KR100282166B1

KR100282166B1 - 약학적 박테리오신 조성물

Info

Publication number: KR100282166B1
Application number: KR1019940702449A
Authority: KR
Inventors: 피터블랙번; 스티븐제이.프로젠; 에드워드비.골드버그
Original assignee: 스폰 벤자민 티.; 에이엠비아이, 인코포레이티드
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2013-01-15
Also published as: ATE152353T1; NZ249007A; GR3024049T3; WO1993013793A1; FI943261A7; ES2102010T3; FI943261L; NZ299034A; NO942644D0; NO942644L; EP0623024A1; AU672384B2; EP0623024B1; IL104364A; MX9300207A; HU219234B; CZ166194A3; RU94037764A; FI943261A0; BR9305754A

Abstract

니신과 같은 란티오닌-함유 박테리오신으로 이루어진 조성물은 위장관내에서 와 같은 조건에서 살균제로 작용한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기한 조성물을 함유하는 약학적 제제는 위장관 장애를 일으키는 박테리아의 살균에 사용된다.

Description

[발명의 명칭]

약학적 박테리오신 조성물

[발명의 배경 및 요약]

란티오닌 함유 박테리오신 니신의 항균 활성은 특정 그람 양성 미생물에 대해서만 작용하며, 이때의 최적 pH는 5.0이다. 니신의 항균 화성은 EDTA와 같은 킬레이트화제와 병용할 경우에 향상된다. 니신-킬레이트화제 조성물의 활성은 pH 5.0이상에서 매우 크거나 또는 최적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 니신 및 EDTA 조성물의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성은 pH 5.0에서의 상기 조성물의 S. 아우레우스에 대한 활성보다 pH 8.0에서 매우 큰 것으로 측정되었다.

킬레이트화제와 니신의 배합물은 일반적으로 니신 그 자체만으로는 얻지 못하는 활성인, 그람 음성균에 대한 활성을 부여한다는 것도 알게 되었다.

본 발명은 pH 5.0이하의 산성에서 활성을 갖고, 그람 음성균에 대해 상당한 활성을 나타내는 란티오닌 함유 박테리오신 조성물에 관한 것이다. 낮은 pH에서 활성을 갖는 조성물은 예컨데 인간과 동물의 위장관에 있어서의 미생물의 감염 또는 생장을 치료 또는 예방하는 방법에 유용할 수 있다. 위장관에 도입된 경우, 이들 조성물은 위의 저-pH 환경에서도 살균제로 작용할 수 있다. 이 살균 활성은 헬리코박터(Helicobacter), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 클로스트리디아(Clostridia), 박테로이드슨(Bacteroides), 캄필로박터(Campylobacter) 및 이르시니아(Yersinia)종과 같은 위장내 병원균에 의해 유발되는 감염균의 생장억제에도 유용할 수 있다. 따라서, 이러한 저-pH 활성 박테리오신 조성물은 상기한 병원성 박테리아의 존재에 기인하는 각종 질병 또는 증상의 치료에 유용할 수 있다.

설사, 위염, 소화성 궤양 및 십이지장 궤양과 위암을 포함하는 각종 위장 질병 또는 증상은 위장관의 병원성 미생물의 존재에 기인한다. 에스케리키아 및 살모넬라, 특히 클로스트리디아, 바실러스, 박테로이드스, 캄필로박터 및 이르시니아 종은 특히 신생 농장 동물들에 있어서의 설사의 원인이 된다(R. E. Holland, 1990, Cine, Microbiol, Rev. 3:345, "Some infectious causes of diarrhea in young farm animals."). 헬리코박터 필로리(pylori)는 위염, 십이지장 및 소화성 궤양 질병에 연루되며(Peterson, W.L., 1991, New Eng. J. Med. 324: 1043, "Helicobacter pylori and peptic ulcer disease") 또한 위암에도 관련이 된다(Henderson, B.E., Ross, R.K., and Pike, M.C., 1991, Science 254:1131, "Toward the primary prevention of cancer," Nomura, A. Stemmermann, G.A., Chyou, P.H., Kato,I., Perez-Perez, G. and Blaser, M.J.(1991) New Eng. J. Med. 325: 1132 "Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese American in Hawaii."; Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vandersteen, D.P., Chang, Y., Vogelman, J.H., Orentreich,N, and Sibley, R.K.(1991) New Eng. J. Med. 325:1127; Forman, D., Sitas, F., Newell, D.G., Stacey, A.R., Boreham, J., Peto, R., Campbell, T.C., Li, J. and Chen, J. (1990) Int. J. Cancer 46:608 "Geographic association of Helicobacter pylori antibody prevalence and gastric cancer mortality in rural China").

많은 위장 병원균은 니신이 불활성으로 예상되는 그람 음성 박테리아, 미생물이다(Hurst, A., 1981, "Nisin," Adv. in App. Micr V. 27, P.85-121). 예를 들어, 헬리코박터 필로리(선행기술에서는 캄필로박터 필로리로서 동정되었음)는 위점막을 콜로니화 하는 그람 음성 미호기성 바실러스이다. 1983년 이래로, 조직형성 위염과 관련하여 최초로 보고되었을 때, H. 필로리의 감염억제와 위장 장애의 개선간에 상관성이 있음을 알게 되었다. 그러나, H. 필로리 감염에 대한 수많은 항생제가 개발되어 있으나, 이들 항생제는 아직까지 허용가능한 것으로 입증되어 있지 않으며, 또한 이 미생물에 대해 사용하는데 있어 공인된 약제나 치료요법은 있지 않다. 미생물을 장기간 근절하는 것은 거의 불가능하며 또한 항생제 자체가 허용될 수 없는 부작용을 일으킬 수 있다(Peterson, W.L., 1991. New Eng. J. Med. 324:1043 "Helicobacter pylori and peptic ulcer disease; Warren, J.R., 1983, Lancet 1:1273, "Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis"; Morgan et al., 1988, Gastroenterology 95:1178, "Nitrofurans in the treatment of gastritis associated with Campylobacter pylori"; Glupczynski, Y. et al., 1988, Am. J. Gastroenterol. 83:365 "Campylobacter pylori-associated gastritis: a double-blind placebo controlled trial with amoxycillin"; Rauws, E.A. et al., 1988, Gastroenterology 94:33, "Compylobacter pylori-associated chronic antral active gastritis:' Glupczynski, Y. 1990 in Helicobacter pylori, gastritis, and peptic ulcer; Malfertheiner, P., Ditschuneit, H., Eds. Springer-Verlag, Berlin, Germany pp 49-58; Rauws, E.A. and Tytgat, G.N. 1990. Lancet 335:1233 "Cure of duodenal ulcer associated with eradication of Helicobacter pylori. O'Riordan, T. et al., 1990, Gut 31:999 "Adjuvant antibiotic therapy in duodenal ulcers treated with colloidal bismuth subcitrate"; Weil, J. et al., 1990. Aliment. Pharmacol. Ther., 4:651 "Helicobacter pylori infection treated with a tripotassium dicitrate bismuthate and metronidazole combination" Coghlan, J.G., Gilligan, D., Humphries, H., et al., 1987, Lancet 2:1109 "Campylobacter pylori and recurrence of duodenal ulcer-a 12-month follow-up study"; Marshall, B.J. Goodwin, C.S., Warren, J.R. et al., 1988, Lancet 2:1437, "Prospective double-blind trial of duodenal ulcer relapse after eradication of Campylobacter pylori").

본 발명은 니신과 같은 란티오닌-함유 박테리오신과, 킬레이팅제와 저-pH 환경에서 사용하기에 적합한 담체를 포함하여 이루어지는 살균제로서의 약학적 조성물에 관한 것이다. 이들 조성물은 산성 pH에서 안정하며, 활성을 지니고, 위장관에서와 같은 저-pH 환경에서 그람 음성균에 대한 살균 활성으로 인해 유용하다.

본 발명에 따른 약제학적 니신 조성물은 신속하게 작용하기 때문에, 위 및 위장관에 도달되었을 때 이들 활성은 위 내용물의 클리어란스에 의해 제한되지 않는다. 더욱이, 니신 조성물은 다른 항생물질과 달리, 안전하게 섭취할 수 있다. 본 약학적 조성물은 치료요법에서 단독으로 또는 다른 약제 또는 약물과 배합하여 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기한 조성물의 사용 및 제조방법에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 효용성은 포유동물의 장에서 발견되고 종종 위장 장애의 원인이 되는 대장균(E. coli)에서 입증되었다.

E. coli의 생존은 EDTA 또는 시트레이트 자체에 노출되거나 니신 그 자체에 노출시에는 영향을 받지 않는다. 이 밖에도, 산에 노출된 현탁액중 E. coli는 pH가 2.5이하로 떨어질 때까지는 산성환경에서 잘 생장한다. 그러나, 후술하는 바와 같이, 니신을 EDTA와 산성 pH범위에서 혼합한 경우, 이 니신 조성물에 단지 1분간 노출시킨 경우에도 박테리아의 생존수는 현저하게 감소되었다. pH 3.5에서는 니신-킬레이트화제 조성물에 단지 1분간 노출시켜 박테리아의 생존수를 6 log 이상으로 감소시킬 수 있다. 3.5 이하의 pH에서는, 니신 조성물의 효력이 약간 감소되는 것 같으나, pH 2.5에서도 약 1000배로 향상된 니신의 활성이 그대로 유지되었다(표 1).

EDTA-활성화된 니신은 표 2 내지 5에서 보는 바와 같이, 아세테이트, 시트레이트, 락테이트 및 숙시네이트를 포함한 각종 산성 비히클 존재하에 E. coli에 대한 살균작용을 한다. pH 3.5에서 얻어진 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 니신 조성물의 신속한 살균 활성은 산성비히클의 선택여하에 따라 영향이 미칠 수 있다. 예시된 모든 경우에서, 각 산 음이온의 농도가 증가함에 따라 니신 조성물의 살균 활성은 감소하는 것으로 나타났다. 그럼에도, 이들 각각의 산성 비히클은 킬레이트화제-향상 니신의 활성을 발현하는데 적합하다. 이들 니신 조성물에 1분이상 긴 시간동안 박테리아를 노출시키는 것이 조성물이 산성비히클을 덜 효율적인 농도로 함유하는 경우에도 박테리아의 수를 감소시키는데 효과가 있다.

[산성 비히클중 킬레이트화제에 의해 향상되는 니신의 그람 음성균에 대한 살균활성의 평가]

각종 킬레이트화제에 의해 향상되는 니신 조성물의 신속한 활성에 대한 평가를 산성 비히클중에서 살균성 현탁액 어세이로 실시하였다.

트립티카제 소이 영양 아가(TSA)에서 하루밤 배양하여 얻은 E. coli 세포를 멸균된 ddH₂O에 밀도가 600nm에서 흡광도가 1.0이 되게 재현탁하였다. 세포와 분석된 각 시험용 살균성 제제의 반응은 시험용 제제 970㎕에 세포 30㎕를 첨가하여 출발시켰다. 반응 혼합물은 1분이상 37℃에서 배양시킨 후, 마이크로원심분리기에서 1분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 중화용 완충액 1㎖에 재현탁시켜 세척하였다(중화용 완충액: 50mM Tris- HCl, pH 7.0, 5mM MgSO₄, 20mM CaCl₂, 0.1M NaCl 및 0.1% 젤라틴은 먼저 Tris 완충액을 만든 다음 pH를 조정하고, 염과 젤라틴을 가한후 얻어진 용액이 투명해질 때까지 가열하면서 교반하였다. 이 용액을 20분간 오토클레이브하였다. 이것을 희석하지 않고 중화용 완충액으로 사용하였다.). 세포를 마이크로 원심분리기에서 1분간 원심분리하고 중화용 완충액 1㎖에 재현탁시켰다. 박테리아 현탁액 100㎕와 중화용 완충액중 이의 연속 희석액을 영양 아가 배지상에 전개시키고 37℃에서 24시간후 생존 콜로니수를 세어서 생존수를 측정하였다. 미처리된 대조군에 대한 생존율을 상기에서 얻은 값으로부터 계산하였다.

니신의 EDTA에 의해 향상된 활성은 저 pH에서 나타났다. pH가 3.5이하인 경우, 활성의 향상은 감소되는데, 이것은 아마도 킬레이트화제중 카르복실기의 적정에 따른 것으로 보인다. 그럼에도, pH 2.5에서도 EDTA에 의한 니신 활성이 약 1000 배나 증가되는 것이 나타났다. 그 결과를 표 1에 나타냈다. 표 1,2,4 및 8 내지 13에서 "〈" 뒤의 값은 생존콜로니가 없는 것으로 검출된 것에 상응하는, 어세이한 박테리아 현탁액 중 생존 박테리아의 초기 농도(콜로니 형성단위 (cfu)/㎖로 표시) 및 어세이하기 위해 채취한 상기 현탁액 분취량에 기초한 생존율을 나타낸 것이다.

a 배양은 pH를 조정한 20mM Na 아세테이트 완충액중 37℃에서 실시

b 초기 생존수 4× 10⁷콜니 형성단위/㎖

a 37℃에서 배양

b 초기 생존수 2× 10⁷콜로니 형성단위/㎖

a 37℃에서 배양

b 초기 생존수 5× 10⁷콜로니 형성단위/㎖

a 37℃에서 배양

b 초기 생존수 5× 10⁷콜로니 형성단위/㎖

a 37℃에서 배양

b 초기 생존수 3.4× 10⁶콜로니 형성단위/㎖

pH 3.5에서 시험된 모든 산 음이온 존재하에 EDTA에 의해 향상된 니신 활성을 관찰하였다(참조 표 2~5). pH 3.5에서, 락테이트가 0.3% 존재시, EDTA에 의해 향상된 니신 활성을 다소 저해하였다. 그럼에도, 활성은 락테이트 단독 0.3%에서 여전히 1000배 이상 향상되고 있으며 락테이트가 0.1% 존재시에는 EDTA에 의해 향상된 니신 활성을 저해하지 않았다.

pH 3.5에서, 아세테이트 0.3% 및 시트레이트 0.3% 존재까지 E. coli 현탁액에 대한 활성은 킬레이트화제에 의해 향상된 니신 살균활성에 견줄 수 있다. 이들 음이온은 EDTA에 의해 향상된 니신과 배합될 수 있는 유력한 산성 비히클이다. 시트레이트는 EDTA에 의해 향상된 니신 조성물의 가장 적합한 산성비히클이다. 시트레이트는 천연 식품이고, 중간대사 산물이며 그 자체로서 니신의 살균활성에 대한 효과적인 활성 증가제이다(표 3). 니신-시트레이트 조성물은 안전하며 인간과 동물의 위장관에서 원치 않는 미생물이 성장하는 것을 억제하거나 제거하는데 효과가 있다.

시트레이트는 대사산물이며, 박테리아의 성장을 억제하지 않는다. 박테리아는 시트레이트가 보충된 영양 아가 배지상에서 잘 생장한다. 그러나, 시트레이트가 존재시의 니신은 그람 음성균에 대해 활성을 갖는다. 따라서, 다양한 농도로 시트레이트가 보충된 영양 아가 배지상에서 생장 저해 어세이를 실시하여 그람 음성균에 대한 니신의 활성을 입증할 수 있다. 이 니신-시트레이트가 아가 어세이는 더욱 많은 분야에 적용할 수 있다. 이 어세이는 니신과의 배합에 있어 시트레이트가 아닌 효능제를 니신 고유의 살균 활성의 증가제로서 이를 효능 특성에 대해 선별하는 방법을 제공한다. 니신과 배합하는 다른 유기산의 예를 들면 아세테이트, 프로피오네이트, 락테이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말로네이트, 아디페이트, 소르베이트, 포스페이트 및 아스코르베이트가 포함될 수 있다. 니신 활성을 효능화하는 다른 물질로는 비이온 및 양성 계면활성제와 유화제, 4급 화합물, 모노글리세라이드 및 지방산이 포함된다.

니신-시트레이트 아가 어세이는 다음과 같이 실시한다.

E. coli 를 A₆₀₀에서 광학 밀도가 1.0이 되게 재현탁시킨다. 박테리아 현탁액 시료 100㎕를 시트레이트가 다양한 농도(예, 0.1%, 0.3%, 1.0%, 3.0%)로 보충된 트립티카제 소이 영양 아가배지(TSA)상에 균일하게 전개한 다음, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 니신 저장액과 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)중 이의 연속 희석액을 준비하고 이 희석액을 각기 5㎕를 취하여 박테리아가 성장하고 있는 잔디 형상 영역에 투입한 다음, TSA 플레이트를 37℃에서 24시간동안 배양한다. 37℃에서 24시간 배양하면, 시트레이트가 보충된 TSA상에서 생장한 E. coli는 잔디 형상의 영역을 형성한다. 시트레이트 존재하에서 생장한 박테리아에 대한 니신의 활성은 연속적으로 희석한 니신 시료가 투입된 박테리아 생장영역이 깨끗하게 됨으로써 입증되었다. 그람 음성균에 대한 니신의 효용성은 생장이 저해되어 깨끗한 영역이 되는데 요구되는 니신의 최소량을 측정하여 추정할 수 있다. 영양 아가 배지중 시트레이트의 농도가 증가함에 따라, E. cole의 생장을 저해하는데 요구되는 니신의 양은 적어지게 된다(참조 표 6의 데이타).

(1 : 표에서와 같이 시트레이트를 다양한 농도로 보충한 트립티카제 소이 아가 상에서 생장된 E.coli 균주 ATCC 8739의 생장을 억제하는데 필요한 니신의 명목상 최소 저해 농도)

EDTA, 시트레이트 또는 다른 킬레이트화제로 향상된 니신의 활성은 살균성 현탁액 어세이에 의해 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 뿐만아니라 관련 미생물, 특히 캄필로박터 제쥬니(Campylobacter jejuni)종의 여러 균주에 대해 입증되었다.

이들 예가 표 7 내지 13에 표시되어 있다. 영양 아가 플레이트(5% 탈 피브린화된 양의 혈액을 보충한, 트립티카제 소이 아가, BBL 11043) 상에서 생장한, H. 필로리 세포를 채취하고 이어서 BBL Campy Pak^TM미호기성 시스템을 갖는 BBL Gaspak^R시스템 챔버중에서, 캄필로박터 미호기성 가스 발생기(bbL71034)를 사용하여 37℃에서 72 내지 96시간 생장시켰다. 이 세포들을 1.0 A₆₀₀의 세포 밀도가 되게 멸균한 탈염-증류수에 재현탁시켜 적절한 저장 현탁액을 만들었다. 본 어세이는 시험액 950㎕에 박테리아 현탁액 50㎕를 첨가하여 37℃에서 5분간 배양시킨 다음 마이크로 원심분리기에서 1분간 원심분리하여 시작하였다. 세포 펠렛을 상기 멸균한 중화용 완충액 1㎖에 재현탁시켜 세척하고, 마이크로 원심분리기에서 1분간 원심분리하였다. 세포들을 브르셀라-알비미(Brucella-Albimi)브로스(BBL)에 재현탁시키고 영양 아가 배지상에 이식하기 전에 동일하게 연속 희석하였다. 상술한 영양 아가 배지상에 박테리아 현탁액 100㎕와 이의 희석액을 전개하고 상기한 변형 대기중 37℃에서 72 내지 96시간 배양한 후 생존 콜로니수를 세어 생존수를 측정하였다. 미처리 대조군에 대한 생존율을 상기에서 얻은 값으로부터 계산하였다.

pH 5.0에서 0.1% 시트레이트 존재 및 부재하 H. 필로리에 대한 니신 활성의 농도 의존성은 표 7에 제시된 데이타로 알 수 있다. H. 필로리가 그람 음성 균이 긴 하지만, 단지 그람 양성균에 대해서만 활성을 갖는 것으로 여겨지는 니신이, 놀라웁게도 이 미생물에 대해 약간의 살균 활성을 나타내었다. 그러나, H. 필로리에 대한 니신의 활성은 시트레이트 존재하에서는 크게 향상된다.

pH 5.0 및 pH 7.0에서, 시트레이트에 의해 H. 필로리에 대한 니신 활성의 농도 의존성은 표 8에 제시된 데이타로 알 수 있다. 일반적으로 시트레이트 그 자체는 pH 5.0에서 이러한 박테리아종의 생존력에 그다지 영향을 주지 않는다. 그러나, pH 7.0에서 미생물의 생존력은 시트레이트가 고농도인 경우에 다소 감소된다. 이러한 시트레이트 단독의 효과는 이 시트레이트가 대사산물이기 때문에 놀랄만한다. 시트레이트의 존재로 니신에 부여된 향상된 활성은 H. 필로리 현탁액 10⁵cfu/㎖을 37℃에서 5분이내에 완전히 사멸시키기에 충분하다.

표 9에 제시된 데이타는 pH 5.0 및 7.0에서 H. 필로리에 대한 니신의 활성이 킬레이트화제인 EDTA 존재하에 매우 향상된다는 것을 설명하고 있다. 킬레이트화제 그 자체는 고농도인 경우를 제외하고는 이들 미생물의 생존력에 그다지 영향을 끼치지 않는다. 그러나, 니신에 기여하는 EDTA에 의해 향상된 활성은 H. 필로리 현탁액 10⁵cfu/㎖을 37℃에서 5분이내에 완전히 사멸시키기에 충분하다.

일정 pH 범위에 걸쳐 시트레이트 또는 EDTA 존재 또는 부재하에 H. 필로리에 대한 니신의 살균 활성은 각기 표 10 및 표 11에 제시된 데이타로 알 수 있다. H. 필로리가 산성인 관강(管腔)인, 위에서 분리된 것임에도, 이 미생물의 생존력은 놀라웁게도 저 pH 조건에 노출후에는 열등하게 되었다. H. 필로리는 위 내장 보다 덜 산성 극소환경인, 위 점막상태를 콜리니화한다. 이들 실험에서, 저 pH에서 H. 필로리에 생존력이 제한됨에도 불구하고, 이 데이터는 시트레이트 또는 EDTA를 함유하는 니신은 위 및 그 점막 상피중에서 H. 필로리가 생장할 수 있는 유력한 조건과 유사한 조건하에서도 H. 필로리에 대한 살균력을 갖게 된다는 것을 시사하고 있다.

캄필로박터 제쥬니는 조류나 포유류의 창자를 콜로니화하고 식중독에 관련된 그람 음성균이다. 시트레이트 또는 EDTA 존재 및 부재하, C. 제쥬니에 대한 니신의 살균 활성은 각기 표 12 및 표 13에 제시된 데이타로 알 수 있다. 니신 그 자체는 이 그람 음성균에 대해 매우 효과가 있다. pH 5.0에서 시트레이트의 농도가 더 높아지는 경우, 이 박테리아에 대해 독성을 갖는다는 것이 입증되었다. 따라서, 니신과 시트레이트 또는 EDTA의 배합물은 표 12 및 13의 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, C. 제쥬니에 대해 효과가 있으리라는 것을 기대할 수 있다.

a 37℃에서 배양

b 초기 생존수 3.19× 10⁷cfu/㎖

a 37℃에서 5분간 배양

b 초기 생존수 1.04× 10⁴cfu/㎖

c 초기 생존수 1.40× 10⁵cfu/㎖

d 초기 생존수 3.26× 10⁵cfu/㎖

b 초기 생존수 1.24× 10⁵cfu/㎖

f 초기 생존수 9.62× 10⁴cfu/㎖

a 37℃에서 5분간 배양

b 초기 생존수 2.04× 10⁵cfu/㎖

c 초기 생존수 3.40× 10⁴cfu/㎖

a pH를 조정한 시트레이트 또는 20mM 아세테이트(pH 5.0)중

37℃에서 5분간 배양

b 초기 생존수 1.85× 10⁶cfu/㎖

c 5회 시험한 평균

d 초기 생존수 2.7× 10⁵cfu/㎖

e 초기 생존수 3.7× 10⁴cfu/㎖

a pH를 조정한 시트레이트 또는 20mM 아세테이트(pH 5.0)중

37℃에서 5분간 배양

b 초기 생존수 8.6× 10⁴cfu/㎖

c 초기 생존수 9.82× 10⁵cfu/㎖

d 0.1% 시트레이트 존재하 배양

e 20mM 아세테이트 존재하 배양

a 37℃에서 5분간 배양

a 초기 생존수 1.57× 10⁵cfu/㎖

a 37℃에서 5분간 배양

a 초기 생존수 1.84× 10⁶cfu/㎖

EDTA, 시트레이트 또는 다른 킬레이트화제로 향상된 니신의 활성은 살균성 현탁액 어세이에 의한 살모넬라 종에 대해 입증할 수 있다. 37℃에서 24시간동안 생장한 영양아가 플레이트(Trypticase Soy Agar, BBL 11043)로부터 갓 자란 S. 티피머륨 세포들을 채취하고, 이들 세포를 세포 밀도가 1.0 A₆₀₀이되게 재현탁시켜 적합한 저장 현탁액을 만든다. 시험액 970㎕에 박테리아 현탁액 30㎕를 가하여 1분이상 배양하고, 마이크로 원심분리기에서 1분간 원심분리하여 어세이를 시작한다. 세포 펠렛을 멸균한 중화용 완충액 1㎖에 재현탁시켜 세척하고 다시 재현탁시킨후 중화용 완충액으로 연속 희석한다. 영양 아가 배지상에 박테리아 현탁액 100㎕와 이의 희석액을 전개시키고 37℃에서 24시간 배양후 생존 콜로니수를 세어 생존균수를 측정한다. 미처리 대조군에 대한 생존율은 상기에서 얻은 값으로부터 계산한다.

본 발명의 저-pH-활성 박테리오신 조성물은 유효량의 란티오닌-함유 박테리오신 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약제 형태로 경구 투여하는 것이 바람직하다. 담체에는 유효량의 킬레이트화제 및/또는 산성 비히클 및/또는 계면활성제 또는 유화제, 모노글리세라이드 또는 지방산이 포함될 수 있다. 란티오닌-함유 박테리오신은 니신, 서브틸린, 에피더민, Pep 5, 안코베닌, 갈리더민, 듀로마이신 또는 신나마이신중에서 선택될 수 있다. 적합한 킬레이팅제에는 EDTA, CaEDTA, CaNa₂EDTA 및 다른 알킬디아민 테트라아세테이트와 시트레이트가 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 어떤 경우에는, 산성 비히클와 킬레이트화제가 둘다 시트레이트인 경우와 같이, 킬레이트화제와 산성 비히클이 동일할 수도 있다. 본 발명의 조성물에서 사용되기에 적합한 산성비히클은 아세테이트, 프로피오네이트, 시트레이트, 락테이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말로네이트, 아디페이트, 소르베이트, 포스페이트 및 아스코르베이트이다.

본 발명의 조성물은 약산 pH 수준(예, pH 5.0)에서 그리고 높은 pH수준(예, pH 8.0)에서도 미합중국 특히 제5,135,910호에 개시된 S. 티피머륨 및 E. coli와 같은, 위장관을 저해하는 병원성 박테리아에 대해 효과가 있다. 상기 미국특허는 그 전내용이 본원에 인용참조되었다.

본 발명의 약학적 조성물은 제산제 조성물로서 조제하거나 또는 예를 들어 투여하기 전보다 위의 pH 상태를 더 높일 수 있는 제산제와 배합하여 투여할 수도 있다. 니신 킬레이트화제 조성물은 상기한 조건에서 병원성 박테리아에 대해 더욱 효과적일 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 고체, 반고체 또는 액체 희석제 또는 캅셀 형태로 할 수 있다. 본 발명의 어떤 실시형태에서는 산성 비히클와 약학적 담체가 동일할 수 있다. 다른 약학적으로 허용가능한 담체는 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 락토즈, 전분 등일 수 있다.

본 약제학적 조성물은 용액, 콜로이드 또는 에멀젼, 산제, 정제, 캅셀제 또는 겔 형태로 할 수 있다.

저 pH에서 활성을 갖는 본 조성물의 건조형태는 정제로 압착할 수 있으며, 이들 정제는 당 농축액으로 제피할 수 있고 아라비아검, 젤라틴, 탈크 또는 이산화티탄과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 치환제를 함유할 수 있으며 또한 다양한 염료로 피복할 수 있다. 박테리오신, 산성 비히클 및 킬레이팅제를 락토즈, 감자성분, 옥수수 전분, 셀룰로즈 유도체 또는 젤라틴과 같은 고체 담체와 배합하여 과립형태로 함유시킨 경질 젤라틴 캅셀로 제조할 수 있다.

경구 투여용 액제는 펩티드 박테리오신, 킬레이팅제, 산성 비히클와, 당, 물 및 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜을 포함하여 이루어지는 시럽 또는 현탁액 형태로 제조할 수 있다. 필요시, 그러한 액제는 착색제, 방향제, 삭카린과 같은 감미료와 셀루로즈 유도체와 같은 중점제를 함유시킬 수 있다.

투여용량은 콜로이드성 현탁액을 형성하도록 중점제, 유화제 또는 입상물의 포접에 의해 수용성 제제로 변형시킴으로써 확실하게 송달할 수 있다. 이와 달리, 적합한 투여용량을 함유하는 삼투압적으로 균형을 이룬 액제를 10㎖ 정도의 적은 양으로 또는 4ℓ 정도의 대량으로 투여할 수 있다. 위장 세척액으로 사용되는 것과 같은 삼투압적으로 균형을 이룬 용액이 적합할 수도 있다(Di Palma, J.A. and Brady, C.E., 1989, Am. J. Gastroenterol. 84:1008, "Colon Cleansing for Diagnostic and Surgical Procedures: Polyethylen glycol Lavage Solution"; Di Palma, J.A. and Marshal, J.B., 1990, Gastrointestinal Endoscopy 1990, 36:285, "Comparison of a new Sulfate-free Polyethylene glycol Electrolyte Lavage Solution versus a Standard Solution for Colonoscopy Cleansing"; Fordtran, J.S., et al., 1990, Gastroenterol. 98:11, "A low-Sodium Solution for Gastrointestinal Lavage").

위장관을 세척하는데 사용되는 위장 세척액의 성능은 본원에 기술한 살균 조성물의 포접에 의해 향상시킬 수 있다.

본 발명 조성물의 전형적인 1일 용량은 처치할 병원성 미생물의 감염정도, 감염부위 및 처치할 질병의 증상에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 경구 투여용량은 란티오닌-함유 박테리오신 물질 용량당 0.1㎎ 내지 300㎎ 범위로, 그리고 킬레이트화제 용량당 0.1g 내지 30g범위로 할 수 있다.

예를 들면, 위 내용물의 용적은 마지막 식사후 경과된 시간의 함수로서 변화되기 때문에, 위장에 사용하기에 적합한 수용성 제제는 다음과 같이 제조할 수 있다:

위에서의 최종농도가 시트레이트 0.1% + 니신 0.001%(10㎕/㎖)가 되게 하기 위해 위에서의 최종 용량이 약 100㎖가 된다고 가정하여, 10㎖중에 함유시킨 조성량:

투여량 1 : 니신 1.0㎎ 및 시트레이트 0.1g

Na 시트레이트 1.0%

니 신 0.01%

사카린 0.005%

폴리소르베이트 20 1.0%

글리세롤 10.0%

물 87.985%

위에서의 최종농도가 시트레이트 3.0% + 니신 0.03%(300㎕/㎖)가 되게 하기 위해 위에서의 최종 용량이 약 100㎖가 된다고 가정하여, 10㎖중에 함유시킨 조성량:

투여량 2 : 니신 30㎎ 및 시트레이트 3.0g

Na 시트레이트 30.0%

니 신 0.3%

사카린 0.005%

폴리소르베이트 20 1.0%

글리세롤 0.0%

물 58.695%

위에서의 최종농도가 시트레이트 0.1% + 니신 0.001%(10㎕/㎖)가 되게 하기 위해, 위에서의 최종 용량이 약 1000㎖가 된다고 가정하여, 10㎖중에 함유시킨 조성량:

투여량 3 : 니신 10㎎ 및 시트레이트 1.0g

Na 시트레이트 10.0%

니 신 0.1%

사카린 0.005%

폴리소르베이트 20 1.0%

글리세롤 10.0%

물 78.895%

위에서의 최종농도가 시트레이트 3.0% + 니신 0.03%(300㎕/㎖)가 되게 하기 위해, 위에서의 최종 용량이 약 1000㎖가 된다고 가정하여, 100㎖중에 함유시킨 조성량:

투여량 4 : 니신 300㎎ 및 시트레이트 30g

Na 시트레이트 30.0%

니 신 0.3%

사카린 0.005%

폴리소르베이트 20 1.0%

글리세롤 10.0%

물 58.695%

위에서의 최종농도가 시트레이트 3.0% + 니신 0.03%(300㎕/㎖)가 되게 하기 위해, 위에서의 최종 용량이 약 100㎖가 된다고 가정하여, 100㎖중에 함유시킨 조성량:

투여량 5 : 니신 60㎎ 및 시트레이트 6.0g

Na 시트레이트 6.0%

니 신 0.06%

사카린 0.005%

폴리소르베이트 20 1.0%

글리세롤 10.0%

물 82.935%

병원성 미생물의 형태와 치료할 질병에 따라 치료 요법에는 다른 약물과 약제를 투여되는 약학적 조성물의 일부로서 또는 저-pH-활성 박테리오신 조성물과 위장관을 치료하는데 효과적인 다른 약물 양자를 혼합한 치료요법에 포함할 수 있다. 예를 들면, 살모넬라 종 중 하나와 같은 병원성 미생물의 감염으로 유발되는 설사병의 치료시 낮은 pH에서 활성을 갖는 박테리오신 조성물을 카올린, 펙틴 또는 다른 결합제를 함유하는 약제에 투입할 수 있다. 이러한 증상은 낮은 pH에서 활성을 갖는 박테리오신 조성물과 결합제를 동시 투여하여 치료할 수도 있다. 이 밖에도, 제산제 제제를 상기한 치료 요법에 함유시킬 수 있으며, 이 제산제는 니신-킬레이트화제 조성물의 활성에는 영향을 끼치지 않는다.

병원성 미생물인 헬리코박터 필로리의 감염을 치료하는데 있어서, 저-pH-활성박테리오신 조성물을 비스무스 염, 예컨데 비스무스 서브시트레이트 또는 비스무스 서브살리실레이트와 같은 H. 필로리에 대한 다른 약학적으로 활성인 물질과 함께 투여할 수 있다. 본 발명 조성물은 위장관내 H. 필로리의 존재로 수반되는 질병과 증상을 치료하기 위해, 시메티딘, 라니티딘, 오메프라졸, 제산제, 우레아제 저해제 또는 이의 배합물과 함께 투여할 수 있다. 이들의 치료요법에서, 활성이 있는 약제를 본 발명의 약학적 조성물과 동시에 다른 간헐적으로 투여할 수 있으며, 투여형태는 필요에 따라 치료하는 중에 변경할 수 있다.

H. 필로리는 위의 회귀성 감염의 보균장소가 되는 치아 플라크로부터 분리하였다(Desa; H.G., Gill, H.H., Shankaran, K., Mehta, P.R., and Prabha, S.R. (1991) Dental Plaque: a permanent reservoir of Helicobacter pylori, Scand. J. Gastroenterol. 26: 1205 and Shames, B., Krajden, S., Fukasa, M., Babida, C. and Penner, J.L. (1989) Evidence for the Occurrence of the Same Strain of Campylobacter pylori in the Stomatch and Dental Plaque. J. Clin. Microbiol. 27: 2849.).

따라서, 치아 플라크내 H. 필로리에 대해 사용하기에 적합한 박테리오신 조성물은 위장관내 H. 필로리에 대해 낮은 pH에서 활성을 갖는 박테리오신 조성물과 함께 사용할 수 있다.

Claims

란티오닌-함유 박테리오신 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 이루어지는 위장관 내 병원성 미생물에 의해 유발되는 위장 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장애가 그람 음성균에 기인하는 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 헬리코박터, 살모넬라, 에스케리키아, 클로스트리디아, 바실러스, 박테로이드스, 캄필로박터 또는 이르시니아 종을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 미생물이 캄필로박터 제쥬니(Campylobacter jejuni)를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화제를 더욱 포함하여 이루어지는 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 킬레이트화제가 EDTA, 시트레이트 또는 EDTA 및 시트레이트 모두인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 킬레이트화제 이외의 성분으로 산성 비히클을 더욱 포함하여 이루어지는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 산성 비히클이 아세테이트, 프로피오네이트, 시트레이트, 락테이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말로네이트, 아디페이트, 소르베이트, 포스페이트 또는 아스코르베이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오신이 니신임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물이 고체, 반고체 또는 캅셀 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물이 pH 2.5 이상 5.0 이하의 액체 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 미생물이 헬리코박터 종을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 미생물이 헬리코박터 필로리를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 산성 비히클이 pH 2.5 이상 5.0 이하를 부여하며, 캅셀 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제10항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 킬레이트화제가 EDTA임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제10항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 비히클이 아세테이트, 프로피오네이트, 시트레이트, 락테이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말로네이트, 아디페이트, 소르베이트, 포스페이트 또는 아스코르베이트로 구성되는 그룹에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제10항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오신이 니신임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
니신, EDTA, 시트레이트 및 이 조성물에 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 이루어지는, 위장 장애를 예방 또는 치료하기 위하여 경구 투여하기에 적합한 산제, 정제 또는 캅셀제.