KR100235782B1

KR100235782B1 - 병리학적 과정의 예방 또는 치료를 위한 성분물

Info

Publication number: KR100235782B1
Application number: KR1019930703303A
Authority: KR
Inventors: 코헨이룬알; 오퍼 리더; 라미 헤르쉬코비즈
Original assignee: 파울리나 벤-아미; 에다 리서치 앤드 디벨럽먼트 컴퍼니 리미티드; 바세비치-프랭켈; 오퍼 리더; 라미 헤르쉬코비즈; 코헨이룬알
Priority date: 1991-05-02
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 1999-12-15
Anticipated expiration: 2012-05-01
Also published as: AU668865B2; ATE217796T1; NO933942D0; HU9303110D0; US5908837A; JPH06507635A; BR9205961A; DE69232615T2; US5686431A; HUT67136A; SK120193A3; WO1992019249A1; EP0583360A4; NO933942L; CA2102207A1; FI934849A0; US5474987A; DE69232615D1; FI934849A7; EP0583360B1

Abstract

본 발명은 TNF-α 분비유도와 연관된 질병의 진행과정의 치료와 예방용 제약학적 성분물에 관계하며, 본 발명의 성분물인 제약학적으로 수용가능한 운반체와 저분자량 헤파린(LMWH)으로 구성되어 LMWH는 5-8일 간격으로 소량주입의 경우 효과가 있고 LMWH는 T세포 특이적 항원, 미토겐, 대식세포 활성물질, dECM, 라미닌, 피브리노겐등과 같은 반응에 의해 휴면 T세포 또는 대식세포에 의한 TNF-α 분비 유도를 저해시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

[발명의 명칭]

병리학적 과정의 예방 또는 치료를 위한 성분물

[도면의 간단한 설명]

제1도는 AA를 유도하기 위해 면역화된 쥐에서 Fragmin의 약량반응을 피하로 주입한다.

제2도는 AA에서 Fragmin 20㎍의 효과를 나타낸 것이다.

제3도는 AA에서 표준 헤파린에 비교하여 Fragmin(batch 38609)의 매주 주입효과를 나타낸 것이다.

제4도는 매일 주입시킬 경우 Fragmin 보다는 헤파린의 저해효과가 큰 것을 알 수 있다.

제5도는 Fraxiparin(매일(□):주당(■)) Fraxiparine(매일(△):매주(▲)), Lovenox/Clexane(매일(●), 매주(○)), PBS 콘트롤(X)을 20㎍양으로 주입한 경우 저해효과를 나타내었다.

제6도는 LMWH를 매주간 처리한 쥐에서 심장 이인자형이식의 생존이 증가됨을 나타내었다.

제7도는 콘트롤 쥐(＂none＂)를 이상 혈당치(400㎖/㎗)를 가지고, 대조적으로 LMWH로 처리된 쥐에서는 정상혈당치(100㎎/㎗)를 가짐을 알 수 있다.

제8도는 테타누스 항원에 대한 DTH반응성을 테스트하기 위해 85㎏의 40세 남성에 실험한 것을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 종양 괴사인자 알파(TNF-α) 분비를 유도하는 것과 연관된 질병의 치료 및 예방을 위한 제약학적 성분물에 관계한다. 이 성분물은 저분자량 헤파린(LMWH)을 적은 양으로 구성되고, 헤파린은 5일 내지 8일 간격으로 주입한다.

본 발명에 이용되는 LMWH는 평균 분자량이 3,000 내지 6000으로, T세포 특이적 항원, T세포 미토겐, 대식세포 활성물질, 파괴된 세포의 매질(dECM), 피브로넥틴, 리미닌 또는 다른 ECM 성분에 의한 활성반응에 대해 T세포 또는 대식세포를 정지시켜 TNF-α 분비를 저해시키는 역할을 한다.

[발명의 배경]

대식세포와 T임파세포에 의해 생산되는 사이토킨인 TNF-α는 염증반응을 만드는 연쇄반응인자중 주요한 요소이고, 질병에 주요한 운영자로써 다양한 효과를 가진다(B. Beutler and A. Cerami, Ann. Rev. Immunol.(1989) 7:625-655).

TNF-α의 생물학적 효과는 생산부위와 생산농도에 따라 달라진다:낮은 농도에서는 TNF-α는 적절한 지혈 및 방어기능을 하지만, 높은 농도에서는 전신 또는 특정조직에서, TNF-α는 다른 사이토킨, 특히 인터루킨-1과 공조작용하여 많은 염증반응을 악화시킨다.

TNF-α(IL-1과 함께)에 의해 유도되는 반응은 다음과 같다; 열, 느린-파장의 수면, 혈액동력학쇼크, 급성 상(acute phase) 단백질의 생산 증가, 알부민 생산의 감소, 맥관 내피세포 세포의 활성화, MHC 분자의 발현의 증가, 지방단백질 리파제 감소, 사이토크롬 P450 감소, 혈장 아연과 철 감소, 섬유아세포 증식, 활액세포 콜라게네이즈의 증가, 사이클로-옥시게네이즈 활성의 증가, T세포와 B세포의 활성, 사이토킨 TNF-α, IL-1과 IL-6와 분비유도 등이 된다.

TNF-α가 그 효과를 어떻게 발휘하는지는 아직 완전하게 밝혀져 있지는 않지만 대부분 효과는 TNF-α가 세포를 자극하여 세포막의 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘과 루코트리엔을 생산하도록 하는 것과 관련된 것으로 본다.

이와 같은 여러 가지 효과로 인하여 TNF-α는 신체의 여러 많은 기관에서 질병에 복합적으로 연관된다. 혈관에서 TNF-α는 출혈쇼크를 촉진시키고, 내피세포 트롬보모듈린을 조절하고 공응집활성을 강화시킨다. 이는 백혈세포의 흡착과 혈관벽에서의 혈소판 흡착의 원인이 되어, 아테롬성 동맥경화증과 맥관염을 유도하는 과정을 촉진시킨다.

TNF-α는 혈액세포를 활성화시켜, 호중구, 호산구, 단세포/대식세포 및 T와 B 임파세포가 흡착되도록 한다. IL-6과 IL-8를 유도하여, TNF-α는 염증세포의 화학주성을 증가시켜 조직으로 침투를 증가시킨다. 따라서, TNF-α는 자가면역질환의 조직손상, 알레르기, 이식거부에 중요한 역할을 한다.

TNF-α가 지방세포의 대사활성을 조절하고, 소모성 악태증을 수반하는 암, 만성 간염, 만성 심장기능이상, 만성염(chronic inflammation)에 관여하기 때문에 TNF-α를 카테친(cachectin)이라고도 한다. TNF-α는 지방 조직의 소비를 증가시키면서, 식욕을 저해시키는 신경성 식욕결핍에 중요한 역할을 한다.

TNF-α는 골근육과 심근에 대사효과를 가진다. 간에 특히 영향을 주는데 알부민과 사이토크롬 P450 대사를 억제시키고 피브리노겐, a1-산 글리코단백질의 생산을 증가시키고, 다른 급성 상 단백질의 생산을 증가시키며, 창자 괴사의 원인이 되기도 한다.

중추신경계에서 TNF-α는 혈액과 뇌의 장벽을 방해하여 열을 나게 하고, 졸음을 증가시키고, 식욕결핍을 유도한다. TNF-α의 농도가 증가되면 다발성 괴사와도 관계한다. 또한 아드레날 출형의 원인이 되고, 스테로이드성 호르몬 생산에 영향을 주며, 피부에서 PGE-2와 콜라게네이즈를 강화시키고, 파골세포를 활성화시켜 뼈와 연골을 파괴시키는 원인이 된다.

요약하면, TNF-α는 자가면역질환, 이식거부, 맥관염, 아테롬성 동맥경화증에서 많은 달갑지 않은 염증 진행에 관여한다. 또한 암이나 신경성 식욕감퇴에 반응하여 심장기능 상실에도 관여한다. 이와 같은 이유로, 다양한 질병을 조절하기 위한 수단으로써 TNF-α 분비를 조절하는 방법을 찾아야 한다.

면역계의 주요기능은 미생물과 같은 외부침입자에 의한 감염으로부터 개채를 보호하는 것이다. 그러나, 면역계는 자신의 조직을 공격하여 질병을 일으키는 소위 자가면역질환을 일으키기도 한다. 다른 개체 조직에 대한 고유 면역시스템이 공격적인 반응을 하여, 이식된 기관이 거부되는 원인이 되기도 한다. 외부물질에 대해 과민반응하여 천식, 비염, 습진과 같은 증상을 가져오는 알레르기를 일으킨다.

이와 같은 반응을 주도하는 세포는 임파세포, 주로 활성화도니 T임파세포이고 이들이 직접 관계하는 병인성 염증반응은 혈관벽을 따라 표적 조직안팎으로 이동하는 능력에 따라 달라진다. 따라서, 혈관벽을 따라 침투하거나 흡착하는 임파세포의 능력이 감소되면 자가면역 공격, 이식거부, 일레르기를 방지할 수 있다. 이것은 현재 이용되는 치료법과 비교할 때 좀 더 효과가 좋고 부작용이 작은 새로운 치료요법적 원리가 될 수 있다.

아테롬성 동맥경화증과 맥관염도 만성 및 급성 병인성 혈관 염증이다. 아테롬성 동맥경화증은 동맥의 내벽을 두껍고 딱딱하게 만들어 관상동맥질환, 심근경색, 뇌경색, 말초혈관 질환을 유도하는데 이는 서양에서 주요한 치사원인이 되는 질병이다. 병리학적으로, 아테롬성 동맥경화증은 지방과 석회 침착물에 의한 병소로써 서서히 만성적으로 진행된다. 섬유조직이 증식되면 궁극적으로 혈관의 관강을 급작스럽게 폐쇄하는 급성질환을 유도한다.

TNF-α는 시험관에서 HIV 복제를 실행하고 증가시키며(Matsuyama T. et., J. Virol. (1989) 63(6):2504-2509; Michihiko, S. et al., Lancet(1989) 1(8648):1206-1207), HIV-1 유전자 발현을 촉진시켜 HIV-1에 감염된 개체에서 임상적 AIDS발생을 촉진시킨다(Okamoto, T. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses (1989) 5(2):131-138.

헤파린은 폴리안이온성 설페이트 폴리사카라이드인 글리코사미노글리칸이고, 항-혈전제로써 응혈을 예방하는데 임상적으로 이용된다. 동물에서 헤파린은 자가면역 T임파세포가 이의 표적기관에 도달하는 능력을 감소시키는 것으로 나타났다(Lider, o. et al., Eur. J. Immunol. (1990) 20:493-499). 또한, 헤파린은 쥐에서 실험적인 자가면역질환을 억제시키고, 피부이식모델 쥐에서, 하루에 소량씩 1회 주입시킨 경우(생쥐는 5㎍, 들쥐는 20㎍)이식편의 생존기간이 연장되었다(Lider, o. et al., J. Clin. Invest. (1989) 83:752-756).

관찰된 효과에 대한 기작은 혈관벽을 침투하는데 필요한 효소, 주로 헤파리네이즈 효소는 T임파세포에 의해 유리를 저해시키는데 관계하며 혈관벽에 대어져 있는 내피하위 세포의 매질(ECM)의 글리코사미노글리칸부분을 특이적으로 공격하는 헤파리네이즈 효소를 T임파세포가 방출시키는 것을 방해하는 것으로 보인다(Naparstek, Y. et al., Nature (1984) 310:241-243). 헤파리네이즈의 발현은 뇌척수염(EAE)에서 혈관세포벽을 침투하고 뇌를 공격하는 자가면역 T임파세포의 능력과 연관된다.

유럽특허출원 EP 0114589(Folkman et al.)은 포유류에서 맥관형성을 방해하는 성분물에 대해 상술하는데, 활성물질은 (1) 헥사사카리드인 헤파린 또는 헤파린 단과 (2) 코르티손 또는 하이드로코르티손 또는 하이드로코르티손의 11-α 이성체로 구성된다. 상기 출원에 따르면, 헤파린 또는 코르티손 단독으로는 효과가 없고; 소요의 효과를 얻기 위해서는 두 가지가 복합되어야 한다는 것이다. 맥관형성과 자가면역 질환에 대한 연관관계가 있다는 문헌적 증거는 없으나, 특허출원 5p에서, 건선 및 관절염 연관된 맥관형성에는 매일 헤파린을 25,000U 내지 47.000U 사용하도록 처방하였다.

Horvath, J.E. et al., Aust. N. Z. J. Med. (1975) 5(6):537-539에서는 초기 신장 이식에서 피하지방 헤파린의 부-응집약량 효과에 대해 상술한다. 매일 약량은 매우 높은데(5000U), 이 연구결과는 부(Sub)-응집양에서는 헤파린은 초기 이식편기능 또는 이식물의 생존에 영향을 주지 못하고, 복합 출혈이 증가되는 것과는 관계가 있는 것으로 보인다.

Toivanen, M.L. et al., Meth. and Find. Exp. Clin. Pharmacol. (1982) 4(6):359-363은 쥐에서 어쥬먼트 관절염을 저해하는데 높은 약량(1000U/쥐)의 헤파린의 효과를 검사하였는데, 쥐 헤파린에 의해 어쥬먼트 관절염이 심해진 것을 볼 수 있다.

PCT 특허:출원 PCT/AU88/00017 No. Wo88/05301에서는 항-전이제와 항-염증물질로써 이용하기 위해, 헤파리네이즈 활성과 같은 엔도글리코실라제 활성을 차단하거나 또는 저해시키는 설페이트 롤리사카라이드에 대해 상술한다. 헤파린 및 항응집 활성이 거의 없는 과요오드화물 산화, 환원된 헤파린과 같은 헤파린 유도체를 매일 쥐마리당 1.6-6.6㎎ 범위내에서 연속주입하는 경우 항-전이활성과 항-염증활성을 가진다는 것을 볼 수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 TNF-α 분비를 유도하는 것과 관련된 질병 치료 및 예방에 사용할 수 있는 제약학적 성분물에 관계하는데, 이 제약학적 성분물은 제약학적으로 수용가능한 운반체와 적은 효과약량의 저분자량 헤파린(LMWH)으로 구성되는데, LMWH는 5-8일 간격으로 주입시키는 경우에, LMWH는 T세포 특이적 항원, 미토겐, 대식세포 활성물질, dECM, 라미닌, 피브로넥틴, 또는 다른 ECM 성분에 바능하여 T세포 또는 대식세포의 활성을 정지시켜, TNF-α 분비를 저해시키는 능력이 있다.

본 발명의 구체예에서 제약학적 성분물중 LMWH는 평균분자량이 3,000 내지6,000이고 5일 내지 7일 간격으로 주입된다.

본 발명의 목적은 TNF-α 분비를 유도하는 것과 연관된 질병의 예방 및 치료에 사용되는 약5-8일 간격으로 주이비되는 제약학적 성분물을 제공하는데, 이 제약학적 성분물의 제약학적 수용가능한 운반체와 LMWH로 구성되고, LMWH는 적은 효과량을 포함하여 제약학적 성분물을 주입하지 않고 또는 주입후 이를 회수한 다음에 피부에 항원을 노출시켜 나타나는 결과 비교하여 본 제약학적 조성물을 투여후 5-7일 후에 항원에 노출시켰을 때 나타나는 경질이 감소되어, 이는 LMWH가 지연형 과민(DTH) 반응을 억제하는 능력이 있다는 증거이다. 이용된 항원은 테타누스, 미엘린 염기성 단백질, 정제된 단백질 유도체, 옥사졸란과 그 유사체가 될 수 있으나 이에 한정시키지 않는다.

또한, 본 발명의 제약학적 성분물은 손으로, 구강주입, 또는 장관외 주입(국소 또는 흡입)과 같이 적절한 방식으로 주입될 수도 있다. 구체예에서는 본 발명의 제약학적 성분물은 피하내로 또는 정맥으로 주입할 수 있다. 따라서, 본 발명은 자가면역질환, 염증 질환(특히, 창자 염증질환), 후천성 면역결핍증(AIDS)에 연관된 다양한 병인성 질환의 치료 및 예방, 이식거부를 지연 및 예방하는데 유용하다. 본 발명은 당뇨병 I, 치근막질환, 포도막염, 류마티스성질환(특히, 류마티스 관절염), 아테롬성 동맥경화증, 맥관염 또는 다발성 경색의 치료에 유용하다.

본 발명의 제약학적 성분물은 적은 양의 LMWH, 일반적으로 5㎎ 이하, 적절하게는 0.3 내지 3㎎, 가장 적절하게는 1 내지 1.5㎎의 LMWH를 포함한다.

본 발명은 TNF-α 분비를 유도하는 것과 연관된 질병의 치료 및 예방하기 위해 5-8일 간격으로 주입되는데 제약학적 조성물에 저분자량 헤파린(LMHH) 을 이용하는 방법에 관계하는 것으로써 LMWH는 T세포 특이적 항원, 미토겐, 대식세포활성물질, dECM, 라미닌, 피브로넥틴 또는 다른 ECM 성분의 반응에 의해 T세포 및 대식세포가 활성화되는 것을 중지시켜 in vitro에서 TNF-α 분비를 저해시킬수 있는데 제약학적 조성물에는 수용담체와 함께 적은 양의 LMWH를 포함한다.

본 발명의 목적은 TNF-α 분비를 유도하는 것과 연관된 질환을 가진환자를 치료하는 방법으로, 상기 제약학적 조서울을 5-8일 간격으로 투여하는 것이다.

본 발명이 목적은 본 발명의 구체예를 포함한 다음의 상술내용을 검토함으로써 본 기술분야에 숙지된 자에 의해 명백해질 것이다.

[발명의 설명]

본 발명에 따르면, LMWHs로 처리하는 경우에 TNF-α를 분비시키는 T세포와 대식세포 활성이 저해됨을 알았다. 쥐와 사람에서 대식세포와 다른 염증세포와 관련이 있는 세포에 의해 촉진되는 DTH반응, 염증반응을 저해시키는 것으로 알 수 있다. TNF-α 생산에 영향을 줄 수 있는 량으로 LMWHs를 투여하면 어쥬먼트 관절염(AA)이라 불리는 자가면역 관절염을 저해시킬수도 있다. LMWH 치료하면 쥐에서 이인자형 심장 이식물의 생존을 연장시키고, NOD 쥐에서 인슐린 량에 의존하는 당뇨병(IDDM)을 치료한다. 또한, LMWHs 치료하면 손상된 ECM 자극에 대해 T세포와 대식세포가 TNF-α를 생산을 유도하는 것을 저해시킨다. 혈관손상부위에서 TNF-α는 아테롬성 동맥경화증의 진행에 중요한 역할을 하기 때문에, 손상된 ECM 부위에서의 TNF-α를 저해시키면 아태롬성 동맥경화증이 진행되지 않는다. LMWHs로 치료할 경우 가장 놀라운 점은 이와 같은 치료에서 주단위로 적은 량을 주입될 경우에 가장 효과적이라는 것이다. 다량의 LMWH 또는 매일 LMWH를 주입하는 경우에 TNF-α 분비억제 또는 면역반응 억제에 효과가 없었다.

헤파린의 탈중화반응 또는 분취에 의해 생산되는 LMWH는 항혈전 성질은 개선되었으나 헤파린과 비교할 때 상이한 약리학적 성질을 가진다. 예를 들면 반감기는 두배가 되고, 피하내로 주입하면, 항-응집 효과는 더 높다(Bratt, G. et al. Thrombosis and Haemostasis (1985) 53:208; Bone, B. et al., Thrombosis Research (1987) 46:845).

본 발명에 따르면, 몇 일 간격으로 항-응집효과를 나타내는 량 이하의 양으로 LMWH를 주입하는 경우에, TNF-α 유도와 관련이 있는 질병의 치료 및 예방에 효과가 있다.

본 발명에 따라 이용된 LMWH은 유럽특허 EP 0014184에 상술된 것과 같이, 분자량이 3000-6000인 LMWHs이다. 일부 LMWHs는 Fragmin, Fraxiparin, Fraxiparine, Lovenox, Clexane과 같은 다른 상표로 시중에서 구입할 수 있다.

몇 가지 다른 방법으로 LMWH를 생산할 수 있다; 표준 헤파린에 있는 LMWH를 겔필터 또는 막필터로 모을 수 있고 화학적(니트로스산에 의한 β-엘리미네이션 또는 과요오드화물 산화) 또는 효소적(헤파리네이즈에 의한) 탈중합반응으로 얻을 수 있다. 원하는 분자량을 가지는 분취물을 얻기 위해 탈중합반응의 조건을 조심스레 조절되어야 한다. 통상적으로 질산 탈중합반응을 이용한다. β-엘리미네이션에 의해 헤파린 벤질 에스테르의 탈중합반응이 이용되는데, 헤파리네이즈를 이용한 효소 탈중합반응으로도 동일한 형태의 단편을 얻을 수 있다. 항-응집 활성은 낮지만 기본 화학구조를 가지는 LMWH는 과요소산염 산화에 의한 탈중합 반응 또는 흡착을 위해 고정된 항-트롬빈을 이용한 다른 방법으로 LMWH에서 항-트롬빈-결합부분을 제거하여 얻을 수 있다.

Fragmin돼지 내장 점막에서 헤파린 나트륨을 질산 탈중합반응시켜 니트로스산 생산된 4000-6000 달톤의 평균 분자량을 가지는 저분자량 헤파린이다. Kabi Pharmacia, Sweden에서 Fragmin항-트롬빈제로 이용하는데, 각각 16㎎과 32㎎에 상응하는 2500 IU/0.2㎖과 5000 IU/0.2㎖로 주입한다.

FraxiparinFraxiprine돼지 내장 점막에서 헤파린 칼슘을 질산에 의한 탈중합 반응시켜 생산된 4500 달톤의 평균 분자량을 가지는 LMWH이다. 이것은 항-트롬빈 활성제로써 Sanofi(Choay Laboratories)에 의해 제조되고, 물 ㎖당 3075 IU에 상응하는 Ca. 36㎎으로 구성된다.

Lovenox(Enoxaparin/e)는 β-엘리미네이션에 의해 돼지 내장 점막에서 헤파린 나트륨의 탈중합 반응에 의해 생산되는 LMWH 단편으로 Pharmuka SF에서 Clexane과 Lovenox의 이름으로 생산되고 Rhone-Poulenc에서 판매한다. 항-트롬빈제는 각기 20㎎/0.2㎖과 40㎎/0.4㎖로 주입될 수 있다.

본 출원에서 보는 바와 같이, 전술한 신규한 특징의 LMWHs는 제조과정, 구조적 상이성(탈중합 반응에 의해 또는 원료로 이용된 헤파린에 따라 다양할 수 있음) 또는 항-응집성 활성의 차이등에 관계없이 공통적으로 포함하는데, 이용된 LMWHs는 특이적 항체, 항원 dECM 또는 피브로넥틴 또는 라미닌과 같은 단백질과의 접촉에 의한 활성화 반응으로 T세포와 대식세포가 TNF-α 분비하는 활성을 저해시키는 능력을 가지고 있다.

본 발명의 목적에 맞는 LMWH를 확인하는 유용한 방법은 다양한 항원(예로, 테타누스 항원, MBP, PPD과 옥사졸린)에 대한 DTH 피부반응의 저해, T임파세포 의존성 반응을 저해하는 가를 확인하는 것이다. LMWHs는 ECM과 이의 단백질 성분에 T세포가 흡착하는 것을 방해한다.

본 발명에 따른 효과가 있는 LMWHs는 염화나트륨, 안정화제와 다른 적절한 비-활성성분으로 구성된 수용액으로 제약학적 성분물에 결합될 수 있다. 적절한 주입 경로는 피하 또는 정맥내 주입이나 다른 경로로도 투여 가능하다.

본 발명에 따르면 LMWH는 5일 내지 8일 간격, 적절하게는 1주일 간격으로 주입된다.

본 발명에 따르는 치료 및 예방될 수 있는 질환은 아테톰성 동맥경화증, 맥관염과 같은 TNF-α 분비를 유도하는 질병 및 이와 연관된 병인성 자가면역질환 예로써; 류마티스 관절염, IDDM; 알레르기; 이식거부; 포도막염과 내장 염증과 같은 급성 및 만성 염증 질환, 신경성 식욕결핍증; 폐혈증에 의한 출혈쇼크, AIDS 감염등이 포함될 수 있다. AIDS의 경우 LMWHs는 감염에 대해 저항성을 강화시키며, HIV의 복제를 억제시키고, AIDS-관련 합병증(ARC)의 발생을 저해시킨다.

본 발명에 따르면, LMWHs는 적은 량으로 효과를 나타내고, 다른 제조과정에 의해 준비한 LMWH는 서로 상이한 광학적 생물효과를 나타낸다. 그러므로, 본 발명에 사용된 LMWH 제조의 단위량을 정하는 것이 필수적이고, 이 단위량은 LMWH로 치료된 쥐의 지라세포에 의해 또는 LMWH에 의한 DTH 반응성 저해에 의한 TNF-α 분비 저해검사에 기초한 것이다. TNF-α 분비를 저해시키는 특정량에서의 LMWH 능력은 DTH 반응을 저해시키는 능력과 연관된다. in vivo에서 세포-중개된 염증반응이 중요한 이유는 자가면역질환, 이식거부, 혈관염증과 알레르기에 관련하여 나타나기 때문이다.

본 발명에 따른 TNF-α 생산을 저해시키고, DTH 반응을 적어도 50% 저해시킬 수 있는 ㎏당 LMWH의 최저량은 ㎏당 12마리 쥐 저해 유닛(12u/㎏)으로 구성된다. 쥐와 사람의 표면적과 대사과정에 차이가 있기 때문에, 쥐에서 12u/㎏이 사람에서 1u/㎏에 상응하는 양으로 한다. 예로써, TNF-α 분비와 DTH 반응을 모두 저해시키는데 효과가 있는 Fragmin batch 38609량은 매주 쥐한마리당 5㎍이 된다. 각 새앙쥐의 체중이 약25g 정도이기 때문에, 12u/㎏에 상응하는 Fragmin 38609의 량은 200㎍/㎏이 된다. 사람에게 적절한 1㎍은 200㎍/㎏:12=16.67㎍/㎏이 된다. 사람의 체중이 70㎏인 경우 매주 피하로 1.2㎎을 주입하는 것이다. 각 개인이 생물학적으로 다양하기 때문에 적정량은 1.2㎎와 차이가 날 수 있고, 5㎎ 이하가 되거나 0.3 내지 3㎎ 사이일 수 있다.

들쥐에 효과적인 LMWH량은 들쥐의 ㎏당 LMWH의 량이 생쥐 ㎏당 량의 절반이 되는 것에 기초하여 유도할 수 있다. 예로써 Fragmin batch 38609의 12u가 200㎍/㎏ 인 경우 들쥐의 6u은 00㎍/㎏ 또는 20/200g으로 매주 주입 될 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명하나 이에 국한시키지 않는다.

[5. 실시예]

[실시예 1:TNF-α 분비 저해검사]

생체내에서 LMWH로 치료한 또는 치료안된 쥐의 지라세포 또는 LMWH 존재하에 또는 없이 배양된 지라세포의 상층액에서 TNF-α 분비능력은 분석하였다. TNF-α 생검은 사이클로헥시미드로 처리된 세포에서의 TNF-α의 세포독성 효과와 중성 레드 흡입검사로 이를 정량화하는 것에 기초한다(Wallach D., J. Immunology (1984) 132:2464-2469). 간략하면, 세포상층액에 존재하는 TNF-α에 의해 CHI 처리된 LeLe 세포를 죽이는 정도를 측정하고, 외부에서 첨가된 적정곡선을 TNF-α 농도 비교하여 상청액에서 TNF-α 농도를 결정한다. 2시간동안 중성 레드로 배양하고, Sorenson 구연산 완충액-에탄올 혼합물로 세포가 취한 중성 레드를 추출하고 Microelisa Autoreader로 570 에서 발색반응을 측정하여 세포의 생존능을 평가한다.

LMWH로 처리된 쥐에서의 세포는 다음과 같이 수득한다. 집단당 5마리 새앙쥐인, BALB/c 균주의 암컷쥐(25g, 2개월)에 0.5 내지 20㎍ 범위의 LMWH를 다양한 양으로 피하내 주입하였다. 5일 후에 쥐의 목을 절단하여 지라를 제거한 후 지라세포를 현탁시켜, 적혈세포는 제거하고, dECM, 콘카나발린 A(con A) 또는 리포폴리사카라이드에 의한 유도반응에 대해 TNF-α가 생산되는지를 검사하였다.

[실시예 2:DTH 반응성에 대한 생검]

쥐를 아세톤/올리브오일(4:1 V:V)에 3% 옥사졸린(OX) 100㎕을 사용하여 면도된 복부를 감작시킨다. 5일 후에 DTH 감응성이 유도되었다. 쥐에 아세톤/올리브오일에 0.5% OX 20㎕로 (각 쥐에 10㎕씩)처리한다. 쥐의 일정부위를 처리직후, 24시간, 48시간 뒤에 Mitutoyo engineer′s micrometer로 측정하였다. 각 집단에서 귀가 부어 있어, 집단을 확인할 수 없었다. 사용한 마이크로메트를 이용하여 귀의 팽창정도는 10^-2㎜ 또는 10^-4인치(±SE) 단위로 나타낸다. 평균 저해도는 다음과 같이 계산한다.

쥐는, 실시예 1과 같이 LMWH를 처리하거나, OX로 1차 처리 하루전에 주입한다. OX 처리후 5일째에 쥐에 전술한 것과 같이 DTH 반응을 유도한다.

양성콘트롤에서는 LMWH 처리없이 면역화된 쥐에서 DTH 반응을 유도한 것이다. 음성콘트롤은 면역화된 쥐에 항원에 의해 생성된 기본적인 팽창이 있는 것이다.

[실시예 5.3]

[실시예 3:Invitro에서 T세포와 대식세포에 의한 TNF-α 분비 유도]

미량적정 플레이트는 다음과 같이 준비할 수 있다. 평편 96-웰플레이트(Costar)에 웰당 PBS 1㎍/50㎕ 농도로 피브로넥틴(FN) 또는 라미닌(LN)(시그마)을 첨가한 후 16시간 뒤에 제거한다. 남아있는 결합부위는 2시간동안 웰에 BSA/PBS(10㎎/㎖)을 첨가하여 차단시키고 세척해낸다. ECM 피복된 웰은 다음과 같이 준비할 수 있다. 소관상 내피세포를 평편 96-웰플레이트에 배양시킨다. 내피세포의 접촉층을 용해시키고 세포와 접촉안된 ECM은 남게 된다(Gospodarowicz, D. et al. J. Biol. Chem.(1978) 253:3736). dECM은 27G 실린저 바늘로 ECM을 3회 부드럽게 긁어내고 노출 부위는 BSA/PBS로 피복시킨다. K1으로 지정된 쥐 CD4+T세포는 미엘린 염기성 단백질(MBP)을 인식하는데 이는 배양에서 증식되어 웰당 10⁵세포로 주입되고 이때 1% BSA와 항생제가 보충된 RPMI 1640(Gibco) 100㎕에 3×10⁵비장 대식세포를 공급할 수도 있다. 비장 대식세포는 특이적 단클론 항체(mAb)를 이용하여 T와 B세포를 제거하고 정제하여 얻을 수 있다. 지적한 것과 같이, 항-뮤린 TNF-α mAb(Genzyme, diluted 1/300)을 웰에 첨가한다. MBP(100㎍/㎖)을 웰에 첨가한다. 플레이트는 3시간동안 습윤 배양기에서 37℃로 배양시킨다. 연속적으로, 웰의 내용물을(각 실험집단에 4개 웰) 수득하고, 원심분리하여, 실시예 1과 같이 TNF-α 분비 검사를 한다. 배양된 대식세포와 임파세포 상청액은 TNF-α에 의해 죽게 되는 HeLa세포 배양물에 첨가하고, 테스트 배지에서 죽은 세포는 TNF-α가 첨가된 적정곡선과 비교하여 계산한다. 세포죽음은 전배양된 HeLa세포에서 뉴트랄 레드 방출로 검사할 수 있다. 이 결과를 보면 총 6회 실험 결과가 거의 유사하였다. 표 1에서는 T세포와 대식세포를 함께 배양하는 경우 특이항원 MBP(4집단), 미토겐 Con A(6집단) 또는 LPS(8집단)과의 접촉에 의해 TNF-α 분비가 유도되을 볼 수 있다. 그러나, 항원성 또는 미토겐성 촉진이 없는 경우에, TNF-α는 dECM(10집단) 또는 ECM 성분 피브로넥틴(FN:12집단) 또는 라미닌(14집단)에 의해 분비가 유도될 수도 있다. 고유 ECM은 TNF-α의 약한 유도물질이다(16집단).

[표 1]

[실시예 4:LMWH에 의한 TNF-α 분비조절]

실시예 3에서 상술한 것과 같이 T세포 및 부차 세포 배양을 실시하였다. 세포배양 시작시에 웰에 LMWHs를 첨가한다. 배양 3시간후에 TNF-α 량을 검사하였다.

표 2에서는 LMWH(Fragmin batch 38609)이 시험관에서 존재함으로써 특이항원(MBP:4), 미토겐(Con A와 LPLS:6과 8), dECM 또는 ECM 성분(10,12, 14)에 의해 TNF-α 분비를 유도하는 것이 방해된 것으로 나타난다. dECM에 의한 TNF-α가 유도되는 것은 아테톰성 동맥경화증과 연관되기 때문에 LMWH에 의한 TNF-α 분비가 저해되면 아테톰성 동맥경화증에 유익하다.

[표 2]

[실시예 5]

시험관에서 지라세포에 의한 TNF-α 분비에서, 쥐에 주입되는 LMWH의 효과를 검사하기 위해 다음과 같이 실험을 실행하였다. BALB/c 쥐(한 그룹당 5마리)를 염으로 희석된 다양한 량의 LMWH(Fragmin batch 38609)을 피하내로 주입시키는 처리를 하였다. 1주 뒤에, 동물을 죽이고 적혈세포가 없는 지라세포는 dECM없는 콘트롤 웰(A) 또는 dECM 피복된 웰(B)에 대한 TNF-α 분비능력을 검사하였다. TNF-α 분비량의 측정은 실시예 1과 같이 실시한다. 표 3에서는 7일 주기로 5㎍ LMWH를 주입하는 경우 dECM에 의해 유도되는 TNF-α 분비가 저해됨을 나타낸다. LMWH의 양이 더 많거나 적어도 효과가 없었다. 따라서, 생체내로 1주간격으로 적정량의 LNWH을 주입하는 것이 효과적이다.

[표 3]

표 4에서는 LMWH Fragmin batch 38609 5㎍이 LPS에 의해 유도되는 TNF-α 분비를 저해시키는데 효과가 있었다. BALB/c(각 실험 집단은 4마리) 쥐에 염으로 희석된 적정 량의 LMWH를 피하내로 주입시킨다. 1주후에 10㎎ LPS를 복막내로 주입하고, 4시간 뒤에 죽이고, 적혈세포가 없는 지라세포를 배양기에서 3시간동안 dECM 피복된 웰에서 배양시킨다. dECM에 대한 분비된 TNF-α 량은 배양상층액에서 측정한다. 결과는 표4에 있다.

[표 4]

[5.6 실시예 6]

DTH 반응과 TNF-α 저해에 대한 상이한 LMWH의 효과를 검사하기 위해, 서로 다른 농도에서 LMWH를 주입하였다. 1주후에 몇 마리의 쥐를 죽이고 시험관내에서 Con A 활성에 대해 유도된 TNF-α 분비 양을 측정하였다. 남아있는 쥐는 항원 옥사졸론에 대한 반응을 검사하였다. 이 결과는 LMWH 처리안된 쥐에 대한 저해도 비율로 나타내었다.

표 5에서의 결과로 두 가지 결론을 내린다:

1. 유사한 항-트롬빈 효과를 가지는 두 가지 다른 LMWH는 각각 TNF-α 분비를 저해시키는데 서로 다른 적정농도를 가진다. 또한 Clexane batch 4096과 같은 LMWH는 시험한 어느 농도에서도 TNF-α 분비효과에 저해효과를 나타내지 않았다. 그러므로, LMWH의 항트롬빈 효과는 TNF-α 분비의 저해에 대한 LMWH의 능력과는 무관하다. 두 가지 상이한 생물학적 정량은 제조물에 존재하는 상이한 요소에 의해 조절된다.

2. TNF-α 분비를 저해시키는 LMWH의 특정농도는 DTH 반응을 저해시키는 능력과 연관되고 TNF-α 분비를 저해시키는데 효과적인 LMWH량은 DTH반응을 저해시키는데 효능이 있다.

[표 5]

[5.7 실시예 7:LMWH 소량으로 처리한 쥐에서 어쥬먼트 관절염 치료]

어쥬먼트 관절염은 미코벡테리움 튜버클로시스의 항원으로 쥐를 면역화시켜 쥐에서 질병을 유도한다(Pearson, C.M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.(1956) 91:91). 이와 같은 실험적으로 유도된 류마티스성 관절염의 모델이 될 수 있다(Pearson, C.M.,Arthritis Rheum.(1964) 7:80). 이 관절염은 결합조직에서 구조간에 교차반응의 원인이 되는 미코박테리움 튜버클로시스의 항원을 인지하는 T임파세포에 의한 것이다(Cohem, I.R., et al., Arthritis Rheum.(1985) 28:841).

어쥬번트 관절염을 유도하는 오일에서 M. 튜버클로시스(1㎎)로 Lewis쥐에서 면역화시킨다(Pearson, C.M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.(1956) 91:91). 5일 후, LMWH와 헤파린의 지정량을 쥐의 피하내로 주입하고, 설명한 것과 같이 0-16으로 관절염의 정도를 기록한다(Holoshitz, Y., et al., Science(1983) 219:56). 모든 실험은 Fragmin, Batch 38609로 실행한다.

AA를 유도하기 위해 면역화된 Fragmin(도면1)에 대한 약량을 연구하기 위해 0.5㎍(○), 1㎍㎍(◆), 2㎍(●), 10㎍(◇), 15㎍(△), 20㎍(■), 30㎍(▲), 40㎍(X) and PBS Control(□) 주입을 5일째 시작한다. 이양도 관절염을 저해시키는 최대효과가 있다.

AA에서 Fragmin의 20㎍량의 효과는 도면5에 나타내었다; PBS 콘트롤(□); 5일에 1회 처리(▲); 매일(●); 매5일째(○); 매주(■); 5일간 격과 7일간격으로 Fragmi n 주입은 관절염을 저해시키는 것으로 나타났다.

제3도는 AA에서 표준 헤파린에 비교하여 Fragmin(batch 38609)의 매주 주입효과를 나타낸 것이다. Lewis쥐도 AA를 유도시켰다. 5일째 쥐에 Fragmin(●), 헤파린(○) 또는 PBS 콘트롤(□) 2㎍을 매주 간격으로 피하로 주입시켰다. 이 결과에서 Fragmin과 헤파린의 능력이 상당한 차이가 있음을 나타내었다. Fragmin은 관절염을 완전히 저해시키고, 헤파린은 저해 효과가 없었다.

AA에 대한 저해효과는 LMWH를 20㎍량으로 매일 주입시킬 때 나타나지 않았으나 매주 주입시킬 때 Fragmin보다는 저해효과가 헤파린이 더 큰 것으로 나타났다(도면4:프라그만(batch 38609)(●), 헤파린(○), PBS 콘트롤(□).

AA를 유도하기 위해 면역화된 Lewis 쥐에 LMWH의 주입하여 유사한 저해 효과를 나타낸다. 상이한 타입의 LMWH에서는 매주 주입한 경우에, 관절염이 저해되고, 매일 주입한 경우에 관절염이 저해되지 않았다.

[5.8 실시예 8:LMWH처리로 이식거부를 예방한다]

Wistar 쥐는 BN 심장 이식을 한다(Ono, K. and Linsay, E.S., J. Thorac. Cardiovasc. Surg.(1969) 45:225-229). 이식전에 쥐에 7일간격으로 20 Fragmin 또는 PBS 콘트롤(도면 6, ■와 □)을 피하내로 주입하고 생존을 기록한다. 주입일은 복부의 촉진에 의해 이식된 심장의 박동이 멈춘 날에 시작한다.

[5.9 실시예 9:NOD 쥐의 IDDM에 LMWH의 생물학적 효과]

IDDM을 자발적으로 발현시키는 NOD균주 쥐를 사람 IDDM의 모델이 된다(Castano, L. and Eisenbarth, G. S., Annu. Rev. Immunol.(1990) 8:647-679). 이 질환은 췌장 아이렛트에 염증이 나타나는 인슐리티스에 의해 4-5주에 시작된다. 인슐리티스는 TNF-α에 의해 쉽게 손상될 수 있는 인슐린-생성베타 세포를 손상시킨다. 4-5개월 경에, 베타세포이 상당수가 당뇨병에 의해 파괴되었다.

LMWH 치료가 IDDM 과정에 영향을 주는지를 검사하기 위해, 10마리 암컷 NOD 쥐는 Fragmin 5㎍(batch 38609)로 피하주입 처리한다. 10 콘트롤 쥐는 염으로 주입한다. 5달후에 모든 쥐에서 표준 과정을 사용하여 IDDM의 발생을 결정하기 위해 혈액을 취한다(Elias, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87:1576-1580). 도면 7에서 콘트롤 쥐의 혈당치는 비정상이고(400㎎/㎗), LMWH 처리된 쥐는 정상 혈당치(100㎎/㎗)가 되었다. LMWH로 처리는 IDDM 과정을 치료한다.

[5.10 실시예 10:사람 DTH의 LMWH 치료]

제8도에서는 테타누스 항원에 대한 DTH 반응성을 테스트하기 위해 85㎏의 40세 남성에 실험한 것을 나타낸다. 24내지 48시간에 18㎜ 경화가 나타났다. 지원자에게 Fragmin(batch 38609) 3㎎을 피하로 주입하였다. 5일후 다시 테타누스 반응에 대한 DTH를 테스트하였고 경화는 5㎜로 저해받았다. 3주후에 다시 DTH 검사를 받았고(＂회복＂) 이 테스트에서 반응이 양성을 나타내었다. Fragmin으로 처리한 자원자에 다시 DTH 반응성을 7일뒤에 검사하였다. 다시 DTH는 5㎜ 경화로 저해 받았다. DTH회복은 3주후에 되었다. 따라서, 5㎎ 이하량의 LMWH는 5 내지 7일 간격으로 치료할 때 DTH가 저해됨을 알 수 있다.

본 명세서에 설명된 방법과 성분물은 공지된 기술분야에 숙지된 자에서 본 발명의 영역내에 변형이 가능함을 인지할 것이다. 따라서 본 발명은 실시예에 국한시키지 않고 청구범위로 한정한다.

Claims

포유류에서 TNF-α 분비 유도와 연관된 질병의 진행을 저해하거나 감쇠시키는데 적합한 제약학적 성분물에 있어서, 성분물은 제약학적으로 수용가능한 담체에 5㎎미만의 저분자량 헤파린(LMWH)으로 구성된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항에 있어서, LMWH의 평균 분자량이 3,000 내지 6,000인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제2항에 있어서, 매7일 간격으로 주입되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제2항에 있어서, 피하 또는 정맥내 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항에 있어서, LMWH 약량은 3 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, LMWH 약량은 1㎎내지 1.5㎎인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동종이식편 거부를 지연시키거나 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제5항에 있어서, 동종이식편 거부를 지연시키거나 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제6항에 있어서, 동종이식편 거부를 지연시키거나 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기 반응을 지연 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제5항에 있어서, 알레르기 반응을 지연 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제6항에 있어서, 알레르기 반응을 지연 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 만성염(chronic inflammation)을 예방하거나 감쇠시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제13항에 있어서, 만성염은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제5항에 있어서, 만성염(chronic inflammation)을 예방하거나 감쇠시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제15항에 있어서, 만성염은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제6항에 있어서, 만성염(chronic inflammation)을 예방하거나 감쇠시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제17항에 있어서, 만성염은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
젱1항 내지 제5항, 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.