KR100222274B1 - 결합되지 않은 mpl 수용체를 사용하여 혈소판 생산을 자극하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
결합되지 않은 mpl 수용체를 사용하여 혈소판 생산을 자극하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
혈소판 증가 유효량의 결합되지 않은, 바람직하게는 용해성인 MPL수용체를 포유류에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 혈소판의 개수를 증가시키기 위한 방법이 기재되어 있다.
Description
[발명의 명칭]
결합되지 않은 MPL 수용체를 사용하여 혈소판 생산을 자극하기 위한 조성물 및 방법
[발명의 배경]
본 발명은 세포, 특히 거핵구 및 혈소판을 자극 및 생장시키는 것에 관한 것이고, 특히 거핵구를 혈소판으로 분화시키기 위한 유도물질로서 소위 MPL수용체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체내에서 혈소판 생산을 유발할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
[발명의 배경]
본 발명에는 최소한 두 개의 넓은 분야의 연구가 관련된다. 첫째는 거핵구로부터 혈소판의 발육과 생산에 관한 것이고, 두 번째는 이후 MPL수용체로 불리는 성장인자 수용체 계열의 폴리펩티드 멤버에 관한 것이다. 이들 각 분야의 연구를 하기에 요약한다.
[A. 거핵구로부터 혈소판의 생산]
혈액의 혈소판은 출혈의 방지 및 혈액 응고에 중요한 순환 세포이다. 거핵구는 혈소판의 세포성 공급원으로서 모든 조혈 세포 계통의 근원인 보통이 골수 전구 세포로부터 발생한다. 이러한 통상의 전구 세포는 다능성 간세포(stem cell) 또는 PPSC로 알려져 있다.
거핵구 전구 세포의 분류는 적절한 성장 인자에 응답하여 시험관내 배양 시스템에서 나타나는 거핵구(MK)콜로니의 발현 시기 및 크기를 기초하여 정의되었다. 파열(burst)형성 유니트 거핵구(BFU-MK)는 가장 원시적인 거핵구 전구 세포이다. BFU-MK는 궁극적으로 보다 분화된 MK전구 세포인 다수의 콜로니 형성 유니트 거핵구(CFU-MK)를 생산하는 것으로 추정된다.
MK가 분화됨에 따라서 MK 세포는 유사분열할 능력을 잃지만, 핵내배가 능력을 얻는다. 핵내배가는 세포 분열이 없을 때 세포에서 생기는 핵분열 현상이다. 핵내배가는 궁극적으로 배추체 MK를 유발한다. 이어 MK가 성숙되면 혈소판을 특성화하는 세포질 소기간과 막 성분을 습득하게 된다.
혈소판은 MK물리적 단편화의 결과인 것으로 제시된 잘 정의되지 않은 방법에 의해 또는 기타 메카니즘에 의해 성숙 MK로부터 생산된다. 거핵구내의 광법위한 막 구조를 관찰하면 혈소판 형성의 전형을 보여주는데, 여기서 분획막 시스템이 세포체내에서 초기 혈소판의 윤곽을 나타낸다. 혈소판 형성의 다른 전형은 골수 및/또는 폐에서 혈류압으로 인하여 혈소판이 파괴되는 것으로 인하여 거핵구가 혈소판-크기의 간격으로 수축된 긴 세포질 과정을 형성한다는 관찰로부터 발전된 것이다. 이들 세포질 과정은 혈소판 형성에서 이들의 추측되는 전구물질 역할을 반영하여 벡커(Becker) 및 드브루인(Debruyn)에 의해 전혈소판(proplatelet)으로 명명되었다. 참조. Becker and Debuyn, Amer. J. Anat. 145 : 183 (1976).
제1도는 거핵구 및 혈소판 발육에 관련된 다양한 전구 세포의 개략도이다. 도면의 가장 좌측에 있는 세포는 PPSC로 생각될 수 있고 또 도면의 PPSC의 우측에 있는 추가의 세포는 BFU-MK, 이어 CFU-MK로 생각된다. 도면에서 PPSC의 바로 우측에 위치하는 핵내유사분열되는 세포가 성숙 거핵구 세포이다. 핵내 유사분열의 결과로서, 이 세포는 배수체로 되었다. 우측에 있는 다음 구조는 성숙 거핵구 세포의 배수체 핵으로부터 발생하는 혈소판 크기의 간격으로 수축된 긴 세포질 과정을 포함한다.
도면의 가장 우측에는 신속하게 진행하는 거핵구 세포에서 세포질 과정의 단편화에 의해 생산된 다수의 혈소판이 도시되어 있다.
상술한 거핵구 성숙 및 혈소판 생산에 관한 선행 기술문헌을 이하에 나타낸다 :
1. Williams, N. and Levine, R.F., British Journal of Haematology 52 : 173-180(1982).
2. Levin, J., Molecular Biolhy and Differentiation of Meagakaryocytes, pub. Wiley-Liss, Ic. : 1-10(1990).
3. Gewirtz, A.M., The Biology of Hematopoiesis, pub. Wiley-Liss, Inc.:123-132(1990).
4. Han, Z. C., et al., Int. J. Hematol. 54:3-14(1991).
5. Nieuwenhuis, H.K. and Sixma, J., New Eng. J.of Med. 327: 1812-1813(1992).
6. Long, M., Stem Cells 11: 33-40 (1993).
[B. 혈소판 형성의 조절]
많은 실험실에서 이루어진 많은 데이터를 보면 혈소판 생산은 체액성 인자에 의해 조절됨을 나타낸다. 이 생물학적 과정의 복잡성은 처음에는 이해되지 않았지만 현재로는 다수의 사람의 성장인자가 이러한 능력을 갖고 있는 것으로 이해되고 있다.
거핵구 조절은 다수의 세포 수준에서 생긴다. 다수의 사이토카인 세포 증식 인자는 전구 세포 풀을 확장시키는 것에 의해 혈소판 생산을 증대시킨다. 제2군의 체액성 성장 인자는 보다 분화된 세포에 작용하여 핵내배가를 증진시키는 성숙 인자로 제공된다. 또한 이들 과정들을 조절하는 2개의 독자적인 바이오피드백 루프(Bilfeedback loop)가 존재하는 것으로 보여진다.
일부 계통 비특이적인 조혈 성장인자는 MK 성숙에 중요한 역할을 발휘한다. 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-3(IL-3), IL-6, IL-11, 백혈병 억제 인자(LIF), 및 에리쓰로포이에틴(EPO) 각각은 MK 크기, 개수 또는 배수체서에 대한 이들의 효과로 축정된 바와 같이 시험관내에서 사람의 MK 성숙을 증진시킨다. LIF, IL-6 및 IL-11의 MK 성숙 효과는 부분적(LIF및 IL-6)이거나 또는 전체적(IL-11)으로 IL-3의 효과에 부가적이다. 이러한 데이터는 생체내에서 MK성숙을 증진시키기 위해 사이토카인의 조합이 필요할 수 있음을 제시한다.
거핵구 및 혈수판 생산의 조절과 관련한 선행 기술 문헌을 이하에 나타낸다 :
7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13 : 75-86(1987).
8. Mruphy, M. J., Hematology/Oncology Cilnice of North America 3 (3) : 465-478(1988).
9. Hoffman, R., Blood 74 (4) : 1196-1212 (1989).
10. Mazur, E.M. and Cohen, J.L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3) : 250-256 (1989).
11. Gewirtz, A. M. and Calabretta, B., Int. J. Cell Cloning 8 : 267-276 (1990).
12. Williams, N., Progress in Grwoth Factor Research 2 : 81-95 (1990).
13. Gordon, M.S. and Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992).
14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21 : 372-281 (1993).
15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21 : 1295-1304 (1993).
[C. MPL 수용체]
골수증식성 백혈병 바이러스(MPLV)는 감염된 포유류에서 급성 백혈병을 유발하는 쥐의 복제-결함성 레트로바이러스이다. MPLV로 표현되는 유전자는 GM-CSF, G-CSF 및 EPO에 대한 수용체를 비롯한 사이토카인 수용체계에 관련된 서열에 융합된 바이러스의 레트로바이러스성 외피(또는 외부 단백질 코팅)를 코드화하는 일부의 유전자로 구성됨이 밝혀졌다.
상술한 MPLV유전자의 발현은 다양한 유형의 쥐의 전구 세포가 증식 및 말단 성숙에 대해 독립적인 성장 인자를 습득하도록 유발하는 생물학적 특성을 갖는다. 더구나, 골수 세포의 일부 배양물은 거핵구에 함유된 MPLV에 의해 급성으로 형질 전환되는데 이는 MPLV유전자와 거핵구 성장 및 분화 사이의 연관성을 제시한다.
최근 MPLV바이러스 유전자(이후, v-MPL로 칭함)는 포유류 세포에서 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 이를 이후 세포성 MPL유전자(또는 c-MPL)로 칭한다. v-MPL-유도된 탐침을 사용하여 사람의 c-MPL유전자에 상응하는 cDNA를 클로닝하였다. 참조. PCT공개출원 WO 92/07074 (1992년 4월 30일 공개 : 이후 기술함). 서열분석은 c-MPL유전자 산물에 의해 코드화된 단백질이 상동 v-MPL유전자 산물과 마찬가지로 고도로 보존되는 사이 토카인 수용체 상과에 속한다는 것을 나타내었다.
세포성 유전자, c-MPL은 정상적인 마우스로부터 취득한 골수, 비장 및 태아 간에서 그의 발현의 노던 블로트 분석법으로 발견되지만, 다른 조직에서는 발견되지 않는 관찰을 기초로 할 때 조혈작용에 기능적인 역할을 담당하는 것으로 생각된다. 특히 c-MPL은 거핵구상에서 발현된다. 사람의 세포성 유전자인 사람의 c-MPL은 정제된 거핵구, 혈소판 및 CD34 항원을 발현하는 기타 세포에서 발현되며, 이는 c-MPL이 초기 조혈작용 전구 세포라는 것을 지시한다. 또한 CD34 양성 세포를 c-MPL mRNA에 대해 안티센스인 합성 올리고데옥시튜크레오타이드에 노출시키면 CFU-MK거핵구 전구 세포의 콜로니 형성능을 억제하지만 적혈구 또는 과립상 대식세포 전구 세포에 대해서는 아무런 효과를 갖지 않는다.
총괄해서, 상술한 데이터와 관찰은 c-MPL-코드화된 단백질이 거핵구 생산을 특이적으로 조절하는 사이토카인에 대한 수용체일 수 있음을 제시한다. 다시 말해, c-MPL은 수용체를 활성화시키는 리간드에 결합되는 세포 표면 수용체(이후, MPL수용체로 칭함)를 코드화 하여 거핵구 생산을 유발하는 것으로 보여진다.
PCT특허 공개 WO92/07074호는 사람과 쥐로부터 취한 c-MPL유전자에 의해 생산된 단백질의 서열에 관한 것이다. 상술한 바와 같이, 수용체일 것으로 생각되는 이 유전자산물은 적어도 3개의 일반적 영역으로 구성된다 : 세포외 영역, 막내외 영역 및 세포내(또는 세포질)영역. 이들 영역은 서로 부착되어 완전한 MPL수용체를 구성한다. 이 PCT공개문헌은 성숙 c-MPL단백질의 세포의 영역에 실질적으로 상응하는 용해성 형태의 수용체를 언급하고 있다. 세포내 영역은 막내외 영역을 통하여 단백질의 세포외 영역에 부착되면 전체 단백질 물질이 응집되어 불용성으로 되는 소수성 영역을 함유한다. 한편, c-MPL유전자 산물의 세포외 영역이 막내외 영역과 세포내 영역으로부터 분리되면, 용해성으로 되므로 이 단백질의 세포외 형태는 용해성 형태의 수용체로 칭한다.
현재 많은 연구자들은 c-MPL수용체에 특징적으로 결합되는 리간드를 단리하고 특징화는 데 주력하고 있다. 그러한 리간드는 성숙 거핵구 및/또는 혈소판의 생산을 자극할 것으로 기대하고 있다. 그러나 여태까지 아무도 그러한 리간드의 정제나 최종 구조를 보고한 사람이 없었다. 한편, MPL수용체(즉, 완전 c-MPL유전자 산물)에 관련한 종래 기술문헌에 따르면, 용해성 형태의 MPL수용체는 순환하는 유리 MPL리간드에 결합되어 거핵구 및/또는 혈소판의 형성을 억제할 것으로 기대하였다.
상술한 v-MPL 및 c-MPL수용체 및 유전자에 관련한 선행 기술문헌을 이하에 나타낸다 :
16. Wendilng, F., et., Leukemia 3 (7) : 475-480 (1989).
17. Wendilng, F., et al., Blood 73 (5) : 1161-1167 (1989).
18. Souyri,M. et al., Cell 63 : 1137-1147 (1990).
19. Vigon, I., et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5640-5644 (1992).
20. Skoda, R.C, et al., The EMBO Journal 12 (7) : 2645-2653 (1993).
21. Ogawa, M. Blood 81 (11) : 2844-2853 (1993).
22. Methia, N., et al., Blood 82 (5) : 1395-1401 (1993).
23. Wendilng, F., et al., Blood 80 : 246a (1989).
[D. 혈소판 생산을 자극할 수 있는 물질의 필요성]
최근 북미, 서유럽 및 일본등지의 의료기관에서는 혈소판 수혈이 증가일로에 있는 것이 보고되고 있다. Gordon, M. S. 및 Hoffman, R., Blood 80 (2) : 302-307 (1992) 참조. 이러한 혈소판 수혈의 증가는 크게는 의료 기술의 진보와 심장수술 및 골수, 심장 및 간이식과 같은 기술의 접근에 기인한 것으로 보인다. 암 환자 및 HIV-1 환자에 대한 치료를 실시하기 위한 수단으로서 투약량을 강화하는 것은 혈소판 공급의 필요성을 더욱 가중시켜왔다.
혈소판 사용은 동종면역처리 뿐만 아니라 많은 혈액에 의한 전염병의 전달가능성을 갖고 있다. 더구나 정제된 혈소판의 생산은 값비싸고 아주 힘들기 때문에 이러한 혈소판의 사용증가는 전체 의료 비용을 증가시킨다. 그 결과, 사람에 사용하기 위한 혈소판을 제조하기 위한 새로운 개선된 방법이 절실히 필요하게 되었다.
혈소판 생산을 향상시키기 위한 선행 기술 수법을 이하에 기술한다 :
미국 특허 5,032,396호는 인터루킨-7(IL-7)이 혈소판 생산을 자극할 수 있다고 보고하고 있다. 인터루킨-7은 임파구생성인자-1로 공지된 것으로 골수에서 B- 및 T-세포 전구물질의 생장을 자극할 수 있는 임파구생성 성장인자이다. 1988년 10월 19일 출원되어 공개된 PCT출원 번호 88/03747호 및 1988년 10월 24일 출원된 유럽특허 출원 번호 88309977.2호에는 DNA, 벡터 및 재조합 DNA수법에 의해 포유류 IL-7 단백질을 생산하기 위한 관련 방법이 기재되어 있다. 미국 특허에 제시된 데이터는 IL-7이 보통의 치사량 이하로 조사된 마우스에서 순환성 혈소판을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
미국 특허 5,087,448호에는 포유류를 인터루킨-6으로 처리하는 것에 의해 포유류에서 거핵구 및 혈소판이 증식하도록 자극될 수 있다고 기재되어 있다. 사람의 제조합성 인터루킨-6은 다수배의 생물학적 활성을 갖는 26,000 분자량의 당단백질이다. 상기 특허에 제시된 데이터는 IL-6이 시험관내에서 거핵구의 콜로니를 증가시키는 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
그러나 상술한 어떤 특허도 본 발명에 포함되는 MPL수용체에 관하여 언급하지 않았다.
상술한 기술 내용에도 불구하고, 포유류에서 거핵구 및/또는 혈소판의 새로운 자극물질이 절실히 요청되고 있는 실정이다.
[발명의 개요]
본 발명의 목적은 거핵구 및/또는 혈소판 생산을 필요로 하는 포유류의 생체 내에서 거핵구 및/또는 혈소판의 생산을 자극하는 수단을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈소판 결핍증 치료가 필요한 사람과 같은 포유류에서 혈소판 결핍증을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람과 같은 포유류에서 혈소판 결핍증을 처리하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
상술한 본 발명의 목적과 그외의 목적은 이후에 자세히 기술한 바와 같이 결합되지 않는 MPL수용체(이하에 정의됨)를 포유류에 투여함으로써 사람에게 혈소판의 수를 증가시키는 본 발명자에 의한 발견 의해 달성되었다. 본 발명은 또한 약제적으로 허용되는 한 개 이상의 희석제, 담체 또는 부형제와 혼합된 유효량의 결합되지 않는 MPL수용체를 포함하는 혈소판 생산을 유발하는 조성물 뿐만 아니라 포유류에서 혈소판 생산을 유발하고 향상시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 결합되지 않은 MPL수용체를 사용하는 방법도 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
도면을 참조하면 본 발명의 수많은 특징과 이점을 분명하게 할 수 있을 것이다 :
제1도는 거핵구 및 혈소판의 발육과 성숙을 도시하는 개략도이다.
제2도는 MPL-P(사람) 및 Mpl(쥐)의 영역을 개략적으로 비교한 것을 도시한다. 추가로, 용해성 형태의 수용체의 예도 도시한다 (Mpl-S).
제3도는 용해성 MPC수용체(MPC-X)를 거핵구 배양액에 부가하면 전혈소판 형성을 향상시키는 것을 예시하는 데이터를 도시한다.
제4도는 마우스 생체내에서 혈소판 개수에 대한 MPL-X의 효과를 도시하는 데이터를 나타낸다.
제5도는 마우스 생체내에서 백혈수 세포(WBC)갯수에 대한 MPL-X의 효과를 도시하는 데이터를 나타낸다.
제6도는 마우스 생체내에서 적혈수 세포(RBC)갯수에 대한 MPL-X의 효과를 도시하는 데이터를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 부가적 특징과 이점은 본 발명의 실시를 상세하게 설명하는 이하의 상세한 설명을 참조하면 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명은 결합되지 않은 형태의 MPL수용체가 포유류의 생체내에서 혈소판 개수증가를 자극시킬 수 있다는 예기치 못한 발견을 기초로 한다. 이는 거핵구가 혈소판으로 단편화되는 비율 증가에 기인한 것으로 생각된다. MPL수용체가 거핵구-세포질 형성에 어느정도 관련이 있을 것으로 전부터 예상되었지만, 이 기술에서의 이해 정도는 이 수용체가 거핵구 세포에 결합될 때, 이 수용체는 거핵구를 성숙시키거나 및/또는 혈소판을 생산하게 하는 리간드에 의한 자극을 필요로 한다는 것이었다. 상술한 가설을 기초하면, 세포 표면에 부착되지 않는 MPL수용체(즉, "결합되지 않은 MPL수용체")는 세포에 결합된 MPL수용체와 리간드를 두고 경쟁할 것이고, 따라서 세포가 거핵구와 펼소판을 생산하도록 통상 자극하는 리간드를 제거함으로써 세포는 거핵구와 혈소판을 생산하지 못하는 최종 효과를 얻을 것이라는 것이 논리적인 예상이었다.
그러나, 본 발명자들은 상술한 예상 결과와는 정반대 결과가 실질적으로 관찰됨을 발견하였다. 즉, 포유류 생체내 실험에서, 결합되지 않은 MPL수용체는 거핵구 및 혈소판의 생산을 향상시키는 효과를 갖는다는 것이다.
특정 메카니즘이나 작용이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 상술한 효과를 설명할 수 있는 가설을 설정하였다. 그 가설은 통상 결합된 MPL수용체를 자극하는 리간드가 덜 성숙한 세포(예컨대 PPSC, BFU-MK, CFU-MK)로부터 성숙 거핵구를 생산하지만 일단 이들 성숙 거핵구가 생산되면 전혈소판을 형성하기 위해 리간드가 제거되어야한다는 것이다. 리간드가 성숙 거핵구로부터 제거되지 않는다면, 그 거핵구는 혈소판을 생산하기보다는 성숙 형태로 잔류한다.
상술한 가설을 전형으로 이용하여, 결합되지 않은 MPL수용체를 투여하면, 성숙 거핵구가 전혈소판을 형성한 다음 혈소판으로 단편화되도록 작용할 것이다. 그와 동시에, 결합되지 않는 MPL수용체에 의해 MPL리간드를 제거하면 부가적인 성숙 거핵구의 형성을 억제할 것이다. 이 가정이 정확하다면, 리간드 및 결합되지 않는 MPL수용체 모두를 투여하여 과량의 혈소판이 형성되었다 하더라도 이러한 투여는 성숙 거핵구의 생산뿐만 아니라 성숙 거핵구로부터 혈소판의 생산을 자극할 것이라는 결론에 도달하게될 것이다. 리간드를 투여한 다음 결합되지 않은 수용체를 순차적으로 투여하면 그 효과를 더욱 더 향상시킬 수 있을 것이다. 어떤 경우든, 본 발명자들은 이 발견이 혈소판 형성 및 MPL수용체/리간드 활성에 관한 선행기술에서는 전혀 예상치 못했던 것이라고 믿고 있다.
[정의]
이하 정의는 첨부한 특허청구 범위에서 주요 용어와 구절의 의미를 설명한다.
"혈소판의 개수를 증가시킨다"는 것은 관련된 특정 포유류에서 혈소판의 개수가 보통 범위의 혈소판 개수를 훨씬 상회한다는 것을 의미한다. 혈소판 개수의 증가는 시간 의존적 방식으로 일어날 수 있고, 또 증가한 다음 일정하게 되거나 또는 감소하거나, 또는 일정한 등의 주기적으로 일어날 수 있다.
예컨대 제4도를 참조하면, 혈소판 개수의 증가에서는 적어도 3가지 주기, 즉 약 7 내지 8일에 생기는 제1 주기, 19 내기 20일에 생기는 보다 증가된 제2 주기 및 약 28일 내지 29일 사이에 생기는 제3 주기가 있음을 알 수 있다. 이들 주기는 특정 모델 시스템의 몇 개 마우스에서 생긴 것이고 또 다른 포유류계 또는 모델에서는 2배 이상이거나 아닐 수도 있다.
바람직하게는, 혈소판 개수의 증가는 보통 범위의 약 40 내지 50이상일 수 있지만, 보통의 평균적인 혈소판 개수에 비하여 약 2배까지 증가하는 것과 같이 현저히 높을 수도 있다. 기억해야 할 것은 5내 10와 같은 임의의 중요 증가는 주어진 상황에 임상적으로 충분해야한다는 것이다. 혈소판 개수의 증가는 다른 변수 중에서도 포유류에 투여된 결합되지 않은 MPL수용체의 튜여량과 관련이 있으므로 다양한 범위에 걸쳐 변형시킬 수 있다.
혈소판의 개수는 다양한 표준 수법에 의해 측정될 수 있다. 예시할 수 있는 1가지 방법은 시판중인 혈액 세포 계수기를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 기기는 입자를 세어이들을 주로 크기를 기초로 해서 세포 유형별로 분류한다. Sysmex또는 코울터 카운터와 같은 기기를 예로 들 수 있다. 이러한 방법의 설명에 관해서는 Bloom, A.L. 및 Thomas, K. P.(eds.), Haemostasis and Thrombosis (Second Edition) Churchill Livingstone : 936 (1987)참조.
처리될 "포유류"는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 사람이다. 처리될 수 있는 기타 포유류는 개, 고양이, 소, 말 등을 포함한다. 특히 2개종으로부터 취한 MPL수용체사이에 높은 상동성(예컨대 약 80이상)이 있으면, 종간 활성(즉, 한 종과 다른 종 사이의 MPL수용체의 활성)이 예상되며, 이는 본 발명의 다른 특징이기도 한다. 예컨대 쥐의 결합되지 않은 MPL수용체는 사람에서 혈소판의 개수를 증가시키기 위해 사용될 수 있을 것이다. 그러나 처리될 종과 동일한 종의 MPL수용체를 사용하면 최대의 활성을 이룰 수 있을 것이라고 예상된다.
"투여"는 통상의 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대 큰 알약 주입, 연속 주사, 이식물로부터 지속적으로 방출되거나, 또는 다른 적합한 수법을 이용할 수 있다. 정맥 투여법이 바람직하다. 결합되지 않은 MPL수용체의 다수회 투여회 투여도 고려할 수 있다.
"혈소판 개수 증가 유효량"이라는 것은 특정 포유류에서 혈소판의 개수를 현저히 증가시키기에 중분한 양을 의미한다. 필요에 따라, 이 양은 과도한 시험없이 예비 시험으로 적합하게 결정될 수 있고 또 처리될 포유류에서 필요로 하는 증가 수준에 따라 다를 수 있다. 일반적으로 1내지 100//일, 바람직하게는 10내지 100//일을 1 내지 20일간 투여하면 치료적으로 현저한 생물학적 효과를 유발할 수 있을 것으로 기대된다. 결합되지 않은 MPL수용체는 일정 기간 동안 매일 투여되거나, 첫날에 한꺼번에 투여된 다음 투여 없이 하루 이상 지속하는 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 10//일의 큰 알약 주사는 혈소판 생산의 자극제로서 3일 간격으로 주입될 수 있을 것이다.
결합되지 않은 MPL수용체 이외에, 본 발명의 MPL수용체와 동시에 또는 순차적으로 한 개 이상의 부가적인 림포카인 또는 사이토카인이 투여될 수 있다. 이러한 림포카인 및/또는 사이토카인은 예컨대 IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 콜로니자극 인자-1(CSF-1), GM-CSF, 과립구 콜로니 자극 인자-1(G-CSF), EPO,인터페론-알파(IFN-알파), IFN-베타 또는 IFN-감마일 수 있다. MPL리간드를 포함하는 것도 유리할 수 있다. 이들은 결합되지 않는 MPL수용체와 부가적으로 또는 상승작용적으로 작용할 수 있다.
"결합되지 않은 MPL수용체"라는 것은 보통의 세포 성분, 특히 세포 막으로부터 분리된 MPL수용체 분자를 의미한다. 바람직하게는, 결합되지 않은 수용체는 소위 용해성 형태의 수용체라고도 불린다. 용해성 형태의 MPL수용체는 당업자에게 공지된 임의 형태이거나 또는 당업자에 의해 개발될 수 있다. 일반적으로 용해성 형태의 수용체는 수용체 분자의 막내외 영역을 갖지 않는다.
MPL수용체의 막내외 영역은 소수성이므로 본 발명의 목적을 위해서는 MPL수용체의 이 영역 모두는 실질적으로 제거되는 것이 바람직하다고 알려져있다. MPL수용체의 세포내 영역은 불용성으로 간주되진 않지만, 이 영역은 본 발명의 목적을 위하여 MPL수용체로부터 실질적으로 제거되는 것이 바람직하다.
요컨대, "용해성"이라는 용어는 물질이 세포에 결합되어 있지 않은 것을 의미하고, 바람직하게는 전체 길이의 분자의 막내외 영역 또는 세포내 영역을 실질적으로 포함하지 않는다(즉, 약 10 잔기 보다 적다). 용해성 MPL수용체(이후, MPL-X로 칭함)는 수용액 뿐만 아니라 혈액, 혈청, 타액, 뇌하수액, 요 등과 같은 체액에 용해될 수 있다. 수용체의 세포내 영역에 직접 부착된 MPL수용체의 세포외 영역을 사용할 수도 있다. 여기서 사용된 "MPL수용체"는 바랍직하게는 바이러스로부터 유도된 형태의 유전자(즉, v-MPL)라기 보다는 수용체의 세포성 형태(c-MPL유전자 산물)을 지칭한다.
무손상 MPL수용체와 그의 성분 영역은 1992년 4월 30일 공개된 PCT공개 WO92/07074호에 자세하게 기재되어 있다. 쥐의 MPL수용체에 대해서는 Vigon일행, EMBO8 : 2607-2615 (1993)에 자세하게 기재되어 있다. 그밖에, 본 명세서에 기재된 SEQ. ID NOS. 1 및 2는 각기 주의 MPL수용체 유전자 및 단백질의 전체 길이 서열을 나타내는 반면에, SEQ. ID NOS. 3 및 4는 각기 사람의 MPL수용체 유전자 및 단백질의 전체 길이 서열을 나타낸다.
쥐의 서열(SEQ. ID NO. 2)에서, 그 영역은 다음과 같다 :
시그널 펩티드 aa 1 (Met) 내지 aa 18 (Ser).
세포외 aa 19 (Gin) 내지 aa 483 (Trp).
막내외 aa 484 (Ile) 내지 aa 505 (Leu).
세포질 aa 506 (Lys) 내지 aa 626 (Pro).
쥐의 서열(SEQ. ID NO. 2)에서, 바람직한 일부 용해성 서열은 다음과 같다 :
aa 1910 aa) 내지 aa 483 (10 aa), 및 aa 506(10 aa) 내지 aa 626 (10 aa)에 융합된 aa 19(10 aa) 내지 aa 483 (10 aa).
사람의 서열은 적어도 2가지 형태, 즉 MPL-P및 MPL-K를 갖는다고 알려져있다. P형태는 SEQ.ID NOS. 3 및 4에서 각기 도시한 아미노산 및 유전자 서열을 갖는다. 사람의 MPL-P서열에서, 영역은 다음과 같다 :
시그널 펩티드 aa 1 (Met) 내지 aa 25 (Ser).
세포외 aa 26 (Gin) 내지 aa 491 (Trp).
막내외 aa 492 (Ile) 내지 aa 513 (Leu).
세포질 aa 614 (Arg) 내지 aa 635 (Pro).
사람의 서열(SEQ. ID NO. 4)에서, 일부 바람직한 용해성 서열은 다음과 같다 :
aa 19(10 aa) 내지 aa 483 (10 aa), 및 aa 506(10 aa) 내지 aa 626 (10 aa)에 융합된 aa 19(10 aa) 내지 aa 483 (10 aa).
제2도를 참조하면, 용해성 형태의 수용체의 한가지 예가 도시되어 있다(Mpl-S). 사람 또는 쥐의 서열중 어느 하나로부터 사이토카인 수용체 영역 ()(CRD)의 큰 부분을 제거할 수 있고 또 여전히 혈소판 향상 활성을 갖는 용해성 형태의 수용체를 갖는다. 따라서 본 발명자들은 CRD영역의 실질적으로 전부가 MPL 수용체로부터 제거된 용해성 수용체를 사용하여 환자에서 혈소판 생산을 향상시키려는 착안을 하였다.
상기 예시한 바와 같이, 공지된 MPL서열 및 당업계의 선행 기술 또는 통상의 실험 방법을 기초로 하여 당업자는 본 발명의 내용을 참조하여 사람이나 쥐의 결합되지 않는 MPL수용체 계열을 용이하게 수득할 수 있는 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물에는 전술한 단백질의 다양한 생물학적 활성 유사물질이 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에서 용어 "MPL수용체"는 천연의 포유류 MPL수용체에 대한 실질적인 아미노산 서열 정의와 표준 생물시험(예컨대 수용체 결합 친화성 및 유사 단백질의 항체 결합 친화성의 측정)으로 측정된 질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 특히 바람직하게는 결합되지 않은 MPL수용체의 유사체는 단백질의 용해성 형태를 기본으로 한다. MPL수용체는 페길화된 형태이거나 또는 IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF, EPO등과 같은 기타 사이토카인 단백질 또는 단편에 융합된 형태일 수 있다.
본 발명의 포유류 MPL수용체를 생성하는 바람직한 방법은 포유류 세포에서 제조합 발현을 포함하지만, 이러한 단백질은 곤충 세포, 효모, 세균 또는 적합한 프로모터의 조절하에 있는 기타 세포를 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 세균, 진균, 효모 및 포유류 세포숙주의 사용과 관련한 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 Powels et al., Cloning Vectors : A Labroatory Manual (Elsevier New York, 1985)에 의해 기재되어 있다. 재조합 단백질을 발현시키기기 위해서 다양한 포유류 세포 배양계가 사용될 수 있다.
포유류 발현계의 예로 글루즈만(Gluman)이 Cell 23 : 175 (1981)에 보고한 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 및 C127, 3T3, CHO, 293, HeLa및 BHK세포주와 같은 양립성 벡터를 발현할 수 있는 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 보제 기점, 적합한 프로모터 및 상승제와 같은 전사되지 않는 요소 및 기타 5`또는 3` 측 비전사 서열 및 필요한 리보솜 결합 부위와 같은 5` 또는 3`비전사 서열 ; 포릴아데닐화 부위 ; 스플라이스 공여체 및 수용체 서열 ; 및 종결 서열을 포함할 수 있다. SV 40 바이러스 게놈으로부터 유도된 SV40기점, 초기 프로모터, 상승제, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 갖는 DNA서열은 이형 DNA서열을 발현시키는데 필요한 유전자 요소를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 포유류 MPL수용체를 생산하기 위한 포유류의 높은 발현 벡터의 사용에 관한 부가적 설명은 이하에 제공된 바와 같다. 벡터의 예는 오카야마 및 버그, Mol. Cell. Biol. 3 : 280 (1983) : 코스만 일행의 Nature 312 : 768 (1984) : 코스칸 일행의 Mol. Immunol. 23 : 935 (1986) : 및 클라크 일해의 미국 특허 4,675,285호에 기재된 바와 같이 작성될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 처리될 조건은 일반적으로 혈소판 결핍상태 또는 장래에 혈소판 결핍이 예상되는 경우(예컨대, 예정된 수술 등으로 인하여)를 포함한다. 혈소판 결핍증의 일반적 용어는 혈소판감소증(thrombocytopenia)이므로 본 발명의 방법 및 조성물은 일반적으로 혈소판 감소증을 치료하는데 유용하다.
혈소판 감소증은 화학요법, 방사선 요법, 수술, 사고로 인한 혈액 손실 및 기타 특정질병 상태를 비롯한 다양한 이유로 존재할 수 있다. 혈소판 감소증을 포함하고 본 발명에 따라 처리될 수 있는 특정 질병 상태의 예로는 재생불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소증 및 혈소판 감소증을 유발할 수 있는 기타 특정 전이성 암을 들 수 있다. AIDS에 대한 특정 치료는 혈소판 감소증(예컨대, AZT)을 유발할 수 있다. 특정 상처 치료 장애는 혈소판 숫자 증가로부터 혜택을 입을 수 있다.
예컨대 장래 수술로 인하여 예상되는 혈소판 결핍증에 관해서는, 혈소판을 필요로 하기 수일전 내지 수시간 전에 MPL수용체를 투여할 수 있다. 급성 상태의 경우, 예컨대 사고로 다량의 피를 손실하는 경우, MPL수용체를 혈액 또는 정제된 혈소판과 함께 투여할수 있다.
상술한 상황과 관련하여 투여된 결합되지 않은 MPL수용체의 특정 투여량은 다양한 변수, 예컨대 처리될 환자의 체중, 성별, 연령 및 일반적 상태 : 처리될 상태의 성질 : 투여 형태 : 및 상황의 긴급도 : 및 기타 변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 급한 상황에서는 투여량은 만성 상태나 혈소판 부족이 덜한 상태에 비하여 일반적으로 훨씬 다량이다.
본 발명의 조성물은 결합되지 않은 수용체가 용해성인 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 담체 물질은 주사용 물로서 일반적으로 포유류에 투여되기 위한 용액에 통상적인 기타 물질을 보충시킬 수 있다. 전형적으로, MPL수용체 치료는 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 조합된 정제 단백질을 포함하는 조성물 형태로 투여될 것이다. 천연의 완충 식염수 또는 형청 알부민과 혼합된 식염수가 적합한 희석제의 예이다. 바람직하게는, 제품은 적합한 부형제 용액(예컨대 수크로오스)를 희석제로 사용하여 동결건조 상태로 제형화 된다. 기타 표준 담체, 희석제 및 부형제도 필요에 따라 포함할 수 있다.
[실시예]
이하 실시예는 본 발명을 보다 자세하게 설명하기 위한 것이다. 부가적으로, 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 구체 예를 제공하지만 특별히 언급하지 않는 한 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다. 하기 실시예에 기재된 많은 수법에 대한 표준 방법 또는 적합한 대체되는 과정은 널리 알려진 분자 생물학 매뉴얼인 예컨대 샘브룩 일행의 "Molecular Cloning", 2판, 콜드 스프링 하버 라보라토리 프레스(1987) 및 아우수벨 일행 (편집)의 "Current Protocols in Molecular Bilolgy", Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990)에 제시되어 있다.
[실시예 1]
[MPL수용체를 코드화하는 핵산 서열의 단리]
쥐(Vigon et al. Oncogene 8 : 2607-2615 (1993) 및 (Skoda et al., EMBO)12 (7) : 2645-2653 (1993)) 및 사람(Vigon et al., DNAS 89 : 5640-5644 (1992))의 MPL수용체의 이소폼을 코드화하는 클론의 단리는 보고되어있다. 이들의 DNA서열은 쥐의 수용체에 대해서는 입수번호 X73677 및 222657로 또 사람의 MPL수용체의 K 및 P이 소폼에 대해서는 입수번호 M90102 및 M90103으로 진뱅크(GenBank)데이타 베이스로부터 구입할 수 있다. 비장, 골수, 태반 및 태아 간이 MPL에 대한 mRNA를 발현하는 모든 조직이라는 것도 또한 보고되어 있다. MPL을 발현하는 세포주는 HEL을 포함한다. 따라서 당업자라면 MPL을 코드화하는 클론을 단리하는 방법을 숙지하고 있을 것이다. 상술한 조직원 또는 세포주중의 어느 하나 또는 RNA의 노던 브럴트 분석 및 단백질의 웨스턴 블러트 분석에 의해 MPL을 발현하는 것으로 확인된 다른 공급원으로부터 cDNA를 생성할 수 있었다.
이 cDNA는 적합한 벡터에서 cDNA라이브러리를 작성하기 위한 원료로 작용한다. 이 라이브러리는 MPL유전자를 함유하는 세포를 확인하기 위해 핵산 탐침과 혼성시킴으로써 스크리닝한다. 이와다르게는, cDNA라이브러리는 항체를 사용하여 MPL 발현을 스크리닝할 수 있다. 이 항체는 MPL서열에 상응하는 합성 올리고-펩티드에 대하여 생성된다.
이 cDNA는 MPL유전자의 PCR증식용 주형으로 작용할 수 있다. 프라이머는 MPL유전자중의 서열로부터 선정하며 또 MPL의 클로닝과 발현을 보조하기 위한 추가의 서열을 포함시킬 수 있다.
[실시예 2]
[쥐의 용해성 MPL을 발현하기 위한 클론의 단리]
상기 확인된 MPL을 함유하는 클론 또는 MPL을 발현할 수 있는 다른 공급원으로부터 취득한 cDNA를 사용하고 PCR수법을 이용하여 용해성 MPL을 발현시키기 위한 클론을 수득한다. 쥐의 MPL을 PCR증식시키기 위한 프라이머는 다음 형태일 수 있다 :
5' 프라이머 : TAC AAG CTT GCC GTC ATC ATG CCC TCT TGG GCC CTC (SEQ. ID NO. 5) : 및 3'프라이머 : ACT TCT AGA CTA TCA TCA AGC AGT CTC GGA GCT GGA (SEQ. ID NO. 6)
1의 cDNA반응 혼합물, 5 피코몰의 상기한 올리고뉴클레이타이드, 10mM 트리스 HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 각 dNTP 및 1유닛의 Tag폴리머라제를 사용하여 PCR반응을 실시하였다. 94에서 30초 50에서 30초, 72에서 1분간 35주기 동안 증식시켰다. 한천 겔 전기영동법에 의해 DNA를 정제시키고 HIND및 XdaI를 사용하여 분해시킨 다음 HIND및 Xda으로 분해된 발현 벡터 pDSRα2에 결찰시켰다. 소망하는 삽입물을 함유하는 클론을 DNA서열 분석법에 의해 확인하였다.
[실시예 3]
[CHO 세포에서 쥐의 용해성 MPL의 발현]
발현 플라스미드 pDSRα2-MPL-X는 SEQ. ID NOS. 7 및 8에 도시된 쥐의 MPL아미노산을 코드화하는 서열을 함유한다. 이 플라스미드 수십을 인산 칼슘 매개된 형질감염에 의해 CHO세포에 도입하였다(Wigler et al., Cell 11 : 233 (1977)). 벡터로부터 디히드로 폴레이트 환원효소의 발현을 기초로 하여 개별 콜로니를 선정하였다. 용해성 MPL의 발현은 RNA 혼성법(Hunt et al., Exp. Hematol, 19 : 779 (1991)) 및 SEQ. ID 2의 아미노산 459(Gly)내지 475(Val)에 상응하는 합성 펩티드에 대하여 생성된 항체를 사용한 웨스턴 블러트법에 의해 조정되었다. 세포주 B.1-18은 상기 분석시험에서 양성이어서 다음 중식 시험에 사용하기 위해 선정하였다. 이 세포주를 30 nM 메토트렉세이트 (Mtx)에 결합시켜 MPL발현의 증식을 자극하였다. 200DMEM(비필수 아미노산(NEAA), 30 nM Mtx 및 5우태아 혈청 (FBS)(뉴욕 그랜드 아일랜드 소재 GIBCO로부터 구입한 시약)이 보충된 Ham`s F12(1:1))중의 2 X 10<SP>7</SP>세포로 로울러 병을 접종하였다. 3 내지 4일 후 증식되면, 배지를 20DMEM(Ham`s F12, NEAA, 30 nM Mtx, 무혈청)로 교체하였다. 6 내지 7일 후 조건하의 배지를 수집하고, 새로운 무혈청 배지로 교체하였다. 제2 및 제3수집물을 수거하였다.
[실시예 4]
[쥐의 용해성 MPL의 정제]
순차적 이온 교환 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 CHO 세포 조절된 배지로부터 쥐의 MPL 유전자 산물(m-MPL-X)의 제조합성 영역을 정제하였다. m-MPL-X를 함유하는 조정된 배지를 30,000 MW 컷오프 막(S10Y30, Amicon, Danvers, MA)를 사용한 한외여과에 의해 농축시키고 10 mM 트리스-HCl, pH8.5에 대하여 재여과하였다. 농축물을 Q-세파로오스, 패스트 플로우(뉴저지 피스카타웨이 소재의 파마시아 제품)칼럼에 걸고 10 mM 트리스-HCl(pH 8.5)을 사용하여 세척하며 동일한 완충액에서 0 M 내지 1.0 M NaCl의 직선 구배로 용출시켰다. 이 칼럼으로부터 수득한 분획을 정제된 m-MPL-X에 대하여 생성된 항혈청을 사용하는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블러팅에 의해 m-MPL-X에 대해 분석하였다. m-MPL-X를 함유하는 분획을 모으고 10mM 인산 나트륨, 0.01 mM CaCl<SB>2</SB>, pH 6.8에 대하여 재여과하고 히드록시아파타이트 칼럼(매사추세츠 말보르 세프라코르 소재의 HA-울트라겔 제품)에 적용하였다. 정제된 m-MPL-X를 함유하는 결합되지 않은 분획을 PBS로 희석시키고 멸균 여과시키며 또 0.10/의 최종 농도로 적합한 부피로 무균적으로 분산시켰다. 정제된 m-MPL-X를 -80에서 얼려 사용하기 전 까지 저장하였다.
리물루스 아메보사이트 결찰물 분석(매사추세츠 우드 홀에 소재하는 어소시에이트 어브 카페 코드, 인코포레이티드)을 실시하였고 최종 생성물은 파이로겐을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다(<0.004 EU/). 코마시 염색을 사용한 SDS-PAGE에 의해 20의 정제 m-MPL-X를 분석하면 분자량 64 KD을 갖는 싱글 밴드가 존재함이 밝혀졌다. 기타 단백질 밴드는 검출되지 않았다.
[실시예5]
[전혈소판 형성에 대한 MPL-X의 효과]
기니아 피그 거핵구를 정제하고 MPL-X(30/; 상술한 바와 같이 제조됨)를 사용하거나 또는 사용하지 않고 웰당 5000세포로 18시간 동안 배양하였다(96-웰 마이크로티터 플레이트). 기초 배지는 BSA(100/) 또는 10보통 사람의 헤파린 첨가된 프라즈마(AB공여자로부터 모음)가 보충된 이스코브(Iscove )배지였다. 배양한 후, 세포를 현미경으로 관찰하여 헌트 일행에 의해 기재된 바와 같이 혈소판 형성에 대해 평가하였다. Hunt, P.일행., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993) 및 Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304(1993)참조. 데이터는 반복 측정의 평균 +/- 표준 에러의 평균(SEM)으로 기록한다.
무혈청 배지 또는 헤파린첨가된 플라즈마에서 배양된 기니아 피그 거핵구는 18시간 배양된 후 전혈소판 형성을 나타내었다. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993) 및 Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304(1993)참조. 제3도에 도시한 바와 같이, MPL-X를 거핵구 배양물에 부가하면 많은 세포에서 전혈소판 형성을 현저히 증가시킨다. 이로부터 세포가 무혈청 조건하에서 배양되었는지 또는 헤파린 첨가된 프라즈마 존재하에서 배양되었는지를 알 수 있다.
[실시예6]
[생체내에서 전혈소판 형성에 대한 MPL-X의 효과]
MPL-X를 담체(PBS+0.2보통 Balb/c 마우스 혈청)에 넣어 100/또는 10/로 희석시켰다. 이어 100/의 소혈청 일부민(BSA)또는 가열 불활성화된 MPL-X(98; 15분)를 사용하였다. Balb/c 마우스(자성, 6 내지 8주령, 찰스 리버산)에 8시간 간격으로 0.5시험 용액을 매일 2회씩 42일간 피하주사하였다. 지시한 날에 메스 블레이드를 사용하여 작은 상처를 만들어 측미맥으로부터 출혈시켰다. 20 마리크로리터의 혈액을 수집하여 시스멕스 세포 분석기(Sysmex cell amalyzer: 일본 고베 TOA 메디칼 엘렉트로닉스)에 대하여 제조자가 추천한 희석제에 즉시 희석시켰다. 백혈구 세포(WBC), 적혈구 세포(RBC) 및 혈소판 개수를 측정하였다. 데이터를 샘플 +/- SEM의 지시된 개수의 평균으로 나타낸다.
혈소판 수준에 대한 MPL-X의 효과를 직접적을 측정하기 위해서, 단백질을 보통의 Balb/c 마우스에 매일 2회 주사하였다. 2개의 별도의 실험으로부터 수득한 데이터를 총괄해서 나타내었다. 실험 1에서는 군당 5마리의 마우스에 담체, 10/일 MPL-X 또는 100/일 MPL-X를 42일간 주입하였다. 실험 2에서는 군당 4마리의 마우스에 담체, 100/일 MPL-X, 100/일 가열 불활성화된 MPL-X 또는 100/일 BSA를 29일간 주입하였다. 동일한 시점으로부터 양쪽 실험으로 부터의 데이터를 수집할 때 마다 이들을 분석용으로 수록하였다(N=9,0,4,7 11, 18일; N=4 또는 5, 기타 날). 제4도에 도시한 바와 같이, 100/일 MPL-X를 주입하면 혈소판 개수에서 현저한 증가를 초래한다. 이 효과는 처리한지 4 내지 7일후 처음으로 나타났는데 혈소판 양은 보통 수준의 132에 도달하였다. MPL-X를 계속 투여할 때 11일째 까지 혈소판 개수가 정상으로 돌아갔지고, 이들은 다시 18일 때 까지 보통의 219까지 증가되었다. 처리한 지 20일 후, 혈소판 개수는 보통의 150로 떨어졌다. 42일째되는 날 이 실험을 끝냈을 때, 혈소판 개수는 보통의 130이었다. 제4도에 도시한 바와 같이, 10/일의 MPL-X, 100/일의 BSA또는 가열 불활성화된 MPL-X를 투여하면 혈소판 개수에 아무런 효과를 나타내지 않았다. MPL-X 투여는 기타 혈액 세포 변수에는 아무런 효과가 없었다. 제5도 및 제6도는 백혈구 세포수 및 적혈구 세포수를 기본한 데이터를 나타낸다.
이들 데이터를 MPL-X를 생체내에 투여하면 순환하는 혈소판의 현저한 증가를 초래한다는 것을 나타낸다. 이 반응은 약 7 내지 10주기로 나타날 수 있다. 어떤 때이건 다른 혈액 세포 변수를 전혀 영향을 받지 않았다.
본 발명을 상기한 일반적이고 바람직한 구체예로써 설명하였지만, 본 발명의 기술 내용을 참조하여 당업자는 다양한 변형을 가할 수 있을 것이다. 따라서 첨부한 특허청구 범위는 본 발명의 범위내에 드는 이러한 모든 변형을 포괄하는 것으로 이해되어 있다.
또한, 본 발명의 배경을 설명하기 위해, 특히 실제에 있어서 부가적인 상세한 설명을 제공하기 위해 인용된 문헌 및 기타 자료를 참고문헌으로 포함시키는 바이다.
[서열목록]
(1) 일반적 정보
(ⅰ) 출원인 : 최, 에스더 에스.
호콤, 마르타 엠.
헌트, 파멜라
니콜, 자넷 엘.
(ⅱ) 발명의 명칭: 혈소판 생산을 지극하기 위한 조성물 및 방법
(ⅲ) 서열 번호 : 8
(ⅳ) 주소 :
(A) 주소 : 암겐 인코포레이티드, 미국 특허 작업/RRC
(B) 스트리스트 : 1840 데하빌랜드 드라이브
(C) 시 : 싸우전드 오크스
(D) 주 : 캘리포니아
(F) 우편번호 : 91320-1789
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매질 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작용 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트제어 : PatentIn Release1.0, 버전1.25
(ⅵ) 현재 출원 데이터:
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(ⅸ) 원거리 통신 정보:
(A) 전화 : 805-447-4955
(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 2046 열기쌍
(B) 서열 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 불명
(D) 형태 : 불명
(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA
(ⅲ) 특징:
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 8...1888
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 1:
(2) SEQ ID NO: 2에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 626 아미노산
(B) 서열 형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 2:
(3) SEQ ID NO: 3에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 1908 염기쌍
(B) 서열 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 불명
(D) 형태 : 불명
(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA
(ⅲ) 특징:
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 1...1908
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 3:
(2) SEQ ID NO: 4에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 635 아미노산
(B) 서열 형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 4:
(2) SEQ ID NO: 5에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 36 염기쌍
(B) 서열 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 불명
(D) 형태 : 불명
(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 5:
(2) SEQ ID NO: 6에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 33 염기쌍
(B) 서열 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 불명
(D) 형태 : 불명
(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 6:
(2) SEQ ID NO: 7에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 1523 염기쌍
(B) 서열 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 불명
(D) 형태 : 불명
(ⅱ) 서열의 종류 : cDNA
(ⅲ) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 69...1514
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 7:
(2) SEQ ID NO: 8에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징:
(A) 서열 길이 : 482 아미노산
(B) 서열 형 : 아미노산
(D) 형태 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 서열 기술 : SEQ ID NO: 8:
Claims (2)
- 혈소판 증가량의 용해성 MPL수용체 및 이 수용체가 용해성인 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 상기 용해성 MPL 수용체가 (1) SEQ ID No. 2의 잔기 19(10 아미노산) 내지 잔기 483(10 아미노산) 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 (2) SEQ ID No. 4의 잔기 26(10 아미노산) 내지 잔기 491(아미노산) 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류에서 혈소판의 개수를 증가시키기 위한 조성물.
- 제1항에 있어서, 혈소판 증가량이 1//일 내지 100//일인 조성물.
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