KR0168866B1 - 푸린 유도체 및 글루타티온에 의해 안정화된 폴리헤모글로빈 - Google Patents
푸린 유도체 및 글루타티온에 의해 안정화된 폴리헤모글로빈 Download PDFInfo
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Abstract
헤모글로빈 제제는 과요오드산염-산화된 ATP(o-ATP)와 분자내 가교 결합하고 과요오드산염-산화된 아데노신(o-아데노신)과 분자간 가교 결합하여, 환원된 글루타티온(GSH)와 혼합된 정제 헤모글로빈(바람직하게는 소에서 유래)으로 이루어진다. 이 화합물은 (1) 혈관내에서 지속적으로 유지되며 혈장 용적을 유지할 수 있고, (2) 저 산소 친화력을 가지며 생리학적 산소 운반체로서 작용할 수 있고, (3) 혈관 확장 활성을 가지며 출혈 후의 혈관 수축을 감소시킬 수 있기 때문에 혈액 대용품으로서 유용하다.
Description
[발명의 명칭]
푸린 유도체 및 글루타티온에 의해 안정화된 폴리헤모글로빈
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 혈액 대용품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 다양한 종의 동물, 가능하게는 사람에 있어서의 심한 출혈 후에 생명을 유지하는데 효과적이며 무독성인 신규한 헤모글로빈 조성물에 관한 것이다.
[발명의 배경]
혈액은 모든 생체에 많은 기능을 부여한다. 그러나, 심한 출혈은 두 가지 주요 이유로 인해 생명을 위태롭게 만든다 :
(1) 순환혈 용적이 급감하면 조직 관류가 감소된다 (허혈증); 및
(2) 산소 전달량이 감소하면 조직 산소화가 손상된다 (저산소증). 순환계는 이러한 변화에 대해 혈관 수축으로 반응하고, 이는 허혈증 및 저산소증을 더욱 악화시킨다. 궁극적으로, 세포 대사 및 기능 전개가 변화되어, 쇼크 및 죽음에 이르게 된다.
본 명세서에서, 혈액 대용품은 혈액의 모든 기능을 대체할 수 있는 제제가 아니라, (a) 혈액 용적의 복원, (b) 산소 전달, 및 (c) 혈관 수축의 감소를 가능케 하는 응급 소생 유체를 의미한다. 명백하게, 이러한 유체는 박테리아 및 비루스와 같은 질병원 뿐만 아니라 독성 부작용도 없어야 한다.
[혈액 대용품으로서의 헤모글로빈]
지난 50여년간 혈액 대용품의 개발에 대한 노력이 헤모글로빈(Hb)에 집중되었는데, 그 이유는 헤모글로빈이 대기 공기로부터 충분한 산소를 추출해내어 생리학적 산소 운반체로서 작용할 수 있는 유일한 물질이기 때문이다. 또한, 헤모글로빈은 혈청 알부민과 동일한 콜로이드-삼투압을 나타내므로, 혈장 용적 팽창제로서 작용할 수 있다. 그러나, 그러한 노력은 인식되기까지 느린, 해결하기 어려운 많은 문제들로 인해 성공하지 못했다. 이러한 문제는 (1) (a) 환경 박테리아 내독소, (b) 기질 인지질 및 (c) 무-헴(non-heme) 단백질 및 펩티드로 인한 헤모글로빈의 오염에 의한 독성; (2) 조직으로의 산소 방출을 방해하는 용액 중 헤모글로빈의 높은 산소 친화성; (3) 일혈(extravasation)과 신속한 신장 분비 경향이 있는 Hb 분자의 불안정성; (4) met-Hb(비기능성 Hb) 및 유독한 산소 유리 라디칼을 생성하는, 헤모글로빈이 자동 산화되는 경향; 및 (5) 간염 및 AIDS와 같은 혈액 관련 질병을 전염시키는 혈액 부산물로서의 Hb의 능력을 포함한다.
지금까지 가장 먼저 인식된 문제는 독성 문제, 즉, 혈액의 혈관 내 응고를 활성화시키고 신장을 손상시키는 Hb 용액 일부에 대한 능력이다. 1960년대에 라비네르(Rabiner)는 그러한 독성이 Hb에 의한 것이라기 보다는 적혈구의 기질 (적혈구 막의 단편)에 의한 것이라는 견해를 보급시켰다. 그는 기질을 포함하지 않는 (stroma-free) 헤모글로빈의 필요성을 강조했다. 그러나, 이 용어는 수년 동안 모든 기질 원소를 전혀 포함하지 않는 헤모글로빈이 생산되지 않았다는 사실에 모순된다. 적혈구막의 독성 인자는 보통 적혈구의 세포질 측에 존재하는 아미노인지질 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 -세린(PS)으로서 확인 되었다 [엠. 페올라(M. Feola) 등, Toxic factors in the red blood cell membrance The Journal of Trauma, 29권: 제1065-1075페이지(1989년) 참조]. 이들 화합물은 Hb에 대해 고유의 친화력을 갖고 있으며 (이들은 다른 기질 성분보다 Hb 용액으로부터 제거하기가 더 어렵다), PE 및 PS로 오염된 Hb의 상당한 용적 (동물의 계산 혈액 용적의 ⅓ 이상)을 실험용 동물 (토끼 및 원숭이)에 주입할 때, 혈관내 응고 및 보체 활성화 작용, 백혈구 및 혈소판 활성화 작용 및 생체 기관 내의 허혈성 염증 병변의 발달을 특징으로 하는 전신성 염증 반응을 일으킨다 [엠. 페올라 등, Toxicity of polymerized hemoglobin solutions, Surgery, Gynecology and Obstetrics, 166권: 제211-222페이지(1988년); 엠. 페올라 등, Complement activation and the toxicity of stroma-free hemoglobin solutions in primates, Circulatory Shock, 25권: 제275-290페이지(1988년) 참조].
최근에 와서야 인식된 문제는 Hb 용액이 환경 박테리아 내독소에 의하여 쉽게 오염된다는 문제이다. 리물러스 변형세포 용해물 시험법(limulus amoebocytelysate test)이 개발되기 까지는, 미합중국 약전에서는 내독소의 검출을 위한 분석법으로서 토끼 발열원성 시험법에 의존해왔다. 상기 참고 문헌들에는 발열원 수준 미만의 농도의 내독소로 오염된 헤모글로빈은 아미노인지질로 오염된 헤모글로빈이 나타내는 독성과 같은 종류의 독성을 일으키는 것이 또한 보고되어 있다 (내독소의 독성 성분은 실제 지질, 지질A이다). 박테리아 내독소는 데톡시-겔(Detoxi-Gel)컬럼 (피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.)사 제품)과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 생물학적 용액으로부터 제거할 수 있다. 그러나, 출발 물질이 1㎖ 당 내독소 단위 2 이상을 함유한다면, 이러한 컬럼은 모든 내독소를 제거할 수 없다 (정량적 색소 리물러스 시험법 (quantitative chromogenic limulus test)을 이용하여 측정함, QCL-1000, 휘태커 엠. 디. 바이오프로덕츠(Whittaker M. D. Bioproducts), 1 EU = 박테리아 지다당류 0.1 나노그람(ng)).
헤모글로빈은 무-헴 단백질 및 펩티드로부터 정제되어야 한다. 독성이 임의의 특정 단백질의 존재와 관련되지 않지만, Hb 용액의 면역원성을 감소시킬 필요성에 의해 정제를 수행한다. 또한, 펩티드가 단리된 기관 (심장 및 신장) 및 단리된 동맥에서 발견되는 Hb 용액의 혈관 수축 효과와 관련있는 것으로 가정되었다. 그러한 정제를 위한 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법의 예로서는 (1) 원심 분리법 및 여과법 (독지(Doczi), 미합중국 특허 제3,991,181호); (2) 톨루엔 추출법 (본센(Bonsen) 등, 미합중국 특허 제4,001,200호 및 동 제4,001,401호); (3) 한외여과법 (코테(Kothe) 등, 미합중국 특허 제4,526,715호); (4) 한외여과법에 겸하여 산침전법 (보나드(Bonhard) 등, 미합중국 특허 제4,136,093호 및 동 제4,336,248호); (5) 이온 교환 크로마토그래피법(마일러(Meiller), 미합중국 특허 제4,100,149호); (6) 아연 침전법 (타이(Tye), 미합중국 특허 제4,473,494호 및 동 제4,529,719호); 및 (7) 결정화법 [드베누토(DeVenuto) 등, Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 89권: 제509-514 페이지(1977년)]. 그러나, 방법 (1) 내지 (4)는 다른 단백질로부터 Hb를 완전히 분리하는 데에는 본질적으로 제한이 있으며, 상기 방법 (5) 내지 (7)은 대규모 정제법에는 적합하지 않다.
1970년대에 인식되었던 문제점은 용액 중의 Hb의 높은 산소 친화력이다. 이것은 폐내의 공기로부터 산소를 포획하여, 그것을 조직으로 방출시키는 헤모글로빈의 능력을 조절하는 특성이다. 이러한 특성은 P50값 (Hb가 50% 포화되는 산소의 부분 장력)으로 표현된다. P50값이 낮을수록, 산소와 결합하는 헤모글로빈의 능력이 더 크고, 이는 산소를 조직으로 전달시키는 능력의 감소로 해석된다. 사람 혈액의 P50값은 28mmHg 이하이며, 용액 중 사람 Hb의 P50값은 13mmHg 이하이다. 이러한 차이는 적혈구 내에서는 Hb가 2,3-디포스포글리세레이트 (2,3-DPG)와 반응하고, 이것이 산소에 대한 Hb의 친화력을 감소시킨다는 사실에 기인한다. 적혈구 외부에서는 그러한 상호작용이 상실된다. 그 결과 Hb가 O2와 너무 단단히 결합하여, O2운반체로서의 기능을 하지 못한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 베네쉬(Benesch) 등은 Hb와 피리독살-5'-포스페이트 (2,3-DPG 동족체)와의 공유 결합 반응을 개발하였다. 처음에는 그러한 반응이 산소 친화력을 감소시키고 테트라머 형태의 Hb 분자를 안정화시킬 것으로 기대되었다. 그러나, 이는 실현되지 못하였다. 그러나, 용액 중 소 헤모글로빈은 사람 혈액과 동일한 P50값을 갖고, 그의 산소 친화력은 2.3-DPG에 의해서가 아니라 염화물에 의해 조절된다 [엠. 페올라 등, Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, 157권: 제399-408페이지(1983년) 참조]. 이러한 바람직한 특성을 고려하여, 소 RBCs가 대량으로 입수가능한 점과 포유 동물 사이에서 순수한 헤모글로빈의 항원성이 낮은 것을 함께 고려하면, 소 헤모글로빈을 혈액 대용품의 주성분으로서 사용하는 것이 유리하다.
1970년대에 인식되었던 또 따른 문제점은 혈관내 지속성이 짧은 헤모글로빈의 신속한 일혈이다. 이것은 일반적으로 Hb 테트라머 α2β2가 모세혈관을 통하여 더 용이하게 통과하는 다이머 2αβ로 해리되는 경향에 기인한다. 현재, 단백질의 표면 전하가 또한 전기 음성도 및 저등전점으로 혈관내 지속을 유리하게 하는 전기 음성도 및 저등전점과 함께 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 헤모글로빈 일혈은 몇몇 바람직하지 못한 효과를 나타낸다: (1) 혈장 용적 팽창 효과가 단시간 지속된다; (2) 신사구체를 통하여 Hb가 통과되면 혈장 용적을 유지하기 보다는 감소시키는 삼투 이뇨 효과를 발생시킨다; (3) 신소관 내에서 Hb의 재흡수는 관상 세포를 손상시킨다; 및 (4) 간질성 유채내로 Hb가 통과하면 부종 및 세포 손상을 일으킨다. 선행 기술에서는 Hb 이량체화의 방지에만 집중하였다. 이러한 목적을 위해, 세가지 유형의 Hb 개질법이 개발되었다 : (a) 분자간 가교 결합 (중합 반응); (b)Hb와 다른 분자와의 결합; 및 (c) α 또는 β 쇄의 분자내 가교 결합. 가장 널리 사용되는 방법은 Hb와 글루타르알데히드의 분자간 가교 결합이다 (본센 등, 미합중국 특허 제4,001,200호, 동 제4,001,401호 및 동 제4,053,590호; 모리스(Morris) 등, 미합중국 특허 제4,061,736호; 보나드 등, 미합중국 특허 제4,136,093호 참조). 그러나, 이러한 방법에는 몇가지 문제점이 있다: (1) 글루타르알데히드는 고유의 독성이 있으며, 그의 대사 부산물의 잠재적 독성은 알려지지 않았다; (2) 이 화합물은 반응성이 매우 크고, 예측할 수 없이 많은 종류의 분자를 형성시키는 Hb 분자의 여러 부위 (α- 및 ε-아미노기 및 술프히드릴기)와 다수의 브릿지를 형성하는 경향이 있다; (3) 중합 과정은 조절하기 어렵고, 그 과정은 4℃에서의 저장 기간 동안 계속되어 점도 및 산소 친화력이 증가된, 점진적으로 더 큰 중합체를 형성시키는 것으로 나타났다; (4) 가교 결합의 비특이적 특성으로 인해 용액 중에 Hb 이량체가 여전히 존재할 수 있다. 별법으로서, Hb를 덱스트란 및 히드록시에틸 전분 (미합중국 특허 제4,064,118호), 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜 (미합중국 특허 제4,412,989호), 이눌린 (미합중국 특허 제4,377,512호) 및 폴리-알킬렌 옥시드 (미합중국 특허 제4,670,417호)와 같은 거대 분자와 결합시킨다. 그러나, 이들 결합된 헤모글로빈은 산소 친화력이 증가되고, 결합 물질의 고유한 바람직하지 못한 성질을 갖게 되는 경향이 있다. 분자내 가교 결합은 디아스피린 에스테르의 사용 (타이, 미합중국 특허 제4,529,719호; 오라더(Walder), 미합중국 특허 제4,598,004호 참조) 및 과요오드산염-산화된 아데노신 삼인산염 (o-ATP)의 사용 P[에프.제이. 스캔넌(F.J. Scannon), Molecular modification of hemoglobin, Critical Care Medicine, 10권: 제261-265페이지(1982년); 에이.쥐. 그린버그(A.G. Greenburg) 및 피. 더블유. 매퓌드(P.W. Maffuid), Modification of hemoglobin-Ring opened diols, Advances in Blood Substitute Research, Alan R. Liss, New York : 제9-17페이지(1983년) 참조]에 의해 형성된다. 그러나, 디아스피린-헤모글로빈은 여전히 혈관내 지속성이 짧고(3-4 시간의 반감기), ATP-헤모글로빈은 짧은 반감기와 함께 높은 수준의 met-Hb 및 높은 산소 친화력으로 인해 만족스럽지 못한 것으로 나타났다.
사람 Hb와 피리독살-5'-포스페이트 및 글루타르알데히드를 반응시켜 중합된 피리독살화 Hb (폴리-PLP-헤모글로빈), 즉, 산소 친화력이 낮고 혈관내 지속성이 연장된 것으로 주장되는 헤모글로빈을 수득한 연구자들은 상당한 진전을 보고하였다 [지.에스. 모스(G.S. Moss) 등, Hemoglobin solution-From tetramer to polymer, Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, 16(1-3)권: 제57-69페이지(1988년); 에프. 드베누토 및 에이. 지그나(A. Zigna), Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglobin, Journal of Surgical Research, 34권: 제205-212페이지(1983년) 참조]. 그러나, 피리독살화는 중합화를 방해한는 것으로 밝혀졌다. 따라서, O2친화력이 감소된 피리독살화 Hb는 신장을 통해 신속히 배설되고, 연장된 반감기를 갖는 중합화된 Hb는 높은 산소 친화력을 갖게 된다. 결론적으로, 산소 전달 기능을 손상시키지 않으면서 Hb를 안정화하는 문제는 아직까지 해결되지 않았다.
과거 수년 동안, 헤모글로빈의 고유 독성에 관한 의문이 제기되어 왔다. 실험적 관찰에서는 혈관 수축 작용이 보고되었다. 또한, Hb는 met-Hb로 자동 산화하는 경향이 있기 때문에 (즉, 제일철 +3으로부터 제이철 +2 상태로 헴 철의 산화, 유독한 산소 유리 라디칼을 생성시키는 과정), 순환혈에 주입시 프로-옥시던트(pro-oxidant)로서 작용할 수 있는 것으로 추측되어 왔다. 이러한 작용은 세포막의 지방 과산화를 일으키며 세포 구조를 손상시킬 것이다. 이러한 두 작용, 즉, 혈관 수축 작용 및 산소 유리 라디칼의 생성은 모두 출혈에 의한 허혈-저산소증 손상을 완화시키기 보다는 악화시킬 것이다. 실험적 연구의 결과에서는 혈관 수축 및 라디칼의 생성이 모두 (1) Hb의 완전한 정제; (2)met-Hb 형성 수준을 낮게 하는 Hb분자의 제조 및 안정화; 및 (3) 산소 라디칼-스캐빈저 첨가의 세 단계에 의해 조절될 수 있는 것으로 보고되었다 [엠. 페올라 등, Biocompatibility of hemoglobin solutions. I. Reactions of vascular endothelial cells to pure and impure hemoglobins, Artificial Organs, 13(3)권: 제209-215페이지(1989년) 참조].
마지막으로, Hb 용액은 혈액 생성물 전염성 질병의 위험을 갖고 있다. 박테리아 및 기생충은 여과 또는 한외여과에 의해 쉽게 제거될 수 있지만, 비루스는 좀 더 심각한 문제점을 나타낸다. 2가지 비루스 불활성화 방법이 당업계에 공지되어 있다. 한 방법은 데옥시-형태의 헤모글로빈을 pH 7.5에서 60℃로 10시간 동안 저온 살균하는 것으로 이루어진 물리적 방법이다. 이 방법은 사람 면역결핍증 비루스 (HIV) 뿐만 아니라 모델 비루스 (sindbis, 소아마비 비루스(polio), 위광견병 비루스(pseudorabies))를 불활성화시키는 것으로 밝혀졌다 [티.엔. 에스텝 (T.N. Estep) 등, Virus inactivation in hemoglobin solutions by heat, Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, 16(1-3)권: 제129-134페이지(1988년) 참조]. 다른 방법은 클로로포름으로 처리하는 것으로 이루어진 화학적 방법이다 {에스.엠. 파인스턴(S.M. Feinston) 등, Inactivation of hepatitis B virus and non-A non-B hepatitis by chloroform, Infection and Immunity, 41권: 제816-821페이지(1983년) 참조]. 그러나, 상기 두 방법 모두 특별한 조치를 취하지 않으면 헤모글로빈을 상당히 변성시킨다.
[발명의 요약]
본 발명은 혈액 대용품으로서 유용한 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 이 조성물은 (a) 전적으로 완전히 정제되고; (b) 과요오드산염-산화된 ATP(o-ATP)와 분자내 가교 결합되고, 과요오드산염-산화된 아데노신 (o-아데노신)과 분자간 가교 결합되며; (c) 환원된 글루타티온 (GSH)과 반응하고; (d) 염화 마그네슘 (MgCl2) 및 만니톨이 풍부한 전해질 균형 식염수에 용해된 포유 동물 (바람직하게는 소) 헤모글로빈(Hb)으로 이루어진다. o-ATP 및 o-아데노신이 2개의 푸린(P) 유도체이기 때문에, 본 명세서에서 생성물을 Hb-PP-GSH로 표시한다.
본 발명의 헤모글로빈 제제는 하기의 각 성분들의 바람직한 특성을 함께 갖는다: (1) 소 Hb가 여러 가지 화학 반응에 의해 영향을 받지 않는 본래 낮은 산소 친화력(28mmHg의 P50값)을 갖는 점에서 효과적인 산소 운반체이다, ; (2) 분자내 및 분자간 가교 결합된 헤모글로빈이 연장된 혈관내 지속성(24시간의 반감기)을 갖는다는 사실의 면에서 효과적인 혈장 용적 팽창제이다; (3) 두 푸린 모두가 노르에피네프린-유발성 혈관 수축을 완화시킨다는 사실에 기인하여, 혈관 확장 특성을 갖는다; 및 (4) 환원된 글루타티온 및 만니톨의 존재로 인해, 프로-옥시던트 작용을 발휘하지 않는다.
소 헤모글로빈의 바람직한 특성은 이미 증명되었다 [엠. 페올라 등, Development of bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, 157권: 제399-408페이지(1983년) 참조]. 그의 대량 입수가능성 및 사람 혈액에 고유한 전염성 질병 (특히, AIDS)을 피하는 것 외에, 소 Hb는 사람 Hb의 P50값 (13mmHg)의 2배 이상인 P50값(28mmHg)을 갖고, 2,3-DPG 조정을 필요로 하지 않는다. 본 발명에 따라서, 소 Hb의 산소 친화력은 염화 이온의 농도를 증가시킴으로써 더욱 저하시킬 수 있다. 잠재적인 면역학적 문제에 관하여, 다른 포유 동물 종에 교차하는 Hb 수혈법의 실행가능성은 잘 증명되었다. 실제, 순수한 소 헤모글로빈은 반응의 임상적 증거 없이 및 아우크테르로니(Ouchterlony's) 시험에 의해 검출가능한 항체 형성없이, 계산된 혈액 용적의 1/3-1/2에 해당하는 용적으로 토끼 및 원숭이에게 반복(6회까지)투여되었다.[엠. 페올라 등, Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions, Trasfusione del sangue(Italian), 33권: 제121-128페이지(1988년)참조.]
박테리아 내독소가 없는 Hb 용액을 생성하기 위해, 현재의 제조방법에 사용되는 방법은 오염을 교정하기 보다는 방지하는 방법이다. 헤모글로빈에 대한 내독소의 친화력을 고려하면, 일단 상당하게 오염되면, 정제는 비록 불가능하지는 않더라도, 극히 어려워진다. 방지 밥법은 다음 조건을 필요로 한다: (1) 출발 물질은 최소 한도로 오염되어 있어야 한다; (2) 제조단계는 밀폐 시스템 방식으로 수행되어야 한다; (3) Hb와 접촉하게 될 모든 표면은 무균이고 피로젠이 없는 상태이어야 한다; (4) 모든 화학 물질은 순수해야 한다; (5) 모든 용액은 무균이고 피로젠이 없는 상태이어야 한다; 및 (6) 모든 단계에서 품질 관리를 실시하여야 한다. 가장 예민한 내독소 검출방법은 정량적 색소 리물러스 시험법(QCL-1000, 휘태커 바이오프로덕츠(Whittaker Bioproducts))이다. 출발 물질 또는 임의의 제조 단계에서의 헤모글로빈이 2 EU/ml이상을 함유하는 것으로 밝혀지면, 이를 폐기하여야 한다. 과정 전체에 걸쳐 낮은 오염 수준을 유지함으로써, 데톡시-겔(피어스 케미칼 캄파니사 제품)과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통하여 용액을 최종 통과시킴으로써 완전한 정제를 성취할 수 있다.
최종 정제와 함께 전체적인 오염을 피하는 것과 동일한 원리가 기질 인지질(특히, 아미노인지질)의 제거에도 적용된다. 기질 오염을 제거하기 위해, 본 발명의 방법에서는 문헌 [제이. 알. 드로크(J.R.DeLoach) 등, Analytical Biochemistry, 157권: 제191-198페이지(1986년)]에서 최초로 제시된 적혈구 투석법 및 한외여과법을 채택한다. 상기 방법에 따라서, 현탁액이 160mOsm/L의 삼투압에 도달할 때까지, 저장성(hypotonic) 인산염 용액에 대하여 RBCs를 먼저 투석시킨다. 이때, RBCs는 구형을 나타내며 세포막공은 팽창된다. 그 후, 세포를 10psi의 컬럼 압력하에 0.1μm 기공의 아미콘 필터(Amicon Filters)를 통해 한외여과시킨다. 이렇게 하여 헤모글로빈은 세포막 을 파괴시키지 않고 세포를 빠져나온다. 본 발명에 따라서, 무균이고 피로젠이 없는 상태인 일회용 단일 밀폐-시스템 과정을 RBC 투석 및 한외여과에 모두 이용한다. 또한, 투석 유체는 인산염 용액 대신, 헤모글로빈 산화를 환원시키는 탬(Tham) 용액을 사용하여 pH8.2로 조정한, 무균이고 피로젠이 없는 탈이온수로 이루어진다. 이러한 과정의 결과로 단지 미량의 아미노인지질 PE 및 PS만을 갖는 (박층 크로마토그래피에 의해 측정), 약 3-5mg/dl의 인지질을 함유하는 (인지질 시험 세트(Phospholipid test set)에 의해 측정됨, 뵈링거-만하임 다이아그노틱스(Boeringer-Manheim Diagnostics, 인디애나주 인디애나폴리스 소재)사 제품) Hb 용액을 얻는다. 이들 잔류하는 인지질은 클로로포름 추출에 의해 제거된다. 인지질이 낮은 수준으로 존재하기 때문에, 저농도의 클로로포름을 사용하여 단시간 원심분리시킴으로써 상기 단계를 수행할 수 있다. 따라서, 헤모글로빈의 변성이 방지된다.
무-헴 단백질 및 펩티드로부터 헤모글로빈을 정제하는 경우에도 같은 원리가 적용된다. 이 경우에, 제1단계는 적혈구의 정제기간 동안 모든 혈장 단백질이 제거되는 것을 의미한다. 두 번째로, 적혈구막의 대규모 파괴없이 RBCs로부터 Hb를 추출하는 방법은 기질 단백질에 의한 오염을 방지한다. 마지막으로, 정제는 선택적 열 침전법(selective thermal precipitation)에 의해 이루어진다. [피.에이. 벨터(P.A. Belter), 이.엘. 쿠슬러(E.L. Cussler), 더블유.에스. 휴(W.S. Hu), 편집자, Bioseparations, John Wiley Sons, New York; 제227-229페이지(1988년) 참조]. 이러한 방법의 과학적 근거는 온도에 의한 단백질의 변성( 및 침전)이 다음과 같은 아레니우스 온도 의존성이 있는 1차 화학 운동학에 따른다는 사실에 근거한다.
여기서, P는 용해된 단백질 농도이다. 비례상수 κ는 다음과 같이 구해진다.
여기서, κ0는 지표 상수이고, E는 변성의 활성화 에너지를 나타내며, T는 온도이다. 변성 에너지는 단백질마다 다르다. 식에서 E는 지수로 나타내기 때문에, 온도가 약간 변화될 때에도 큰 영향을 받는다. 이 에너지는 PH 변화에 의해서도 또한 영향을 받는다. 본 발명자는 또한 일산화 탄소로 포화된 헤모글로빈(HbCO)이 pH7.6-7.8에서의 온도 유발성 침전에 대해 저항성이 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 10g/dl 농도의 카르복시 형태인 헤모글로빈 용액을 pH7.6-7.8dptj 60℃에서 9시간 동안 저온 살균하고, 이어서 70℃에서 1시간 동안 저온 살균하면 헤모글로빈은 거의 변성되지 않고 모든 무-헴 단백질이 침전된다는 것을 발견하였다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 바와 같은 용액중에서 무-헤모글로빈 단백질이 없는 것은 등전 집속법(IEF)을 이용하고, 크기 배제(size-exclusion) 및 음이온 교환 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용함으로써 증명되었다. 회수된 헤모글로빈의 비변성 상태는 IEF 상의 집속된 밴드의 얼룩(smudging)의 부재 및 산소 전달 기능의 보존에 의해 증명된다.(산소 해리 곡선, P50, 보어(Bohr)효과).
정제과정의 부차적 결과로 비루스가 불활성화된다. 실제, 클로로포름 추출은 혈장 및 혈청 모두에서 B형 간염, 비 A형 비 B형 간염, 우두증 및 천연두 비루스와 같은 다수의 지질-엔벨럽드 비루스를 불활성화시키는 것으로 밝혀졌다(파인스턴 등, 상기 참조). 지질이 없는 몇몇 비루스(레오비루스)도 또한 클로로포름에 의해 부분적으로 불활성화될 수도 있다. 반면, 60℃에서 10시간 동안의 저온 살균은 사람 면역결핍증 비루스(HIV)뿐만 아니라, 다수의 무-지질 엔벨럽드 비루스를 불활성화시키는 것으로 증명되었다(티.엔. 에스텝 등, 상기 참조).
클루타르알데히드를 사용한 중합반응의 바람직하지 않은 효과 때문에, 본 방법은 아데노신 5'-트리포스페이트의 디알데히드 유도체(o-ATP)를 사용하여 테트라머 형태로 Hb 분자를 안정화시킨다. ATP 분자는 3개의 기본 성분, 즉, 푸린 염기 아데노신, 당 D-리보스 및 트리포스페이트 사슬을 갖는다.
과요오드산 나트륨으로 ATP를 산화시키면 2,3'-시스 부위에서 리보스 고리가 열려, 2,3'-디올이 대응하는 디알데히드로 변형된다[피.엔. 로웨(P.N.Lowe)등, Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds, Biochemical Society Transactions, 7권; 제1131-1133페이지(1979년) 참조].
o-ATP 분자의 각 알데히드기는 리신의 ε-아미노기와 반응하여 쉬프(Schiff)염기 부가물을 형성한다.
(HB)-NH2+OCH-ATP →(HB)-N = CH-ATP
헤모글로빈의 2,3-DPG포켓(2,3-DPG와 결합하는 Hb분자 내의 영역)이 2개의 리신을 함유하기 때문에, o-ATP를 사용하여 이러한 기를 가교 결합시켜, 테트라머 형태로 분자를 안정화시킬 수 있다. 트리포스페이트 사슬의 존재는 이러한 반응의 특이성을 증가시키며, 이러한 특이성은 피리독살-5'-인산염과 같은 다른 폴리인산염에 대해 증명되었다. 다른 화합물보다 뛰어난 ATP의 잇점은 아데닌 잔기에 의해 제공된다. 생체 내에서 ATP가 ADP, AMP 및 마지막으로 아데노신으로의 가수분해되면, 전신 및 폐 순환혈에서 모두 유익한 약리 효과, 주로 혈관 확장 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 출혈 쇼크의 조절시에 ATP를 염화 마그네슘(MgCl2)과 혼합하여 투여할 때, 또 다른 유익한 효과가 증명되었다. 상기 효과는 미세혈행의 개선, 세포막 기능의 개선 및 세포내 아데닌 뉴클레오티드의 복구에 대한 자극(priming)효과를 포함한다. [아이.에이치. 코드리(I.H. Chaudry) 및 에이.이. 바우에(A.E. Baue), Overview of hemorrhagic shock, Pathophysiology of shock, anoxia and ischemia, 알.에이. 카울리(R.A. Cowley) 및 비.에프. 트럼프(B.F.Trump), 편집자, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland; 제203-219페이지(1982년) 참조].
상기한 바와 같이, 화학 반응으로 인해 허용되지 않는 수준(30% 이하)의 met-Hb가 생성되고, o-ATP를 사용하여 변형된 Hb가 여전히 짧은 혈관내 지속성을 갖기 때문에, Hb를 o-ATP와 가교 결합시키는 이전의 시도는 성공적이지 못했다. 또한, ATP는 혈관계로부터 이가 양이온을 킬레이트화시키기는 바람직하지 못한 경향이 있다.
본 발명자는 o-ATP의 옥시던트효과가 화합물 중에 존재하는 미량의 요오드 산염(IO4및IO3)에 기인하는 것을 밝혀냈다. 실제, o-ATP를 완전히 정제시키면 (실시예 I 참고)그러한 문제가 해결된다. 본 발명자는 또한 이전에 행해진 바와 같이, o-ATP를 데옥시-Hb와 반응시키기 보다는 카르복시-Hb(일산화 탄소로 포화된 Hb)와 반응시킴으로써 met-Hb 성이 최소화될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자는 용액의 pH를 약 7.20으로 감소시키면 o-ATP와 카르복시-Hb와의 반응이 일어날 수 있다는 것을 발견하였다. 양이온-킬레이트화 효과에 관하여, 본 발명자는 ATP와 동몰량인 염화 마그네슘(MgCl2을 첨가하면 그러한 문제가 해결된다는 코드리 및 바우에(상기 참조)의 보고를 확인하였다. 그러나,짧은 혈관내 지속성의 문제가 남아 있다. 본 발명자는 테트라머 형태의 분자내 가교 결합된 Hb가 여전히 신사구체를 통해 여과되어, 신소관을 손상시킬 것임을 밝혀냈다. 그러므로, 적절한 혈관내 보유시간을 얻으려 한다면, 헤모글로빈을 분자내 뿐만 아니라 분자간 가교 결합시킬 필요가 있다.
본 발명에서는 제2가교 결합제로서 제2푸린 유도체, 즉, 아데노신의 디알데히드 유도체 또는 과요오드산염-산화된 아데노시(0-아데노신)을 이용한다. Hb 분자는 그의 표면 상에 44개의 리신 아미노기를 갖고 있으므로, 0-아데노신을 이용하여 2개 이상의 이들 기를 브리지하고, 2개 이상의 테트라머를 결합시킬 수 있다. 다른 화합물보다 뛰어난 아데노신의 잇점이 몇가지 있다. 먼저, 아데닌의 존재로 인해, 아데노신은 ATP와 유사한 혈관 확장 효과를 갖는다[씨. 수(C. Su), Extracellular functions of nucleotides in heart and bolld vessels, Annual Review of Physiology, 47권; 제665-676페이지(1985년) 참조]. 또한, 아데노신은 혈소판 응집을 저해하며 신장에서의 사구체 여과를 개선시키는데, 두가지 효과 모두 출혈 및 재관류 후에 유약하다[알.엠. 베른(R.M. Berne) : Regulatory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, Massachusetts(1983년) 참조]. 헤모글로빈과 0-아데노신과의 반응은 당업계에 공지되어 있지 않다. 이 반응을, met-Hb 형성을 감소시키기 위해 카르복시 형태의 헤모글로빈을 사용하여 수행하는 것도 또한 중요하다. 마지막으로, 상기 반응은 4℃에서 매우 느리게 진행하므로, 원하는 분자 응집체의 형성 후에 임의의 시간에 반응을 중지시킬 수 있다. 이러한 특징으로 인해 계획된, 재현가능한 양식으로 상이한 분자 크기의 Hb 중합체를 제조할 수 있게 된다(이는 글루타르알데히드와 같은 다른 가교 결합제를 사용하여서는 수행될 수 없다). 헤모글로빈과 0-아데노신과의 가교 결합은 리신과 같이 ε-아미노기를 갖고 있는 환원된 글루타티온(GSH)을 첨가하여 중지시킨다. 이 반응을 도입함으로써 GSH가 Hb조성물의 일부가 된다.
GSH의 선택은 이 화합물이 적혈구 내에 풍부하게 존재한다는 사실에 근거한 것이며, 이 화합물의 주요 기능은 옥시던트 스트레스로부터 헤모글로빈을 보호하는 옥시던트 트랩으로서 작용하는 것이다 [에이. 래르슨(A. Larsson): Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press, New York(1983년) 참조]. 본 발명자는 GSH가 적혈구 환경내에서 뿐만 아니라 용액중에서도 헤모글로빈을 보호한다는 것을 증명하였다. 본 발명자는 또한 0-아데노신과 가교 결합시킨 다음 GSH와 반응시키면, Hb의 등전점이 6.8에서 6.1-6.2로 저하되어, Hb분자의 표면 상에 음전하가 증가한다는 것을 발견하였다. 이것은 혈관내 지속성을 연장시키고, 신장을 통한 여과를 방지한다는 의미에서, 헤모글로빈의 안정화에 기여한다.
o-ATP 및 0-아데노신은 상업 공급자(시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 입수할 수 있거나, 하기 실시예 I 및 실시예 2에 기재한 방법에 따라 제조할 수 있다. 환원된 글루타티온은 상업 공급자로부터 입수할 수 있다.
이러한 반응들 및 카르복시-Hb의 옥시-Hb로의 재전환에 이어서, 신규 화합물(Hb-PP-GSH)을 염화 마그네슘(MgCl2) 및 만니톨이 풍부한 전해질 균형 식염수에 용해시킨다. MgCl2는 ATP와 동몰량으로 첨가된다. 이는 몇몇 유익한 작용을 한다: (1) ATP의 2가 양이온 킬레이트화 작용을 조절한다; (2) 미세혈행에 대한 유익한 효과면에서 ATP를 보충한다; 및 (3) 산소에 대한 Hb의 친화력을 저하 조절시키는 염소 이온을 과량 제공한다(높은 P50값을 유지하도록 보조한다). 만니톨은 이것이 다른 라디칼 뿐만 아니라 OH 라디칼(가장 독성이 큰 산소-유래 유리 라디칼)의 스캐빈저로서 작용한다는 사실에 근거하여 소량 첨가한다 [비.에이. 프리만(B.A. Freeman) 및 제이.디. 크라포(J.D. Crapo), Free radicals and tissue infury, Laboratory Investigation, 47권: 412-426페이지(1982년) 참조].
본 발명의 목적은 혈액 대용품으로서 유용한, 즉 (a) 혈장 용적을 회복하여 유지할 수 있고, (b) 생체 기관에 산소를 공급할 수 있으며, (c) 출혈 후의 혈관 수축을 완화시킬 수 있는 화학물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 독성이 없는 상기 혈액 대용품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 헤모글로빈으로부터 혈액 대용품을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 하기의 본 발명에 따른 바람직한 실시태양의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 크기 배제 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 얻어지는 순수한 소 헤모글로빈의 스펙트럼 분석결과를 도시한다. 크로마토그램은 테트라머 형태(64,000 달톤)의 헤모글로빈을 확인하는 9.4분에 위치한 단일 피크를 나타낸다.
제2도는 DEAE 칼럼을 이용한 HPLC에 의해 얻어지는 순수한 소 헤모글로빈의 스펙트럼 분석 결과를 도시한다. 크로마토그램은 다양한 Hb성분의 상이한 등전점에 해당하는, 20분 및 36분 사이에 위치한 몇 개의 피크를 나타낸다.
제3a도 및 제3b도는 저온 살균에 의한 정제 전(3a) 및 정제 후(3b)의 소 헤모글로빈의 스펙트럼 인덱스를 도시한다(DEAE 컬럼을 사용한 HPLC, 스펙트럼 파장 230-599nm). 제3a도에서, 무-Hb단백질이 보이고, 체류시간 17분 및 51분에 위치한 것으로 나타났다 제3b도에서, 무-Hb단백질은 더 이상 보이지 않는다.
제4도는 o-ATP와 분자내 가교 결합되고 0-아데노신과 분자간 가교 결합되고, 환원된 글루타티온과 결합된 소 Hb의 HPLC(크기 배제)에 의한 스펙트럼 분석결과를 도시한다. 크로마토그램은 6개의 피크를 포함하는 Hb분자 응집체를 나타낸다.
제5도는 제4도에서와 같이 변형된 소 Hb의 HPLC(DEAE 컬럼)에 의한 스펙트럼 분석 결과를 도시한다. 크로마토그램은 체류 시간 51분에서 단일 피크를 나타낸다. Hb의 등전점은 표면 음전하의 증가로 인해 이동되었다(비변형된 Hb와 비교할 때).
제6도는 등전 집속법(IEF-Pharmacia)에 의한 검사 결과를 도시한다.
제7도는 세파덱스(Sephadex) 컬럼에서 물로 용출된 o-ATP 및 과요오드산 나트륨 반응 혼합물의 연속 분획물의 258nm에서의 흡수도를 도시한다.
제8도는 음이온 교환 컬럼으로부터 용출제 A에 의해 용출된 0-아데노신 및 과요오드산 나트륨 반응 혼합물의 연속 분획물의 258 및 232 nm에서의 흡수도를 도시한다.
[바람직한 실시태양의 설명]
[실시예 1]
본 발명에 따른 복합 생성물을 제조하기 위한 바람직한 방법은 다음 5단계로 이루어진다 : (A) 적혈구의 정제 ; (B) 헤모글로빈의 추출; (C)헤모글로빈의 정제; (D) 헤모글로빈의 변형(o-ATP, o-아데노신 및 글루타티온과의 반응); 및 (E) 최종 생성물(Hb-PP-GSH)n의 제조.
A. 적혈구(RBCs)의 정제
전술한 바와 같은 이유로 바람직한 출발 물질은 소 혈액으로 대표된다. 그러나, 본 발명의 제조 방법은 사람을 포함한 다른 포유 동물 혈액을 출발 물질로 하는데 이용될 수 있다. 소 혈액은 다수의 건강한 공여체로부터 또는 도살장에서 희생된 각 동물로부터 얻을 수 있다. 첫 번째 경우에, 성숙한 소를 감금시켜, 목의 털을 깍고, 가죽을 방부 비누로 처리하여 준비하였다. 혈액은 무균 조건하에 외측 경정맥의 천공에 의해 체혈하였다. 약 1,500 ml의 혈액을 한 동물로부터 얻어, 200ml의 ACD항응고제(비르백, 인크(Virbac, Inc., 캔사스주 레넥사 소재)사 제품)를 포함한 진공상태의 무균이고 피로젠이 없는 2리터 용량의 병에 모았다. 두 번째 경우, 동물을 도살하기 전에 기절시킨 후에, 목의 한쪽을 신속히 준비하고, 투관침을 피부를 관통하여 경동맥에 삽입하였다. 각각의 성숙한 소로부터 혈액 약 10리터를 체혈할 수 있다. 다른 동물로부터 체혈한 혈액은 혼합하지 않았다. 병을 실험실로 이동시 얼음에서 유지시켰다.
특히 소 혈액을 출발 물질로 사용하였을 경우에, RCBs(적혈구)를 백혈구, 혈소판 및 혈장으로부터 완전히 분리하는 것이 중요하다. 이러한 단계는 무-헴 단백질 및 궁극적으로 헤모글로빈에서 정제시켜야 할 필요가 있는 다른 물질이 부하되는 것을 감소시킨다. 또한, 모든 백혈구를 제거하면, 이들 세포, 특히 임파구에 관련된 비루스(거대 세포 봉입체 비루스(cytomegalovirus), 사람 면역결핍증 비루스 등)가 제거된다.
RBCs를 회전-냉각-여과(spin-cool-filter)법에 의해 정제하였다. 회전단계는 다음과 같은 방식으로 DIDECO시스템(일렉트로메딕스, 인크(Electromedics, Inc.), 콜로리다주 잉글우드 소재)과 같은 혈액은행(blood bank) 세포 분리기를 사용하여 밀폐 시스템 방식으로 수행되는 다수회의 원심분리로 이루어진다:
1. 15℃에서 20분 동안 1,100 rpm으로 원심분리시켜 혈소판 및 혈장을 제거한다.
2. 15℃에서 10분동안 4,500 rpm으로 원심분리시켜 혈장을 더욱 완전히 제거한다.
3. 15℃에서 10분동안 4,100 rpm으로 원심분리시켜 등장 식염수(RBCs/염수1:4)로 4회 세척한다.
4. pH 8.1-8.2의 등장 탬 용액(Tham USP, 애보트 래보래토리스(Abbott Laboratories), 일리노이주 노쓰 시카고 소재)으로 최종 세척한다.
이러한 과정은 세척된 RBCs의 현탁액을 전해질이 없는 높은 pH의 용액으로 만들어, 헤모글로빈을 산화로부터 보호한다. 본 과정의 냉각 단계에 있어서, RBCs는 전달 팩(transfer packs)(펜월 래보래토리스(Fenwal Laboratories, 일리노이주 디어필드 소재)사 제품인 무균이고 피로젠이 없는 플라스틱 용기)내에서 4℃로 철야로 또는 18시간 동안 저장한다. 저온에서, 백혈구는 응집하여 소형 덩어리가 되는 경향이 있다. 여과단계에 있어서, 세포를 백혈구 응집체를 제거하는 고성능 수혈 필터(펜월사 제품)와 같은 20μ 셀룰로오스 필터를 통하여 통과시켰다.
백혈구 및 혈소판의 부재를 확인하기 위해 코울터(Coulter)세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하였고, 현탁액 중 단백질의 부재를 일상적인 화학적 방법에 의해 증명하였다. 박테리아 내독소의 존재는 정량적 색소 리물러스 시험법(QCL-1000, 휘태커 바이오프로덕츠, 매릴랜드 주 워커스빌)을 이용하여 측정하였다.
B. 헤모글로빈의 추출
RBCs로부터 헤모글로빈의 추출을 2단계로 실시하였다. 먼저, pH 8.1-8.2의 등장성 탬 용액에 현탁된 RBCs(농도 20%(헤마토크릿 0.20)) 1리터를 표면적이 10 Ft2인 크로스플로(Krosflo) II 여과 모듈(미크로곤 인크(Microgon Inc., 캘리포니아주 라구나 힐스 소재)사 제품)과 같은 0.20μ의 다공도를 갖는 인공신장에 의해 저장성 (230mOsm/L) 탬 용액 10리터에 대해 투석하였다. 투석은 투석액이 적색(헤모글로빈 색조)이 될 때까지 실시된다. 이 시점에서, RBCs는 구형으로 팽창되고, 신장된 세포막은 Hb에 대해 투과성이 된다. 제2단계에서, 10psi의 압력을 인공 신장에 가해, 세포막을 파괴시키지 않고 세포밖으로 Hb를 추출해 낸다. 한번 통과시킨 후에 고스트(ghost)막은 폐기시킨다. 헤모글로빈이 저장성 용액 저장기에 유입될 때, 탬 용액(230mOsm/L)를 첨가하여 RBC 저장기 내의 용적을 유지하였다. 추출된 헤모글로빈을 포시딘(Posidyne) I.V. 필터(폴 바이오메디칼 인크(PALL Biomedical Inc., 푸에르토리코 파자르도 소재)와 같은 0.20μ필터를 통하여 여과시켜, 잔류하는 미립자 잔해(debris) 또는 미생물 오염 물질을 제거하고, 전달팩내에 4℃로 저장하였다.
이러한 과정의 결과로 미량의 아미노인지질 PE 및 PS만을 갖는 (박층 크로마토그래피에 의해 측정됨), 인지질 3-5mg/dl를 함유하는 (인지질 시험 세트를 이용하여 측정, 뵈링거-만하임 다이아그노틱스, 인디애나주 인디애나폴리스 소재) Hb용액을 얻었다.
C. 헤모글로빈의 정제
헤모글로빈의 정제는 다음 4단계로 수행된다:
1. 카르복시 형태의 헤모글로빈(HbCO)의 저온 살균
이 단계는 NBS 모델 ML-4100조절 시스템을 가진 마이크로리프트(Microlift)-15리터 현장 살균 처리용 생물반응기(sterilizable-in-place bioreactor)(뉴 브룬스위크 사이어티픽 캄파니(New Brunswick Scientific Co.), 뉴저지주 에디슨 소재)와 같은 예비 살균된 피로젠이 없는 생물 반응기 내에서 수행한다. 이 반응기는 기체 및 액체를 위한 다수의 도입 부위, 샘플링을 위한 포트(Port), 교반을 위한 교반기 및 온도 조절기가 부착된 밀폐용기이다. 생물 반응기를 배기 퓸 후드(fume hood) 하에 설치한다. 헤모글로빈을 4℃에서 서서히 교반시키며 760mmHg의 무균 기체로 연속적으로 플러쉬시켜 일산화 탄소(99.99% 순도, 크리오게닉레어 카스 캄파니(Criogenic Rare Cas Co. 사우쓰 캐롤라이나주 해내한 소재)사 제품)로 포화시켰다. 총 포화도는 쿡시메터(cooximeter)(Model 282, 인스트루멘테이션 래보래토리스(Instrumentation Laboratories), 매사추세츠주 렉싱턴 소재)를 사용하여 증명하였다. 이 과정은 약 15분이 소요되었다. 이 용액을 760mmHg의 CO하에 방치해 두었다. 이어서, 생물 반응기 내에서 온도를 4℃에서 60℃로 점차적으로 상승시키고, 9시간 동안 그 상태로 둔 다음, 1시간 동안 70℃로 상승시켜 저온 살균을 실시하였다. 이러한 간격을 둔 후, 온도를 다시 점차적으로 4℃로 저하시켰다.
2. 클로로포름으로 원심분리
이 단계를 위하여, Hb 용액을 0.20μ필터를 통하여 여과하여, 적당한 캡으로 밀봉된 250ml용량의 무균이고 피로젠이 없는 원심분리용 병(클로로포름, 단백질 및 알콜에 대해 내성이 있는 폴리알로머(polyallomer) 병, 듀퐁 캄파니의 소르볼 디비젼(Sorvall Division of Du Pont Co.), 델라웨어주 월밍턴 소재)에 넣었다.
소르볼 원심분리기(로터(rotor)TFA 20.250이 장치된 Model OTD75B)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 3회 연속 원심분리시켰다.
a. 15:1의 비율로 클로로포름과 혼합된 헤모글로빈(각 병 당 Hb 232ml; 클로로포름 18ml)을 4℃에서 30분 동안 760× g로 원심분리시켰다. 상등액을 층류(laminar flow)의 후드 하에 무균이고 피로젠이 없는 튜브 및 연동 펌프를 사용하여 제2열의 병으로 통과시켰다.
b. 16:1의 비율로 클로로포름과 혼합된 Hb를 4℃에서 15분 동안 1,600×g로, 15분동안 3,800×g로 원심분리시켰다. 상등액을 제3열의 병으로 옮겼다.
c. 클로로포름 없이 60분동안 61,400×g로 원심분리시켰다.
세 번째 원심분리시킨 후, Hb용액을 교반 막대가 장치된, 1000ml용량의 무균이고 피로젠이 없는 진공 상태의 병(애보트 래보래토리스)으로 옮겨, 용액을 4℃에서 2시간 동안 서서히 교반시키면서, 무균 CO가스로 플러쉬시켜 용액으로부터 잔류하는 미량의 클로로포름을 제거하였다.
본 단계에 사용된 클로로포름은 UV 컷오프(cutoff) 244nm를 갖는 HPLC등급이다(피셔 사이언티픽 캄파니(Fisher Scientific Co.), 뉴저지주 페어 론 소재). 병은 (a) E-TOXS-클린(Clean)비누(시그마 케미칼스(Sigma Chemicals)), (b) 190표준 강도(proof)의 에탄올 및 (c) 120℃에서 80분 동안 멸균 처리시킨 후 재사용할 수 있다.
이러한 연속 원심분리에 의해 모든 인지질이 제거될 뿐만 아니라, 앞서 저은 살균 단계에서 변성되어 침전된 무-헴 단백질로부터 정제된 헤모글로빈이 분리된다.
3. 내독소 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통한 여과
Hb 용액을 유입 및 배출 전달 팩 및 연동 펌프를 사용하여 데톡시-겔 컬럼(피어스 케미칼 캄파니(일리노이주 록포드 소재)사 제품)과 같은 친화성 크로마토그래피에 통과시켜, 밀폐 시스템을 형성한다. 상기 절차는 클래스(Class) 100 층류 후드 하에서 실시한다.
이 단계에 의해, 내독소의 농도가 2.0-2.5EU/ml에서 0.10EU/ml 미만으로 감소될 수 있다.
4. 투석
Hb 용액을 탬 용액의 첨가에 의하여 pH 7.20으로 조정된 무균이고 피로젠이 없는 탈이온수에 대해 1:10의 비율로 투석시켰다. 이러한 투석은 90 SCE-인공신장(씨-닥 캄파니(C-DAK CO.), 플로리다주 마이애미 레이크스 소재)과 같은 6,000 달톤의 다공도를 갖는 인공 신장을 사용하여 실시한다. 이 단계는 (a) 소형분자를 제거하고, (b) 헤모글로빈을 10g/dl로 농축시키며, (c) Hb 용액의 pH를 약 8.2에서 약 7.2로 저하시킨다.
본 발명 방법의 이 시점에서, 순수한 헤모글로빈, 즉, (a) 박테리아 내독소, (b)기질 지질 및 인지질, 및 (c) 무-헴 단백질이 완전히 제거된 헤모글로빈이 생산되었다. 또한, 본 발명 방법의 여러 시점에서 0.20μ필터를 합하여 반복한 여과에 의해 모든 미생물 오염 물질이 제거되는 것이 기대되는 한편, 저온 살균 및 클로로포름 처리에 의해 비지질 및 지질 엔벨럽드 비루스를 불활성화시키는 것이 기대된다. 또한, 카르복시-형태의 헤모글로빈을 사용함으로써 정제과정이 낮은 산화도에서 가능하게 된다. (1-2.5% met - 헤모글로빈 형성).
D. 헤모글로빈의 변형
헤모글로빈과 o-ATP, 0-아데노신 및 환원된 글루타티온과의 반응을 다음과 같이 생물 반응기 내에서 수행한다. 탬 용액을 사용하여 pH 7.20으로 조정한 물 중의 카르복시 상태의 헤모글로빈 10g/dl를 생물 반응기에 재도입하여, 일산화 탄소 1기압 하에 서서히 교반시키며, 4℃로 유지하였다.
실시예 III에 따라 제조되어 분말 형태로 저장된 o-ATP를 pH 7.20으로 조정된, 무균이고 피로젠이 없는 물에 용해시키고, 즉시 Hb/o-ATP = 1:3의 몰비로 Hb용액에 첨가하였다. CO 하에 24시간 동안 150rpm으로 교반시키며 4℃에서 반응을 진행시켰다. 용액이 시료를 매 6시간마다 취하고, 크기 배제 컬럼을 갖는 HPLC로 검사하여 헤모글로빈의 분자량 증가를 측정하고, 음이온 교환 컬럼을 갖는 HPLC로 검사하여 전하의 변화를 측정하였다. 워터스(Waters) 600E 시스템 콘트롤러, 워터스 712 주입기, 워터스 990 포토다이오드 검출기 및 NEC 파워 메이트(Mate) 2 컴퓨터로 이루어진 워터스 HPLC 시스템을 사용하였다. 크기 배제 컬럼(Protein Pak 300 SW) 및 음이온 교환 컬럼(DEAE-5 PW)도 또한 워터스사(Waters Chromatography Division, Millipore Co., 매사추세츠주 밀포드 소재)로부터 구입하였다. 음이온 교환 HPLC에 의한 검사에서 화학 반응에 사용되었던 o-ATP의 90-95%가 나타날 경우, 이상적인 가교 결합 조건은 약 24시간에서 일어난다. 그 결과로, 다음의 성분으로 이루어진 분자 응집체가 생성되었다.
즉, 반응 조건 하에 o-ATP는 대부분 분자내 가교 결합을 형성하지만, 또한 약간의 분자간 가교 결합도 형성한다. 그러나, 이것은 다음 반응을 방해하지는 않는다.
24시간 후에, 실시예 IV에 따라서 제조되어 분말 형태로 저장된 0-아데노신을, 탬 용액을 첨가하여 pH 7.20으로 조정된 멸균수에 에탄올 몇 방울과 함께 용해시켰다. 이 화합물을 Hb:o-아데노신 = 1:5의 몰비로 Hb용액에 첨가하고, 동일한 조건하에 24시간 동안 계속 반응시켰다. 이 때 o-아데노신의 2번째 투여량을 1:5의 동일한 몰비로 첨가하고, 24시간 더 반응시켰다. 시료를 HPLC로 검사하고 Hb 테트라머의 농도가 70에서 30%로 감소되었을 때 화학 반응을 종결시켰다. 반응이 이 시점 이상으로 진행하면 과도한 크기의 중합체가 생성된다. 이어서, 물 및 탬 용액(pH 7.20)에 용해된 GSH를 Hb/GSH 1:20의 몰비로 Hb 용액에 첨가하고, 16시간 동안 반응시켰다.
이때, 헤모글로빈 분자 응집체는 다음의 성분들을 포함한다.
이 응집체는 50-51분에서 HPLC-DEAE에 의해 단일 피크를 나타낸다.
이러한 화학반응의 종결시, 헤모글로빈을 4℃에서 서서히 교반시키며 35psi에서 무균 산소로 반복 플러쉬하고, 또한 type 4051 molequartz(몰-리차드슨 캄파니(Mole - Richardson Co.), 캘리포니아주 헐리우드 소재)에 연결된 석영라인 등(quartzline lamp), DWY, 120V, 650W(제너럴 일렉트릭 캄파니(General Electric Co.) 오하이오주 클리브랜드 소재)에 의해 제공된 강한 광선과 20초 펄스에 노출시킴으로써 카르복시 형태에서 옥시 형태로 재전환시킨다. 헤모글로빈의 재산소화는 IL 쿡시메터를 사용하여 증명할 수 있다.
E. 최종 생성물의 제조
최종 단계에서, Hb용액을 pH 8.1의 50mM 탬 용액에 대해 먼저 투석시킨 후, 전해질 균형 식염수(노르모솔(Normosol) R. pH 7.4, 나트륨 140mEq/L, 칼륨 5mEq/L, 마그네슘 3mEq/L, 염화물 98nEq/L, 아세테이트 27mEq/L 및 글루코 네이트23mEq/L를 함유함)에 대해 투석시켰다. 최종 Hb응집체의 분자 크기 프로파일은 다음과 같다.
따라서, 가장 큰 비율의 분자 종류는 분자량이 260,000 달톤인, 4개의 Hb 테트라머로 이루어진다. 응집체는 50-51분에서 HPLC-DEAE에 의해 단일 피크를 나타내고, 이는 등전점이 6.8에서 6.1로 변화된 것을 반영한다.
폐기된 헤모글로빈을 함유하는 투석물을 6,000달톤의 인공신장(90 SCE 인공신장(씨-닥 캄파니))으로 투석시킴으로써 10g/dl의 Hb로 농축시킬 수 있으며, o-아데노신과 분자간 가교 결합시키기 위해 재사용할 수 있다.
최종 형태에서, 변형된 헤모글로빈은 10g/dl의 농도로 pH 7.4의 노르모졸 R에 용해된다. 마더슨 콜레만 앤드 벨(Matheson Colemand Bell, 오하이오주 노르우드 소재)사에서 구입한 염화 마그네슘(MgCl2)를 ATP와 동몰량으로 상기 용액에 첨가하였다. 깁코-덱스터 캄파니(GIBCO-Dexter Co., 오하이오주 샤그린 폴스 소재)사에서 구입한 만니톨을 용액의 2mg/ml의 투여량을 첨가하였다.
[실시예 2]
다음의 절차를 이용하여 신규 생성물을 특징화하였다. 헤모글로빈, met-Hb 및 카르복시-Hb 농도를 쿡시메터 (Model 282 Cooximeter, 인스트루멘테이션 래보래토리스, 매사추세츠주 렉싱턴 소재)에서 측정하였다. 용액의 전해질 농도 및 삼투압은 아스트라(ASTRA) 장치 (베크만 캄파니(Beckman Co.), 켈리포니아주 팔로 알토 소재)에 의해 측정하였다. 웨일(Weil) 장기 용적계(oncometer)(인스트루멘테이션 래보래토리스)를 사용하여 종장압(oncotic pressure)을 측정하였다. 브룩필드(Broodfield) 점도계(브룩필드 엔지니어링 래보래토리스(Broodfield Engineering Laboratories), 매사추세츠주 스터프턴 소재)를 사용하여 37℃ 및 100/초의 전단 속도에서 점도를 측정하였다. 다른 단백질, 인지질 및 박테리아 내독소로부터의 Hb의 순도를 상기한 바와 같이 측정하였다. 산소 결합 용량은 Hb 농도 측정 및 쿡시메터로 얻은 산소 용적 함량으로부터 계산하였다. Hb 산소 해리 곡선은 헴-O-스캔(Hem-O-Scan)장치(SLM Aminco, 아메리칸 인스트루먼츠(American Instruments), 매릴랜드주 실버 스프링 소재)으로 구하였다. 온도(37℃), pH(7.40) 및 pCO2(40토르)의 표준 조건 하에, 이 곡선 상에서 P50값을 읽었다. 인산염 함량에 대한 분석은 피스크(Fiske) 및 서바로우(Subbarow)의 방법[Journal of Bioligical chemistry, 66권: 제375-380페이지(1925년) 참조]로 실시하였다. GSH 함량의 측정은 리드(Reed) 등의 [Analytical Biochemistry, 106권: 제55-62페이지(1980년) 참조]에 따라 실시하였다. HPLC를 이용하고, 258nm에서 흡수도를 측정하며, 헤모글로빈에 도입된 양 및 헤모글로빈에 결합된 양을 계산하여, 아데노신을 검출하였다.
본 명세서에서 특성화된 생성물은 (Hb-PP-GSH)n (여기서, Hb는 정제된 소 헤모글로빈이고, PP는 2개의 푸린 유도체, o-ATP 및 o-아데노신이며, CSH 는 환원된 클루타티온이다)으로 확인되었다. 기본 분자는 제1도 및 2도에 도시한 테트라머 형태의 Hb이다. 다른 단백질로부터의 정제는 제3도에 예시하였다. 헤모글로빈 각 밀리몰(mM)에 대해서, 본 발명의 화합물은 ATP 1.05mM, 아데노신 10mM 및 GSH 7mM를 함유한다. 제조 과정 동안 다양한 간격에서 측정된, 이러한 화학 조성 및 HPLC분석에서는 o-ATP가 주로 Hb의 분자내 가교 결합에 관여하는 반면, o-아데노신은 분자간 가교 결합을 형성함을 나타낸다. 또한, o-아데노신은 GSH 분자를 Hb에 고정시킨다. 상기 화합물을 제4도 및 제5도에 나타낸다. HPLC(크기 배제)에 의한 스펙트럼 분석(제4도)에서는 다음 6개의 분자 종류로 이루어진 화합물을 나타낸다.
1. Hb(테트라머) = 5%
2. (Hb)2= 18%
3. (Hb)3= 20%
4. (Hb)4= 30%
5. (Hb)5= 16%
6. (Hb)6= 10%
이 중에서, (Hb)4, 즉, 4개의 테트라머의 응집체가 우세한 종류로 나타났다. HPLC-DEAE 컬럼에 의한 분석(제5도)에서는 상기 화합물이 균일하고 감소된 등전점을 갖는 것을 (비변형된 Hb에 대해) 지시하는, 50-51분에서 단일 피크를 나타낸다. 등전 집속법(IEF)에 의한 분석(제6도)에서는 다른 견지에서 Hb의 이러한 변형을 나타낸다.
탬 용액을 첨가하여 pH 7.4로 조정된 전해질 균형 식염수를 사용하여 투석한 후, MgCl2와 만니톨을 첨가하면, 최종 헤모글로빈 용액은 하기 표에 나타낸 조성을 갖는다.
10g/dl 농도에서, 대기 공기에 노출된 상기 Hb 용액은 산소 13용적 %를 전달하고, 이는 산소 결합 용량이 100%에 가깝다는 것을 나타낸다( Hb의 1 gm당 산소 1.3용적). 고농도의 염화물로 인한 중합화에도 불구하고 용액의 P50값은 높다(~28 mmHg). 삼투압은 혈장의 삼투압보다 높지만, 점도는 백혈구의 점도보다 낮다. 콜로이드 삼투압은 헤모글로빈이 중합되어 Hb 입자의 수가 감소된다는 사실로 인해, 높은 농도의 헤모글로빈(알부민에 비해)에도 불구하고 혈장의 콜로이드 삼투압보다 더 낮다.
[실시예 3]
o-ATP의 기본적인 제조 방법은 당 업계에 공지되어 있다 [에스.비. 이스터브룩-스미쓰(S.B. Easterbrook-Smith) 등, Pyruvate Carboxylase : Affinity labelling of the magnesium adenosine triphosphate binding site, European Journal of Biochemistry, 62권: 제125-130페이지(1976년) 참조].
더 많은 양의 물질을 생산하고, 헤모글로빈과의 만족스러운 화학 반응을 보장하도록 변경이 이루어졌다.
아데노신 5'-트리포스페이트 이나트륨염 수화물(ATP) (F. W. 551.15) 및 순도 99%의 과요오드산 나트륨(NaIO)(F. W. 213.89)를 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company, 위스콘신주 밀워키 소재)사로부터 구입하였다. 10개의 120ml 세파덱스 G-10 컬럼은 파마시아 파인 케미칼스(Pharmacia Fine Chemicals, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)사로부터 구입하였다. 각 컬럼에 대해서, ATP 550mg을 0℃에서 탬 용액을 사용하여 pH 7.0으로 조정한, 무균이고 피로젠이 없는 물(주사용수, 애보트 래보래토리스) 15ml에 용해시켰다. 과요오드산 나트륨을 ATP/NaIO1:1.1의 몰비로 첨가하고, 용액을 암실에 4℃에서 1시간 동안 방치해 두었다. ATP/에틸렌 글리콜 2:1의 몰비로 에틸렌 글리콜을 15분에 걸쳐 첨가하여 반응을 중지시켰다. 4℃에서 주사용수로 미리 평형화시킨 세파덱스 G-10 컬럼에 상기 반응 혼합물을 부하시켰다. 컬럼을 물 200ml로 용출시켰다. 제7도에 도시한 바와 같이 뉴클레오티드 피크의 앞쪽 절반인 분획물 20 내지 30을 모으고, 즉시 10μHg 미만의 진공 상태로 -40℃에서 랩콘코 동결-건조 시스템(Labconco Freeze-Dry System, Stoppering Tray Dryer가 부착됨, 랩콘코 캄파니(Labconco Co., 미주리주 캠사스 시티 소재)사 제품)으로 즉시 동결 건조시켰다. 분말은 사용할 때까지 -90℃에서 차광된 병에 저장하였다.
258nm에서 흡수도를 측정함으로써 o-ATP의 농도를 결정하는 한편, 과요오드산염의 존재는 232nm에서 흡수도를 측정함으로써 평가한다. 컬럼을 용출물이 232nm에서 0.043 미만의 흡수도를 나타낼 때 까지, 즉, 모든 과요오드산염이 세척될 때 까지, 재사용하기 전에 4℃에서 30분 동안 주사용수로 세척하였다.
본 발명의 목적을 위해서 다음 두가지 처치가 중요하다:
(1) 미량의 과요오드산염 조차도 함유하지 않는, o-ATP를 함유하는 분획물만을 모은다; 및 (2) 이들 분획물을 즉시 동결건조시키고, -90 ℃에서 냉동시킨다. 이러한 처치는 화학 반응시 헤모글로빈의 산화를 방지할 것이다.
[실시예 4]
o-아데노신의 대규모 제조
o-아데노신의 기본적인 제조 방법은 당 업계에 공지되어 있다 [제이.엑스. 카임(J.X. Khym) 및 더블유.이. 콘(W.E. Cohn), Characterizations and some chemical reasons of periodate- oxidized nucleotides, Journal of American Chemical Society, 82권: 제6380-6386페이지(1960년) 참조]. 더 많은 양의 물질을 생산하고 헤모글로빈과의 만족스러운 화학 반응을 보장하도록 변경이 이루어졌다.
98% 순도의 아데노신은 시그마 케미칼 캄파니사에서 구입하고, 과요오드산 나트륨은 알드리치 케미칼사에서 구입하였다. 아데노신 6g을 실온에서 30분 동안 물 중의 150 mM NaIO200ml에 용해시켰다. 이용액을 피셔 사이언티픽 캄파니사에서 구입한 20mM 아세트산(용출매 A)으로 미리 평형화시킨 음이온 교환 수지 AG 1-X-8, 100-200 메쉬 아세테이트 형태(바이오-라드 래보래토리스(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 리치먼드 소재)의 300ml 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 4℃의 온도에서 15ml/분의 유속으로 2리터의 용출매 A로 용출시켜, 분획물 150ml를 수득하였다. 분획물 2 내지 15만을 모아 (제8도에 도시한 바와 같음), o-ATP에 대해 실시한 바와 같이 즉시 동결 건조시키고 냉동시켰다.
재사용하기 전에, 100mM 염화 암모늄(용출매 B) 6l를 컬럼에 적용하여, 모든 과요오드산염을 방출시켰다. 분획물 중의 과요오드산염의 농도는 232nm에서 흡수도를 측정함으로써 결정하였다. 이 후에, 컬럼을 주사용수 6리터로 세척하고, 20mM 아세트산으로 다시 평형화시켰다.
본 발명의 목적을 위해서 다음 두가지 처치가 중요하다 :
(1) 미량의 과요오드산염 조차도 함유하지 않는, o-아데노신을 함유하는 분획물만을 모은다; 및 (2) 이들 분획물을 즉시 동결건조시키고 -90℃에서 냉동시킨다. 이러한 처치는 화학 반응시 헤모글로빈의 산화를 방지할 것이다.
[발명의 효용에 대한 설명]
[실시예 5]
토끼에서의 독성 시험
과학 문헌 [엠. 페올라 등, Toxicity of polymerized hemoglobin solutions, Surgery, Gynecology 및 Obstetrics, 166권: 제211-222페이지(1988년)]에 이미 보고된 방법에 따라 신규 조성물(Hb-PP-GSH)의 독성을 토끼에 대해 시험하였다.
체중 4.0kg의 뉴질랜드산 토끼 12마리를 1% 리도카인으로 국소 마취시킨 상태에서, 멸균 카뉼라를 한쪽 귀의 중심 동맥 및 다른 쪽 귀의 가장자리 정맥에 삽입하였다. 멸균 카테테르를 방광에 삽입하였다. 국소 마취시킨 상태에서, 더미스터(thermistor)탐침 및 ECG 침전극을 사지에 삽입하였다. 심전도(ECG), 혈압, 체온 및 소변 배출량을 3시간 동안 계속 모니터하고, 그 후 카테테르와 침전극을 제거하고 동물들을 우리로 되돌려 보냈다. 정상 상태(기저선)에서 30분 후에, 혈액용적(토끼의 계산된 혈액 용적 = 체중(kg)의 6%)의 ⅓에 해당하는 혈액 80ml를 5분에 결쳐 동맥으로부터 채혈하였다. 동일 면적의 Hb-PP-GSH를 30분에 걸쳐 정맥을 통하여 주입하였다. 이것은 헤모글로빈 2g과 거의 동일하다. 혈액을 제거하면, 심박수는 증가하고, 혈압은 저하된다. 이러한 변화는 신속히 교정된다. 또한, 출혈 이후 좁아진 맥압 (수축기 혈압과 확장기 혈압의 차이)은 처음에는 정상으로 회복된 후, 기저선에서 보다 더 커지게 되며, 이는 Hb 용액의 혈관 확장의 효과를 지시한다. 이 효과는 3시간의 정확한 전체 관찰 기간 동안 지속하였다. ECG에서는 심장 부정맥이 나타나지 않았다. 소변 배출량은 소변으로 헤모글로빈의 일혈없이 정상으로 유지되었다.
혈액 대체 후 30분, 1시간, 3시간 및 24시간에 채혈한 혈액 시료는 다음과 같이 나타났다 : (1) 과도한 혈관 확장 효과에서, 백혈구 및 혈소판이 감소되지 않았다; (2) 혈청 피브리노겐, 프로트롬빈 시간 및 피브린 스플릿 생성물의 측정에 의해 결정되는 바와 같이, 혈관내 응고 및 섬유소 용해가 활성화되지 않았다; (3) 대뇌 또는 심근 손상을 암시하는 크레아틴 포스포키나제 뇌 동위효소(isoenzyme)(CPK-BB) 또는 심근 동위효소(CPK-BB)의 상승이 일어나지 않았다; (4) 간 손상을 암시하는 혈청 글루타민산 피루브산 트랜스아미나제(SGPT)의 상승이 일어나지 않았다; (5) 정상적인 폐 기능의 지표가 되는 정상 동맥 혈액 기체; (6) 정상적인 신장 기능을 암시하는 정상 혈청 크레아티닌. 3시간 및 24시간에 얻은 혈액 및 소변의 혈액 시료는 다시 정상적인 신장 기능의 지표가 되는 정상 크레아티닌 정화율을 나타냈다. 전혈 산소 해리 곡선에서 P값은 변화하지 안았고, 즉, 헤모글로빈에 의한 산소 친화력이 증가하지 않았다. 24시간에서의 혈장 Hb의 수준은 초기 수준의 약 50%였고, 이는 24시간의 헤모글로빈 반감기를 암시한다.
동물은 24시간 동안 정상으로 나타나며 행동한다. 이 때, 동물들을 희생시키고, 생체 기관을 조직학적으로 시험하였다. (a) 심장, (b) 폐, (c) 간 및 (d) 신장에서 과학 문헌들에 이미 보고되어 있는 어떤 병리학적 변화도 발견되지 않았다. 이러한 조사 결과는 예전에 글루타르알데히드와 가교 결합된 비순수 헤모글로빈을 사용한 후에 보고되었던 조사 결과와 뚜렷이 대조된다.
[실시예 6]
토끼에서의 효능
혈액 대용품으로서의 본 발명의 생성물의 효능을 토끼에서 시험하였다. 상기 실시예에 기재된 방법과 유사한 방법에 따라, 체중 4.0kg의 뉴질랜드산 토끼 10마리의 대조군에 대해 계산된 혈액 용적(혈액 용적 = 체중(kg)의 6%)의 ⅓을 채혈한 후, 15분 후에 ⅓을 더 채혈하였다. 아무런 처리도 하지 않으면, 모든 동물들은 1시간 내에 사망한다. 10마리의 실험군에 대해 상기 절차를 반복하지만, 총 채혈량과 동일한 용적의 Hb-PP-GSH를 주입하였다. 모든 동물들은 생존하였고, 7일 내에 그의 기저선 헤마토크릿(적혈구의 농도)을 재구성하였다.
[실시예 7 ]
쥐에서 혈액 대체 후의 혈관 확장
체중 350-450 gm의 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 쥐 12마리를 펜토바르비탈 나트륨 45 mg/kg을 복강내 주사하여 마취시키고, 수술대 위에 반듯이 눕혀 놓았다. 우대퇴 동맥, 경동맥 및 외부 경정맥을 외과적으로 노출시켜, 폴리에틸렌 카데테르(Model PE 50; 인트라메딕(Intramedic), 뉴욕 소재)로 캐눌라로 연결시켰다. 외부 경정맥 카테테르를 우심방에 도입하고, 더미스터 탐침 (Model IF, 콜롬부스 인스트루먼츠(Columbus Instruments), 오하이오주 콜롬부스 소재)를 경동맥을 통해 상행 대동맥에 도입시켰다. 각각의 카테테르를 소 헤파린 5 IU/ml를 함유한 식염수로 채웠다. 대퇴 동맥 및 경정맥을 압력 변환기에 연결하였다. 침전극을 사지에 피하 삽입하여 심전도(ECG)를 모니터하였다. 가열 램프는 일정 체온을 유지하도록 조절하였다.
심박수는 ECG 추적으로 결정하고, 심장 혈액 박출량은 실온 (20-22℃)으로 유지된 식염수 200㎕를 우심방에 주입하고 대동맥 더미스터로부터 열희석 곡선을 기록함으로써 열희석법에 의해 측정하였다. 전신 혈관 저항은 평균 동맥압에서 우심방압을 빼고 심장 혈액 박출량으로 나누어 계산하였다.
기저선 혈류역학 데이터를 기록한 후, 계산된 혈액 용적 (쥐의 혈액 용적 = 체중(kg)의 7%)의 ⅓을 5분에 걸쳐 동맥에서 채혈하였다. 15분 후에, 동일한 용적의 Hb-PP-GSH를 정맥을 통하여 주입하였다. 심박수, 평균 동맥압 및 심장 혈액 박출량을 측정하고, 전신 혈관 저항을 기저선(T), 혈액 제거후 15분(T), 및 헤모글로빈 주입 후 15분(T)에 계산하였다. 짝진(paired) 데이터에 대한 스튜던트 t-시험법(Student's t-test)을 사용하여 데이터를 통계학적으로 분석하였다.
하기 요약된 결과는 혈액 제거 후 전신 혈관 저항이 증가된 다음, 혈액 대체 후에 정상으로 감소되고, 기저선에 비해서조차 혈관이 확장된 것을 나타낸다.
[실시예 8]
토끼에서 산소 유리 라디칼의 생성:
체중 4.0kg의 뉴질랜드산 토끼 12마리를 클로르프로마진 (5mg/kg, 근육내 주사)으로 진정시키고 정해진 방법으로 처리하였다. 멸균 플라스틱 카뉼라를 한쪽 귀의 중심 동맥 및 가장자리 정맥에 삽입하고, 더미스터 탐침 및 침전극을 사지에 피하 삽입하였다. 계산된 혈액 용적 (체중(kg)의 2%)의 ⅓을 5분에 걸쳐 동맥으로부터 제거하고, 동일한 용적의 Hb 용액을 30분에 걸쳐 정맥을 통하여 주입하였다. 6마리 토끼의 한 대조군에는 비변형된 Hb를 주입하고, 6마리 토끼의 실험군에는 Hb-PP-GSH를 주입하였다. 기저선, Hb 주입 후 15분, 1시간, 3시간 및 24시간에 결정한 과산화수소 (HO) 및 과산화 지질의 혈장 농도에 대해서 효과를 연구하였다. 혈장 Hb 및 met-Hb도 또한 동일한 시간 간격에서 측정하였다.
비변형된 Hb를 주입한 군에서 HO는 1시간 후에 2 ± 2 마이크로몰/밀리리터(μmol/ml에서 70±5μmol/ml로 증가된 다음, 3시간 후에는 50 ± 5 μmol/ml로 감소되고, 24시간 후에는 10 ± 5 μmol/ml로 감소되었다. 실험군에서, HO는 1시간 후에 2 ± 2에서 10 ± 2 μmol/ml로만 증가되고, 3시간 후에는 기저선으로 회복되었다. 유사하게, 대조군에서 과산화 지질은 기저선에서 1.5±0.9 nmol/ml이었다가, 1시간 후에 4.0 ± 1.0 nmol/ml 로 증가하였다. 실험군에서는 유의한 증가가 일어나지 않았다. 비변형된 Hb를 주입한 군에서 혈장 met-Hb는 1시간 안에 0%에서 15%로 증가하였다. Hb-PP-GSH를 주입한 군에서는 0%에서 5%로 증가하였다. 통계학적 분석, 짝진 시료 및 짝지지 않은 시료에 대한 스튜던트 t-시험법 + 아노바(ANOVA)에서 두 군 사이의 상기 변수의 차이가 유의한 것으로 밝혀졌다.
본 발명이 상기 구체적인 실시태양과 함께 기재되어 있지만, 많은 별법, 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당 업계의 숙련자에게 명백할 것이다. 그러한 별법, 변화 및 변형은 첨부된 청구 범위의 취지 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
Claims (16)
- 실질적으로 파이로젠이 없고, 미생물이 없는 활성 헤모글로빈을 과요오드산염 산화된 ATP(o-ATP) 및 과요오드산염 산화된 아데노신 (o-아데노신)과 반응시켜, 분자내 및 분자간 가교 결합된 헤모글로빈 생성물을 형성하고, 이를 식염수에 용해시킨, 혈액 대용품으로서 사용하기 위한 조성물.
- 제1항에 있어서, 일정량의 환원된 글루타티온을 더 함유함을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, o-ATP와 거의 동몰량 농도의 염화 마그네슘을 더 함유함을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 헤모글로빈이 과요오드산염 산화된 ATP와 분자내 가교 결합하고, 과요오드산염 산화된 아데노신과 분자간 가교 결합하여 폴리헤모글로빈 분자를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 글루타티온을 더 함유하며, 헤모글로빈, o-ATP, o-아데노신 및 글루타티온이 각각 약 1:1.05:10:7의 몰비로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 가교 결합된 헤모글로빈 분자의 분자량이 약 130내지 약 390킬로달톤 범위임을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 5% 미만의 헤모글로빈이 met-헤모글로빈으로 산화됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 헤모글로빈이 소에서 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 전혈을 원심분리시켜 혈소판 및 혈장을 제거하고, 생성된 백혈구-적혈구 혼합물을 용액 중에 현탁시키는 단계; 상기 백혈구-적혈구 혼합물을 냉각시켜 백혈구를 응집시키는 단계; 여과에 의해 상기 백혈구 응집체를 제거하는 단계; 적혈구를 저장성 용액에 대해 투석하고, 증가된 정수압 하에 적혈구를 한외여과시켜 헤모글로빈을 추출하는 단계; 상기 헤모글로빈을 일산화탄소로 포화시켜 헤모글로빈을 카르복시 형태로 전환시키는 단계; 상기 헤모글로빈 용액을 저온 살균시켜 무-헴(non-heme) 단백질을 변성시키고 침전시키는 단계; 상기 헤모글로빈 용액을 클로로포름과 혼합하여 원심분리시켜, 인지질 및 침전된 무-헴 단백질을 제거하는 단계; 상기 헤모글로빈 상등액을 일산화탄소 기체로 플러쉬시켜 그로부터 잔류 클로로포름을 제거하는 단계; 및 상기 헤모글로빈 용액을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 그로부터 내독소를 제거하는 단계를 포함하는 전혈로부터 정제된 헤모글로빈을 추출하는 방법.
- 상기 정제된 헤모글로빈의 용액을 일산화탄소로 포화시켜 헤모글로빈을 카르복시 형태로 전환시키는 단계; 생성된 카르복시-헤모글로빈 용액을 등장 용액에 대해 투석시켜, 헤모글로빈을 약 10g/dl로 농축시키는 단계; 상기 카르복시-헤모글로빈을 산화된 아데노신 트리포스페이트 (o-ATP)와 반응시켜 헤모글로빈 분자 내에 주로 분자내 가교 결합을 수행하는 단계; 상기 카르복시-헤모글로빈을 산화된 아데노신 (o-아데노신)과 반응시켜 헤모글로빈 분자 사이에 주로 분자간 가교 결합을 수행하는 단계; 상기 용액에 글루타티온을 첨가하여 0-아데노신 가교 결합 반응을 종결시키는 단계; 및 용액을 산소로 플러쉬시켜 헤모글로빈을 카르복시- 형태에서 옥시- 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 혈액 대용품으로서 사용하기에 적합한 조성물의 제조 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 헤모글로빈 조성물을 염화 마그네슘을 함유하는 용액 중에 용해시키는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물에 만니톨을 첨가하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, o-아데노신 및 o-ATP를 각각 아데노신 및 ATP의 과요오드산염 산화에 의해 제조하며, o-ATP 및 o-아데노신을 헤모글로빈과 반응시키기 전에 과요오드산염을 제거함을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 제9항에 의한 방법을 이용하여 전혈로부터 정제된 헤모글로빈을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 전혈이 소로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 따른 방법에 의해 제조된 헤모글로빈 조성물.
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