KR100337069B1

KR100337069B1 - 항-hiv모노클로날항체

Info

Publication number: KR100337069B1
Application number: KR1019950703809A
Authority: KR
Inventors: 에다야스유끼; 마에다히로아끼; 마끼즈미게이이찌; 시오사끼고우이찌; 오사또미기요시; 기마찌가즈히꼬; 히구찌히로후미; 도끼요시사찌오
Original assignee: 사이단호진가가쿠오요비겟세이리요호오겐큐쇼
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-09
Publication date: 2002-10-11
Also published as: PT690132E; DE69433422T2; DE69433422D1; EP0690132A1; AU6219494A; US6114143A; WO1994020632A1; AU681633B2; ES2213148T3; EP0690132A4; ATE256751T1; EP0690132B1; DK0690132T3; JP3855071B2; KR960701214A

Abstract

본 발명은 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)의 외피막상에 분자량이 약 1.2 × 10⁵달톤 인 당단백 항원(gp120)의 V3-PND 영역의 보존성 영역을 인식하고, 넓은 범위의 각종 HIV 변종을 중화시킬 수 있는 임상적 응용에 유용한 모노클론 항체 또는 그의 단편에 관한 것이고, 그로 부터 유래된 키메라성 및 인간화 항체를 제공한다. HIV gp-120의 PND 내에 보존성이 높은 GPGR 서열을 함유하는 PND-팁 영역을 갖는 복수의 펩티드를 면역원으로서 사용하여, 많은 HIV 변종에 대해 중화 활성을 갖는 모노클론 항체를 제조할 수 있다. 상기 모노클론 항체의 가변부를 코드하는 유전자 단편 또는 상기 영역이 상보성 결정 영역(CDR)을 사람 항체 유전자로 이식시키므로서, 임상적 응용에 효과적인 항 - HIV 중화 활성을 갖는 키메라성 항체 또는 개변 항체를 수득할 수 있다.

Description

항 - HIV 모노클로날 항체

사람 면역 결핍 바이러스(HIV)는 후천성 면역 결핍증(AIDS) 및 AIDS 관련된 증후군(ARC)와 같은 일련의 질병을 유발하는 사람 레트로바이러스이다. 오늘날, 상기 질병들은 세계적으로 심각한 문제가 되고 있지만, 상기 질병들에 효과적인 백신 또는 정립된 치료법이 제공되고 있지 않다.

HIV에 대한 항-바이러스제로서, 3'-아지도-2', 3'-디데옥시티미딘 (AZT) 또는 2', 3'-디데옥시이노신(ddI)과 같은 핵산 유사체의 역 전사효소 억제제를 사용함으로써, 바이러스 성장의 억제, CD4-양성 세포수의 증가 및 생명 주기의 연장과 같은 치료 효능을 관찰할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우에서, AIDS에 대한 상기약제들의 치료 효능은 부분적이거나 또는 일시적이고, 또한, 상기 약제들은 조혈 세포에 독성을 나타내거나 성장 억제를 나타내므로, 결핍된 면역 체계의 재구성을 억제한다. 상기 견해의 관점으로 부터, 더욱 효과적인 항-HIV제의 개발이 요망된다.

항체는 사람을 포함하는 포유류에서의 면역반응에서 역할하는 중요한 단백질이고, 외부로 부터 침입한 외래 물질 또는 생체에 의해서 외래 물질로서 인식되는 물질을 중화시켜 제거하는 기능을 갖는다. 상기 관점에서, 항체는 감염성 질병의 치료에 유용한 것으로 기대된다.

카르파스(Karpas) 등은 HIV로 감염된 건강한 환자로 부터 유래된 항-HIV 항체를 AIDS 환자에게 투여한 후 임상적 증상의 차도를 관찰했다[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, p. 9234 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 7613 (1990)]. 잭슨(Jackson) 등은 또한 유사한 결과를 수득하였다[Lancet, 2, p. 647 (1988)]. 상기 결과들은 AIDS 에서의 항체 요법의 유용성을 나타낸다.

상기 수동 면역 요법과는 별개로, HIV의 성분 백신을 사용한 환자의 능동 면역법도 또한 면역력을 증강시키기 위해 시도되었다[AIDS Res. Hum. Retroviruses, 8, P1051 (1992)]. 상기 치료는 아직 중상을 나타내지 않은 환자에게 효과적인 것으로 발견되었으나, 능동 면역 응답이 부족하여 CD4-양성세포의 수가 감소되는 AIDS를 나타내는 환자에게는 상당한 효과를 보이지는 않는다. 따라서, 질병이 진행된 환자의 경우는, 수동적인 면역치료법에 의존할 수 밖에 없으므로, 중화 항체가 대단히 중요하다.

HIV를 중화시키는 항체에 의해 인식되는 에피토프는, HIV 외피막에 존재하는 분자량이 약 1.2 × 10⁵달톤 인 당단백질 항원(gp120), 분자량이 약 4.1 × 104 달톤 인 막통과(transmembrane) 당단백질 항원(gp41) 및 분자량이 약 1.7 × 10⁴달톤 인 핵 단백 항원(p17)에 위치한다. 상기 에피토프중, 주요 중화 영역(Principal Neutralization Determinant; PND)로도 칭해지는, gp120의 제 3 가변 영역(아미노산 번호 303 - 338)에 위치하는 것은 강력한 중화 항체를 유도할 수 있으므로, 의약 또는 백신을 개발하는데 있어서 주요 표적이 된다.

바이러스 감염에서 PND 영역의 정확한 역할이 여전히 미지로 남아있다해도, gp120과 CD4 사이에 결합한 후 바이러스 침투를 돕는 것으로 추정된다. PND 영역은 또한 CD4-양성 세포에 의한 다핵 거대세포의 형성에 중요한 역할을 한다. 따라서, 상기 영역에 결합하여 바이러스의 감염 및 생장을 억제하는 항체가 제조된다면, 이것은 효과적인 항-HIV 제제가 될 수 있다.

그러나, PND 영역이 gp120에서의 다른 에피토프와 비교하여 아미노산 서열에서 상당한 변이성을 나타내므로, 상기 영역을 인식하는 대부분의 모노클로날 항체는 특정 HIV 주 만을 인식하는 바이러스 주-특이성 중화 항체이다. 상기 주-특이성 모노클로날 항체가 치료 또는 예방을 위해 사용된다면, 그의 효능은 상기 주-특이성 모노클로날 항체로 중화될 수 있는 HIV 주로 감염된 환자에 제한된다. 더우기, 개개의 HIV - 감염 환자에서, HIV는 단일한 HIV 주로서는 결코 존재하지 않으며 아미노산 서열이 수 %의 변이도를 나타내는 많은 HIV 변종의 집합체로서 대개 존재한다.

그러므로, 의약으로서의 모노클로날 항체의 가능성은, 환자들 또는 단일 환자 내에 존재하는 많은 HIV 변종의 어느 정도까지 상기 항체가 결합하여 중화시킬 수 있는지, 즉, 항체의 중화 스펙트럼 범위에 긴밀하게 관련된다. 임상적으로 유용한 HIV 의약을 수득하기 위해, 가능한한 넓은 중화 스펙트럼을 갖는 모노클로날 항체를 확립하는 것이 바람직하다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 HIV의 상기 PND 영역을 인식하고, 넓은 중화 스펙트럼을 갖는 모노클로날 항체 및 상기 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마를 제공하고, 또한 사람에게 투여하기 위한 상기 모노클로날 항체로 부터 제조된 키메라 또는 인간화 항체, 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명자들은 많은 HIV - 감염 개인으로부터 수득한 바이러스의 PND 영역을 연구한 결과, PND 영역의 중앙에 존재하는 Gly - Pro - Gly - Arg 서열을 포함하는 소위 PND-팁 영역이, 비록 몇몇 영역이 아미노산 서열에 있어서 높은 변이성을 나타낸다 해도[AIDS Res. Human Retroviruses, 7, p. 825 (1991)], 상대적으로 보존되어 있음이 나타났다. 그러므로, 상기 보존 영역을 인식하는 항체를 제조할 수 있다면, 상기 항체는 많은 종류와 바이러스 주를 중화시킬 수 있는 임상적으로 효과적인 모노클로날 항체가 될 것으로 기대된다.

그러나, 상기 영역을 인식하는 상기 항체는 단지 낮은 효율로 제조될 수 있다는 것이 예견될 수 있다. 보우뎃 등[Boudet et al.; Int. Immunol., 4, p. 283(1992)]은, PND 영역 내에서, Gly - Pro - Gly - Arg (GPGR; 이후 동일)의 바깥쪽에 위치하는 염기성 아미노산에 의해서는 높은 면역원성이 나타나지만, GPGR 서열의 면역원성은 낮음을 제안하고 있다. 또한 PND 영역을 인식하는 대부분의 항체가 주-특이성이라는 사실은, 상기 언급된 바와같이 넓은 중화 스펙트럼을 가지는 항체를 생성하는 항체-생성 세포가 HIV 항원으로 면역화되는 동물 (마우스 등) 또는 HIV - 감염 환자에게서는 부족하다는 것을 암시한다. 따라서, 어떠한 방법으로든 상기 항체를 생성하는 세포의 수를 증가시키는 것이 필요하다.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 이후 논의될 신규한 면역화 방법을 제공하므로서 PND-팁 영역을 인식하는 항-HIV 항체의 능동적 유도에 성공하였다. 즉, 시험 동물을 GPGR 서열을 포함하는 HIV의 어느 한 주로 우선 면역화한다. 이어서, 일차 면역화에 사용된 HIV 주의 아미노산 서열과는 N 및 C 말단의 아미노산 서열이 다르다는 것을 제외하고는 일반적인 PND 영역의 GPGR 서열을 또한 포함하는 다른 HIV 주로 이차 및 잇따른 면역화 차례로 수행한다. 면멱화를 위한 항원은 바이러스 입자, 감염된 세포, 정제된 gp120, 적당히 처리(예: 효소처리)된 gp120, 또는 PND 영역 및 그의 유도체 등의 아미노산 서열을 기초로하여 합성된 펩티드를 포함한다. 이중, PND 영역의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드 또는 혈청 알부민 또는 키홀 점착 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH) 등과의 그의 콘쥬게이트가 PND 영역내에 한정된 면역화를 유발하기 위해서 바람직하다. 면역화에 사용되는 마우스로는 BALB/c, C57BL/6, C3H/HeN, 및 그로 부터의 F1 마우스가 포함된다. 마우스(생후 4 ∼ 8주, 체중 20 ∼ 30 g) 한마리 당 20 ∼ 200 μg의 항원을 사용하여1 ∼ 2주 간격으로 4 ∼ 7회 면역화를 수행한다.

상기 면역화 방법으로, 이차 및 차기 면역화의 부스터(booster) 효과의 결과로는, 일차, 이차 및 차기 면역에 사용되는 항원의 중복 영역, 즉, PND-팁 영역을 인식하는 항체를 생성하는 항체 - 생성세포가 면역화 동물의 생체내에서 유발되는 항체-생성 세포 집단에서 증가되어야 한다. 상기 면역화 마우스의 비장 세포는 목적한 항체-생성 세포를 효율적으로 생성하기 위하여 세포 융합용 재료로서 사용될 수 있다.

세포 융합 기술을 사용하지 않고, 엡스타인 바 바이러스(EBV)를 사용하여 HIV - 감염 환자로 부터의 B 세포를 형질전환시키고, 상기 항체-생성 세포를 모노클로날 항체-생성 가능 세포로 전환시키는 것을 포함하는 또다른 방법에 의해 모노클로날 항체-생성 세포가 제조될 수 있다. 그러나, 본 발명 방법의 경우는 항체-생성 세포의 원재료가 말초 혈액이므로 재료가 거의 입수될 수 없기 때문에 상기 방법은 본 발명의 방법으로는 적합하지 않다. 또한, HIV - 감염 개인에게서 발견되는 대부분의 중화 항체가 주-특이성 항체인 반면, 상기-언급된 PND-팁 영역을 인식하는 항체는 매우 적으므로 상기 방법은 효율적인 방법이 아니다. 반면, 하이브리도마 방법은, 마우스와 같은 실험 동물을 이용하여 면역원이 용이하게 입수될 수 있어, 상기 언급된 면역화 방법의 고안이 가능하기 때문에 유리하다. 따라서, 목적 모노클로날 항체 - 생성 세포(PND-팁 영역을 인식)를 적극적으로 유발하기 위해, 하이브리도마 방법이 본 발명에서 효율적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 바이러스 감염의 예방, 치료, 진단에 유용하고, 생화학 및 조직학의 연구를 위한 신규 물질을 제공하는 면역학적 기술에 관한 것이다. 보다 특히, 후천성 면역 결핍증(AIDS)을 유발하는 바이러스인, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대해 폭넓은 중화 스펙트럼을 가지는 모노클로날 항체, 상기 항체를 분비하는 하이브리도마, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 임상적 응용을 위한 인간화된 재조합 모노클로날 항체에 관한 것이다.

제 1 도는 다종류의 PND 펩티드(SP-1, SP-17, SP-11, SP-12, SP-14, SP-30)로 순차적으로 면역화한 마우스로 부터 수득한 항-혈청과 각 V3 펩티드 사이의 반응성을 나타낸다.

제 2 도는 단일 PND 펩티드(SP-1)으로 순차적으로 면멱화한 마우스로 부터 수득한 항-혈청과 각 V3 펩티드 사이의 반응성을 나타낸다.

제 3 도는 본 발명의 모노클로날 항체 C25 및 주-특이성 중화 항체 μ5.5, α64에 의한 각종 HIV 변이주의 감염(세포 - 유리 바이러스의 감염 및 세포간 감염) 억제 활성을 나타낸다.

제 4 도는 각종 PND 펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 5 도는 각종 PND 펩티드와의 μ5.5 항체의 반응성을 나타낸다.

제 6 도는 MN으로 부터 유래된 IHIGPGRAFY, NI54-2로 부터 유래된 IRVGPGRAIY, 및 NI53으로 부터 유래된 IRVGPGRTLY의 데카펩티드로 부터 각각 하나의 아미노산을 결여시키므로서 수득된 각각 10개의 노나펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 7 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY를 기본으로 제조된 3 ∼ 10개의 아미노산을 함유하는 중복 펩티드 군(N 말단으로 부터 하나씩 변화시킨 아미노산 서열을 갖는 일련의 펩티드)과의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 8 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 첫번째 아미노산(I)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 9 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 두번째 아미노산(H)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 10 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 세번째 아미노산(I)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 11 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 네번째 아미노산(G)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 12 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 다섯번째 아미노산(P)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 13 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 여섯번째 아미노산(G)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 14 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 일곱번째 아미노산(R)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 15 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 여덟번째 아미노산(A)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 16 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 아홉번째 아미노산(F)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 17 도는 MN-유래된 펩티드 IHIGPGRAFY에서 열번째 아미노산(Y)을 다른 아미노산으로 치환하여 수득한 데카펩티드와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

제 18 도는 일본에서 HIV - 감염된 사람으로 부터 유래된 콘센서스(consensus) PND 펩티드와 C25 항체와의 반응성을, μ5.5 및 α64 항체와 비교하여 나타낸다.

제 19 도는 C25 항체의 H 사슬 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.

제 20 도는 C25 항체의 L 사슬 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.

제 21 도는 인간화 C25 항체(RC25)의 H 사슬 가변 영역의 5' 말단 유전자의 핵산 서열 및 그의 N 말단의 아미노산 서열을 나타낸다.

제 22 도는 인간화 C25 항체(RC25)의 H 사슬 가변 영역의 3' 말단 유전자의 핵산 서열 및 그의 C 말단의 아미노산 서열을 나타낸다.

제 23 도는 인간화 C25 항체(RC25)의 L 사슬 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.

제 24 도는 C25 항체 및 정상 사람 면역글로블린과 비교하여 HIV - 감염된 세포에 대하여 인간화 C25 항체(RC25)의 항체 의존성 보체 - 매개된 세포장해(ACC)을 나타낸다.

제 25 도는 C25 항체 및 보통 사람 면역글로블린과 비교하여 HIV - 감염 세포에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 항체 의존성 세포 - 매개성 세포장해활성(ADCC)을 나타낸다.

제 26 도는 HIV - 감염된 환자(YHI)로 부터 수득한 혈장으로 부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 중화 활성을 나타낸다.

제 27 도는 HIV - 감염된 환자(ASA)로 부터 수득한 말초 혈액의 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 중화 활성을 나타낸다.

제 28 도는 HIV - 감염된 환자(HHA)로 부터 수득한 말초 혈액의 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 중화 활성을 나타낸다.

제 29 도는 HIV - 감염된 환자(MNI)로 부터 수득한 말초 혈액의 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 중화 활성을 나타낸다.

제 30 도는 HIV - 감염된 환자(MOK)로 부터 수득한 말초 혈액의 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 중화 활성을 나타낸다.

제 31 도는 CD8의 재구성 후 HIV - 감염된 환자(KMO)로 부터 수득한 말초 혈액의 단핵 세포로부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 중화 활성을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

제 1 도는 상기 언급된 방법으로 면역화한 마우스 혈청의 각종 PND 영역 펩티드에 대한 반응성을 조사한 결과이다. 즉, 다른 남아있는 아미노산 서열은 다르고 GPGR 서열을 공통으로 가지는 다종류의 PND 펩티드로 순차적으로 면역화한 마우스로부터 수득된 항-혈청은 면역화를 위해 사용된 PND 펩티드 모두와 반응한다. 보다 놀랍게도, 상기 항-혈청은 면역화를 위해 사용되는 펩티드 뿐아니라 GPGR 서열을 공통으로 포함하는 다른 PND 펩티드와도 반응한다. 또한, 면역원성 PND 펩티드에서 공통인 아미노산 서열 GPGR을 5회 반복하여 함유하는 펩티드(SP-30)과 강하게 반응한다. 또한 상기 항-혈청이 많은 HIV 주를 중화시킬 수 있다는 것이 확인되었다.

반대로, 제 2 도에 나타난 바와 같이, 단일 펩티드(SP-1)로 5 ∼ 6회 면역화한 마우스로부터 수득된 항-혈청은 면역원성 PND 펩티드와는 반응하지만 다른 PND 펩티드와는 낮은 반응성을 나타낸다. 합성 GPGR 펩티드와의 반응성을 또한 연구하였으나, 거의 반응하지 않는다. 즉, 상기 단일 펩티드로 면역화한 마우스는 고도면역화하여도 주-특이성 항체와의 반응만을 나타낸다.

상기는 몇가지 상이한 HIV의 PND 펩티드로 순차적으로 면역화한 상기 마우스가 각종 HIV 균주에 대하여 넓은 중화 스펙트럼을 갖는 항-PND-팁 항체를 유발한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 상기 마우스로 부터의 비장 세포와의 세포 융합은 넓은 중화 스펙트럼을 가지는 모노클로날 항체를 생성하는 세포를 효율적으로 제조할 수 있는 것으로 기대된다.

하이브리도마는 문헌[Kohler and Milstein; Nature 256, p. 495 (1975)]에 의한 방법에 따라서 제조된다. 골수종 세포는 MOPC-21NS/1 [Nature 256, p. 495 (1975)], SP2/0-Ag14 [Nature 276, p. 269 (1979)], p3X63Ag8-U1 [Eur. J. Immunol. 6, p. 511 (1976)], p3X63-Ag8 [Nature, 256, p. 495 (1975)], p3×63-Ag8.653 [J. Immunol. 123, p. 1548 (1979)] 등을 포함하는 것이 바람직하다. 비장 세포 및 골수종 세포를 1 : 1 ∼ 10 : 1의 비율로 함께 혼합한다. 융합은 NaCl(약 0.85 %) 및 1,000 ∼ 6,000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 포스페이트 완충용액(pH 7.2 ∼ 7.4)에서 수행한다. 융합은 양 세포의 혼합물을 35 ∼ 37 ℃ 에서 1 ∼ 5 분간 인큐베이션하여 수행한다. 하이포크산틴(1.3 ∼ 1.4 mg/dl), 아미노프테린(18 ∼ 20 μl/dl), 티미딘(375 ∼ 4,000 μl/dl), 스트렙토마이신(50 ∼ 100 μg/㎖), 페니실린(50 ∼ 100 단위/ml), 글루타민(3.5 ∼ 4.0 g/l 및 소의태아 혈청(10 ∼ 20 %)을 함유하는 기초 배지를 사용하여 생육하는 세포를 선별하므로서 융합된 세포(하이브리도마)를 선별한다. 기초 배지는 RPMI1640 배지, 이글 MEM 배지 등과 같은, 동물 세포의 배양을 위해 일반적으로 사용되는 것을 포함한다. 융합된 세포의 클로닝은 제한 희석 방법에 의해서 2회 이상 수행된다.

모노클로날 항체를 제조하는데 있어서 고려되어지는 또다른 중요한 관점은 하이브리도마에 의해 생성된 항체중 어떠한 종류를 선별해야만 하는지이다. 즉, 세포 융합은 많은 하이브리도마를 제공하지만, 그 중, 목적한 항체를 생성하는 하이브리도마를 클론하여야 한다. 지표로서, HIV-MN 등의 연구실에서 사용되고 있는 HIV 주 또는 그로부터 유래된 중화 에피토프인 PND 펩티드 등과의 반응성을 이용하여 대개 선별한다. 그러나, 상기 주는 생체외에서 계대배양된 것이므로, 환자의 생체내에서 실제적으로 존재하는 HIV 주를 항상 반영하는 것은 아니다. 본 발명의 목적은 환자의 체내에 존재하며 실제 만연하고 있는 HIV 주를 퇴치하는 것이기 때문에, 상기 목적을 위해 중화 항체를 생산하는 하이브리도마의 선별을 감염된 환자로부터 유래된 HIV 주를 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 그러므로, PND 영역의 아미노산 서열을 코ELD하는 유전자를 HIV - 감염 사람으로 부터 직접 단리시켜 E. coli에서 발현시킨다.

지표로서 상기 재조합 PND 펩티드와의 반응성을 이용하여, 환자의 생체내에 존재하는 HIV에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 선별하므로서 목적 하이브리도마의 선별을 수행한다. 더우기, 넓은 중화 스펙트럼을 가지는 항체를 확립하기 위해서, 재조합 PND 펩티드를 가능한한 많은 HIV - 감염된 사람으로 부터 제조하고, 대부분의 상기 펩티드와 반응할 수 있는 항체를 선별한다.

상기 언급된 방법을 사용하여, 본 발명자들은 각종 HIV 변종을 폭넓게 중화시키는 모노클로날 항체 C25를 확립하였다. C25 항체는 시험관내에서 세포 - 유리 바이러스 및 세포간 감염에 의한 감염을 강하게 억제한다. C25 항체는 면역원으로서 사용된 대부분의 펩티드와 반응하고 추가의 많은 HIV 균주를 중화시켰는데, 이는 상기 항체에 의해 인식되는 에피토프가 주들 사이에서 보존된 영역, 즉, GPGR 및 그의 주변 부위라는 것을 암시한다.

합성 펩티드를 사용하여 에피토프를 더욱 상세히 분석한 결과, 본 발명의 C25 항체는 PND 영역의 PND-팁 주변에서 하기의 아미노산 서열 :

또는 Tyr 이고;

Xa2은 Gly 또는 Ala 이고;

일련의 펩티드와 반응하는 것으로 밝혀졌다.

또한, 본 발명의 C25 항체가 하기 펩티드와 반응하는 것으로 밝혀Val, Tyr 이다]

즉, 본 발명의 C25 항체는 코어로서 GPGR, 및 그에 인접한 N 및 C 말단의 각각 하나의 아미노산으로 이루어진 6개의 아미노산에 의해 형성되는 에피토프를 인식한다.

상기 관찰을 기준으로 하여, C25 항체는 HIV의 PND 영역내 보존성이 높은 아미노산을 인식하여 많은 HIV 감염을 억제하므로 폭넓은 중화 스펙트럼을 갖는 것으로 확인되었다.

이어서, 본 발명자들은 실제로 HIV - 감염된 사람으로 부터 유래된 HIV에 대한 C25 항체의 중화 스펙트럼을 연구하므로서 실질적인 임상적 사용에 있어서 C25 항체의 유용성을 조사하였다.

우선, 임상적 유용성은 C25 항체가 결합하여 중화시킬 수 있는 실제적으로 만연하는 HIV 변종이 얼마만큼의 범위인지를 의미한다. 상기 관점에서, 각각의 감염된 사람의 생체내에 존재하는 HIV 변종의 PND 영역을 먼저 연구하여, 콘센서스 서열로서 가장 높은 빈도를 가지는 HIV의 아미노산 서열을 결정하고, 상기 서열을가지는 PND 펩티드와 C25 항체 사이의 반응성을 측정하였다. 그 결과, C25 항체는 각각의 환자로 부터 유래된 HIV 변종의 콘센서스 펩티드와 약 80 % 반응하였다. 본 발명자들에 의해 이미 확립된 주 - 특이성 중화 모노클로날 항체 μ5.5가 30 %의 결합율을 나타내는 데 비해, C25 항체는 매우 넓은 중화 스펙트럼을 가짐이 밝혀졌다.

임상적 유용성의 이차 관점은 단일 환자에게서 발생하는 HIV 변종의 집합체(quasispecies)사이에서 어느 정도의 변종 범위까지가 효과적인지 하는 것이다. 각각의 HIV - 감염된 개인에게서 발생하는 바이러스 변종의 아미노산 서열을 결정해 보면, 완전히 동일한 아미노산 서열은 없지만, 약간의 변화된 아미노산 서열을 갖는 바이러스 변종의 집합체가 환자를 감염시킨다. 따라서, 의약으로서 항체를 투여함으로써 생체로 부터 감염 바이러스 모두를 배제하기 위해서는, 항체는 환자에게서 발생하는 대부분의 HIV 바이러스 변종과 반응해야 한다. 그러한 점에서, 단일 환자로 부터 단리한 PND 영역 펩티드와 C25 항체 사이의 반응성을 측정했다. 주 - 특이성 항체 μ5.5를 사용하는 경우, 항체와 반응하지 않은 여러 HIV 변종이 생체내에 남아있었다. 반대로, C25 항체는 감염된 개인에게서 발생하는 모든 또는 대부분의 HIV 변종과 반응할 수 있었다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 C25 항체는 PND 영역의 고보존성 PND-팁 영역을 인식하고 강한 중화 활성을 나타내는 모노클로날 항체이므로, 다양한 HIV를 충분히 대처할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 사실상, C25 항체는 감염된 개인의 생체내에서 발생하는 대부분의 HIV 변종과 반응하므로, 임상적 유용성이 큰데, 이는 상기 항체의 임상적 응용성을 암시하는 것이다.

본 발명의 모노클로날 항체 C25를 생성하는 대표적인 하이브리도마는 1994년 2월 10일 부다페스트 조약에 따라서 국제기관[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology with the accession number of FERM BP-4561]에 기탁되어 있다.

상기 언급된 바와 같이 본 발명의 C25 항체가 넓은 중화 스펙트럼을 가지고 임상적으로 유용하다고 제안되었다해도, 마우스 - 유래된 항체이므로, 사람에게로의 투여는 안전성(항원성 유발) 및 유효성(반감기의 단축)의 면에 있어서 실제로 불가능하다. 그러므로, 유전 공학적 방법을 사용하여 항원 - 결합력을 변화시키지 않고 C25 항체를 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 분자로 개질시키는 것이 필요하다.

C25 항체의 항원 - 결합 부위가 사람 항체 불변 영역에 연결된 소위 키메라 또는 인간화 항체를 제조하기 위해서, C25 항체의 가변 영역(V) 유전자를 우선 클로닝하여, 염기 서열 및 그에 의해 코eld되는 아미노산 서열을 결정하였다.

가변 영역 유전자를 통상적인 유전자 조작 방법에 의해 단리시킬 수 있다. 예를 들면, 예를 들어, 참고 문헌[T. Maniatis, "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor Lab. (1982)]에서와 같은, 통상적인 방법에 따른 세포의 염색체 DNA로 부터 가변 영역 유전자를 클로닝하거나, 또는 통상적인 방법[D. M. Glover ed. "DNA cloning Vol. I" IRL press (1985)]에 따라 세포의 mRNA 물질로 부터 cDNA를 합성하여 가변 영역 유전자를 클로닝함으로써 단리시킬 수 있다. 상기 방법중 하나에서, 가변 영역 유전자를 클로닝하기 위한 프로브로서, 이미 문헌[Sakano et al., Nature, 286, p. 676 (1980); E. E. Max et al., J. Biol. Chem., 256, p. 5116, (1981)]에 보고되었던 마우스 면역글로블린 유전자의 핵산 염기 서열을 참고로 하여 DNA 프로브를 합성하였다. PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 클론을 또한 수행할 수 있다[R. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, 3833 (1989); W. D. Huse et al., Science, 246, 1275 (1989)].

상기 방법을 사용하여, C25 항체의 가변 영역 유전자를 단리시켜 염기 및 아미노산 서열을 분석한 결과, C25 항체의 가변 영역은 지금까지 보고된 항체들의 서열과는 다른 매우 신규한 서열이라는 것이 밝혀졌다.

제 19 도 및 제 20 도에서 CDR1 ∼ CDR3 영역은 실제로 항원과 결합하는 영역인데, 그의 서열은 C25 항체의 폭넓은 중화 스펙트럼과 밀접하게 관련된 것으로 추정된다.

상기 관점에서, 가변 영역의 아미노산 서열을 코eld하는 유전자 단편을 사람 항체 불변영역의 유전자 단편의 상류에 연결하여 키메라 항체 유전자를 제조하거나, 또는 상기 - 언급된 CDR 영역을 단독으로 사람 항체 가변 영역의 CDRs에 이식하므로서 인간화 C25 항체 유전자를 제조한다. 상기 유전자를 발현시키고 발현 생성물을 그의 특성에 대해 분석한 결과, 키메라 및 인간화 C25 항체가 마우스 C25 항체의 중화 스펙트럼과 동일한 중화 스펙트럼을 갖는 것으로 밝혀졌다. 무엇보다도, CDR 영역만을 이식한 인간화 C25 항체를 PND와 반응한다는 사실은, 항체의 가변 영역중, CDRs가 결합을 위한 가장 중요한 아미노산이라는 것을 의미한다. 또한,상기 항체는 항-사람 IgG 뿐아니라 항-마우스 IgG 와도 반응하는데, 이는, 상기 항체가 사람 항체로서의 항원성을 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, 사람에게 투여하는 경우, 키메라 및 인간화 C25 항체는 심각한 항원성을 자극하지 않음을 암시한다.

키메라성 및 인간화 항체의 또다른 잇점은, 그들이 항체 의존성 보체 - 매개된 세포장해(ACC) 및 항체 의존성 세포 - 매개된 세포장해(ADCC)와 같은 사람 항체의 불변영역으로 인한 작용인자 활성을 갖는다는 것이다. 상기 언급된 바와같이, C25 항체는 세포 - 유리 HIV 바이러스 또는 세포간 감염을 억제한다. 그러나, 상기와 더불어, 감염된 세포를 파괴시킬 수 있는지가 의약을 위한 또다른 중요한 요소이다. 일반적으로, 항체만으로는 감염된 세포를 죽이거나 파괴시킬 수는 없으나, FcR을 갖는 보체 또는 작용인자 세포를 통해 감염된 세포를 파괴시킬 수 있다. 항체가 보체 또는 FcR에 결합하는 곳은 불변영역이다[Mol. Immunol, 22, p 161 (1985)].

상기 관점에서, 항체 불변영역을 기초로 한 본 발명의 키메라 및 인간화 C25 항체의 ACC 및 ADCC 활성을 조사하였다. 결과로서, 키메라성 및 인간화 C25 항체는 보체 또는 작용인자 세포의 존재에서 연속적인 HIV 감염의 세포를 상당히 파괴시켰다. 상기는 본 발명의 키메라 및 인간화 C25 항체가 감염된 세포의 표면에서 유리 바이러스 입자 또는 바이러스 항원에 의한 감염을 억제할 뿐아니라 감염된 세포를 파괴할 수 있다는 것을 의미한다.

상기 언급된 바와같이, HIV - 감염된 환자에게서 실제로 발생하는 HIV 변종은 완전히 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이 아니라 다른 아미노산 서열을 가지는 많은 변종의 집합체이다. 따라서, 치료 목적으로 항체를 투여하므로써 생체로 부터 감염된 바이러스를 배제하기 위해서, 항체는 변종의 집합체 대부분을 중화시켜야 한다. 상기 관점에서, 환자로 부터의 혈장 및 말초 혈액 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 중화 활성에 대해 상기 인간화 C25 항체를 시험한 결과, 환자로 부터 유래된 많은 바이러스에 대하여 중화 활성을 나타냄이 분명하였다. 상기는 상기 인간화 C25 항체가 실제 환자에 대해 임상적으로 유용하다는 것을 나타낸다.

상기 언급된 바와같이, 본 발명자들은 감염된 사람으로 부터의 많은 종류의 HIV 균주를 폭넓게 중화시킬 수 있는 모노클로날 C25 항체를 제조하였다. 더우기, 상기 항체의 인간화는 사람에 있어서의 항원성을 감소시킬 수 있고 감염된 세포의 파괴와 같은 작용인자의 활성을 부여한다. 그러므로, 본 발명은 HIV 감염의 예방, 치료 및 진단을 위해 유용한 항체를 제공한다.

실시예 1 : 모노클로날 항체의 제조

1-1) 항원 (합성 PND 펩티드)의 제조

표 1 에 나타낸 것과 같은 gp 120의 303 - 322번 아미노산에 해당하는 합성 PND 펩티드를 면역화를 위한 항원 및 분석을 위한 항원으로서 사용한다.

표 1

상기 펩티드의 화학적 합성을 위해서, ABI430A 펩티드 합성기(Biosystem 사용)를 사용한다. 결과로서, 조생성물을 수득한다. TFMSA 방법에 의해 수지로부터 펩티드를 옮겨 역 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제한다. 역 HPLC에 의한 정제를 3회 반복하고 수득한 분획을 수합한다.

이어서, 수득한 합성 펩티드 각각을 동결 건조시켜 KLH에 결합시키므로서 펩티드 - KLH 콘쥬게이트를 제조한다. 우선, 각각의 상기 펩티드(10 mg)을 10 mM PBS(pH 7.0; 2 ml) 중에 용해시키고, 거기에 디메틸포름아미드 용액(MBS 형 가교 결합제) (40 mg/100 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분간 교반한다. 반응 용액을 이어서 디클로로메탄(2 ml)으로 3 회 세척하고, 수득한 수성층을 분리한다(용액 A). 별개로, KLH(20 mg)을 0.2 M 트리스 - HCl(pH 8.6, 8M 우레아) (5 ml)중에 용해시키고 거기에 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반시킨다. 반응 용액에 10 % 트리클로로아세트산(3 ml)을 첨가한다. 침전물을 흡인 장치로 여과시키고, 증류수(2 ml)로 세척한 다음, 20 mM NaPB(pH 7.0, 6M 우레아) (5 ml)중에 용해시킨다(용액 B). 용액 A 및 B를 함께 혼합하고, 혼합물을 실온에서 3 시간동안 교반시킨다. 반응 생성물을 투석시킨 다음 동결 건조시킨다.

상기 언급된 바와 같이, PND 펩티드 및 PND 펩티드 - KLH 콘쥬게이트를 제조하여 면역화용 항원 및 분석용 항원으로서 사용한다.

1-2) 마우스의 면역화

실시예의 방법에 의해서, 면역화를 위한 펩티드의 순서를 변화시킬 수 있는 것을 제외하고, 상기 언급된 바와 같이 제조된 합성 펩티드를 사용한 면역법을 이하에서 나타낸다.

생후 4 ∼ 8 주된 BALB/c 및 C3H/HeN 마우스를 사용한다. 복강내 접종 5회 및 이어서 정맥내 접종 1회로 면역화를 수행한다. 즉, 0일에는 프로인트 완전 면역보강제의 존재하에서 SP - 1 - KLH를 복강내 투여하고; 7일째에는 프로인트 불완전 면역보강제의 존재하에서 SP - 17 - KHL을 복강내 투여하고; 14일째에는 프로인트 불완전 면역 보강제의 존재하에서 SP - 11 - KHL을 복강내 투여하고; 21일째에는 프로인트 불완전 면역보강제의 존재하에서 SP - 12 - KHL을 복강내 투여하고; 28일째에는 프로인트 불완전 면역보강제의 존재하에서 SP - 14 - KHL을 복강내 투여하고; 및 35일째에는 면역보강제 없이 SP - 30 - KLH를 정맥내 투여한다.

1-3) 면역화 마우스의 항-혈청 중 항체 역가의 측정

상기는 EIA 방법으로 수행한다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 합성 펩티드항원(2 μg/ml)을 100 ㎕/홈 의 96 - 홈 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 항원을 고정시킨다. 거기에 1 % BSA(소혈철 알부민)용액 (150 ㎕)을 더 첨가하고, 플레이트를 은폐를 위해 동일한 방법으로 인큐베이션한다. 이어서 제조된 항원 - 고정된 플레이트에 클로닝 후의 세포 융합법에 의해 수득한 하이브리도마 또는 하이브리도마의 배양 상충액을 첨가한다.

플레이트를 4 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 0.1 % 트윈(Tween) 20/PBS로 3 회 세척한 다음, 퍼옥시다제 - 표지된 항-마우스 면역글로블린 항체 용액[Kappel 사 제; 5,000 배 희석]을 거기에 100 μl/홈 첨가한다. 4 ℃에서 1시간동안 플레이트를 인큐베이션시킨 후, 0.1 % 트윈 20/PBS로 5회 세척한다. 이어서, 통상적인 방법으로 TMBZ 기질의 용액을 첨가하여 발색 반응을 전개시켜 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다.

제 1 도에서 명백한 바와 같이, 최종 면역화 후 수득한 항-혈청은 모든 펩티드 SP - 1, SP - 17, SP - 11, SP - 12, SP - 14 및 SP - 30과 반응한다. 놀랍게도, 항-혈청은 면역화를 위해 사용되는 펩티드 뿐아니라 다른 HIV 균주로 부터 유래된, PND 펩티드 SP - 6, SP - 9 및 SP - 20과도 반응한다. 반대로, 마우스가 단일 펩티드 SP - 1로 5 ∼ 6회 면역되는 경우, 수득한 항-혈청은 면역원성 펩티드(SP - 1)와 상당히 반응성이 있지만 다른 펩티드와는 낮은 반응성을 나타낸다(제 2 도). SP - 30와의 반응성에 대해서, 단일 펩티드로 면멱화된 마우스의 항-혈청은 상기 펩티드와 거의 반응하지 않고(제 2 도), 반면 다른 PND 펩티드로 면역화된 마우스의 항-혈청은 강한 반응성을 나타낸다(제 1 도). 중화 시험을 또한 항-혈청에 대해 수행한 결과, SP - 1 만으로 면역화한 마우스의 항-혈청은 HIV - MN 주만을 중화시키는 반면 많은 종류의 PND 펩티드로 면역화한 마우스의 항-혈청은 많은 HIV 균주를 중화시킬 수 있다. 상기는 면역화한 마우스가 다양한 HIV 균주에 대한 넓은 중화 스펙트럼을 가지는 항-GPGR 항체를 유도한다는 것을 나타낸다. 본 항-혈청은 또한 다양한 HIV 균주를 중화시키는 것으로 확인되었다. 그러므로, 세포 융합은 상기 마우스의 비장 세포를 사용하여 수행하였다.

1-4) 세포 융합 및 하이브리도마의 배양

최종 면역화 3일 후, 비장 세포를 통상적인 방법에 의해 마우스로 부터 수합한다.

비장 세포를 골수종 세포 p3X63Ag8-U1와 세포 수 비율, 1 : 5로 혼합하고, 혼합물을 원심분리(1,200 r.p.m. 5 분)시켜 상충액을 제거한다. 침전된 세포 덩어리를 충분히 푼 후, 폴리에틸렌 글리콜 용액(폴리에틸렌 글리콜-4000 (2 g), RPIM1640 (2 ㎖) ) (1 ㎖)을 교반하면서 거기에 첨가한다. 혼합물을 37 ℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨 다음, PRMI1640을 혼합물에 천천히 첨가하여 총 부피 50 ml이 되도록 한다. 원심분리(900 r.p.m, 5분)후, 상충액을 제거하고 세포를 부드럽게 푼다. 거기에 보통 배지(10 % 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지) (100 ml)를 첨가하고 측정 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 현탁시킨다.

현탁액을 24-홈 배양 플레이트(1 ml/홈)의 각각의 홈에 붓고, 5 % 탄산 가스를 함유하는 배양기내 37 ℃에서 24 시간 동안 배양을 수행한다. 이어서, 1 ml /홈의 HAT 배지{하이포크산틴 (1,3 ∼ 1.4 mg/dl), 티미딘(345 ∼ 4,000 μl/dl) 및아미노프테린(18 μl/dl)이 주입된 보통 배지}를 플레이트에 첨가하고 24시간 동안 계속해서 배양을 더 시킨다. 그 이후, 배양 상충액(1 ml)을 동일 부피의 HAT 배지로 매 24시간 마다 2일 동안 교환하고, 동일한 방법으로 10 ∼ 14일 동안 배양을 수행한다.

콜로니 형태로 자란 융합된 세포(약 300 세포)가 관찰되는 홈 각각에, 배양 상충액(1 ml)을 동일한 부피의 HT 배지(아미노프테린을 뺀 상기 HAT 배지)로 교환하고, 그 후 매 24시간 마다 2일 동안 동일한 교환을 수행한다. 3 ∼ 4일 동안 HT 배지에서의 배양 후, 배양 상충액의 일부를 수득하여 하기에 언급된 것 처럼 검색법에 의해 목적한 하이브리도마를 선별한다.

1-5) 하이브리도마의 검색

하기의 EIA 방법 및 웨스턴 블로팅 방법을 조합하여 목적 하이브리도마를 선별한다. 그리하여 선별한 클론의 중화 활성을 측정한다.

(1) EIA 방법

96 - 홈 마이크로테스트 플레이트에 상기 언급된 바와 같이 제조된 합성 PND 펩티드 항원 또는 실시예 2(2-5)에 기재된 바와 같은 E. coli에서 발현된 PND 펩티드(단백질 농도: 1 ∼ 10 μg/ml)를 100 μl /홈 으로 첨가하고, 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이션시켜 펩티드를 고정시킨다. 거기에 1 % BSA(소 혈청 알부민)용액(150 μl)을 더 첨가하고 플레이트를 은폐시키기 위해 동일한 방법으로 인큐베이션한다. 상기 제조된 항원 - 고정된 플레이트에 클로닝 후의 하이브리도마 또는 하이브리도마 배양 상충액을 첨가한다. 4 ℃에서 1.5시간 동안 플레이트를 인큐베이션한 후, 플레이트를 0.1 % 트윈 20/PBS로 3 회 세척하고, 퍼옥시다제 - 표지된 항 - 마우스 면역글로블린 항체(Kappel 사 제; 5,000 배 희석) (100 μl/홈)를 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 0.1 % 트윈 20/PBS로 5 회 세척한다. 이어서, TMBZ 기질의 용액을 첨가하여 통상적인 방법으로 발색 반응을 전개시키고, 파장 450 nm에서의 흡광도를 측정한다.

PND 영역의 GPGR 서열이 보존된 펩티드 군과 대체로 반응하는 하이브리도마를 선별하여 클로닝한다. 클로닝 후 하이브리도마 클론을 또한 동일한 방법으로 선별한다.

(2) 웨스턴 블로팅 방법

상기 방법을 문헌[Towbin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, p. 4350 (1979)]에 따라서 수행한다.

HIV-MN, HIV-LAV 또는 HIV-RF와 같은 실험실 주 또는 NI61, NI23, NI54-2, NI53, NI18 또는 NI63과 같은 임상적으로 단리된 주의 바이러스 입자, 또는 실시예 2(2-5)에 기재된 바와 같은 E. coli에서 발현되는 PND 펩티드를 제조한다. 제조된 바이러스 입자 또는 펩티드는 10 % SDS-PAGE를 사용하여 전기영동을 수행하고, 겔을 니트로셀룰로스막으로 옮겨 상기 막으로 바이러스를 전이시킨 다음, 막을 0.4 ∼ 0.5 cm 너비로 절단한다. 각 조각을 하이브리도마의 배양 상충액에 침지시키고 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 그 이후, 조각을 PBS로 3회 세척하고 바이오틴-표지된 항-마우스 IgG(TAGO 사 제)의 1 : 750 희석액에서 2시간 동안 인큐베이션한다.조각을 PBS로 3 회 세척한 후, 그들을 아비딘 커플된 무 퍼옥시다제(Sigma 사 제) (1 : 1000 희석)에 침지시키고 1 시간 동안 인큐베이션한다. 조각을 PBS로 3회 세척한 후, 4 - 클로로 - 1 - 나프톨을 사용하는 발색제(Bio-Rad 사 제)로 발색 반응을 전개시켜, 바이러스 gp120 및 PND 영역에 GPGR 서열이 보존된 E. coli에서 발현되는 PND 펩티드의 밴드와 보통 반응하는 하이브리도마를 선별하여 클로닝한다. 클로닝 후 하이브리도마 클론을 또한 동일한 방법으로 선별한다.

(3) 중화 활성의 측정

중화 활성의 측정을 위해, 각각 PND 아미노산 서열을 갖는 각종 실험실 바이러스, 및 환자 및 클로닝 후 바이러스의 배양 상충액으로 부터 단리시킨 각종 바이러스를 바이러스 원재료(10⁴⁵~ 10⁵TCID₅₀)로서 사용하였다. 제한 희석 방법, 또는 CD4-HeLa 세포 중 플라크 방법으로 바이러스를 클로닝한다.

우선, 10 TCID₅₀/50 μl로 조정한 바이러스 용액 및 하이브리도마 클론의 배양 상충액 또는 정제된 복수(50 μl) (다양한 희석)를 96 - 홈 평평한 바닥 플레이트에 접종하고 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 10⁴세포/100 μl/홈 의 MT4 세포(10 % FCS, 3.5 ∼ 4.0 g/l의 L-글루타민, 50 U/ml의 페니실린 및 50 μl/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁)을 첨가하여 5 일동안 배양시킨다.

항체가 감염에 의해 발생하는 합포세포 형성을 억제하는지 여부를 기준으로하여 중화 활성을 측정한다. 중화 역가는 합포세포 형성을 100 % 억제하는 항체의 최저 유효 농도로서 표현된다.

모노클로날 항체 C25를 생산하는 하이브리도마를 상기 - 언급된 선별 방법으로 수득한다.

1-6) C25 모노클로날 항체의 제조

생후 8 주된 프리스탄 - 처리된 SPF 암컷 마우스(BALB/c, C3H/HeN, 및 그의 F1 마우스)에, 상기 1-5로 부터 수득한 하이브리도마 C25 항체 주의 마우스 당 5 × 10⁶세포를 복강내로 투여한다. 10 ∼ 21 일 후, 복수암이 유발된다. 복수를 마우스로부터 채취하여, 3000 r.p.m.으로 5분간 원심분리하여 고체 성분들을 제거한 후, 키트[Affigel Protein A MAPS-II kit ; Bio-Rad 사 제]를 사용하는 친화 크로마토그래피에 의해 정제한다.

실시예 2 : C25 모노클로날 항체의 특성 분석

2-1) 바이러스를 중화시키는 C25 항체의 활성

HIV에 대한 C25 항체의 증화 활성을 각종 HIV 균주를 사용하여 분석한다. 제 3 도는 사용된 바이러스 주 및 바이러스의 PND 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예 1에서 나타낸 바와 같이 중화 시험을 수행한다. 대조군으로서, HIV-MN 주를 주 - 특이적 방식으로 중화시키는 모노클로날 항체 μ5.5, 및 NI53 주를 주 - 특이적 방식으로 중화시키는 α64를 사용하고 C25 항체와 비교한다.

제 3 도의 왼쪽 면은 세포 - 유리 바이러스의 감염을 100 % 억제하는 항체의최저 유효 농도(μg/ml)를 나타낸다. C25 항체의 중화 활성은 μ5.5 또는 α64와 거의 동일하므로, 매우 강하다. HIV 균주에 대한 특이성에 있어서는, C25 항체는 μ5.5 또는 α64와 같은 주 - 특이성 항체와 비교하여 훨씬 많은 HIV 주를 중화시키는데, 이는 C25 항체의 넓은 중화 스펙트럼을 나타낸다.

제 3 도의 오른쪽 면은 감염된 세포의 세포간 감염을 80 % 이상 억제하는 항체의 최저 유효 농도를 나타낸다. 세포간 감염에 대한 C25 항체의 억제 활성은 μ5.5 또는 α64와 거의 동일하므로, 매우 강하다.

C25 항체는 μ5.5 또는 α64와 같은 균주 - 특이성 항체와 비교하여 훨씬 많은 HIV 균주의 세포간 감염을 억제하는데, 이는 C25 항체의 넓은 중화 스펙트럼을 나타낸다.

2-2) 각종 합성 펩티드와의 반응성

중화 시험은 C25 항체가 넓은 중화 스펙트럼을 갖는다는 것을 나타낸다. 이어서, 실시예 1(1-1)에 나타난 C25 항체가 각종 PND 펩티드(20 개의 아미노산 포함)와 반응하는 방법을 EIA 방법으로 조사한다.

제 4 도로 부터 명백한 바와 같이, C25 항체는 SP - 1, SP - 6, SP - 9, SP - 11, SP - 12, SP - 20 및 SP - 30과 반응한다. 상기는 C25 항체가 펩티드의 콘센서스 서열인, PND-팁 영역을 인식한다는 것을 의미한다. 반대로, 주 - 특이성 항체 μ5.5는 면역화에 사용된 항원, SP-1에만 결합하며, 다른 펩티드와는 반응하지 않는다(제 5 도).

2-3) C25 항체에 의해 인식되는 에피토프의 분석

C25 항체에 의해 인식되는 에피토프는 PND 영역중의 GPGR 주변의 팁 서열에 위치하므로, 인식되는 에피토프를 하기의 방법에 따라서 확인한다.

(1) 특정 아미노산이 없는 PND 펩티드와의 결합 시험

상기 실험 2-2는 C25 항체가 HIV-MN 균주로 부터 유래된 펩티드 SP - 1 (YNKRKRIHIGPGRAFYTTKN-C), NI53으로 부터 유래된 SP - 12(NNTKKAIRVGPGRTLYATRR-C), 및 NI54 - 2로 부터 유래된 SP - 11(NNTRKGIRVGPGRAIYATEK-C)과 반응한다는 것을 나타낸다. 상기 펩티드중 어느 하나의 아미노산이 없는 펩티드를 합성하고 C25 항체와 생성된 펩티드의 반응성을 조사하므로서, 결합에 관여하는 특정 아미노산을 명백히 한다. 따라서, C25 항체에 결합하는 것으로 공지된 2개의 데카펩티드, MN 균주로 부터 유래된 IHIGPGRAFY 및 NI53 균주로 부터 유래된 IRVGPGRTLY인, 데카펩티드로 부터 어느 하나의 아미노산이 없는 10 개의 노나펩티드 각각을 폴리에틸렌 로드상에서 합성하고 C25 항체와의 반응성에 대해 시험한다 (제 6 도).

HIV-MN 균주로 부터 유래된 IHIGPGRAFY의 경우에 있어서, 3 번째 내지 8 번째 아미노산, I, G, P, G, R 및 A가 없는 펩티드는 C25 항체와 거의 반응하지 않는다. NI53 균주로 부터 유래된 IRVGPGRTLY의 경우에 있어서, 3번째 내지 8번째 아미노산, V, G, P, G, R 및 T가 없는 펩티드는 C25 항체와 반응하지 않는다. 더우기, NI54 - 2 균주로 부터 유래된 IRVGPGRAIY의 경우에 있어서, 3번째 내지 8번째 아미노산, V, G, P, G, R 및 A가 없는 펩티드는 C25 항체와 반응하지 않는다.

상기 결과는 HIV - MN 균주와 C25 항체의 결합을 위해서 서열 IGPGRA, NI63 균주와의 결합을 위해서 서열 VGPGRT, 및 NI54-2 균주와의 결합을 위해서 서열VGPGRA가 필수적이라는 것을 나타내는데, 이는 GPGR 코어, 및 상기 코어의 양 면에 인접한 각각 1개의 아미노산으로 이루어진 6개의 아미노산이 C25 항체에 의해 인식되는 에피토프임을 의미한다.

(2) 중복 헥사펩티드와의 결합 시험

이어서, C25 항체와 반응하는 HIV-MN 균주로 부터 유래된 펩티드 IHIGPGPRAFY를 기초로 하여, 3 ∼ 10개의 아미노산으로 구성된 중복 펩티드의 군 (N 말단으로 부터 하나씩 이동된 아미노산 서열을 갖는 일련의 펩티드)을 (1)에서 처럼 고체상에서 합성한다. 상기 펩티드 군과 C25 항체 사이의 반응성을 EIA 방법으로 조사하고, 에피토프로서 가능한 부분을 평가한다(제 7 도).

결과로서, C25 항체는 펜타펩티드 보다 더 짧은 펩티드와는 낮은 반응성을 갖지만 헥사펩티드 보다 긴 펩티드와는 충분한 반응성을 나타낸다. 상기 중복된 헥사펩티드 중, 가장 강한 반응을 나타내는 펩티드는 IGPGRA이고 반응성이 두번째인 펩티드는 GPGRAF이다. 그러나, HIGPGR 및 PGRAFY는 극히 감소된 반응성을 나타내는데, 이는 C25 항체에 의해 인식되는 에피토프는, (1)에서 나타난 결과처럼, 6개의 아미노산 서열, IGPGRA이라는 것을 의미한다.

2-4) 아미노산 치환 분석

HIV 변종에 대한 C25 항체의 중화 폭(중화 스펙트럼)을 연구하기 위해서, 다른 19개의 아미노산중의 어느 하나로 각각의 아미노산을 순차적으로 치환하므로서 제조되는 PND 펩티드와의 반응성을 조사한다(제 8 도 내지 제 17 도). 실시예에 의해서, HIV-MN 균주로부터 유래된 데카펩티드 IHIGPGRAFY를 여기에서 치환용으로 사용한다.

I₁HI₂G₁PG₂RAFY중의 G₁, P 및 R을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, C25 항체는 상기 펩티드에 거의 결합하지 않는다. C25 항체는, 6번째 G₂를 A로 치환한 펩티드와 강하게 반응하므로, G₂는 A로 치환될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 결합에 가장 기여하는 아미노산은 GPGR인 것으로 여겨진다. GPGR의 N 말단에 위치하는 I₂는 A, L, M, N, P, Q, S, T, V 및 Y로 치환될 수 이는 반면, GPGR의 C 말단에 위치하는 A는 P 이외의 모든 아미노산으로 치환될 수 있다. 상기는 GPGR의 양쪽면에 위치하는 아미노산은 중요하지는 않으며 어느 정도까지만 결합에 공헌한다는 것을 증명한다.

N 및 C 말단에 더욱 비껴서 위치하는, I₁, H, F 및 Y를 다른 아미노산으로 치환할 지라도, 펩티드는 C25 항체와의 반응성을 유지한다.

상기 실험 2-3 및 2-4의 결과는, C25 항체가 결합 코어로서 GPGR 및 하기에 나타낸 바와 같이 그의 양쪽면에 인접한 각각 하나의 아미노산을 포함하는 6개의 아미노산으로 형성된 에피토프를 인식한다는 것을 증명한다.

또한, 2-4에서 나타난 아미노산 치환 분석의 결과는 C25 항체가 하기의 많은아미노산 변이성에 대처할 수 있다는 것을 나타낸다 :

2-5) 감염된 사람의 바이러스로 부터 유래된 PND 펩티드와 C25 항체의 반응성

이어서, HIV - 감염된 개인의 생체내에서 실제로 발생하는 HIV와 C25 항체의 반응성을 하기의 방법으로 조사한다.

우선, HIV - 감염된 사람의 말초 혈액 림프구(PBL)를 1 × RSB 완충 용액에 현탁시키고, 거기에 SDS(최종 농도 1 %)를 첨가하고, 프로테나제 K(최종 농도 1 mg/ml)을 첨가하고 혼합물을 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 페놀 추출 및 에탄올 침전 공정을 반복하여 고분자량의 DNAs(게놈 DNAs)를 수득한다. 또한, HIV 입자를 감염된 사람의 혈청으로부터 침전시키고, cDNAs를 역전사 효소로합성한다. 주형으로서 고분자량의 상기 DNAs 또는 cDNAs를 사용하여, 감염된 환자의 HIV gp120/PND 영역을 하기의 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

Taq 폴리머라제를 사용하여 30 ∼ 35회 윤행하여 증폭시킨다.

그리하여 수득한 증폭된 DNA 단편을 pUC18 플라스미드로 클로닝하고 증폭된 DNA 단편을 디데옥시(dideoxy)방법으로 서열화한다. 더우기, 클론된 DNA 단편을 pUEX2 발현 벡터로 도입하고 상기 벡터를 E. coli에 형질 감염시켜 발현되도록 42 ℃에서 열 유도를 수행한다. β-갈락토시다제와의 융합 단백질의 형태인 발현된 단백질을 하기와 같이 E. coli에서 봉입체로 부터 정제한다. 발현된 E. coli 세포를 유리 비이드로 분쇄한 다음 리소자임(최종 농도 0.1 mg/ml)으로 4 ℃에서 처리하고, 원심분리하여 수득한 침전물을 트리톤(Triton) X-100(최종 농도 0.5 %)로 처리한다. 원심분리하여 수득한 침전물을 8 M 우레아로 용해시킨 다음 C25 항체와 반응시킨다. 결합성을 실시예 1(1-5)에 기재된 바와 같이 EIA 방법 및 웨스턴 블로팅 방법으로 확인한다.

제 18 도는 환자에게서 가장 빈번하게 발생하는 HIVs의 PND 영역의 아미노산 서열 및 그와의 C25 항체의 반응성을 나타낸다. C25 항체는 여기에서 조사된 HIV - 감염된 사람 30 명 중 25 명의 환자로 부터 유래된 콘센서스 서열과 결합하였다. 즉, C25 항체의 결합 범위는 83 % 만큼 넓다. 반대로, 균주 - 특이성 모노클로날 항체, μ5.5 또는 α64는 단지 약 30 %의 스펙트럼을 갖는다.

HIV - 감염된 사람에서의 바이러스의 아미노산 서열을 조사하는 경우, 완전히 동일한 서열을 나타내는 것이 아니라 약간 다른 아미노산 서열을 가지는 바이러스 집합체로서 환자를 감염시킨다. 항체를 투여하여 감염된 사람의 생체로부터 바이러스를 배제하기 위해, 항체는 환자의 생체내에 존재하는 대부분의 HIVs와 반응해야 한다. 표 2 및 3은 단일 환자로 부터 분리시킨 HIVs로부터 유래된 PND 영역 펩티드와 C25 항체의 반응성을 나타낸다.

표 2

표 3

환자 TIW의 경우에 있어서, C25 항체는 모든 HIVs에 결합하는 반면 μ5.5는 HIVs에 결합하지 않는다(표 2). 감염된 사람 NI230의 경우에 있어서, C25 항체는 모든 HIVs에 결합할 수 있으나 항체 μ5.5가 반응할 수 없는 일부 HIVs가 남아있다(표 3). 표 4는 상기 13명의 HIV - 감염된 사람으로 부터 수득한 결과를 요약한다. C25 항체는 거의 모든 감염된 사람에게서 높은 비율의 반응성을 나타내는데, 100 %의 반응성이 8명의 사람으로 나타나고, 90 % 이상의 반응성이 11명의 사람 만큼 많이 나타난다. 반대로, 균주 - 특이성 μ5.5 항체는 90 % 이상의 반응성이 단 한사람에게서만 나타나는 낮은 반응성을 나타낸다. 상기는 C25 항체가 HIVs의 높은 변이성과 충분하게 대처할 수 있으므로 실제 임상적으로 이용 가능하다는 것을 증명한다.

표 4

주 1) 100 %의 항체 결합율을 갖는 환자의 수

괄호 내의 수는 90 % 이상의 항체 결합율을 갖는 환자의 수를 나타낸다.

실시예 3 : 키메라 C25 항체의 제조 (CC25)

3-1) C25 항체의 가변 영역의 단리

마우스 면역글로블린 가변(V)부를 코드하는 유전자의 단리를 하기에 언급된 바와 같이 수행한다. 통상적인 방법[Glober ed. "DNA cloning Vol. 1" IRL press (1985)]에 따라 C25 세포로 부터 RNAs 전체를 추출하고, cDNA 합성 시스템 플러스 (cDNA Synthesis System Plus, Amersham 사 제)를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 합성한다. 주형으로서 상기 단일 가닥 cDNA를 사용하여, 합성효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하는데 카밭 등[Kabat et al.; Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987]에 의해 분류된 V 영역 및 J 영역의 핵산 염기 서열을 기준으로 합성된 DNA 프라이머를 사용한다. HindIII 및 BamHI 위치는 V 부 프라이머 및 J 부 프라이머내에 각각 포함된다. PCR은 CETUS의 방법에 따라 수행된다. 즉, 각 100 pmol의 프라이머를 사용하고 PCR 시약은 CETUS사의 키트이다. PCR 조건은 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 1분이고, PCR을 25회 윤행하여 수행한다. PCR 후, 수득한 DNA 단편을 pUC18[Takara Shuzo K. K. 사 제; 상기 실시예에서 사용되는 시약은 다른 언급이 없는한 Takara Shuzo K. K. 사 또는 Toyogo K.K 사의 제품이다]의 HincII 위치로 서브클로닝한다.

3-2) C25 항체의 마우스 가변 영역 유전자의 핵산 염기 서열

시쿼나제 키트[Sequenase Ver. 2 Kit; Toyobo K. K. 사 제]를 사용하여, pUC18에 도입된 가변 영역 유전자를 서열화한다. 상기 수득한 C25 항체의 핵산 염기 서열을 제 19 도 및 제 20 도에 명시한다. 핵산 염기 서열로 부터 추정되는 아미노산 서열을 제 19 도 및 제 20 도에 또한 명시한다. C25 항체의 핵산 아미노산 서열은 가변 영역 유전자에 특이적인 배열을 나타내고 발현을 위한 ORF(open reading frame)을 형성한다.

3-3) 키메라 C25 항체를 발현하는 유전자의 구축(CHC25, CLC25)

C25 항체의 분리된 가변 영역 유전자가 항-HIV 활성을 나타내는 가변 영역을코ELD하는 유전자인 것을 확인하기 위하여, 마우스 - 사람 키메라 항체를 제조한다. 키메라성 항체의 발현을 위해, δ-액틴(AG) 프로모터를 갖는, 발현 벡터, AG-k 및 AG-γ1가 사용된다. AG-k는 사람 k 사슬 불변부 유전자 및 선별 표식으로서 DHFR 유전자를 함유하는 반면 AG-γ1은 사람 γ1 사슬 불변부 유전자 및 선별 표식으로서 neo 유전자를 함유한다. 상기 제조된 C25 항체의 가변 영역을 HindIII 및 BamHI 제한 효소로 절단하고 수득한 VH 및 VL 단편을 AG-γ1 및 AG-k의 HindIII-BamHI 위치로 각각 도입시킨다(CHC25 및 CLC25).

3-4) 키메라성 C25 항체의 발현 (CC25)

상기 언급된 바와 같이 구축된 키메라성 C25 항체 유전자를 COS7 세포[ATCCCRL 1651]를 사용하는 일시성 발현 시스템에서 그의 항체 활성을 시험한다. CHC25 및 CLC25 플라스미드 DNAs의 혼합물을 일렉트로포레이션 장치[Bio - Rad 사 제]를 사용하여 바이오-래드의 방법에 따라 COS7 세포로 도입시키고 COS7 세포를 10 % 소 태아 혈청(GIBCO 사 제)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양한다. 3일 후, 배양 상충액을 수합하여 배양 상충액에 존재하는 항체의 활성을 각종 HIVs로 부터 유래된 항-사람 IgG 또는 PND 펩티드를 사용하여 ELISA 방법으로 측정한다. 결과로서, CHC25 및 CLC25 플라스미드 DNAs 혼합물의 발현 생성물은 항-사람 IgG에 결합할 수 있다. 각종 PND 펩티드와의 반응성을 본래 C25 항체의 반응성과 비교하고, 이에 의해 발현 생성물은 본래 C25 항체의 것과 유사한 반응 범위를 나타낸다. 더우기, HIV-MN 균주에 대한 중화 활성을 또한 시험하고, 결과로서, 발현 생성물이 마우스 C25 항체 처럼 1 μg/ml의 최저 유효 농도에서 바이러스 감염을 100 % 억제한다는 것을 발견하였다. 따라서, 상기 언급된 바와 같이 분리된 C25 항체 가변 영역 유전자는 정확하게 중화 활성을 갖는 항체의 가변 영역을 코드하는 유전자이다.

3-5) 키메라성 C25 항체를 높은 비율로 생성하는 세포 균주의 제조

키메라성 C25 항체(CC25)를 생성하는 안정한 혈장 세포라인을 제조하기 위해서, 상기 - 언급된 혈장 DNAs, CLC25 및 CHC25는 PvuI으로 직선화시키고, CHO-DG44 세포 및 P3-653 세포를 직선 DNAs 및 리포펙틴의 혼합물로 전형시킨다. 키메라성 항체의 일시성 발현에서 처럼, 유전자가 도입된 Neo - 내성 DHFR - 내성 세포의 배양 상충액을 수합하고, 배양 상충액에 존재하는 항체의 활성을 항-사람 IgG 및 각종 PND 펩티드를 사용하여 ELISA 방법으로 측정한다. CLC25 및 CHC25 플라스미드 DNAs로의 공-형질감염에 의한 발현 생성물은 각종 PND 펩티드와 결합되므로, 상기 전형된 세포를 클론시킨다. 더우기, 4 ∼ 32 × 10^-7M의 농도에서 MTX를 첨가하여 DHFR 유전자의 증폭 공정을 반복한다. 결과로서, MTX에 내성이 있고 50 ∼ 70μg/ml의 수준에서 CC25 항체를 생성하는 안정한 플라스미드 세포 라인을 제조한다.

실시예 4 : 인간화 C25 항체 (RC25)의 제조

4-1) PCR 변이에 의한 C25 항체 가변 영역 유전자의 CDSs의 이식

클론된 C25 항체의 VH 및 VL 부중의 항원 결합을 위한 중요한 부위를 연구하기 위해서, C25 항체의 CDR(complementarity determining region) 영역을 사람 가변 영역으로 이식한다. 상기를 인간화 항체를 제조하기 위한 방법[일본국 특허 일차 공보 제 4-141095 호]에 따라서 수행한다. C25 항체 VH 부의 CDR 영역을 사람 아군I(NEW: Dr. Bending of U.K. MRC Collaborative Centre 기부)의 골격(framework; FR) 영역을 갖는 VH 부로 이식하는 반면 C25 항체 VL부의 CDR 영역을 사람 k 사슬[REI: W. Palm and N. Hilscmann, Z. Physiol. Chem., 356, 167 (1975)]의 FR 영역을 갖는 VL 부로 이식한다. 구체적으로, 상기는, 본 발명자들이 이전에 제조한 인간화 항체 μ5.5 또는 0.05로 PCR[Saiki, R. G. et al., Science, 239, 487 (1988)]에 의해 돌연변이를 도입시키는 PCR - 돌연변이에 의해 수행된다. 제 21 도, 제 22 도 및 제 23 도는 인간화 항체의 VH 및 VL 부와 같은, PCR 주형으로 안닐링시키는 돌연변이에 사용되는 합성 프라이머를 나타낸다.

PCR의 조건은 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 1분 이고, 25회 윤행을 반복한다.

VH의 경우에 있어서, 인간화 항체 μ5.5의 VH 유전자[일본국 특허 일차 공보 제 4-152893 호]를 주형 및 프라이머 #1 및 #2 로서 사용하면서, VH 유전자의 5' 부위를 증폭시킨다(제 21 도). 상기는 주형으로서 인간화 항체 0.5β의 VH 유전자[Hum. Antibod. Hybridomas, 2, p124 (1991)]를 사용하는 프라이머 #3 및 #4로 증폭되어 제조된 유전자 단편에서 중앙의 BglII 위치를 통해 연결된다(제 22 도). 한편, VL의 경우에 있어서, #5 및 M13-M4 프라이머를 사용하여 VL의 5' 부위를 증폭시키고 VL의 3' 부위를 프라이머 #8 및 M13-역 프라이머를 사용하여 증폭시키며, 생성된 증폭된 유전자를 함께 연결하여 KpnI 위치를 형성하는데, 이 위치에서 합성 DNAs #6 및 #7과 자가-안닐링된다(제 23 도).

이어서, 인간화 C25 항체의 가변 영역(각기, RHC25 및 RLC25; 참고, 서열 번호 : 2 및 서열 번호 : 4)를 수득한다. 상기 인간화된 가변 영역 단편을 키메라성 항체의 제조(참고; 실시예 13)에서 처럼 HindIII 및 BamHI 제한 효소로 절단하고, 생성된 VH 및 VL 단편을 AG-γ1 및 AG-k의 HindIII-BamHI 위치로 각각 도입시킨다. 이어서, 인간화 C25 항체의 발현 벡터(각각, RHC25 및 RLC25)을 제조한다.

4-2) 인간화 C25 항체의 발현 (RC25)

상기 제조한 인간화 항체 유전자에 의해 수득한 항체의 활성을 상기 - 언급된 COS7 세포의 일시성 발현 시스템에서 조사한다. 키메라성 항체의 일시성 발현에서 처럼, 유전자가 도입된 세포의 배양 상충액을 수합하여 배양 상충액에 존재하는 항체의 활성을 각종 HIVs로 부터 유래된 항-사람 IgG 또는 PND 펩티드를 사용하는 ELISA 방법으로 측정한다. 결과로서, RHC25 및 RLC25 플라스미드 DNAs의 혼합물의 발현 생성물은 각종 PND 펩티드에 결합한다. 더우기, HIV-MN 균주에 대한 중화 활성에 대하여 발현 생성물을 조사하고, 그 결과로서, 그들이 마우스 C25 항체 및 키메라성 항체 처럼 1 μg/ml의 최저 유효 농도에서 바이러스 감염을 100 % 억제한다는 것을 발견하였다. 따라서, 제 19 도 및 제 20 도에 나타난 바와 같이 C25 항체의 아미노산 서열중, 이식된 CDR 영역을 항-HIV 활성을 나타내는 중요한 부위이므로, 상기 부위를 코드하는 유전자는 재조합 항체를 제조하기 위한 가장 중요한 유전자이다.

4-3) 인간화 C25 항체를 높은 비율로 생산하는 세포라인의 제조

인간화 C25 항체(RC25)를 생성하는 안정한 혈장 세포라인을 제조하기 위해서, 상기 - 언급된 플라스미드 DNAs RLC25 및 RHC25를 PvuI으로 직선화시키고, 리포펙틴과의 혼합물로서, 직선화된 DNAs를 CHO-DG44 세포 및 P3-653 세포의 전형을 위해 사용한다. 키메라성 항체의 일시성 발현의 경우에 있어서 처럼, 유전자가 도입된 neo-내성 DHFR-내성 세포의 배양 상충액을 수합하고 배양 상충액에 존재하는 항체의 활성을 항-사람 IgG 및 각종 PND 펩티드를 사용하는 ELISA 방법으로 측정한다. RLC25 및 RHC25 플라스미드 DNAs로의 공-형질감염에 의한 발현 생성물은 각종 PND 펩티드에 결합하므로서, 상기 전형된 세포를 클론한다. 더우기, 4 ∼ 32 × 10^-7M의 농도에서 MTX를 첨가하여 DHFR 유전자의 증폭 공정을 반복한다. 결과로서, MTX에 내성이 있고 80 ∼ 100 μg/ml의 수준에서 RC25 항체를 생성하는 안정한 혈장 세포라인을 제조한다.

실시예 5 : 키메라성 및 인간화 C25 항체의 작용인자 활성

5-1) 항체 의존성 보체-매개된 세포 장해 (ACC)

C25 항체, 키메라성 C25 항체(CC25), 인간화 C25 항체(RC25) 및 보통 사람 IgG(NHG)를 최종 농도 0.1 ∼ 50 μg/ml가 되도록 5 % FCS를 함유하는 RPMI1640에 희석하고 각각 50 ㎕씩을 96-홈 플레이트에 첨가한다. 이어서, HIV-MN(2.5 × 10⁵세포; 100 ㎕) 및 신선한 사람 혈청(30 ㎕)으로 연속 감염된 H9 세포를 첨가하고 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 방치시킨다. 1시간 후, 세포를 트리판 블루(trypan blue)로 염색시켜 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 센다.

제 24 도에 나타난 바와 같이, 10 μg/ml 의 CC25 항체 및 RC25 항체는 표적세포의 약 70 % 를 파괴하는 반면 C25 항체 및 NHG는 낮은 세포 장해를 나타낸다. 상기는 키메라성 및 인간화 C25 항체가 강한 ACC 활성을 갖는다는 것을 증명한다.

5-2) 항체 의존성 세포 - 매개된 세포 장해 (ADCC)

HIV-MN으로 연속 감염된 세포는 NK 세포에 내성이 있는 CEM 세포(CEM-NKR)를 사용하여 확립되고 표적 세포로서 사용된다. 감염된 세포(3 × 10⁶세포)를 10 % FCS(1 ml)을 함유하는 RPMI1640에 현탁하고⁵¹Cr로 90 분간 표지시킨다. 세포(10⁴세포)를 96-홈 플레이트에 접종하고 거기에 각각 0.1 ∼ 10 μg/ml의 C25 항체, CC25 항체, RC25 항체 및 NHG를 첨가한다. 이어서, 보통 사람 말초 혈액 림프구(5 × 10⁵세포)를 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 배양시킨다. 파괴된 세포의 퍼센트는 통상적인 방법으로 수득한다.

제 25 도에 나타난 바와 같이, 작용인자 세포/표적 세포 = 50 인 조건하에서, 1 μg/ml의 CC25 항체 및 RC25 항체는 표적 세포를 약 50 % 파괴시키는 반면 C25 항체는 NHG 처럼 낮은 세포 장해를 나타낸다. 상기는 C25 항체 및 NHG가 낮은 세포 장해 활성을 나타내고 키메라성 및 인간화 C25 항체가 강한 ADCC 활성을 갖는다는 것을 증명한다.

실시예 6 : 환자로 부터 유래된 바이러스에 대한 인간화 C25 항체(RC25)의 유효성

6-1) 환자로 부터 유래된 바이러스와의 RC25 항체의 결합성

HIV는 단일 환자에게서 변종 바이러스의 집합체로서 발생한다고 공지되었으므로, 실시예 2(2-5)의 공정에 따라서, 혈장중 바이러스 RNA의 PND 영역 및 항-HIV 항체 양성 환자로 부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포에서 프로바이러스 DNA의 염기 서열을 한 종당 다종류의 클론으로 분석하고, 수득한 서열을 기준으로 하여 제조된 재조합 PND 단백질과 RC25 항체의 결합성을 조사한다. 표 5는 HIV-IIIB 타입 바이러스 - 특이성 키메라성 항체(Cβ1) 및 MN 타입 바이러스 - 특이성 인간화 항체(Rμ5.5)와 비교하여 다양한 환자로 부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포의 PNDs와 RC25 항체의 결합성을 나타낸다. 표 5로 부터 명백한 바와 같이, RC25 항체는 다양한 환자로 부터 유래된 PND 재조합 단백질과 91 ∼ 100 %의 높은 비율로 결합한다.

표 5

6-2) 환자 혈장으로 부터 유래된 바이러스에 대한 RC25 항체의 중화 활성

RC25 항체(2 mg/㎖; 5 ㎕)는 상기 6-1에서 사용된 환자 혈장 (50 ㎕) 과 실온에서 30분간 반응시킨다. RC25 항체와 혈장의 혼합물을, 바이러스의 생성을 향상시키기 위해서 단핵 세포 보다 10배 더 많은 양의 CD8 - 양성 세포를 항-CD8 항체 - 결합된 자기 비이드(Dinal 사 제)로 제거하는, 보통 사람 말초 혈액 단핵 세포시스템(50 ㎕)에 첨가시키므로서 배양을 개시하고, 3일 동안 10 μg/ml의 식물성 혈구 응집소로 활성화시킨후, 인터루킨-2 를 함유하는 배지에서 4일 동안 단핵 세포를 배양한다. 4일 후, 신선한 배지로 세포를 세척하고 상충액의 수합 및 배지의 교환을 5 ∼ 7일 간격으로 수행하면서 배양을 계속한다. 수합된 배양 상충액에서의 HIV-1 p24 항원의 농도를 HIV 항원을 나타내주는 키트 [Dinabbott 사 제]를 사용하여 측정한다. 환자 혈장으로 부터 보통 사람 말초 혈액 단핵 세포로의 바이러스 감염이 발생하는 시험된 모든 경우에 있어서, 제 26 도에 나타난 바와같이, 대조 항체로서 사용된 HIV-IIIB 타입 바이러스 - 특이성 키메라성 항체(Cβ1) 및 MN 타입 바이러스 - 특이적 인간화 항체(Rμ5.5)는 효과가 없으나, R25 항체가 첨가된 군은 p24 항원 생성의 감지 제한을 덜 나타내고, 그에 의해 감염을 억제하는 RC25 항체의 분명한 효과를 확인했다.

6-3) 환자의 말초 혈액 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 RC25 항체의 중화 활성

단핵 세포는 상기 - 언급된 환자 말초 혈액(20 ∼ 40 ml)으로 부터 제조되고, CD8-양성 세포는 바이러스의 생성을 향상시키기 위해 상기 언급된 방법에 의해 제거한 다음, 바이러스를 생성하기 위해 세포를 항-CD3 모노클로날 항체(0.5 μg/ml) 의 존재하에서 3 ∼ 5 일 동안 배양시킨다. 상충액의 수합 및 배양액 교환을 5 ∼ 7일 간격으로 수행하면서 60, 120 및 240 μg/ml의 RC25 항체의 존재하에서 배양을 또한 계속하여, 배양 상충액에서 HIV-1 p24 항원의 농도는 하기에 언급된 바와 같이 측정된다. 환자의 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 말초 혈액 단핵세포에서 프로바이러스 DNA를 기준으로 하여 제조된 PND 단백질과 RC25 항체의 결합이 90 % 이상을 것을 나타내며 시험된 모든 경우에 있어서, RC25 항체는 제 27 도 내지 제 30 도에 나타난 바와 같이 농도 의존성 방법으로 바이러스 항원의 생성을 억제한다.

6-4) CD8의 재구성 후 환자의 말초 혈액 단핵 세포로 부터 유래된 바이러스에 대한 RC25 항체의 중화 활성

환자의 감염된 세포에서 잠복한 프로바이러스를 활성화시켜 바이러스 감염을 유발하므로서 HIV 감염의 체내 형태를 모방하는, 본 발명의 유효성을 확인하기 위한 상기 시험 방법은, CD8-양성 세포가 제거되고 바이러스 활성이 항-CD3 항체에 의해 인위적으로 도입된 매우 심한 조건하에서 수행된다. 따라서, 시험 공정에서 매우 효과적인 것으로 증명된 RC25 항체는, 환자에게 임상적으로 적용된다면, 시험공정에서 보다는 보다 더욱 효과적일 것으로 기대된다.

이어서, 상기 언급된 동일한 시험 공정은 항체의 첨가에 있어서 제거된 CD8-양성 세포의 1/10의 양으로 재구성되어 수행된다. 결과로서, 제 31 도에서 나타난 바와 같이, RC25 항체의 유효 농도는 30 μg/ml 정도 낮게 감소되며, RC25 항체는 임상적 이용에 있어서 매우 효과적이라는 것을 제안한다.

본 발명의 산업상 이용가능성

HIV는 다른 아미노산 서열을 가지는 바이러스 변종의 집합체로서 단일 환자에게 감염되는 상당히 다양한 바이러스이다. 상기 바이러스 변종의 집합체에 대한 처리 효능을 발휘하기 위해서, HIV 균주중의 보존성 영역을 확인하고 상기 보존성부위를 인식하는 중화 항체를 확립하는 것이 필수적이다. HIV의 V3-PND 영역은 강한 중화 항체를 유발하는 중요한 부위이고 보존성 서열 GPGR을 함유하는 PND-팁 영역에 대한 모노클로날 항체는 넓은 중화 스펙트럼을 갖는 것으로 믿는다.

본 발명자들은 각 균주 사이에 보존되는 영역을 인식하는 중화 모노클로날 항체를 효율적으로 제조하는 신규 면역 요법을 확립하고, 감염된 사람으로 부터 분리시킨 많은 HIV 균주를 중화시키는 C25 모노클로날 항체를 확립했다. 더우기, 상기 항체를 인간화시키므로서, 항체는 사람에게 항원성을 감소시켜 Fc 영역 의존성 방법으로 감염된 세포를 파괴하는 능력을 가능케 한다. 더우기, 실험실에서 분리된 단일 바이러스에 대해서만 유효성을 나타내는 통상적인 HIV 중화 항체와는 달리, 본 발명의 항체는 그의 넓은 중화 스펙트럼로 인해 환자의 인체내에서 많은 바이러스 변종의 집합체에 대해 분명하게 유효한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 항체는 각종 HIVs의 다양성 및 변이성에 반응할 수 있고 예방, 치료 또는 HIV 진단용 치료약으로서 임상적 응용 가능하다.

서열표

서열 번호 : 1

서열 길이 : 355

서열 형태 : 핵산

가닥수 : 이중 가닥

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 게놈 DNA에 대한 cDNA

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 2

서열 길이 : 354

서열 형태 : 핵산

가닥수 : 이중 가닥

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 다른 핵산 (변형된 핵산)

기원 생물명 : 마우스 및 사람

서열

서열 번호 : 3

서열 길이 : 340

서열 형태 : 핵산

가닥수 : 이중 가닥

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 게놈 DNA에 대한 cDNA

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 4

서열 길이 : 339

서열 형태 : 핵산

가닥수 : 이중 가닥

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 다른 핵산 (변형된 핵산)

기원 생물명 : 마우스 및 사람

서열

서열 번호 : 5

서열 길이 : 6

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

기원 생물명 : 사람 면역 결핍 바이러스

서열

서열 번호 : 6

서열 길이 : 6

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

기원 생물명 : 사람 면역결핍 바이러스

서열

서열 번호 : 7

서열 길이 : 6

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

기원 생물명 : 사람 면역결핍 바이러스

서열

서열 번호 : 8

서열 길이 : 6

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

기원 생물명 : 사람 면역결핍 바이러스

서열

서열 번호 : 9

서열 길이 : 6

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

기원 생물명 : 사람 면역결핍 바이러스

서열

서열 번호 : 10

서열 길이 : 6

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

기원 생물명 : 사람 면역결핍 바이러스

서열

서열 번호 : 11

서열 길이 : 5

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

단편 : 중간 단편

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 12

서열 길이 : 17

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

단편 : 중간 단편

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 13

서열 길이 : 9

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

단편 : 중간 단편

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 14

서열 길이 : 17

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

단편 : 중간 단편

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 15

서열 길이 : 7

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

단편 : 중간 단편

기원 생물명 : 마우스

서열

서열 번호 : 16

서열 길이 : 9

서열 형태 : 아미노산

토폴로지 : 직선형

서열 종류 : 펩티드

단편 : 중간 단편

기원 생물명 : 마우스

서열

Claims

사람 면역 결핍 바이러스(HIV)의 외피막상에 있는 분자량이 약 1.2 × 10⁵달톤 인 당단백질 항원(gp120)의 제 3 가변 영역(V3)에 존재하는 주요 중화 영역(PND)내에 아미노산 서열 : Xal - Gly - Pro - Xa2 - Arg - Xa3

[식중, Xal은 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Try 이고; Xa2는 Gly, Ala이고; Xa3은 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr 이다]에 의해 정의되는 영역에 결합하며, 상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 갖는, 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁 번호 FERM SP-4561로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체.
제 1항에 있어서, 상기 주요 중화 영역 (PND)내에 아미노산 서열 : Xaa - Gly - Pro - Gly - Arg - Ala[식중, Xaa는 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, gln, Ser, Thr, Val, Tyr이다]; Ile - Gly - Pro - Gly - Arg -Xaa[식중, Xaa는 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr이다]; Val - Gly - Pro - Gly - Arg - Thr; Val - Gly - Pro - Gly - Arg - Ser; 또는 Ile - Gly - Pro - Ala - Arg - Ala에 의해 정의되는 영역에 결합하며, 상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 갖는 모노클로날 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, H 사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)의 아미노산 서열이 하기의 서열 :

을 갖는 모노클로날 항체.
제 3 항에 있어서, H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열표 서열 변호 : 1에 기재된 아미노산 서열인 모노클로날 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L 사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)의 아미노산 서열이 하기의 서열 :

을 갖는 모노클로날 항체.
제 5 항에 있어서, L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열표 서열 번호 : 3에 기재된 아미노산 서열인 모노클로날 항체.
Gly - Pro - Gly - Arg 서열을 포함하는 펩티드로 일차 면역화를 행한 후, Gly - Pro - Gly - Arg 서열을 포함하는 다른 펩티드로 2차 면역화 이하의 추가 면역화를 행하여 수득한 비장 세포를 세포 융합 재료로 사용하여 세포 융합을 수행하는 것을 특징으로 하는, 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 외피막상에 있는 분자량이 약 1.2 × 10⁵달톤 인 당단백질 항원(gp120)의 제 3 가변 영역(V3)에 존재하는 주요 중화 영역(PND) 내에 아미노산 서열 : Xal - Gly - Pro -Xa2- Arg - Xa3

[식중, Xal은 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Tyr이고; Xa2는 Gly, Ala이고; Xa3은 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr이다]에 의해 정의되는 영역에 결합하며, 상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 갖는, 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁 번호 FERM BP-4561로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 제조 방법.
사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 외피막상에 있는 분자량이 약 1.2 × 10⁵달톤 인 당단백질 항원(gp120)의 제 3 가변 영역(V3)에 존재하는 주요 중화영역(PND)내에 아미노산 서열 : Xal - Gly - Pro - Xa2 - Arg - Xa3

[식중, Xal은 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Tyr이고; Xa2는 Gly, Ala이고; Xa3은 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr이다]에 의해 정의되는 영역에 결합하며, 상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 가지고; 가변 영역의 적어도 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)가 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁 번호 FERM BP-4561로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 마우스 항체로부터 유래되며, 나머지 영역은 사람 항체로 부터 유래되는 재조합 항-HIV 항체의 H 사슬.
제 8 항에 있어서, 상기 PND 내에 아미노산 서열 : Xaa - Gly - Pro - Gly - Arg - Ala[식중, Xaa는 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Tyr이다]; Ile - Gly - Pro - Gly - Arg - Xaa[식중, Xaa는 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr이다]; Val - Gly - Pro - Gly - Arg - Thr; Val - Gly - Pro - Gly - Arg - Ser; 또는 Ile - Gly - Pro - Ala - Arg - Ala에 의해 정의되는 영역에 결합하며, 상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 갖는, 재조합 항 - HIV 항체의 H 사슬.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, H 사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)의 아미노산 서열이 하기의 서열 :

을 갖는 재조합 항 - HIV 항체의 H 사슬.
제 10 항에 있어서, 키메라 항체의 H 사슬이며, H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열표 서열 번호 : 1에 기재된 아미노산 순위 1 ∼ 118의 아미노산 서열인 재조합 항 - HIV 항체의 H 사슬.
제 10 항에 있어서, 인간화 항체의 H 사슬이며, H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이 서열표 서열 번호 : 2에 기재된 아미노산 순위 1 ∼ 118의 아미노산 서열인 재조합 항 - HIV 항체의 H 사슬.
사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 외피막상에 있는 분자량이 약 1.2 × 10⁵달톤 인 당단백질 항원(gp120)의 제 3 가변 영역(V3)에 존재하는 주요 중화 영역 (PND) 내에 아미노산 서열 : Xal - Cly - Pro - Xa2 - Arg ∼ Xa3

[식중, Xal은 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Tyr이고;Xa2는 Gly, Ala이고; Xa3은 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr이다] 에 의해 정의되는 영역에 결합하며,상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 가지고; 가변 영역의 적어도 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR3)가 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 수탁 번호 FERM BP-4561로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 마우스 항체로 부터 유래되고 나머지 영역은 사람 항체로 부터 유래되는 재조합 항-HIV 항체의 L 사슬.
제 13 항에 있어서, 상기 PND 내에 아미노산 서열 : Xaa - Gly - Pro - Gly - Arg - Ala[식중, Xaa는 Ala, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Tyr이다]; Ile - Gly - Pro - Gly - Arg - Xaa[식중, Xaa는 Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr이다]; Val - Gly - Pro - Gly - Arg - Thr; Val - Gly - Pro - Gly - Arg - Ser; 또는 Ile - Gly - Pro - Ala - Arg - Ala에 의해 정의되는 영역에 결합하며, 상기 영역을 갖는 HIV를 중화시키는 능력을 갖는 재조합 항 - HIV 항체의 L 사슬.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, L 사슬 가변 영역의 상보성 결정영역(CDR1 내지 CDR3)의 아미노산 서열이 하기의 서열 :

을 갖는 재조합 항 - HIV 항체의 L 사슬.
제 15 항에 있어서, 키메라성 항체의 L 사슬이며, 가변 영역의 아미노산 서열이 서열표 서열 번호 : 3에 기재된 아미노산 순위 1 ∼ 113의 아미노산 서열인 재조합 항 - HIV 항체의 L 사슬.
제 15 항에 있어서, 인간화 항체의 L 사슬이며, 가변 영역의 아미노산 서열이 서열표 서열 번호 : 4에 기재된 아미노산 순위 1 ∼ 113의 아미노산 서열인 재조합 항 - HIV 항체의 L 사슬.
제 8 항에서 청구된 재조합 항 - HIV 항체의 H 사슬 및 제 13 항에 청구된 재조합 항 - HIV 항체의 L 사슬을 포함하는 재조합 항 - HIV 항체.
제 18 항에서 청구된 재조합 항 - HIV 항체를 발현할 수 있는 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포내에서 상기 발현 벡터를 발현시키고, 상기 항체를 수합하는것을 포함하는 항 - HIV 항체의 제조방법.