을 코딩하는 올리고뉴클레오티드에 의해 MMLV R 영역과 융합시켰다. pRTD2.2SVG는, pRTD2.2의 Sac I-Bst EII 단편(750bp)을 LXSN의 Sac I-Bst EII 단편(736bp)으로 대체시킴으로써 만들었다(Miller and Rosman, BioTechniques 7:980 (1989)). pRTD2.2SSA는, pRTD2.2의 SacI-Eco R1 단편(1441bp)을 LXSN의 Sac I-Eco RI단편 (1053bp)으로 대체시킴으로써 만들었다(Miller and Rosman, 상기 참조). pRTD2.2SVGE-는, 5' 말단에 Apa I 부위가 부가되어 있는 pLXSN(GenBank Accession Bank, M28248)의 뉴클레오티드 2878-2955를 코딩하는 올리고뉴클레오티드의 합성에 의해 만들었다. 이 플라스미드를 이용하여 pRTD2.2SVG의 Apa I-Nhe I 단편을 대체 시켰는데, 이 단편은 3' LTS의 Nhe I 부위의 5'와 폴리링커의 3' DNA 서열을 포함한다. 본 발명의 이와 같은 레트로바이러스 벡터 구조체는 pBR322의 기본구조를 가지며, pRTD2.2, pRTD4.2, pRTD2.2SVG, pRTD2.2SVGE-및 pRTD2.2SSA를 포함한다.
SV40 T 항원을 발현시키는 세포에서 플라스미드 복제가 가능하도록 하기 위해, 상기 설명한 바와 같이 pIK1.1의 Sac I와 Eco RI 부위 사이에 pRTD2.2의 5'와 3' LTR 사이의 서열을 클로닝 시켰는데, 이것은 벡터 pIKT2.2를 형성하기 위한 SV40 복제 개시점을 포함한다. pIKT2.2SVG는, 5' 말단은 pRTD2.2SVG의 HCMV프로모터의 Sac I 부위로 되어 있고 3' 말단은 pSTD2.2SVG의 3'LTS의 하류 750bp에 위치하는 Eco RI 부위로 되어 있는 단편을, pIK1.1의 Sac I과 EcoRI 부위 사이에 삽입시킴으로써 만들었다. pIKT2.2SVGE-F3은 전술한 바와 같이, pIKT2.2SVGF3의 182 bp Apa I-Nhe I 단편을 pRTD2.2SVGE-F3 의 80bp Apa I-Nhe I 단편으로 대체시킴으로써 만들었다.
pRT43.2F3는, 3' LTR의 하류 약 750bp에 위치하는 Eco RI-Apal 폴리링커를 Ascl 인식부위를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드로 대체시킴으로써 pIKT2.2SVGE-F3에서 유도되었다. 또한, 바이러스 gag 서열의 3' 말단에서 Nde I 부위는 올리고뉴클레오티드 삽입에 의해 XhoI 부위로 전환되었다. pRT43.3PGKF3은, pRT43.2F3에서 3' LTR을 제거하고 PvuII-Xhol 서열이 결실된 3' LTR을 삽입함으로써 pRT43.2F3로부터 만들어졌다.(MMLV, Genbank session #J02255 뉴클레오티드 번호 7938-8115). 또한, MMLV 스플라이스 수용체 영역은 5' 말단에 XhoI 부위와 3' 말단에 Eco RI을 가진 폴리링커내로 클로닝된 인간의 포스포글리세레이트 키나아제 유전자 프로모터(GenBank session #M11958 뉴클레오티드 2-516)로 대체되었다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터에 대한 하나의 구체적인 실시예에 있어서, 키메라 수용체 구조체의 발현을 위해 본 발명의 방법을 이용하여 포유류 표적 세포내로 형질도입될 유전자를 코딩하는 DNA가 제조된다. 키메라 수용체 구조체의 제조방법은 다음과 같다.
CD4/CD3 제타와 안티-HIV/CD3 제타 레트로바이러스 벡터
KAT 레트로바이러스 벡터인 pRTD2.2F3, pRTD2.2SVGF3, pSTD2.2SSAF3, pRTD2.2SVGF3E-, pIKT2.2SVGF3는 pIKF3(후술함)를 Eco RI/Apa I으로 분해하고, 1.9kb 단편을 분리한 다음 이 단편을 벡터 pRTD2.2, PRTD2.2SVG, pRTD2.2SSAF3, pRTD22SVGE-, pIK2.2SVG의 pIK 폴리폴링커의 Eso RI 과 ApaI 부위 사이에 결합시킴으로써 만들었다. KAT 레트로바이러스 벡터 pRTD2.2F15는, pIKF15neo(후술함)를 EcoRI/Apa I으로 분해하고. 2.2kb 단편을 분리한 다음, 이 단편을 pRTD2.2의 폴리링커의 Eco RI과 Apa I 부위 사이에 결합시킴으로써 만들었다. 이들 벡터는, CD4 수용체의 세포질 도메인(성숙한 CD4 사슬의 아미노산 372-395)과 CD3-복합체 연관-유전자 제타()(성숙한 제타 사슬의 아미노산 372-395)에 각각 융합된, 인간의 CD4의 세포외 도메인(F3 유도체) 또는 HIV의 gp41에 대한 단일 사슬 항체(F15 유도체)를 포함하는 키메라 분자를 코딩한다. 인간의 CD4 수용체(F3)의 세포외 도메인 (성숙한 CD4 단백질의 잔기 1~371) 또는 HIV 외피단백질(F15)의 gp41 부분에 특이적인 인간 항체(98.6)에서 유래된 HIV gp41에 대한 단일 사슬 항체를 코딩하는 키메라 수용체 카세트는 CD3사슬과 융합시켜 전술한 바와 같이 pIK1.1의 Eco RI과 Apal 사이에 클로닝시켰다. 단일-사슬 항체에서, 헤비 체인과 라이트 체인 모두에 대한 가변 도메인을 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결시켜 단일 분자상에 항원 결합부위를 만들었다.
키메라 수용체의 제조방법에 대한 좀더 상세한 설명은 다음과 같다.
CD4- 제타 키메라의 제조
플라스미드 pGEM3zeta는 인간의 제타 cDAN를 가지고 있다(Weissman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). 플라스미드 pBS.L3T4는 인간의 CD4 cDNA(Littman and Getter, Nature 325: 453-455 (1987))을 가지고 있다. 세포외(EXT) 도메인의 잔기 7로부터의 인간 제타 사슬 코딩 서열 전체를 포함하는 BamHI-Apal 제한효소 단편(약 0.64kb)을 pGEM3zeta에서 절단해 내어, 스트라타진 (Stratagene, San Diego, CA)의 파지미드계 클로닝 벡터인 pBluescript II SK (+) 9pSK의 폴리링커의 BamHI과 ApaI 제한효소 부위내로 서브클로닝시켜 pSK.zeta를 만들었다. 이어서, CD4 코딩서열(약 1.8kb) 전체를 포함하는 BamHI 제한 효소 단편을 pBS.L3T4로부터 절단해 내어 pSK.zeta 의 BamHI 부위에 서브클로닝시켜 pSK.CD4.zeta를 만들었다.
단일 가닥 DNA는 pSK.CD4.zeta(Stratagene pBluescript II Protocol)로부터 제조되어, 후술하는 바와 같이 원하는 결합부위(junction)을 가진 CD4-제타 키메라를 만들기 위해 올리고뉴클레오티드 중재에 의한 방향성 돌연변이(Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982))를 위한 주형으로서 이용되었다. CD4-제타 융합체 1, 2와 3은 생거의 디데옥시올리고뉴클레오티드 기법(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1977))을 이용하여 시퀀싱한 다음, EcoRI-Apal 제한효소 단편의 형태로 절단해 내어, 발현벡터 pIK1.1의 폴리링커 또는 pIK1.1.Neo의 동일부위에 클로닝시켰다.
CD4의 코딩 영역 전체를 포함하는 EcoRI-BamHI 제한효소 단편(약 1.8kb)은pSK.CD4.zeta로부터 절단하여, pIK.1.1 또는 pIK1.1.Neo 폴리링커의 EcoRI과 BglII 부위 사이에 서브클로닝시켰다.
플라스미드 pUCRNeoG(Hudziak, 등, Cell (1982) 31:137-146)는 라우스 육종 바이러스(RSV) 3' LTR 의 전사 조절하에 네오마이신 유전자를 운반한다. RSV-neo 카세트를 HincII 제한효소 단편(약 2.3kb)의 형태로 pURCNeoG로부터 절단하여, pIK1.1의 두 개의 SspI 부위 사이에 서브클로닝시켜 pIK.1.1.Neo를 만들었다.
CD4-제타 키메라 수용체 F3는 CD4와 제타의 세포외(EC) 및 세포질(CYT) 도메인으로부터 만들었다. 이 수용체의 전달막(TM)도메인은 CD4로부터 유도되었다. F3은 4개의 V 도메인(성숙한 CD4 단백질의 잔기 1~371) 모두와, CD4의 TM 도메인(성숙한 CD4 사슬의 잔기 372-395) 및 제타의 CYT 도메인(성숙한 제타 사슬의 잔기 31-142잔기)을 포함하는 CD4 EXT도메인을 보유한다.
단일사슬 항체-제타 키메라 수용체의 제조
인간의 단일클론 항체(mAb) 98.6의 헤비체인을 코딩하는 발현벡터의 제조:
인간의 mAb 98.6의 헤비체인을 발현시키기 위하여(S.Zolla-Pazner, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:1624-1628), 플라스미드 pIK.98.6-Y FL을 만들었다. 전체 길이의 IgG1 헤비체인 cDNA는 올리고-dT를 프라이머로 사용하여 세포계 SP-1/98.6(Zolla-Pazner, 상기 참조)의 총 RNA 5μg을 역전사시킨 다음, 올리고 뉴클레오티드 프라이머 17과 2를 이용하여 PCR 반응시킴으로써 만들었다(후술하는 부분 참조). 1.5kb EcoRI-BalII 단편을 pIK1.1의 EcoRI과 BglII 부위사이에 클로닝시켰다. 헤비체인이 원하는 바의 이인자형(allotype)이 되도록 하기 위하여, cDNA의Kasl-Bgl II 단편을 pKI.Cγ l으로부터의 0.94Kb Kasl-Bgl II 단편으로 대체시켰다. pKI,Cγ l은, 올리고뉴클레오티드 프라이머 2 와 18 (후술하는 부분 참조) 및 기질로서 인간의 지라 cDNA 라이브러리(Clontech, Inc., Palo Alto, CA)로부터의 DNA를 이용하여 PCR에 의해 수득된 IgG1 헤비체인의 불변영역(constant region)을 코딩하는 cDNA를 pIK1.1의 EcoRI과 Bal II 부위 사이에 삽입시킴으로써 만들었다.
인간의 단일클론 항체(mAb)98.6 의 라이트체인을 코딩하는 발현 벡터의 제조:
mAb 98.6의 라이트체인 발현을 위해 플라스미드 pIK98.6K FL을 만들었다. 총 길이의 IgG1 라이트체인 cDNA는 pdN6(Pharmacia/LKB)를 프라이머로 이용하여 세포계 SP-1/98.6의 총 RNA 5μg을 역전사시킨 다음, 프라이머 19와 20(후술하는 부분참조)을 이용하여 PCR 반응시킴으로써 만들었다. 그리고 난 후, EcoRI과 Bal II를 이용하여 0.78 단편을 절단한 다음, 이 단편을 pIK1.1의 EcoRi과 Bal II 사이에 클로닝시켰다.
mAb 98.6의 헤비 및 라이트체인에서 유래된 SAb를 코딩하는 발현벡터의 제조:
a) pIK.98.6-K/L/H의 제조:
mAb 98.6의 단일-사슬항체(SAb) 형태의 발현을 위해 pIK.98.6-K/L/H를 만들었다. 발현된 SAb는 분비 리더 서열과, GSTSGSGSSEGKG 서열의 14 아미노산 링커 (L212, Betzyk 등, J. Biol. Chem. (1990) 265: 18615-18620)에 융합된 성숙한98.6mAb 라이트 체인 가변영역(VL)의 아미노산 1-107로 구성되어 있으며, 후자의 성분은 다시 성숙한 98.6mAb 헤비체인 VH영역의 아미노산 1에 융합되었다. 그런 다음, IgG1 헤비체인 불변영역의 CH1 도메인을 결실시켜 분비를 증진시키기 위해, IgG1 헤비체인 불변영역의 아미노산 113-234에 융합시켰다. pIK.98.6-K/L/H는 3단계 과정을 거쳐 제조되었다.
먼저, 주형으로서 pIK.98.6-γFL의 단일가닥 주형과, 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 21(후술하는 부분 참조)을 이용하여, mAb 98.6의 VH영역의 아미노산 113을 IgG1 헤비체인의 아미노산 234에 융합시키키 위해 결실 돌연변이화를 수행하였다. 정확하게 결실된 플라스미드는 올리고뉴클레오티드 22를 프로우브로서 사용하여 찾아내었다. 이 플라스미드는 pIK.H/Fc-int라 칭한다. 링커 펩티드의 아미노말단에 아미노산 107을 융합시키기 위해, 기질로서 pIK.98.6-κFL과 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 23과 24(후술하는 부분 참조)를 이용하여 PCR에 의해 mAb 98.6 라이트체인의 VL영역을 만들었다. 이는, 생성되는 단백질의 아미노산 서열의 변경없이, VL서열의 3' 말단에 Sal I 부위를 위치시킴으로써 이루어졌다. 올리고뉴클레오티드 25와 26(추술하는 부분 참조)과 함께 이 단편을 pIK1.1의 EcoRI과 Bal II 부위사이에 결합시켜 플라스미드 pIK.K/L-int를 만들었다.
마지막 단계에서, pIK.K/L-int의 0.45kb 단편을 pIK.H/Fc-int 의 Eco RI과 Kpn I사이에 클로닝시켜 pIK.K/L/H-int 플라스미드를 만들었다. 이 플라스미드로부터의 단일가닥 DNA를 주형으로 사용하고 올리고뉴클레오티드 27을 프라이머(후술하는 부분 참조)로 사용하여 결실 돌연변이시킴으로써 mAb 98.6의 VH영역의 아미노산 1에 링커의 카르복시 말단 아미노산을 융합시켰다. 정확하게 결실된 플라스미드는 올리고뉴클레오티드 28(후술하는 부분 참조)을 프로우브로서 사용하여 찾아내었다. 그 결과 만들어진 플라스미드가 pIK 98.6K/L/H 이다.
b) pIK.CD4γ2의 제조:
플라스미드 pIK.CD4γ2는, 분비 리더와 인간의 IgG2 헤비체인의 불변영역의 아미노산 234에 융합된 성숙한 CD4항원의 처음 180개 아미노산으로 구성되어 힌지의 일부와 CH2와 CH3 도메인 전부를 포함하는 융합단백질의 발현을 유도하기 위하여 제조되었다. 이 플라스미드는 분비증진을 위해 IgC2 헤비체인의 CH1 도메인이 결실되어 있다. pIK.CD4γ2는, 기질로서 인간의 지라 cDNA 라이브러리(Clontech)로부터의 DNA와 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 3과 4를 이용하여 PCR에 의해 인간의 IgG2 헤비체인의 Fc 영역을 포함하는 단편을 만듦으로써 제조되었다. 생성된 0.75kb Nhe 1-Bal II 단편을 pSKCD4ζ로부터의 0.6kb Eco R1-Nhe I 단편과 함께 pIK1.1의 Eco RI과 Bgl II 부위 사이에 결합시켰다.
c) pIK.F5의 제조:
플라스미드 pIK.F7은 인간의 막-결합형 IgG 막 힌지 도메인(Tyler 등(1982) Proc. Natl. Acad.Sci.79:2008-2012)을 모두 포함하는 CD4/IgG/제타(ζ) 융합단백질의 여러 가지 변형체(version)를 발현시키기 위해 제조되었다. 발현될 각 단백질에는, CD4 수용체의 아미노산 1-180, 다음으로 인간의 IgG2 헤비체인 불변영역의 아미노산 234-445, 다음으로 인간의 IgG3의 18 아미노산 M1 막 힌지 도메인 (Bensmana and Lefranc,(1990) Immunogenetics 32: 321-330), 다음으로 전달막 도메인, 다음으로 인간의 ζ사슬의 아미노산 31-142이 포함되어 있었다. pIK.F7은 CD4의 전달막 도메인(아미노산 372-395)을 포함한다.
이러한 플라스미드를 만들기 위해, 제1단계는 인간의 IgG3 Ml 엑손(Bensmana and Lefranc, 상기 참조)을 클로닝시키는 것이었다. 이는, 기질로서 인간의 세포계 W138로부터의 DNA와 올리고뉴클레오티드 7과 8을 이용하여 PCR에 의해 Ml 엑손을 포함하는 0.13kb BamHI-Bgl II 단편을 만들고, 이 단편을 pIK.CD4γ2의 Bal II 부위내로 클로닝시킴으로써 이루어졌다. 생성된 플라스미드는 pIK.CH3/Ml-int라 칭한다. 이 플라스미드로부터의 단일가닥 DNA를 주형으로 사용하고 올리고뉴클레오티드 9를 프라이머로 사용하여 결실 돌연변이 생성에 의해 IgG3 막 힌지 도메인의 첫 번째 아미노산에 인간의 IgG2의 아미노산 445를 융합시켰다. 융합은 막-결합형 IgG 분자의 CH3와 Ml 사이의 자연적 결합부위(junction)에서 발견되는 서열을 만들기 위함이다. 정확하게 결실된 클론은 올리고뉴클레오티드 10을 프로우브로 이용하여 찾아내었다. 생성된 플라스미드는 pIK.CD4γ2/Ml라 칭한다.
pIK.CD4γ2/Ml을 Bal II를 이용하여 절단하고, T4 중합효소를 이용하여 비접착성 말단으로 만든 다음 Nhe I을 이용하여 절단하였다. 생성된 0.83kb 단편을 pIK.F3로부터의 1.3kb PvuII-Apa I 단편과 함께 pIK.CD4γ2 의 Nhe I과 Apa I 부위사이에 결합시켜 플라스미드 pIK.F7-int를 만들었다. 이 플라스미드로부터의 단일가닥 DNA를 주형으로 사용하고 올리고뉴클레오티드 15를 프라이머로 사용하여 결실돌연변이 생성에 의해 CD4의 아미노산 372에 IgG Ml 막 힌지 도메인의 마지막 아미노산을 융합시켰다. 정확하게 결실된 클론은 올리고 뉴클레오티드 16을 프로우브로 사용하여 찾아내었다. 생성된 플라스미드는 pIK.F7이다.
전술한 프라이머로 사용한 올리고뉴클레오티드와 프로우브는 다음과 같다.
pIK.F15neo의 제조:
IgG1 헤비체인의 아미노산 445에서 IgG3 M1 막 힌지의 18 아미노산에 연결된다음 다시 CD4 전달막 도메인(아미노산 371-395)과 ζ세포질 도메인(아미노산 31-142)에 융합된 mAb 98.6의 K/L/H SAb 형으로 구성된 융합단백질의 발현을 위해, pIK.F7neo의 Nsi I 부위 사이에 pIK.98.6-K/L/H의 1.5kb Nsi 1 단편을 삽입시킴으로써 pIK.F15neo를 제조한 다음, 방향성이 정확한 클론을 선택하였다.
포유류 세포에서의 레트로바이러스의 생산
위에서 설명한 바와 같이 제조된 KAT 레트로바이러스 구조체로서 다음과 같은 것으로 제한되는 것은 아니지만 예를 들면 pRTD2.2F3, pRTD2.2SVGF3, pRTD2.2SSAF3, pRTD2.2SVGF 3E-, pIKT2.2 SVGF3, pRTD2.2F15(전술한 바 있음)와 함께, 단일 또는 이중 게놈 KAT 패키징 플라스미드, 예를 들어 pIK6.1MMSVampac, pIK6.1MCVampac 또는 pIK6.1amenvATG 및 pIK6.1gagpolATG(모두 전술한 바 있음)가 인산칼슘 동시형질감염과 같은 표준수단에 의해 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포내로 도입된다(Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-1377(1979)). 바이러스를 생산할 수 있고, 본 발명의 KAT 구조체에 의해 형질감염될 수 있는 포유류 세포에는 293 세포, tsa201 세포와 같은 인간의 배아 신장세포, 쥐 3T3 쥐 섬유아세포, 엠. 던니(M. dunni) 섬유아세포, 아프리카 녹색원숭이 신장 (cos)세포를 포함되나 이에 국한되지는 않는다. DNA 구조체가 성공적으로 도입되었는지를 확인하기 위해 키메라 수용체의 표면발현에 대하여 FACS에 의해 형질감염된 세포를 분석한다.
형질감염후 48시간되는 때에 상등액의 여과와 같은 표준 방법을 이용하여 바이러스 상등액을 수득한다. 바이러스 역가는 80 g/ml의 폴리브렌(Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO) 존재하에 적정량의 바이러스 상등액을 이용하여 106개의 NIH 3T3 세포를 감염시킴으로써 결정된다. 48시간 후, 3T3 세포의 형질도입 효율은 FACS 분석과 서던 블랏팅에 의해 분석한다.
표적세포의 고효율 형질도입
본 발명의 방법에 있어서 본 발명의 KAT 구조체는, 포유류 표적세포와 KAT 형질감염된 세포의 공배양에 의해 외래유전자를 포유류 표적세포에 고효율로 형질도입시키는데 이용된다. 바람직한 구체적인 실시예에 있어서, 293 세포와 같은 원하는 바이러스 생산 세포가 적절한 KAT 구조체에 의해 형질감염된 다음, 형질감염 24시간 후, 형질감염된 293 세포가 CD8+ 세포와 같은 정제된 포유류 표적세포와 함께 48시간동안 공배양된다. 표적세포는 표준방법을 이용하여 수득하고, 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 또는 형광물질-활성화 세포분류기(Fluorescence-activated Cell Sorter: FACS) 및 서든 블랏 DAN 분석과 같은 공지 기술을 이용하여 형질도입효율을 테스트한다. 형질도입효율은 FACS 또는 서든 블랏분석에 의해 측정하였을 때 대조표준에 대해 양성을 나타내는 형질도입 세포의 백분율로 나타낸다.
바이러스를 생산하기 위해 인간의 293 세포내로 형질감염된 KAT 구조체를 이용함으로써, 앞서 설명한 COS 일시적 바이러스 생산시스템(Landau and Litman, 상기 참조)에 의해 생산된 바이러스와 비교할 때, 3T3 와 같은 정립된 세포계의 상등액 감염에 의해 결정된 바이러스 역가로서 5 내지 50배까지의 증가가 이루어진다.또한, 조혈간세포와 인간의 T 세포와 같은 1차 인간 세포는, PA317과 같은 통상의 패키징계(Miller and Buttimore, 상기 참조)에 비해 KAT 플라스미드 형질감염된 293 세포와의 공배양에 의해 3 내지 20배 더 높은 수준으로 형질도입된다.
본 발명이 임의의 이론에 구속되기를 원하지는 않지만, 본 발명의 방법을 이용하여 수득한 인간의 표적세포의 고효율 형질도입은 레트로바이러스에 의해 감염된 인간의 293세포와 표적세포와의 세포-세포 접촉에 의해 중개되는 것으로 믿어진다. 다양한 표적세포의 고효율 형질도입에 영향을 주는 인간의 293 세포의 성분은 293세포에 의해 합성된 단백질 또는 지질인 것으로 생각된다. 이 시스템의 활성성분을 결정하기 위해, 293 세포의 막단백질과 지질을 공지의 방법으로 정제하고, 표적세포의 형질도입 효율에 영향을 주는 능력을 알아내기 위해 정제된 다양한 성분의 능력을 테스트한다. 일단 활성성분이 확인되면, 재조합 DNA 또는 화학적 방법에 의해 활성성분을 합성할 수 있다. 이들 합성된 성분은 상등액의 형질도입효율을 증진시키기 위해 바이러스 입자내로 도입될 수 있다.
적절한 표적세포는 임파구, 특정 세포독성 T세포, 인간의 조혈간세포, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 근아세포, 망막 내피세포, 랑게르한스섬, 부산수질세포, 골아세포, 파골세포, 뉴런, 신경교세포, 신경절세포, 배아간세포(embryonic stem cell) 및 간세포(hepatocyte)를 포함하나 이들로 국한되지는 않는다.
표적세포내로 도입될 수 있는 유전자에는 1992년 12월 9일자로 출원되어 본 출원과 함께 계루중이며 참고문헌으로서 명세서 전체가 본 명세서에 통합되어 있는 미국특허 출원번호 988,194에 기재되어 있는 것과 같은, 임파구에서 시그날 형질도입을 위한 키메라수용체를 코딩하는 유전자; G-, M- 및 GM-콜로니 자극인자 (CSF), 표피성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 형질전환 성장인자 (TGF)와 간세포 성장인자 (SCF)와 같은 성장인자; 인터루킨과 같은 림포킨: ACTH, 소마토메딘(somatomedin), 인슐린, 안지오텐신과 같은 호르몬; 인자 VIII 및 인자 IX와 같은 응집인자; 멀티드럭 내성 약물(MDR) 유전자; 인간의 아데노신 디아미나제 (ADA); 글루코즈 세레브로시다제(cererosidase); 및 정상 β-글로빈 유전자와 에리트로포이에틴(EPO)을 포함하나 이들로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
고역가 재조합 레트로바이러스의 일시적 생산
확립된 세포계의 세포성장, 형질감염과 감염
293 세포로 명명된 인간의 배아 신장 세포(ATCC CRL 1573, ATCC,Rockrville, MD)를 DMEM(JHR Biosciences, Lenexa, Kansas), 1g/ l글루코스, 10% Donor 송아지혈청(Tissue Cu1ture Biologics, Tulare, CA)에서 성장시켰고, 매 3일마다 1:10으로 나누었다. 3T3 세포(ATCC CRL1573)를 DMEM(JHR Biosciences), 4.5 g/l 글루코스, 10% Donor 송아지 혈청(Tissue Cu1ture Biologics)에서 성장시켜, 매 3일마다 1:10 으로 나누었다. COS 세포(ATCC CRL1650)를 DME/F12 (GIBCO, Grand Island, NY), 10% 태아 소혈청 (Tissue Culture Biologics, Tulare, CA)에서 성장시켜, 매 3일마다 1:10 으로 나누었다. 네오마이신 내성 유전자(Heinzel 등, J. Virol. 62(10): 3738-3746(1988))가 동시형질감염되어 있는 SV40 T 항원의 온도 민감성 돌연변이체를 포함하는 293의 유도체인 tsa201 세포를 DME/F12 (GIBCO), 10% 태아 소혈청 (Tissue Culture Biologics)에서 성장시켜, 매 3일마다 1:10 으로 나누었다. 293 세포와 tsa201 세포를 형질감염 48시간 전에 각각 10cm 플레이트당 1x106과 0.5x106개의 수준으로 플레이팅하였다. COS와 3T3 세포는 형질감염 24시간 전에 10 cm 플레이트당 0.5x106개의 수준으로 플레이팅하였다. 각 플라스미드 10μg을 이용하여 단독 또는 다양한 조합으로 모든 세포형에 대하여 인산칼슘 공침전(Wigler 등, 상기 참조)에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후에 배지를 교체하였다. 그리고 24시간 후에 바이러스 상등액을 수득하여, 0.45μm 필터를 통하여 여과시킨 다음, 드라이 아이스에서 급속 냉동시켰다. 3T3 세포는 감염 24시간 전에 10cm 플레이트당 0.5x106개 세포 수준으로 플레이팅하였다. 감염은 바이러스 상등액과 8μ g/ml 폴리브렌(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 포함하는 배지 5ml에서 실시되었다. 감염 24시간 후에 배지는 폴리브렌 무배지로 바꾸었고, 세포는 24시간 동안 더 배양시켰다.
293 세포는 일시적 형질도입후 고역가 레트로바이러스를 생산했다.
KAT 패키징 플라스미드 pIK6.1MCVampac 또는 pIK6.1amenvATG와 pIK6.1gagpo1ATG 및 F3 와 F15 키메라 수용체를 코딩하는 레트로바이러스 벡터 pRTD2.2F3, pRTD2.2SVGF3, pRTD2.2SSAF3, pRTD2.2SVGF3E-, pIKT2.2SVGF3와 pRTD2.2F15에 의해 동시형질감염되는 경우 재조합 레트로바이러스를 일시적으로 생산하는 293 세포의 능력을 알아보기 위하여, 형질감염 48시간 후에 바이러스 상등액을 회수하여 쥐 3T3 세포를 감염시킨 다음 48시간후 FACS 분석방법으로 분석하였다.
FACS 분석을 위하여, 감염된 3T3 세포를 트립신 부재하에 배양접시로부터 제거하고, 40mM 트리스, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA에서 배양후 FACS 분석한다. 2%(FCS) 태아 송아지 혈청(Hycione)이 부가된 인산완충 식염수(PBS)로 세포를 1회 세척한 다음, 40℃에서 30분간 1x106/ml 밀도로 2% FCS가 부가된 PBS존재하에 적절한 FITC-결합 검출 항체와 함께 배양한다. 2% FCS가 부가된 PBS로 세포를 3회 세척하고, 최종적으로 0.5ml PBS에 재현탁시켜, 플로우 시토메트리를 이용하여 분석한다.
FACS 분석결과가 제 2도에 도시되어 있다. 모의(대조표준) 형질감염된 세포 (제 2A도)와 비교할 때, pIK6.1ampac과 pRTD2.2F3에 의해 동시형질감염된 293 세포는 그들의 표면(제 2B도)상에 F3를 높은 수준으로 발현한다. 형질감염된 293 세포로부터 회수한 바이러스 상등액으로 감염시킨 3T3 세포는 감염되지 않은 3T3 세포와 감염된 3T3 세포에 상응하는 2개의 잘 분리된 피크를 나타내는데 (제 2D도), 이것은 형질감염된 293 세포(제 2B도) 또는 모의 감염된 3T3 세포의 FACS의 프로파일과 비교할 때 상당히 다른 것이었다.
표 1은, KAT 패키징 플라스미드와 KAT 레트로바이러스 구조체의 동시형질감염에 의해 형질감염 48시간 후 고역가의 바이러스 상등액이 생산되는 것을 3T3 감염과 FACS 분석에 의해 보여주고 있다. pIK6.1ampac과 pRTD2.2F3의 동시형질감염은감염시의 초기에 존재하는 106개의 3T3 세포의 50%를 형질도입시키는 바이러스 상등액을 생산한다. 반면, 란다우와 리트만 (Landau and Litman, 상기 참조)에 의해 설명된 바와 같이 COS 세포에서 일시적 동시형질감염에 의해 생산된 바이러스는 293 세포내로 KAT 플라스미드가 동시형질감염되는 경우에 생산되는 전술한 역가보다 10배나 적었다. 3T3 감염을 2회 반복실시한 4번의 형질감염 실험에서 바이러스 생산의 재현성은 매우 높다. 반면, 레트로바이러스 구조체 pRTD 2.2F3 단독에 의한 형질감염에서는 검출가능한 3T3 감염이 관찰되지 않았는데, 이는 바이러스 생산이 패키징 구조체와 레트로바이러스 벡터의 존재에 의존한다는 것을 보여주는 것이다. 또한 고역가 바이러스 생산 역시 레트로바이러스 구조체의 존재에 따라 달라진다. pIKF3 발현벡터 단독의 형질감염 또는 pIKF3 발현벡터와 pIK6.1MMSVampac의 동시형질감염은 3T3 세포를 형질도입시킬 수 없는 상등액을 만든다.
고역가 바이러스는 pIK6.1amenvATG, pIK6.1gagpolATG 와 pRTD2.2F3 의 동시형질감염에 의해서도 생산될 수 있다(표 1). 후자의 플라스미드의 형질감염효율이 p6.1MCVampac과 pRTD2.2F3의 형질감염 효율과 거의 동일할지라도, 바이러스 생산은 2 내지 27% 감소된다. 란다우와 리트만(Landau and Litman, 상기 참조)에 의한 설명과 유사한 결과가 나타났는데, 이들은 5배 감소한 것을 관찰했다. 하나 또는 2개의 게놈 패키징 플라스미드를 사용한 KAT시스템의 전체적인 효율은 COS 세포 시스템에 대해 전술한 것보다 10~20배 여전히 더 높다.
293 세포의 KAT 플라스미드 형질감염후에 생산된 바이러스 상등액의 FACS 분석에 의해 관측된 높은 3T3 세포 형질도입효율은 감염된 3T3 세포에 통합된 프로바이러스 DNA의 서든 블랏팅에 의해 확인되었다. 고분자량 DNA 를 감염 48시간 후에 준비하여, Eco RV를 이용하여 10μg의 DNA를 분해하였다. 샘플을 0.8% 아가로스 겔상에서 전기영동시켜, 제타바이드에 옮긴 다음, 제타 전달막과 세포질 도메인을 코딩하는 605 bp 단편을 프로우브로 이용하여 하이브리드시켰다. 형질감염된 플라스미드 pRTD2.2F3를 Eco RV로 분해하여 4.2Kb 밴드를 얻었다. MMLV 5'와 3' LTR을 포함하는 pRTD1.2F3을 Eco RV로 분해하여 3.6kb 단편을 생산하였다. 바이러스 감염, 3' LTR의 삽입과 복제후에 Eco RV로 분해하면 3.6kb 단편이 생산되게 된다. 이로 인해, 표적세포에 통합된 프로바이러스 DNA가 존재하는 지의 여부를 결정할 수 있게 된다. 표 2는 Eco RV 분해와 제타프로우브에의 하이브리드 후 형질감염된 플라스미드 DNA 와 삽입된 프로바이러스에서 기대되는 밴드의 크기를 보여준다.
감염된 3T3로부터 제조된 게놈 DNA를 Eco RV를 이용하여 분해하고, 감염된세포와 대조군 세포의 분해된 DNA 10μg을 0.8% 아가로스겔상에서 전기영동시킨 다음, 제타바인드에 옮겨 ζ전달막과 세포질 도메인을 코딩하는 605bp 단편을 프로우브로 하여 이용하여 하이브리드시켰다. pRTD2.2F3와 pIKMCVampac를 293 세포에 동시형질감염시킨 다음 얻은 상등액으로 감염시킨 3T3 세포에서 유래된 DNA만이. Eco RV을 이용하여 분해한 pRTD1.2F3 플라스미드 대조군 레인(제 3A도, 레인 11-14)에서 볼 수 있는 단편과 동일한, 통합된 프로바이러스를 나타내는 3.6kb 단편(제 3A 도, 레인 4와 5)을 만들어냈다. 주사 밀도측정계(scanning densitometry)에 의해 서던 블랏을 정량하여, 3배 증가량으로 0.1 내지 3.0의 사본수를 나타내는 플라스미드 대조표준(제 3A도, 레인 11-14)과 비교해보면, 바이러스 상등액 1ml당 0.5 사본/세포의 형질도입효율과 일치하는 것이었다. 이러한 형질도입효율은 FACS 분석에 의해 관측된 효율과 동일하다. 프로우브는 모의 감염된 293 세포에서 유래된 상등액으로 감염시킨 3T3 세포(레인 1)), pRTD2.2F3 단독으로 형질감염시킨 293 세포(제 3A도, 레인 2와 3), 발현벡터 pIKF3 단독으로 형질감염시킨(제 3A도, 레인 6과 7) 또는 pIK6.1MCVampac과 pIKF3로 동시형질감염시킨(제 3A도, 레인 8과 9) 292 세포의 경우에는 DNA 밴드가 검출되지 않았으며, 이것 역시 FACS 분석과 일치하는 것이다.
2개는 바이러스 기본구조면에서 서로 다른 pRTD2.2SSAF3(제 3B도, 레인 4), pRTD2.2SVGF3(제 3B로, 레인 5), pRTD2.2SVGE-F3(제 3B도, 레인 6)이고, 하나는 키메라 수용체 삽입체 pRTD2.2F15(제 3B도, 레인 7과 8)가 서로 다른 3개의 추가적인 레트로바이러스 구조체를 pIK6.1MCVampac과 함께 293 세포내에 동시형질감염시켜,그 상등액을 이용하여 3T3 세포를 감염시킨 다음 FACS 분석(표 1)과 서든 블랏팅(도 3B)을 실시하였다. F3 구조체는 모두 예상한 것과 같이 FACS 분석에 의할 때 역가가 유사하였고(표 1), 유사한 강도로 제타 프로우브에 하이브리드되었다. F15 레트로바이러스는 서든 블랏의 밀도계 분석뿐만아니라 FACS분석(표 1)에 의해 측정하는 경우에도 50% 이상 높은 역가를 나타내었다. 감염후, 각각의 벡터를 지닌 293에서 생성된 레트로바이러스는 삽입된 프로바이러스와 정확하게 동일한 크기를 생산해냈다. 그러므로, 5 KAT 레트로바이러스 구조체에 대한 FACS와 서든 블랏 결과들은, 고역가의 레트로바이러스기 293 세포에서 생산될 수 있고, 이러한 생산은 레트로바이러스 구조체와 패키징 기능의 동시형질감염에 달려있으며, 293 세포에서 고역가의 레트로바이러스 상등액의 생산은 레트로바이러스 구조체의 어떠한 비정상적인 재배열도 유도하지 않는다는 것을 보여준다.
포유류 세포계에서의 바이러스 생산
7종류의 추가적인 세포계에 대해, KAT 플라스미드를 이용하여 동시형질감염시킨 다음 바이러스를 회수하여 3T3를 감염시키는 과정을 통해 레트로바이러스를 생산하는 지의 능력을 조사하였다(표 3).
pRTD2.2F3와 pIK6.1Vampac의 동시형질감염이 있는 경우에도 L929와 CHO D-에서는 CD4 표면 발현과 바이러스 생산이 없었다. 그러나 이들 세포계는 lac z 유전자를 코딩하는 플라스미드가 사용되는 조건하에서는 형질 감염성이 매우 높았다. 형질감염된 HELA, 143B, 3T3와 COS의 FACS 분석 결과는, 4개의 세포유형 모두에서약 50%의 형질감염효율을 나타내어 표면 CD4 발현율이 매우 높은 것을 증명해 주었다. 그러나 이들 세포들은 바이러스 생산에 있어서는 실질적으로 다른 양상을 나타내었다. HELA 와 143B 세포는 바이러스를 전혀 생산하지 않았고, 반면에 3T3 세포는 냉동 상등액 1ml 당 3% 3T3의 수준으로 형질도입시킬 수 있는 바이러스를 생산하였다. KAT 플라스미드에 의해 COS 세포가 동시형질감염되면 레트로바이러스 구조체의 DNA 복제없이도 3T3 세포에 의해 생산되는 경우에 비해 4.5배 이상의 역가로 바이러스가 생산되었다. 이러한 역가는, 바이러스 벡터 구조체의 플라스미드 복제없이도, 란다우와 리트만(Landau and Litman, 상기 참조)에 의해 보고된 역가보다 200배 더 높은 것이다. 이것은, 다양한 세포에 형질감염되는 경우, 플라스미드 복제없이 레트로바이러스를 생산하는 능력을 가지고 있다는 점에서 KAT 구조체가 매우 독특하다는 것을 보여주는 것이다. 란다우와 리트만이 바이러스 벡터 구조체의 플라스미드 복제가 있는 경우에 관측된 역가가 100배라고 가정하면, KAT 패키징 기능과 플라스미드 복제를 뒷받침하는 레트로바이러스 벡터가 플라스미드 복제를 뒷받침하는 숙주내로 형질감염되는 경우에는 역가가 아마도 10 내지 100배 더 증가될 수 있을 것이며, 또한 현재로서는 감염시키기가 어려운 세포유형을 감염시키는데 있어서의 KAT-형질감염 세포의 이용성도 증가시킬 수 있을 것이다.
[실시예 2]
인간 T 세포의 고효율 형질도입
본 실시예는 KAT 구조체에 의해 형질감염된 293 세포가 공배양에 의해 인간의 1차 세포인 표적 CD8+ T세포를 고효율로 형질도입시킬 수 있는 본 발명의 방법을 설명해준다.
레트로바이러스 벡터와 패키징 플라스미드의 제조
KAT 구조체들은 실시예 1에서 기재한 방법에 따라 제조하였다.
말초혈액으로부터 인간의 CD8+ T 세포의 분리 및 활성화
인간의 1차 CD8+ T 세포는 다음과 같이 건강한 공여자의 말초혈액으로부터 정제하였다: 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 피콜-하이파크 밀도경사 원심분리 (Ficol-Hypaque density gradient centrifugation)에 의해 인간의 혈액으로부터 분리하였다. PBMC를 D-PBSE/CMF(1mM EDTA을 포함하며 Ca, Mg가 없는 PBS)로 3회 세척하고, 0.5%의 인간 감마 글로블린을 포함하는 4ml의 D-PBSE/CMF에 5x107세포의 농도로 재현탁시켜, 적어도 15분간 실온에서 배양시켰다. 배양 후, CD8+ T 세포를 양성 패닝(positive panning)에 의해 PBMC 세포 현탁액으로부터 정제하였다. PBMC 현탁액을 미리 세척한 T-25 조직배양 플라스크(AIS CD8 selection flask (Applied Immune Sciences, Santa Clara, CA))에 로딩하였는데, 이 플라스크는 인간의 CD8 수용체에 대해 특이적인 항체가 T-25 플라스크당 4ml당 5x107개 세포의 밀도로 코팅되어 있는 것이다. 세포를 실온에서 1시간 배양한 다음, 비-흡착된 세포는 강렬하지 않은 피젯팅과 D-PBSE/CMF로 3회 세척함으로써 제거하였다. CD8+ T 세포를 플라스크로부터 동시에 배출시켜, 10ng/ml의 OKT3 (Ortho Pharmaceuticals, Raritan, NJ)와 10% IL2 (Pharmacia)를 포함하는 T 세포 배지 10ml을 첨가하여 활성화시켰다. 이 배지를 이용하여 세포를 48시간동안 배양한 다음 플로스크로부터 회수하여,T세포 배지로 1회 세척하고, 0.5-1.0 x106/ml의 밀도로 10% 1L2가 부가된 새로운 T세포 배지에 최종적으로 재현탁시켜 24-웰 플레이트에 부가하였다.
F3 표면 발현의 검출에 사용되는 CD4-특이적 항체 또는 F15 표면 발현을 검출하는데 사용되는 인간의 Fc-특이적 항체와 교차반응하는 잔류 세포(통상 2-3% 존재)를 제거하기 위해, 농축된 CD8+ T 세포 집단에 대해 추가로 정제과정을 실시하여, 안티-CD4 또는 안티-인간 Fc 항체로 코팅된 전술한 AIS 선택 플라스크를 이용하여 음성 패닝에 의해 오염된 세포를 제거하였다. 농축된 CD8+ T세포 집단을 1시간동안 선택 플라스크에서 배양한 다음, 비-흡착(즉 매우 정제된 CD8+ T 세포)를 제거하였다. 이어서, 세포를 세척하여, 24시간동안 10% 1L2가 부가된 T세포 배지에서 놓아 두었다. 이와 같은 방식으로 준비된 CD8+ T 세포는 95% 이상의 CD8+와 CD3+ 및 0.5% 미만의 CD4+ 또는 FC+ 이었고, 이들은 레트로바이러스 형질도입의 표적으로서 이용되었다.
공배양 또는 상등액 감염에 의한 CD8+ T 세포의 레트로바이러스 형질도입
293 세포를 전술한 바와 같이 6웰 플레이트당 1x 106개의 세포 수준으로 플레이팅하여 48시간후 적절한 구조체로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 형질감염 배지를 제거하고 T세포 성장배지(조성에 관해서는 아래 참조)로 대체하였다.
(a) 공배양: 2~4시간후에, 전술한 바와 같이 준비된 0.5x106개의 정제 및 활성화된 인간의 CD8+ T 세포(통상적으로 정제/활성화 후 4일 또는 5일되는 시점)를 형질감염된 293 세포와 폴리브렌이 2μg/ml의 최종농도로 포함되어 있는 웰에 부가하였다. 초기 형질감염을 위하여 293 세포를 플레이팅한지 24시간 후에 293 세포의 두 번째 세트를 전술한 것과 같이 플레이팅하고 형질감염시켰다. 초기 공배양 24시간 후에, T 세포를 1차 공배양물로부터 제거하여 2차 293 형질감염 플레이트에 옮겨 동일조건하에 24시간동안 추가로 배양하였다. 일시적으로 형질감염된 3T3 세포 또는 안정한 PA317 생산자 세포계 40.39와 함께 공배양시킴으로써 CD8+ T 세포의 형질 도입에도 유사한 조건을 이용하였다(후술하는 부분 참조).
(b) 상등액 감염: 전술한 바와 같이 준비된 0.5x106개의 정제 및 활성화된 인간의 CD8+ T세포(통상적으로 정제/활성화 후 4일 또는 5일 되는 시점)를 전술한 바와 같은 293 일시적 형질감염 시스템 또는 안정한 PA317 생산자 세포계 40.39(후술하는 부분 참조)으로부터 얻은 바이러스 상등액 1ml과 함께 새로운 T세포 배지(10% IL2와 2μg/ml 폴리브렌이 부가되어 있음) 1ml을 이용하여 배양하였다. 8시간 배양후에, 1.5ml의 배지를 각 웰로부터 제거하고, 1.0ml의 바이러스 상등액(2μg/ml의 폴리브렌과 10% IL2 함유)과 함께 새로운 T세포 배지 0.5ml로 대체시켰다. 12시간 배양후, 전술한 2단계 상등액 제조 과정을 반복하였다.
공배양과 상등액 감염을 위해, CD8+ T 세포를 10% IL2가 부가된 새로운 T 세포 배지에서 24-28시간동안 놓아두었다. 형질도입효율을 측정하기 위해, CD4(CD4-ζF3 수용체) 또는 F3(F15항체-수용체)의 표면발현에 대해 플로우 사이토메트리 방법으로 세포를 분석하였다. 형질감염된 293 세포와 공배양하에 있는 T세포를 293 모노레이어로부터 현탁액으로서 조심스럽게 제거하였다. 공배양 및 상등액 감염된T세포는 2% (FCS) 태아 송아지 혈청(Hyclone)이 부가된 인산완충염식염수(PBS)로 1회 세척하였다. 그리고나서, 2% FCS가 부가된 PBS 존재하에 적절한 FITC-결합형 검출 항체와 함께 40℃에서 30분간 1x106/ml의 밀도로 T세포를 배양하고, 2% FCS가 부가된 PBS로 3회 세척한 다음, 최종적으로 0.5ml PBS에 재현탁시컥서 플로우 사이토메트리로 분석하였다.
이어서, 형질도입된 CD8+ T세포 집단을 T 세포 배지(10% FCS, Hyclone: RPMI 1640, CellGro; 10mM Hepes 완충액(Gibco); 1% 피루베이트산 나트륨(Gibco); 1% 비 -필수 아미노산(Gibco); 2mM 글루타민(Gibco); 25μ M 2-메르캅토에탄올(Sigma)와 1% 스트랩토마이신/페니실린)에서 유지시켰다. OKT3를 10ng/ml의 농도로 첨가하거나 또는 10% IL2가 부가된 10ml의 T 세포 배지당 1-2x107개의 CB8+ T 세포 밀도로 T-25 조직배양 플라스크에 고정화된 OKT3에 세포를 노출시킴으로써 7 내지 10일마다 주기적으로 T 세포를 재자극시켰다. 세포를 48시간 배양한 다음, T 세포 배지로 1회 세척하고, 10% IL2가 부가된 새로운 배지에 0.5-1.0x106/ml의 농도로 재현탁시켰다.
CD8+ T 세포 형질도입에 대한 분석:
KAT 시스템을 사용하여 일시적으로 생산된 레트로바이러스에 의한 1차 인간 CD8+ T 세포의 형질도입효율을 암포트로픽 패키징계 PA317 (Miller and Buttimore, 상기 참조)에서 유래된 고역가의 안정한 생산자 클론으로부터 생산된 레트로바이러스와 비교하였다. F3 키메라 수용체를 형질도입시키는 안정한 생산자 클론 40.39는, 에코트로픽 패키징계 gpe(Markowitz 등, 상기 참조)에 pRTD4.2F3을 형질감염시킨 다음, 형질감염 48시간 후 상등액을 회수하여 8μg/ml의 폴리브렌(Miller and Buttimore, 상기 참조) 존재하에 PA317을 감염시킴으로써 분리하였다. 제한회석법에 의해 개별 클론을 얻은 다음 클론의 배지에서 바이러스 mRNA를 분리하여 603bp 제타 사슬 프로우브를 이용하여 돗트 블랏 하이브리드화시킴으로써 바이러스 생산에 대해 50개의 클론을 조사하였다. 가장 강한 하이브리드 시그날을 나타내는 클론인 클론 40.39에 대해 106NIH 3T3 세포를 제한희석법으로 감염시킨 다음 플로우사이토메트리법으로 분석하였다. 50㎕의 상등액이 17%의 세포를 형질도입시켰는데, 이는 340% 또는 평균 3.4 프로바이러스 복사본/세포/ml과 동등한 것이다. 40.39 생산자 세포와 1차 인간 CD8+ T세포를 48시간 공배양한 경우 형질도입효율은 1%-3% CD4+ 이었다(표 4).
이 결과를, 본 발명의 KAT 일시적-형질감염과 공배양 방법에 따른 형질도입 효율과 비교하였으며, 키메라 수용체 F3와 F15를 CD8+ T 세포내로 형질도입시키는데 이용되었다(제 4도). CD8+ T세포를 48시간동안 형질감염된 293세포상에서 공배양한 다음, 회수하고 14일간 T세포를 배양한 다음 전술한 것과 같이 FACS에 의해 형질도입효율을 분석하는 것을 내용으로 하는 4가지 실험을 실시하였다. F3와 F15 구조체에 의한 CD8 세포의 형질도입효율은 8 내지 38%로 다양하고 공여자 의존성이 매우 높은 것으로 보인다. 그러나, 평균적으로 이 효율은 고역가의 안정한 PA317과의 공배양에 의해 얻은 형질도입효율보다 8-12 배 높다. 또한, 높은 형질도입효율은 F15 구조체가 유사한 효율로 형질도입되기 때문에 F3 구조에만 특이적은 아니다 (제 4도). 이 데이터는 어떠한 다른 간행된 보고자료의 경우에 비해서도 적어도 5배이상의 효율로 CD8 T 세포가 형질도입될 수 있다는 것과 안정한 생산자의 발생이 필요하지 않다는 것을 보여주고 있다.
형질도입 3주 후, 형질도입된 T세포로부터 얻은 상등억에 대해 연장된 S+L-검사 (Miller 등, Mol.Cell. Biol.5:431-437(1985))방법으로 테스트한 결과 복제가능 레트로바이러스가 없는 것으로 보였다.
고효율 형질도입은 세포-세포 접촉에 의해 중개된다.
KAT 플라스미드의 일시적인 형질감염과 CD8+ T세포와의 공배양에 따른 고효율 CD8 T 세포형질 도입의 기작을 조사하기 위해, 다음과 같은 접근방식을 이용하여 CD8+ T 세포의 형질도입효율을 비교하였다: (1) 고역가의 안정한 PA317 생산자계에서 유래된 상등에 의한 감염, (2) 고역가의 안정한 PA317 생산자계와의 공배양, (3) pIK6.1MMSVampac과 pRTD 4.2F3에 의해 일시적으로 형질감염된 NIH 3T3 세포에서 유래된 상등액에 의한 감염, (4) pIK6.1MCVampac과 pRTD4.2F3에 의한 일시적인 형질감염 후 NIH 3T3 세포와의 48시간 공배양, (5) pIK6.1MCVampac 및 pRTD 2.2F3에 의한 293 세포의 일시적인 형질감염에서 유래된 상등액에 의한 감염, 및 (6) pIK6.1MCVampac과 pRTD2.2F3에 의한 일시적인 형질감염후 293 세포와의 48시간 공배양(표 4). 각각의 일시적인 형질감염 실험에 있어서, 형질감염된 세포의 플레이트수를 2배로 이용하여 3T3 세포의 상등액 감염을 위한 배지를 회수하였고, CD8 T 세포를 공배양시키는데도 플레이트를 2배 이용하였다. 안정한 생산자에 대해서도동일한 접근방식을 이용하였다.
ND1= 결정 안됨
바이러스가 293세포, 3T3 세포 또는 안정한 PA317 생산자에서 생산되는 지의 여부에 관계 없이 CD8+ T세포의 상등액 감염은 1% 였다(표 4, 실험 1A, 2A와 2C). 반면, pIK6.1MCVampac과 pRTD2.2F3에 의해 동시형질 감염된 293 세포와 CD8 T세포를 공배양하는 경우에는, 293 세포내로 이들 플라스미드들을 동시형질감염시켜 생산되는 상등액을 포함한 모든 상등액 감염에 비해 10-14배 이상인 10%-14%로 CD8 T세포의 형질도입을 초래하였다(표 4, 실험 1D, 2D). 이는 세포-세포 접촉이 CD8+ T세포의 고효율 형질도입을 일으킨다는 것을 나타낸다. 또한, 공배양하는 경우 KAT 형질감염효율은 3T3 세포가 이용될때 안정한 PA317 생산자와의 공배양시의 형질도입효율보다 1~3배 높고(표 4, 1B, 2B와 1C 비교), 293 세포가 이용될때에 비해서는5-10배 높다. 이 데이타는 293 세포가 포유류 세포의 고효율 형질도입을 뒷받침하는 독특한 성질을 지닌 점을 확인시켜준다.
본 발명이 임의의 특정 이론에 구속되기를 원하지는 않지만, 이들 결과는 배양 배지로의 고역가 바이러스 생산이 효율적인 T세포 형질도입에 충분하지 않다는 것과 관찰된 고효율 형질도입은 293 세포와 CD8+ T 세포의 세포-세포 접촉에 의해 중개되어, 효율이 10배까지 증가되는 것을 보여준다.
본 실시예에 제시된 결과들은, 선택과정 없이도, 종래에 보고된 결과들에 비해 상당히 높은 형질도입효율인 10-40%의 수준으로 CD8+ T세포가 바이러스에 의해 형질도입되는 것을 증명하고있다.
[실시예 3]
1차 인간 조혈간세포의 형질도입
본 실시예는 1차 인간 CD34+ 골수 간세포를 형질도입시키는데 있어서 본 발명의 방법과 KAT 구조체를 이용하는 것에 대해 기술하고 있다.
골수세포 준비
인간의 골수는 건강한 지원자에서 수득하였다. 먼저, 피콜 그라디언트 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용하여 단핵세포 분획으로 상기 골수를 분획화하였다. CD34+ 세포는 CellPro CEPTRATE LCTM친화성 칼럼(CellPro, Bothell, WA)상에서 양성 선택법을 이용하여 분리한다. 정제 후 FACS 분석결과 약 90% CD34+ 세포의 집단을 얻었다. 이 세포 집단을, 100ng/ml의 인간 간세포인자(hSCF) (R&D Systems,Minneapolis, MN), 50ng/ml hIL-3와 10ng/ml hIL-6 존재하에, 테리 폭스 랩(Terry Fox Labs, Vancouver, Canada)으로부터 완전배지로서 공급되는 배지(Myeloid Long Term Culture Medium)에 배지 1ml당 5x105세포의 밀도로 24웰-플레이트에 플레이팅하여 48시간 동안 배양하였다.
CD34+ 골수간세포의 형질도입
293 세포는, 형질감염전에 48시간동안 6웰-플레이트당 1x 106세포의 밀도로 플레이팅한 다음 pRTD2.2F3와 pIK6.1MCVampac를 각각 10μg씩 사용하여 형질감염시켰다. 24시간후, 형질감염 배지를 제거하고 실시예 2에 기재한 바와 같이 50ng/ml hIL-3, 100ng/ml hSCF와 10ng/ml hIL-6가 부가된 T세포 성장배지로 대체시켰다.
2-4시간후, 감염된 293 세포를 8μg/ml 폴리브렌 존재하에 웰당 5x105개의 정제된 CD34+와 함께 공배양하였다. 48시간후, 293 모노레이어 형태의 세포를 수집하여 전술한 것파 같은 성장인자를 함유하는 미엘로이드 장기 배지에 다시 플레이팅하였다. 집단의 수를 반으로 줄이는 방법을 통하여 매일 성장인자가 부가된 배지를 보충해주었다. 4일 후, 배지를 보충하고 G-CSF 2ng/ml과 hSCF 20ng/ml을 부가하여 그래뉼로사이트로의 분화를 촉진시켰다. 4~6일 후, 형질 도입된 유전자로부터의 표면발현 및 그래뉼로사이트 마커인 CD15에 대해 분석하였다. 또한, 서던 블랏 분석을 위해 DNA를 준비하였다.
제 5도는 14일간의 성장과 그래뉼로사이트로의 분화 후 형질도입된 조혈간/조상세포에 대한 FACS 분석결과를 나타낸다. 패널 A는 제 5도에서 모든 세포집단의분석에 사용된 전방과 측방 스케터 게이트를 나타낸다. 패널 B에는 동형 대조표준항체(FITC 와 PE)로 염색된 형질도입되지 않은 세포가 나타나 있다. 패널 C에는 인간의 CD4(형질도입된 유전자, y축) 및 CD15(그래뉼로사이트 분화 마커, x축)에 대한 항체로 염색된 형질도입되지 않은 세포가 도시되어 있다. 패널 D에서는, KAT 패키징 시스템이 조혈간/조상세포를 형질도입시키기 위하여 293 세포 공배양 방법이 이용되었다. 패널 C와 D 의 우측 상부 1/4을 비교한 결과는 형질도입된 세포의 5-6%가 CD4 단백질을 발현했다는 것을 나타낸다.
형질도입 효율에 대한 서던 블랏 분석
조혈간/조상세포가 KAT시스템에 의해 생산된 레트로바이러스에 의해 감염되는지를 결정하기 위해 서던블랏 분석을 실시하였다. 게놈 DNA 는 분화된 간세포로부터 준비하여, Eco RV를 이용하여 분해시켰다. pRTD1.2F3의 이배체 게놈당 0.12, 0.6, 1.2 및 6.0 복사본(제 6도 6, 레인 4-7)과 pRTD2.2F3의 이배체 게놈당 5 복사본(제 6도, 레인 8)과 동등한 Eco RV-분해 플라스미드 DNA뿐만 아니라, 감염된 세포(제 6도, 레인 2)와 대조표준 세포(제 6도, 레인 1)로부터 DNA 10μg씩을 0.8% 아가로즈겔상에서 전기영동하고, 제타바인드에 옮겨, 제타 전달막 및 세포질 도메인을 코딩하는 605bp 단편을 프로우브로 이용하여 하이브리드시켰다. 형질감염된 플라스미드 pRTD2.2를 Eco RV로 분해한 결과 4.2kb 밴드가 만들어졌다(제 6도, 레인8). MMLV 5'와 3' LTR을 포함하는 pRTD1.2의 Eco RV 분해 결과 3.6kb 단편이 만들어졌다(제 6도, 레인 4-7). 3' LTR의 바이러스 감염, 삽입 및 복제되면, Eco RV에 의한 분해시 3.6kb 단편이 만들어져야 한다. 감염된 CD34+ 세포에서, 프로우브는 삽입된 프로바이러스에 상응하는 적절한 3.6kb 밴드에 하이브리드되었다(제 6도, 레인 7). 대조표준 세포는 프로바이러스 밴드를 결여하고 있었지만, 프로우브는 내생 제타 유전자 서열에 상응하는 밴드에 하이브리드되었다(제 6도, 레인 8). 주사 밀도측정계를 이용하여 형질도입효율을 정량하여, 감염된 세포에서 세포당 프로바이러스 평균복사본수가 0.5(50% 형질도입)였음을 증명하였다. 또한, 내생 밴드에 대한 밀도측정을 통해 동일한 양의 DNA가 감염된 세포와 감염되지 않은 세포에 해당하는 레인에 로딩되었음을 확인하였다.
두 번째 실험에서는, 고역가 PA317 생산자 클론의 형질도입효율을 KAT 시스템에 의해 생산된 바이러스의 형질도입 효율과 비교하였다. 전술한 바와 같이, pIK6.1MCVampac 및 pRTD2.2F3를 이용하여 293 세포를 일시적으로 동시형질감염시키고, CD34+ 세포의 분리, 공배양 및 감염된 세포의 정제과정을 수행하였다. 실시예 2에서 기재한 바와 같이, CD34+ 세포와의 공배양 개시 24시간 전에 클론 40.39를 6웰-플레이트당 5x105개의 세포 수준으로 플레이팅. CD34+ 세포의 분리, 공배양, 감염된 세포의 정제는 293 세포에 대해 설명한 바와 같이 실시하였다. 형질도입효율은 전술한 것과 같이 Eco RV에 의해 분해된 DNA의 서던 블랏팅에 의해 분석하였고, 그 결과가 제 7도에 나타나 있다. KAT플라스미드와 공배양된 CD34+ 세포로부터 분리된 DNA에 존재하는 밴드는 3.6kb 밴드에 하이브리드되었는데(제 7도, 레인 2), 이는 크기면에서 Eco RV에 의해 분해된 플라스미드 DNA(제 7도, 레인 4-7)와 동일하고 삽입된 프로바이러스에 상응한다. 모의 감염된 293 세포(제 7도, 레인 1) 또는 40.39 세포(제 7도, 레인 3)와 공배양된 CD34+ 세포로부터 분리한 DNA에서는 하이브리드 밴드가 없었다. 플라스미드 표준은 세포당 삽입된 프로바이러스 0.3 내지 10 복사본까지의 범위를 갖는 것이었다. 따라서, PA317 레인에서 밴드의 부재는 KAT 형질도입이 적어도 10배 이상의 효율적이라는 것을 의미한다.
형질도입된 유전자의 표면발현에 대한 FACS 분석에서 형질도입효율이 단지 5-6%로 나타났지만, 서던 블랏 분석에서는 형질도입효율이 훨씬 더 높은(50-100%)것으로 나타난다. 인간의 CD4 단백질의 발현수준이 FACS 분석의 검출수준보다 낮을 가능성이 있거나, 또는 유전자가 존재하지는 않지만 효율적으로 발현될 가능성은 있다. 구조체에 대한 변형을 통해 발현수준을 높일 수 있을 것이다. 293 세포 공배양과 함께 KAT 패키징 시스템을 통한 인간의 조혈간/조상세포의 형질도입의 높은 효율은 PA317과 같은 통상의 쥐 섬유아세포 패키징 시스템을 이용하여 얻은 형질도입효율(제 7도)과 대조적이다. PA317 패키징계를 이용하여 얻은 데이타는, 쥐세포를 형질도입시킬 때 고역가 바이러스가 발생될 수 있지만 인간 골수간/조상세포의 형질도입효율은 매우 낮다는 것을 나타낸다.
상기 결과들은, 고역가 바이러스 상등액의 신속한 생산외에도, KAT구조체가 통상의 방법에 의해서는 형질도입이 어렵운 인간의 T 세포와 조혈세포와 같은 표적세포를 고효율로 형질도입시키는데 사용될 수 있다는 것을 보여주고 있다.
[실시예 4]
pIKT 레트로바이러스에 의한 인간 세포에서의 고역가 바이러스의 생산 및 인간 CD34+ 조혈세포의 고효율 형질도입
본 실시예에서는 인간 세포계에서 고역가 바이러스를 얻기 위해 본 발명의 신규 레트로바이러스 벡터를 이용하는 것과, 1차 인간 조혈간세포에서 고효율 형질도입을 위해 상기 바이러스를 이용하는 것에 대해 설명한다.
전술한 패키징 벡터 pIK6.1MCVampac UT△와 레트로바이러스 벡터 pIKT2.2SVGe-F3를 전술한 바와 같이 인간의 tsa54 세포내에 일시적으로 동시형질감염시켰다. tsa54 세포는 라지(large) SV40 T 항원의 형질감염에 의해 293 세포로부터 유도되었다(Heinzel 등, J. of Virol. 62(10): 3738-3746 (1988)). pIKT2.2SVGe-F3는 전술한 바와 같이 플라스미드 기본구조가 SV40 복제 개시점을 포함한다는 점에서 pRTD2.2F3과는 상이하다. 이로 인해, SV40 t-항원을 포함하는 tsa54 세포에서 고사본수의 플라스미드 복제가 이루어지게 된다. tsa54 세포를 형질감염시켜, 바이러스 상등액을 회수하여 전술한 바와 같이 3T3세포를 감염시키는데 이용하였다. 냉동된 바이러스 상등액 100㎕당 38%의 CD4 양성세포는 7x 106/ml과 동일하다.
pIKT 벡터를 이용하여 전술한 바와 같이 tas54 세포에서 레트로바이러스를 생산하여, 이를 이용하여 공배양에 의해 1차 인간 CD34+ 골수간세포를 형질도입시켰다. 골수간세포를 정제하여 다음과 같이 변화시킨 것을 제외하고는 실시예 3에서 기재한 바와 같이 pIKT2.2SVGe-F3를 이용하여 형질도입시켰다. tsa54 세포는 6웰-플레이트당 5x 105개 세포 밀도로 형질감염시켰다. 형질감염 배지를 대체하는데 이용된 배지는 10% FBS(태아 소혈청)가 부가된 IMDM 이었다. 바이러스를 생산하는tsa54 세포와의 2일간 공배양후 CD34+ 세포를 제거하여 성장인자가 함유된 미엘로이드 장기 배지에서 배양시켰다. 8~10 일후, 분화를 촉진하기 위해 10ng/ml의 hSCF와 함께 G-CSF를 2ng/ml 첨가하였다. 6~8일후, 인간의 CD4의 표면발현에 대해 세포를 분석하였다.
제 8도는 18일간의 성장과 그래뉼로사이트로의 분화 후 형질도입된 조혈간/조상세포에 대한 FACS 분석결과를 도시한 것이다. 패널 A는 제 8도에서 모든 세포집단의 분석에 사용된 전방과 측방 스케터 게이트를 나타낸다. 패널 B에는 동형 대조표준 항체(FITC와 PE)에 의해 염색된 형질도입되지 않은 세포가 도시되어 있다. 패널 C에는 인간의 CD4(형질감염된 유전자, y축)과 CD15(그래늘로사이트 분화 마커, x축)에 대한 항체에 의해 염색된 형질도입되지 않은 세포가 도시되어 있다. 패널 D에는 3T3 플레이트상에서 107 neor CFU 클론/ml과 등가의 역가를 가진 PA317 클론(78.81)이 조혈간세포와의 공배양시에 안정한 바이러스 생산자로서 사용되었다. 패널 E에서는, KAT 패키징 레트로바이러스 벡터가 조혈간/조상세포를 형질도입시키기 위해 293 세포 공배양과 함께 사용되었다. 패널 C와 D, C와 E의 우측 상단 1/4을 비교하면, KAT 구조체를 이용하여 형질도입된 세포의 24%가 CD4 단백질을 발현한 것에 비하여 PA317 형질도입된 세포의 1.7%가 CD4 단백질을 발현했음을 알 수 있다.
[실시예 5]
단일 벡터 293 또는 tsa54 안정한 패키장 클론의 생산
본 실시예는 단일 벡터 패키징 클론의 제조 및 이용에 대해 설명하고 있다.인간의 293 또는 tsa54 세포를 형질감염 48시간 전에, DME(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), 1g/l 포도당, 10% Donor 송아지 혈청(Trssue Culture Biologics, Tulare, CA) 배지에 10cm 플레이트당 5x105개 수준으로 플레이팅하였다. 10μg의 MCV ampac UT△와 0.1μg의 MC1 neo (Thomas and Capecchi Cell 51: 503-512(1987))를 인산칼습 침전법(Wigler 등, Cell 16:777 (1979))에 의해 동시형질감염시켰다. 클론은 벡터의 동시전기영동에 의해서도 효율적으로 만들어질 수 있었다(Shigekawa and Dower Biotechniques 6(8):742-751 (1988)). 형질감염 18시간 후에 배지를 교환하였다. 24시간 후, 세포를 1 mg/ml G418(Geneticin, GIBCO, Grand Island, NY)이 부가된 배지를 이용하여 1:10, 1:20 및 1.50의 비율로 플레이트에 나누었다. 배지는 14일동안 매 3일마다 교환하였다. 클론을 골라내어 24웰-플레이트에 취하여, 융합성장이 이루어지도록 성장시켰다. 배지를 웰로부터 수집하여 0.45㎛ 필터를 통하여 여과시키고 드라이 아이스에서 급속냉동시켰다. 10% DMSO(Sigma Chemical Co., Sst. Louis, MO)가 부가된 배지에 세포를 재현탁시켜, 드라이아이스에서 냉동시켜 -70℃에서 저장했다. 상등액에 대해, RNA 주형내로 방사능 표지된 티미딘이 결합되는 것을 측정하는 역전사 효소 분석법을 이용하여 비어 있는 바이러스 입자의 생산을 알아보았다(Goff 등, J. of Virol. 38:239~248 (1981)).
자가방사능에 의해 가장 강한 역전사 효소 시그날을 지닌 클론을 해동시켜 성장시킨 다음 일시적인 형질감염에 의한 바이러스 생산에 대해 테스트하였다. 형질감염은 10μg의 43.3PGKF3를 사용하여 전술한 바와 같이 실시하였다. 배지는 형질감염 18시간 후에 교환하였다. 24시간후, 바이러스 상등액을 수집하여 45㎛ 필터를 통하여 여과시키고 드라이아이스에서 급속냉동시켰다. 감염 24시간 전, 10cm 플레이트당 5x105개 세포 수준으로 플레이팅된 3T3 세포상에에서 바이러스 상등액을 분석하였다. 감염은 전술한 바와 같이 실시하였다. 세포를 회수하여 OKT4A 안티-CD4 단일클론 항체(Ortho Diagnostic Systems Lns., Raritan, NJ)로 염색하고 전술한 것과 같이 플로우 시토메트리에 의해 분석하였다. 클론들은 다양한 양의 패키징 기능을 나타내었다. 일시적인 역가가 가장 높은 클론을 선택하여 추가적인 특정에 대해 조사하였다(표 5).
클론 90.74, 107.75와 107.18에 대해, G418 존재 또는 부재하에 시간이 지남에 따라 패키징 게놈을 유지하는 능력을 연구하기 위해 연장된 시간동안 배양하였다. 세포를 3 내지 4일마다 1:10 내지 1:20의 비율로 나누었다. 계대 1, 6 및 12에서, 세포를 전술한 바와 같이 10μg의 43.2를 이용하여 형질감염시켰고, 일시적인 바이러스 상등액에 대해 전술한 바와 같이 3T3 세포를 감염시키는 방법으로 분석하였다. 연구된 세개의 클론중에 오직 하나(90.74)만이 12 계대 이후에도 일관된 역가를 지니는 것으로 나타났다. 또한, 연속되는 G418 선택은 역가와 무관한 것으로 나타났다. 클론 90.74는 약 107/ml과 동등한 일시적인 역가를 가진다. 클론 90.74는 부다페스트 조약에 따라 ATCC(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland)에 하기와 같이 기탁되었다.
상등액에 대해, PG4 세포상에서 S+/L- 분석에 의해 RCR 생산 여부를도 조사하였다. PG4 세포는 고양이 뇌로부터 얻은 몰로니 육종 바이러스에 의해 형질전환된 세포(ATCC CRL2032)이다. 적격의 쥐 레트로바이러스에 의해 감염되는 경우, PG4 세포는 현미경에 의해 분간될 수 있는 분별가능한 병소부분을 만들어낸다.(Haapala, 등 J.of Virol., 53(3):827-833). PG4 세포를 감염 24시간 전에 10cm 플레이트당 5x106개 접종시켰다. 감염은 시험용 상등액 1ml와 8μg/ml 폴리브렌을 포함하는 배지 4ml을 이용하여 실시하였다. 배지는 24시간 후 교체하고, 양성 대조 표준 플레이트상에 병소부분이 나타날때까지 2-3일마다 교체했다. 연구한 모든 클론은 12 계대를 거치는 동안 RCR이 없는 상태로 유지되었다.
예상치않게도, 이들 결과는 본 발명의 레트로바이러스 벡터를 이용하여 gag, pol 및 env 단백질을 생산하는, 안정하게 형질감염된 293-유래의 세포계가 만들어진 것을 보여주고 있다. 이들 세포계로부터의 바이러스 생산은 패키징 및 레트로바이러스 벡터의 일시적인 동시형질감염으로부터 생산된 것과 동일하다. 더욱 놀라운것은 약물 선택없이도 이들 세포계가 gag, pol, env 단백질 생산을 유지했다는 것이다. 문헌에 기재되어 있는 레트로바이러스 구조체를 이용하여 293계 레트로바이러스 생산자를 만드는 기존의 시도들이 실패하였다(Pear 등 Proc.Nat'1.Acad.Sci.(USA) 90:8392-8396 (1993)). 계대를 거듭하여 배양한 후에도, 이들 패키징 세포주는 복제가능 레트로바이러스를 자발적으로 생성하지는 않는다.
[실시예 6]
이중게놈의 안정한 패키징 세포의 생산
본 실시예는 293 또는 tsA54 패키징 세포에서 2개 게놈의 제조 및 용도에 대해 설명한다. 먼저, 인간 tsa 세포에서 gag/pol 클론을 만들었다. 0.8ml의 PBS당 1x106개의 세포를 15μg의 notI에 의해 직선화된 gag/pol ATG(전술한 바와 같음) 및 1μg 의 MC1 neo와 함께 동시전기영동시켰다. 전기영동은 Gene Pulser(Biorad, Richmond, CA)상에서 960μF와 260mV(Shigekawa and Dower, (1988) 상기 참조)에서 실시하였다. 세포를 DME, 1g/l 포도당, 10% 도노르 송아지 혈청 배지가 들어 있는 10cm 플레이트에 즉시 플레이팅하여 48시간동안 배양하였다. 그런 다음, 1.0mg/ml G418 선택배지를 이용하여 1:5, 1:10, 1:20 및 1:50으로 세포를 나누었다. 배지는 3일마다 교체하고 G418 선택 12일 후 클론을 24웰-플레이트에 골라내었다. 세포가 일단 융합성장을 보이면, 배지를 수집하여 0.45μm 필터를 통하여 여과시키고 드라이아이스에서 급속냉동시켰다. 클론들을 트립신 처리하고 -70℃에서 냉동시켰다. 상등액은 해동시켜 역전사효소 활성에 대해 분석하였다(Goff 등, (1981) 상기 참조). 최대 역전사효소 활성을 나타내는 클론을 성장시켜서, 전술한 5μg의 pIK6.1MCVamenvATGUT△와 전술한 10μg의 pRT43.2F3의 인산칼슘 형질감염법에 의한 일시적인 바이러스 생산에 대해 평가하였다. 배지는 18시간후에 교체하였고, 그리고나서 24시간 후에 바이러스 상등액을 수집하여 여과하고 3T3의 감염에 의한 분석을 위해 냉동시켰다. 일시적 바이러스 역가는 pRT43.2F3에 의해 형질감염된 단일 게놈 패키징계 90.74의 일시적 바이러스 역가와 견줄만한 것이었고, pIK6.1MCVampacUT△와 pRT43.2F3에 의해 동시형질감염된 tsA54 세포의 바이러스 역가의 50%였다(표 7).
가장 양호한 클론 4개를 선택하여 G418 선택단계 존재 및 부재하에 장기간 안정성에 대한 연구를 실시하였다. 이들에 대해 RCR 생산에 대해서도 PG4 세포상에서 조사하였는데, 그 결과 RCR 음성이었다.
클론 111.4는 전술한 바와 같이 히스티놀로 선택된 sv2his (Hartman and Mulligan, Proc. Nat:l.Acad .Sci (USA) 85: 8047-8051 (1988))와 pIK6.1MCVamenvATGUT△에 의해 동시형질감염된다. 클론들을 골라내어, 전술한 바와같이 일시적 형질 감염에 의한 바이러스 생산에 대하여 알아보았다. 여러개의 고역가 클론은 전술한 바와 같이 안정성과 RCR과 관련한 특징을 가지고 있다.
패키징 세포주는 전술한 방법을 사용하여 pIK6.1MCVamenvATGUT△의 암포트로픽 env 유전자를 다른 레트로바이러스의 외피, 예컨대 에코트로픽, 제노트로픽, 폴리트로픽, MLV, 10A1, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스, 개 백혈병 바이러스 C, 소포 구강 바이러스 (VSV) G 단백질, 인간의 T세포 백혈병(HTLV) I 및 II, 이들의 조합으로 대체시킴으로써 만들어질 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물과 특허출원은, 이들 각각의 간행물과 특허출원이 본 명세서에서 개별적이고 구체적으로 포함되는 것으로 기재되어 있다고 할지라도, 참고문헌으로서 그 전체가 본 명세서에 통합되어 있다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식인에게는 명백하게 이해되듯이, 본 발명은 본 발명의 정신과 필수적 특징으로부터 벗어남이 없이 예를 들어 다른 포유류 세포를 형질감염 및 형질도입시키는 것과 같이 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과는 다른 형태로 구현될 수 있다. 그러므로, 전술한 본 발명의 특정 실시예는 단지 설명을 위한 것이며, 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 발명의 상세한 설명에 포함된 실시예에 한정되는 것이 아니라 첨부된 청구 범위에 기재되어 있는 것과 같다.

Claims (82)

  1. 외래유전자를 포유류 표적세포에 고효율로 형질도입시키는 방법에 있어서;
    A) i) 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스요소에서 코드화하는 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래된 하나 이상의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하고, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이 상기 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산하는 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드로서, 상기 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열이 상기 바이러스의 바이러스성 5' LTR의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하는 영역을 결여하고 있고, 패키징 헬퍼 게놈을 패키징하는데 관여하는 psi 기능서열과 3' LTR을 모두 결여하고 있으며, 선택된 포유류 세포에서 작용하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하고, SV40 폴리아데닐화 부위를 갖고 있는, 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드; 및
    ii) 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 포유류 세포의 제1집단에서 생산하기 위해 상기 외래유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터;를 이용하여 바이러스를 생산할 수 있는 상기 포유류 세포의 제1집단을 일시적으로 동시형질감염시키는 단계:
    B) 상기 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 상기 포유류 세포의 제1집단과 포유류 표적세포의 제2집단을 공배양시켜, 상기 외래유전자를 상기 표적세포의 제2집단에 형질도입시킴으로써 상기 외래유전자에 의해 효율적으로 형질도입된 표적세포를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에서, 상기 표적세포는 임파세포, 인간의 조혈간세포, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 근원세포, 망막 상피세포, 랑게르한스섬, 부신수질세포, 골아세포, 파골세포, 뉴우런, 신경교세포, 신경절세포, 배아간세포와 간세포로 구성된 집단에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 포유류 표적세포의 제2집단이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 인간의 표적세포가 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 임파세포가 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 T 세포가 세포독성 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 임파세포가 CD8 양성 세포독성 T세포, CD4 양성 T 세포와 종양-침윤성 임파세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 포유류 표적세포의 제2집단이 인간의 조혈간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 포유류 표적세포의 제1집단이 인간의 배아 신장세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 인간의 배아신장세포가 293(ATCC No. CRL 1573)세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1도에 도시된 구조를 가지며 ATCC No.75484로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드 pIK6.1MMSVampac.
  12. 제 1도에 도시된 구조를 가지며 ATCC No.75483으로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드 pIK6.1MCVampac.
  13. 제 1도에 도시된 구조를 가지며 ATCC No.75486으로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드 pIK6.1gagpolATG.
  14. 제 1도에 도시된 구조를 가지며 ATCC No.75485로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드 pIK6.1amenvATG.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 레트로바이러스 패키징 플라스미드가 제 11, 12, 13 또는 14항의 레트로바이러스 패키징 플라스미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 레트로바이러스 게놈이 MMLV, HIV 와 GALV 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 백혈병 바이러스 게놈인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 외래 인핸서가 인간의 CMV 즉시초기 인핸서이고 상기 프로모터가 고유 MMLV 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 외래 인핸서와 프로모터가 인간의 CMV 즉시초기 인핸서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 외래 인핸서와 프로모터는 MMSV 인핸서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 레트로바이러스 패키징 플라스미드가 두 개의 레트로 바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 제1헬퍼 서열이 에코트로픽 MMLV gag 와 pol 단백질을 코딩하며, 제2헬퍼 서열이 제노트로픽, 암포트로픽, 에코트로픽, 폴리트로픽, 10A1 쥐 백혈병 바이러스, GALV, HIV, 소포 구강 바이러스 (VSV) G단백질, 인간의 T 세포 백혈병 (HTLV)타입 I 및 II, env 단백질과 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 env 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항의 방법에 의해 생산된, 외래유전자에 의해 형질도입된 것을 특징으로 하는 포유류 표적세포.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 세포가 인간세포인 것을 특징으로 하는 표적 세포.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 세포가 임파세포, 인간의 조혈간세포, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 근원세포, 망막 상피세포, 랑게르한스섬, 부신수질세포, 골아세포, 파골세포, 뉴우런, 신경교세포, 신경절세포, 배아 간세포와 간세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 표적세포.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 외래유전자가 성장인자, 림포카인, 호르몬 및 응집인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 외래유전자가 키메라 T 세포 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 키메라 T 세포 수용체가,
    시그날 서열을 코딩하는 서열;
    하나 이상의 리간드에 특이적으로 결합하는 비-MHC제한형 세포외 표면 막단백질 도메인을 코딩하는 서열;
    전달막 도메인을 코딩하는 서열; 및
    세포내 메신저 시스템을 활성화시키는 단백질의 세포질 신호-전달 도메인을 코딩하는 서열:을 리딩 프레임내에 포함하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 세포질 도메인이 CD3 제타사슬, CD3 에타사슬, CD3 감마사슬, CD3 델타사슬, CD3 입실론사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 세포질 도메인이 FcεR1 수용체의 감마사슬인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 CD 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 CD4 또는 CD8인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 27항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 단일-사슬 항체 또는 그 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 27항에 있어서, 상기 단일-사슬 항체가 HIV env 당단백질에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 27항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 HIV env 당단백질에 대해 특이적인 단일-사슬 항체이고 상기 세포질 도메인이 제타인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 27항에 있어서, 상기 키메라 T 세포 수용체는 CD4/제타 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 외래유전자를 포유류 표적세포에 고효율로 형질도입시키는 방법에 있어서;
    A) i) 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 필요한 모든 비리온단백질을 트랜스요소에서 코드화하는 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래된 하나 이상의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하고, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이 상기 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산하는 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드로서, 상기 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열이 상기 바이러스의 바이러스성 5' LTR의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하는 영역을 결여하고 있고, 패키징 헬퍼 게놈을 패키징하는데 관여하는 psi 기능서열과 3' LTR을 모두 결여하고 있으며, 선택된 포유류 세포에서 작용하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하고, SV40 폴리아데닐화 부위를 갖고 있는, 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드; 및
    ii) 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 293 세포에서 생산하기 위해 상기 외래유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터;를 이용하여 293 세포(ATCC No. CRL 1573)를 일시적으로 동시형질감염시키는 단계;
    B) 상기 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 상기 293 세포와 포유류 표적세포의 제2집단을 공배양시켜, 상기 외래유전자를 상기 표적세포의 제2집단에 형질도입시킴으로써 상기 외래유전자에 의해 효율적으로 형질도입된 표적세포를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 표적세포가 인간의 표적세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 인간의 표적세포가 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 인간의 표적세포가 조혈간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 외래유전자를 고효율로 표적세포에 형질도입시키는 방법에 있어서, 선택된 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 형질감염된 293 세포와 포유류 표적세포를 공배양하여, 상기 표적세포를 상기 외래유전자에 의해 형질도입시킴으로써 상기 외래유전자에 의해 효율적으로 형질도입된 표적세포를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 293 세포가 일시적으로 동시형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 상기 293 세포가 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, 상기 포유류 표적세포가 인간의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 인간의 세포가 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 상기 인간의 세포가 조혈간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 40항에 있어서, 상기 293 세포가,
    (a) 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스요소에서 코드화하는 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래된 하나 이상의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하고, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산하는 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드로서, 상기 레트로 바이러스 헬퍼 DNA 서열이 상기 바이러스의 바이러스성 5' LTS의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하는 영역을 결여하고 있고, 패키징 헬퍼 게놈을 패키징하는데 관여하는 psi 기능서열과 3' LTR을 모두 결여하고 있으며, 선택된 포유류 세포에서 작용하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하고, SV40 폴리아데닐화 부위를 갖고 있는, 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드; 및
    (b) 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 293 세포에서 생산하기 위해 상기 외래유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터;에 의해동시형질감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 인간세포에서 재조합 레트로바이러스를 고역가로 생산하기 위한 레트로바이러스 패키징 플라스미드에 있어서, 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스형으로 코딩하는 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래되고, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산하는 하나 이상의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하며, 상기 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열은 상기 바이러스의 바이러스성 5' LTR의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하는 영역을 결여하고 있고, 패키징 헬퍼 게놈을 패키징하는데 관여하는 psi 기능서열과 3' LTR을 모두 결여하고 있으며, 선택된 포유류 세포에서 작용하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 코드화하고, SV40 폴리아데닐화 부위를 갖는 것을 특징으로 하는, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 또는 HIV 바이러스를 이용한 레트로바이러스 패키징 플라스미드.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 외래 인핸서가 인간의 CMV 즉시초기 인핸서이고 상기 프로모터가 고유 MMLV 프로모터인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드.
  49. 제 47항에 있어서, 상기 외래 인핸서와 프로모터가 인간의 CMV 즉시초기 인핸서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드.
  50. 제 47항에 있어서, 상기 외래 인핸서와 프로모터가 MMSV 인핸서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드.
  51. 제 47항에 있어서, 상기 DNA 구조체가 두 개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드.
  52. 제 51항에 있어서, 제1헬퍼 서열이 에코트로픽 MMLV gag 와 pol 단백질을 코딩하며, 제2헬퍼 서열이 제노트로픽, 암포트로픽, 에코트로픽, 폴리트로픽, 10A1 쥐 백혈병 바이러스, GALV, HIV, 소포 구강 바이러스 (VSV) G단백질, 인간의 T 세포 백혈병 (HTLV)타입 I 및 II, env 단백질과 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 env 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키징 플라스미드.
  53. 제 47항 또는 52항의 레트로바이러스 패키징 플라스미드에 의해 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  54. 제 53항에 있어서, 인간의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  55. 포유류 세포에서 고역가의 복제-결함 재조합 레트로바이러스를 효율적으로 신속하게 일시적으로 생산하는 방법에 있어서, 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포내로 제 47항에 따른 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드와 외래유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 도입시킴으로써, 상기 레트로바이러스 패키징 플라스미드와 레트로바이러스 벡터를 가지고 있는 포유류 세포가 고역가의 감염용 레트로바이러스를 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 포유류 세포가 인간의 세포인 것을 특징으로 하는 방법 .
  57. 제 56항에 있어서, 상기 인간의 세포가 인간의 배아 신장세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 인간의 배아 신장세포가 293세포 (ATCC No.CRL1573)인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 55항에 따른 방법에 의해 제조되는, 복제-결합 재조합 레트로 바이러스를 고역가로 생산하는 것을 특징으로 하는 형질도입된 포유류 세포.
  60. 제 59항에 있어서, 인간의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질도입된 포유류 세포.
  61. 제 60항에 있어서, 인간의 배아 신장세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질도입된 포유류 세포.
  62. 제 61항에 있어서, 293 세포(ATCC CRL1573)를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  63. 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR의 U3 영역이 MMSV의 U3 영역으로 대체되어 있는 변형된 5' MMLV LTR, MMLV의 Nar I 부위까지의 바이러스성 gag 서열, 레트로바이러스성 스플라이스 수용체와 3' MMLV LTR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 pSTD4.2로 지정된 복제-결함 레트로바이러스벡터.
  64. 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR이 인간 CMV 즉시초기 인핸서/프로모터로 대체되어 있고, 상기 인핸서/프로모터는 MMLV의 뉴클레오티드 +1∼+32(KpnI)에 연결된 인간 CMV 프로모터의 뉴클레오티드 19(sac I) 내지 +1을 코딩하는 올리고뉴클레오티드에 의해 MMLV R 영역에 융합되어 있는 변형된 5' MMLV LTR, MMLV의 Nar I 부위까지의 바이러스성 gag 서열, 레트로바이러스성 스플라이스 수용체와 3' MMLV LTR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 pRTD2.2로 지정된 복제-결함 레트로 바이러스벡터.
  65. 벡터 pRTD2.2의 Sac I-Bst EII 단편이 벡터 LXSN의 Sac I-Bst EII 단편으로 대체되어 있는 변형된 제 66항의 pSTD2.2 벡터를 포함하는 pRTD2.2SVG로 지정된 복제-결함 레트로바이러스 벡터.
  66. SV40 T항원 폴리아데닐화 부위와 SV40 복제 개시점을 가진 변형된 pIKT1.1벡터를 포함하며, 상기 변형이 pIK1.1의 Sac I과 Eco RI 부위 사이에 제 67항의 pRTD2.2 벡터의 5' LTR과 3'LTR 사이의 DNA 서열이 삽입된 것임을 특징으로 하는 pRTD2.2로 지정된 복제-결함 레트로바이러스 벡터.
  67. SV40 T항원 폴리아데닐화 부위와 SV40 복제 개시점을 가진 변형된 pIKT1.1벡터를 포함하며, 상기 변형이 5'가 인간 CMV 프로모터의 Sac I 부위로 되어 있고 3'가 제 67항에 따른 벡터 pRTD2.2SVG의 3' LTR의 하류 약 750bp에 위치한 Eco RI 부위로 되어 있는 DNA가 pIK1.1의 Sac I과 Eco RI 부위 사이에 삽입된 것임을 특징으로 하는pRTD2.2SVG로 지정된 복제-결함 레트로바이러스 벡터.
  68. 변형된 pIK1.1을 포함하는 복제-결함 레트로바이러스 벡터로서, 인간의 CMV 즉시초기 인핸서/프로모터의 하류부분과 SV40 복제 개시점과 SV40폴리아데닐화 부위의 상류부분의 pIK1.1 서열이 제1 레트로바이러스 벡터의 5' R 영역에서 상기제1 레트로바이러스 벡터의 3' LTR의 하류 제한효소 부위까지의 단편으로 구성된 제1 레트로바이러스 벡터 단편으로 대체되어 있는 것을 특징으로 하는 복제-결함 레트로바이러스 벡터.
  69. 제 68항에 있어서, 상기 제1 레트로바이러스 벡터가 MMLV 벡터인 것을 특징으로 하는 복제-결함 레트로바이러스 벡터.
  70. 제 67항에 있어서, 상기 스플라이스 수용체가 프로모터, 인핸서, 인핸서/프로모터와 우성 콘트롤 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터의 전사 조절요소로 대체되어 있는 것을 특징으로 하는 복제-결함 레트로바이러스 벡터.
  71. 제 63항 내지 67항 및 70항 중 어느 한항에 있어서, 상기 스플라이스 수용체의 하류부분에 삽입된 외래유전자를 코딩하는 DNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터.
  72. 제 71항에 있어서, 상기 외래유전자가 키메라 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터.
  73. 제 72항에 있어서, 상기 수용체가 CD4/제타 또는 단일-사슬 항체 사슬/제타 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터.
  74. 제 71항의 복제-결함 레트로바이러스 벡터를 이용하여 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포에서 패키징가능한 게놈 레트로바이러스 전사체를 고농도로 발현시키는 방법에 있어서, 패키징 플라스미드와 레트로바이러스 벡터를 포유류 세포의 제1 집단에 일시적으로 동시형질감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 74항의 방법에 따라 생산된, 재조합 레트로바이러스를 생산하는 포유류 세포.
  76. 제 75항에 있어서, 상기 포유류 세포가 인간의 세포인 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  77. 제 76항에 있어서, 상기 인간의 세포가 293 세포인 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  78. 제 74항에 있어서, 상기 표적세포의 제1집단을 표적세포의 제2집단과 공배양하여 상기 표적세포에 외래유전자를 형질도입시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 상기 표적세포가 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 90.74(ATCC CRL11654)로 지정된 것을 특징으로 하는 세포주.
  81. 외래유전자를 포유류 표적세포에 형질도입시키는 방법에 있어서;
    A) i) 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하는데 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스형으로 코딩하는 복제불가능 레트로바이러스 게놈에서 유래되고, 복제가능 헬퍼 바이러스의 생산없이 복제불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생산하는 하나 이상의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드로서, 상기 레트로 바이러스 헬퍼 DNA 서열이 상기 바이러스의 바이러스성 5' LTR의 고유 인핸서 및/또는 프로모터를 코딩하는 영역을 결여하고 있고, 패키징 헬퍼 게놈을 패키징하는데 관여하는 psi 기능서열과 3' LTR을 모두 결여하고 있으며, 선택된 포유류 세포에서 작용하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 부위를 코딩하고 있는, 하나 이상의 레트로바이러스 패키징 플라스미드; 및
    ii) 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 포유류 세포의 제1집단에서 생산하기 위해 상기 외래유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터;를 이용하여 바이러스를 생산할 수 있는 상기 포유류 세포의 제1집단을 일시적으로 동시형질감염시키는 단계:
    B) 세포 상등액으로부터 상기 포유류 세포의 제1집단을 분리하는 단계: 및
    C) 상기 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 포함하는 상기 상등액과 포유류 표적세포의 제2집단을 배양하여, 상기 외래유전자를 상기 표적세포의 제2집단에 형질도입시킴으로써, 상기 외래유전자에 의해 효율적으로 형질도입된 표적세포를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 외래유전자를 포유류 표적세포에 형질도입시키는 방법에 있어서, 선택된 외래유전자를 운반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 형질감염된 포유류 세포의 제1집단으로루터 얻은 상등액과 상기 포유류 표적세포를 배양하여 상기 외래유전자를 상기 표적세포의 제2집단에 형질도입시킴으로써, 상기 외래유전자에 의해 효율적으로 형질도입된 표적세포를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
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