KR0165691B1 - 장출혈성 대장균 015:h7 및 026:h11에 대한 단일클론 항체 및 검출 방법 - Google Patents
장출혈성 대장균 015:h7 및 026:h11에 대한 단일클론 항체 및 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대장균 0157:H7의 균주를 사용하여 BALB/c 생쥐를 면역화시킴으로써 생성되는 장출혈성 대장균 0157:H7 및 026:H11에 특이적인 단일클론 항체에 관한 것이다. 항체는 장출형성 대장균 0157:H7 및 026:H11의 균주의 약 5,000 내지 6,000달톤의 분자량을 갖는 외막 단백질과 효소-결합된 면역흡착 분석법에 의해 강하게 반응한다. 또한, 이 생물체를 검출하기 위한 신속하고 민감한 분석법이 기재되어 있다.
Description
[발명의 명칭]
장출혈성 대장균 0157:H7 및 026:H11에 대한 단일클론 항체 및 검출 방법
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 단일클론 항체를 생성하도록 개발된 하이브리도마세포 주에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 장출혈성 대장균(Escherichia coli) 0157:H7(이. 콜리 0157:H7) 및 대장균 026:H11(이. 콜리 026:H11)에 대한 단일클론 항체를 생성하는 세포 주에 관한 것이다.
[선행기술의 설명]
특정 패스트-푸드 체인으로부터 덜익힌 쇠고기를 섭취한 것과 관련하여 국부적으로 별도인 두가지 출혈성 대장염의 발병의 원인으로서 진단되었던 이. 콜리 0157:H7은 그 당시 1982년에 미합중국에서 중요한 인간 병원체로서 처음 인식되었다(Riley, Lee Wet al., 1983, Hemorrhagic Colitis Associated With A Rare Escherichia Coli Serotype, The New England Journal of Medicine, Vol. 308, No. 12. pgs. 681-695참조). 이 생소한 위장병의 발병은 갑작스런 심한 복통 증세 및 열이 없거나 미열을 수반하는 육안으로 보이는 혈변의 개시로 특징지워진다. 이러한 질병은 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11과 관련되어 있다(Levine, M. M. 1987, Escherichia coli that Cause Diarrhea: Enterotoxigenic, Enteropathogenic, Enteroinvasive, Enterohemorrhagic, and Enteroadherent, Jouranl of Infectious Disease, Vo. 155, pgs. 377-389;Levine, M. M., et al., 1987, A DNA Probe to Identify Enterohemorrhagic Escherichia coli of 0157:H7 and Other Serotypes that Cause Hemmorhagic Colitis and Hemolytic Uremic Syndrome, Journal of Infectious Diseases, Vol. 156, pgs. 175-182 참조). 이들 세균을 장출혈성 이. 콜리로 정의한다.
이. 콜리 유기체는 인간을 포함한 여러 포유동물에 심각한 장출혈을 유발시키는 베로톡신(verotoxins)으로 알려져 있는 독소를 생성한다. 이. 콜리 0157:H7 감염과 관련된 질병의 범위는 무증후성 감염 내지 무출혈성 설사, 출혈성 대장염, 용혈성 요독증 및 사망에 이르기도 한다(Ryan, Caroline A. et al. 1986, Escherichia coli 0157:H7 Diarrhea in a Nursing Home:Clinical, Epidemiological, and Pathological Findings, Journal of Infectious Diseases, Vo1. 154, No. 4, pgs. 631-638 참조). 용혈성 요독증은 기도의 상부, 위 또는 장에서 증세가 나타난 후 갑작스럽게 발병되는 용혈성 빈혈, 혈소판감소증 및 급성 신부전증으로서 정의된다. 용혈성 요독증은 일반적으로 수많은 다른 자극 사상과 발병 기작의 최종 결과이다.
유기체를 육류 및 가금 및 저온살균되지 않은 우유로부터 단리하였다. 여러 보고에서는 식품, 특히 특정 동물성 식품은 이. 콜리 0157:H7 감염의 중요한 원인이 될 수 있음을 제안하고 있다(Doyle, Michael P. and Jean L. Schoeni, 1987, Isolation of Escherichia Coli 0157:H7 from Retail Fresh Meats and Poultry, Applied and Environmental Microbiology, Vo1. 53, No. 10, pgs. 2349-2396 참조).
대부분의 출혈성 대장염의 발병이 식품과 관련되어 있기 때문에, 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11을 검출하기 위한 신속하고 민감하며 특이적인 분석법이 요구되고 있다. 최근의 식품내 유기체를 검출하기 위해 이용할 수 있는 방법은 시간이 많이 소모되거나 또는 고도로 특이적이 아니다. 예를 들어, 미합중국 위스콘신주 매디슨에 소재한 푸드 리써치 인스티튜트(Food Research Institute, Madison, Wisconsin)은 현재, 이. 콜리 0157:H7 유기체 검출을 위해 많은 시약을 사용하고 있다. 그러나 푸드 리써치 인스티튜트에 의해 이용되는 방법은 상기 도일(Doyle)과 쇼에니(Schoeni)의 문헌에 기재된 복잡하고 시간이 며칠 소요되는 방법이다. 도일과 쇼에니는 여러 가지 육류를 시험하고 시험된 육류 중 약 1% 또는 2%에서 유기체를 발견하였다. 또한, 이 유기체는 분변, 생우유 등으로부터 단리될 수 있다. 실험적으로 감염된 닭에서 얻은 난의 표면에도 오염된다.
유기체를 분석하기 위한 제1단계는 식품 시료내의 유기체를 농축시키는 것이다. 식품 시료가 소량의 유기체를 가질 수 있기 때문에, 시료를 농축 배지에 놓아 기타 형태의 세균을 억제하고 원하는 유기체의 수를 증가시킨다. 농축 배지는 이. 콜리 0157:H7을 포함한 그람-음성 세균에 대해 선택적인 선택적 시약을 갖는다. 이어서 배지를 37℃에서 배양한다.
이어서, 배양된 시료를 소수성 그리드 막 여과지(HGMF)에 통과시킨다. 여과지를 약 1,400 내지 1,600의 작은 사각형으로 세분하였다. 여과지를 구별하기 위해 왁스를 사용한다. 왁스는 콜로니를 계속 단리시킨다. 이어서, 여과제를 제거하고 니트로셀룰로오스지 조각상에 놓는다. 니트로셀룰로오스지를 농축배지에서와 동일한 선택적 시약을 함유한 몇몇 한천 배지에 놓는다.
이어서, 플레이트를 37℃에서 철야 배양한다. 이렇게 하면, 여과지상에 콜로니가 생긴다. 그것이 자라면서 베로톡신을 만든다. 이 독소를 니트로셀룰로오스지에 트래핑한다. 이어서, 여과지를 제거하고 저장한다. 그 후, 니트로셀룰로오스지를 제거하고 독소에 대해 토끼중에서 생성되는 항체를 사용하는 면역블로트법을 개발하였다. 블로트를 전개한 후, 독소가 존재하는 페이퍼상의 반점을 관찰한다. HGMF상의 반점을 HGMF상의 세균성 클론과 대비시킨 후, 일치하는 콜로니를 생화학적 또는 기타 시험에 의해 표적 이. 콜리 0157:H7로서 확인한다.
요약하자면, 유기체는 선택적인 농축 배지중의 식품 시료중에서 성장한다. 이어서 유기체를 일련의 방법으로 단리한다. 분리된 단리체를 아래에 놓여진 여과지내로 확산시켜 트래핑한다. 이어서, 시약으로서 독소에 대한 항체를 사용하여 독소를 검출한다. 위에 놓여진 그리드 여과제상의 세균성 콜로니를 독소와 반점을 나타내는 여과지를 사용하여 배열시킨다. 독소를 생성시킨 콜로니를 표준 분류방법에 의해 동정한다.
이 방법에서는, 저농도의 유기체가 주입된 식품 시료로부터 이. 콜리 0157:H7를 효율적으로 단리할 수 있지만, 복잡하고, 각각에 대해 소요되는 시간이 많기에 수용불가능하다.
헬쓰 앤드 웰퍼어 캐나다(Health and Welfare Canada)에 의해 개발된 것과 같은 기타 시험이 개발되었다. 이 시험에는 이. 콜리 0157에 대한 단일클론 항체가 사용되지만, 살모넬라 군 N 및 H7이 아닌 중요하지 않은 이. 콜리 0157균주와 같은 다른 장과 교차-반응하기 때문에 특이적인 시험이 아니다(Todd, E. C. D. et al, 1988, Rapid Hydrophobic Membrane Filter-Enzyme Labeled Antibody Procedure for Identification and Enumeration of Escherichia coli 0157:H7 in Foods Applied and Environmental Microbiology, Vo1. 54, pgs. 2536-2540 참조).
유전자-탐침 기재 분석법은 베로톡신을 코딩하는 DNA를 결합하는 것을 기초로 한다(상기 레빈(Levine), 엠. 엠.(M. M.) 등의 문헌(1987) 참조). 따라서, 모든 베로톡신-생성 이. 콜리는 단독의 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11이 아닌 다음과 같은 방법에 의해 검출된다.
[발명의 요약]
본 발명의 목적은 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대해 고도로 특이적인 단일클론 항체를 생성하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11을 분석하는 단일클론 항체를 사용하는 시험을 개발하는 것이며 이 방법은 사용가능한 시간을 예를 들어 1일 이내로 단축시킨다.
본 발명의 또 다른 목적은 식품 및 분변 피검물내 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11을 신속히 검출하기 위한 ㅕㄴ역 분석법을 개발하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식품 또는 기타 시료로부터 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11을 단리시키는 방법을 개발하고, 시료내 유기체의 우세성을 결정하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장출혈성 이. 콜리의 균주를 동정하기 위한 마커로서 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11의 특이적인 외막 단백질을 사용하는 것이다. 이 마커에 특이적인 단일클론 항체를 기재로 하는 ELISA를 포함한 분석법은 식품, 환경 및 임상 피검물로부터 단리된 장출혈성 이. 콜리를 검출하고 감별하는데 사용될 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예를들어, 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11의 존재를 분석하기 위한 시험 키트내의 유용한 항체 분석용 생물학적 시약의 합성을 준비하는 것이다.
본 발명은, 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 특이적인 단일클론 항체는 이. 콜리 0157:H7의 조(rough) 균주로 예비면역화된 생쥐로부터 얻은 비장 세포와 생쥐 골수종 주로부터 얻은 세포의 융합에 의해 형성된 하이브리도마에 의해 생성된다고 요약할 수 있다. 이 조 균주를 변형시킨 결과, 세포 표면상에 0157 항원의 발현을 포함하는 평활한 리포폴리사카라이드가 부족하게 된다. 단일클론 항체는 약 5,000 내지 6,000 달톤(dalton)의 분자량을 갖는 단백질과 반응하는 것으로 특징지워진다. 이 단백질은 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11의 외막 단백질의 일부이다. 이 단백질은 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대해 분명한 특이성을 갖는다. 또한 단일클론 항체는 서브클래스 면역 글로블린 G2a의 일원이며 카파선 사슬을 갖는 것으로 특징지워진다.
또한, 본 발명은 이. 콜리 0157에 대한 다가클론 항체가 흡착체기질 단위에 결합하여 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위를 생성하는 단계, 기지량의 시험물을 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위에 노출시켜서, 항체를 시험물에 존재하는 모든 이. 콜리 0157:H7 유기체에 결합하도록 유도하여 반응시킨 미지의 시료를 생성시키는 단계, 기지량의 이. 콜리 0157:H7을 갖는 이. 콜리 0157:H7 유기체의 표준 제제 소정량을 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위에 노출시켜서 반응시킨 대조 시료를 생성시키는 단계, 반응시킨 미지 시료 및 대조 시료를 이. 콜리 0157:H7에 대한 단일클론 항체(4E8C12)에 노출시켜서 결합된 이. 콜리 0157:H7과 반응시키는 단계, 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위상에 결합된 이. 콜리 0157:H7과 반응하지 않은 단일클론 항체를 제거하는 단계 및 이. 콜리 0157에 대한 제1 및 제2 항체-충전된 기질 단위상의 반응시킨 단일클론 항체의 존재를 상대적으로 정량 분석하는 단계로 이루어진, 시험물 내 이. 콜리 0157:H7의 존재에 대한 분석 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 항체를 생성할 수 있는 세포를 골수종 세포와 융합함으로써 형성된 하이브리도마를 증식시키고 하이브리도마에 의해 생성된 항체를 수거하는 것으로 이루어진, 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 단일클론 항체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 특이적인 단일클론 항체 및 그의 사용 지침으로 이루어진, 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및(또는) 이. 콜리 026:H11의 존재를 분석하기 위한 진단용 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약 5,000 내지 6,000달톤의 분자량을 갖는 실질적으로 순수한 단백질로 이루어진 항체 분석용 생물학적 시료에 관한 것이다. 이 단백질은 이. 콜리 0157:H7 또는 이. 콜리 026:H11에 외막에서 발견되며, 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 단일클론 항체와 특이적으로 반응할 수 있다.
또한, 본 발명은 약 5,000 내지 6,000 달톤의 분자량을 가지며 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 단일클론 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 이. 콜리 0157:H7 또는 이. 콜리 026:H11이 외막내에서 발견되는 실질적으로 순수한 단백질에 관한 것이다.
그의 고특이성 때문에, 단일클론 항체는 식품 및 임상 피검물내 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및(또는) 이. 콜리 026:H11을 신속히 검출하는데 유용한 시약일 수 있다. 게다가, 시험 공정을 1일 이내로 단축시켜야 한다. 시험 방법은 우선 선택된 성장 배지상에서 유기체를 성장시킨 다음, 예를 들어 효소-결합 면역 분석법(enzymelinked immunosorbent assays, 이하 ELISA) 및 기타 면역분석법에 의해 유기체의 존재를 시험하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 식품과 같은 기질 내의 이. 콜리 0157:H7을 검출하기 위한 특이적이며 민감한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 아크리플라빈(acriflavin(e))을 함유한 선택적 농축 배지를 강화시켜 농축 배양물을 형성하는 것이다. 농축 배양물을 ELISA 분석법과 같은 분석법에 적용한다. 이 방법은 고도로 특이하고 민감할 뿐만 아니라 수행이 신속하고 용이하며 통상의 미생물학적 시험을 수행하는 실험에 사용할 수 있다. 기질내의 이. 콜리 0157:H7의 예상되는 양성 반응을 20시간 미만내에 확인할 수 있다. 유기체를 예상 양성 검출 후 2일 이내에 이. 콜리 0157:H7로서 단리하고 확인할 수 있다.
본 발명의 목적 및 잇점은 본 발명의 바람직한 실시태양인 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1a도는 이. 콜리 0157:H7 균주 932(레인 3), 이. 콜리 HAI(레인 4), 이. 콜리 026:H11 균주 94-381(레인 5), 이. 콜리 026:H11 균주 89326, 이. 콜리 0157:H7(레인 7), 및 이. 콜리 0157:H45(레인 8)의 외막 단백질(OMP)의 트리신(tricine)-SDS-PAGE프로파일을 설명하는 사진이다. OMP의 시료 5㎍을 레인당 적용하였다. 저분자량 표준(왼편을 나타낸, 수천)을 레인1 및 2에 나타낸다. 겔을은 염색하였다.
제1b도는 MAb 4E8C12로 처리된 SDS-PAGE-분리된 OMP의 서던 블로트를 설명하는 사진이다. 레인 번호는 제1A도에 나타낸 OMP 제제에 대응한다.
제2도는 실시예 II에 기재된 바와 같이 이. 콜리 0157:H7을 검출하기 위한 직접적 ELISA에서 단일클론 항체 4E80C12의 민감성을 설명하는 그래프이다.
제3도는 mTSB에서 교반하여 성장된 순수한 배양물내 이. 콜리 0157:H7 균주 932를 검출하는 샌드위치 ELISA의 민감성을 설명하는 그래프이다.
제4도는 샌드위치 ELISA에 의한 이. 콜리 0157:H7 균주 932의 검출에 대한 성장 온도의 효과를 설명하는 그래프이다. 세포를 mTSB에서 교반하거나 또는 교반하지 않으면서 성장시켰다. 주석:▲=교반하 37℃; △=교반하 30℃; ■=정적 37℃; □=정적 30℃.
제5도는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은, Mab 4E8C12와 반응하는 이. 콜리 0157:H7 항원의 발현 증진에 대한 농축 배지 중의 아크리플라빈-HCI(10mg/L) 및(또는) 카자미노산(10g/L)의 효과를 나타내는 그래프이다. 이. 콜리 0157:H7 균주 932의 배양물을 37℃에서 교반하에 성장시켰다. 주석:○=mTSB; ■=mTSB+카자미노산; □=mTSB+아크리플라빈-HCI;●=mTSB+아크리플라빈-HCI+카자미노산.
[바람직한 실시 태양의 상세한 설명]
장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11은 중요한 인간병원체로서 확인되어 있다. 이들은 1종 이상의 독소(베로톡신)을 생성하여 인간을 포함한 각종 포유 동물에게 심각한 장 출혈을 야기시킨다. 이것은 생우유, 구입한 날육류 둥에서 발견되며, 아마도 분변 오염에 의해 도입될 것이다. 상기 리얀(Ryan) 등의 문헌(1988)에 기재된 이. 콜리 0157:H7의 몇가지 특징은 다음과 같다. 이. 콜리 0157:H7은 열에 안정하거나 또는 열에 불안정한 엔테로톡신을 생성하지 않는다. 이것은 HeLa 세포에 공격적이 아니며 결합하지 않는다. 이것은 쉬가(Shiga) 톡신과 유사한 것으로 보이는 베로톡신을 높은 수준으로 생성한다. 이. 콜리는 문헌[Padhye, Vikas V. et al., 1989, Production and Characterzization of Monoclonal Antibodies to Verotoxins 1 and 2 from Escherichia coli of Serotype 0157:H7, Journal of Medical Microbiology, Vol. 30, pgs. 219-226]에 기재된 바와 같이, 1종 이상의 다른 베로 세포 세포독소를 생성한다고 나타난다.
이. 콜리 026:H11은 이. 콜리 0157:H7과, 둘 다 베로톡신을 생성하고 출혈성 요독증 및 출혈성 대장염을 유발시키는 장출혈성 이. 콜리란 점에서 유사하다(Bopp, C. A., et al., 1987, Unusual Verotoxin-Producing Escherichia coli Associated with Hemorrhagic Colitis, J. Clin. Microbiol,. Vol. 25, pgs. 1486-1489;Karmali, M. A. et al., 1983, Sporadic Cases of Hemolytic Uremic Syndrome Associated with Fecal Cytoxin and Cytoxin Producing Escherichia coli in Stools, Lancet, Vol. i, pgs. 619-620;Levine, M. M., supra., 1987 참조).
개략적으로는, 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대해 특이적이며 4E8C12로 표시하는 단일클론 항체는 0157 항원이 결핍된 이. 콜리 0157:H7의 조 균주에 의해 BALB/c 생쥐를 면역화시킴으로써 생성된다. 이렇게 면역화된 생쥐로부터 얻은 비장 세포를 공지된 방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜중에서 처리하여 생쥐 골수종 세포와 융합시킨다. 얻어진 하이브리도마를 배양한 다음 항체 활성을 위해 선택하였다. 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 특이적인 항체를 생성하는 세포를 당분야에 주지된 방법으로 ELISA 수단에 의해 검출하였다. 항체를 통상의 방법으로 복수액으로부터 정제하였다. 이렇게 생성되고 선택된 클로닝된 세포 주를 통상의 세포 배양 기술에 의해 영속시켰다.
이러한 방법으로 생성된 하이브리도마는 1990년 5월 10일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 HB10452라는 표시하에 기탁되었다. 이 특정 하이브리도마 및 그에 의해 성성된 항체는 다른 표시가 없는 한 하기에 기재되는 하이브리도마 및 단일클론 항체이다. 하이브리도마의 제조에 대해서는 이하에 설명한다. 하이브리도마를 참고로 ATCC HB 10452로 표시한다.
이것은 부다페스트 조약하에 특허 절차 및 규정에 적합한 국제 미생물 기탁 기관에 기탁된 것이다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 생육가능한 배양물의 생존을 보장한다. 유기체는 부다페스트 조약의 조항하에 ATCC에 이해 이용할 수 있고, 출원인과 ATCC 사이에 협정을 맺어서 대응 미합중국 특허받거나 또는 어느것이 우선이 되든 미합중국 또는 외국 특허 출언이 공개되었을 때 일반에게 배양물의 자손을 영구히 비제한적으로 이용할 수 있도록 보장하며, 특히 886OG638에 대한 37 CFR § 1.14를 포함하여 35USC § 122 및 특허청장령에 따라 명명되는 미합중국 특허 및 상표청장에 의해 정해진 자손의 이용가능성을 보장한다. 본원의 양수인은 기탁된 배양물이 적절한 조건하에 배양될 때 죽거나 또는 유실되거나 또는 파괴되는 경우, 인지하는 즉시 동일한 배양물의 생육가능한 시료로 신속히 대체시킬 것에 동의한다. 기탁된 균주의 이용가능성을 특허법에 따른 어느 정부 기관에 의해 부여된 권리를 위반했을 때 발명을 실시하는 허가로서 간주하지 않는다.
앞서 보고된 내용과는 반대로, 이. 콜리 0157:H7과 반응할 뿐만 아니라 체세포 0157 항원에 결합하여 혈청군(serogroup) 0157에 속하는 모든 이. 콜리와 반응하는 단일클론 항체에 대해 기재되어 있고(Perry, M. B. et al., 1988, Indentification of Escherichia coli Serotype 0157 Strains by Using a Monoclonal Antibody, J. Clin Microbiol., Vol 27, pgs. 1973-1978 참조), 본 발명의 단일클론 항체는 0157 항원과 반응하지 않으며, 한 다른 혈청형(serotype) 이. 콜리를 제외하고는, 이. 콜리 0157:H7에 대해 매우 특이적이다. 다른 혈청형 이. 콜리는 026:H11이다. 여기에 사용된 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대해 특이적이란 표현은 본 발명의 단일클론 항체가 하기의 실시예 I의 표 2에 기재된 이. 콜리 균주와 반응하지 않음을 의미하는 것이다.
ELISA, 및 각종 장염의 면역블로팅에 의해서 특이성에 대해 항체를 시험하였다. 이 수단에 의해서, 단일클론 항체는 각각 이. 콜리 0157:H7의 36종의 균주 및 이. 콜리 026:H11의 5종의 균주를 사용한 직접적 ELISA에 의해 강한 반응을 형성한다고 결정되었다. 그러나, 예를 들어, 살모넬라(Salmonella), 예르시니아 엔트로 콜리티카(Yersinia entrocolitica), 쉬겔라(Shigella), 프로테우스(Proteus), 클렙시엘라(Klebsiella), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 세라티아(Serratia), 에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 시트로박터(citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 하프니아(Hafnia), 에스케리키아 헤르마니이(Escherichia hermanii) 및 혈청형 0157:H7 및 026:H11 이외의 모든 기타 이. 콜리의 균주(H7이 아닌 혈청형 0157의 균주 포함)와 같은 다른 장염의 균주와의 교차-반응성은 없다.
이. 콜리 0157:H7 및 026:H11에 대한 단일클론 항체에 대해 연구한 결과, 단일클론 항체(Mab)는 다음과 같은 특징을 갖는다:(1) 서브 클래스 IgG2a의 일원이며; (2) 카파선 사슬을 갖고 ; (3) 다른 혈청형 이. 콜리의 외막 단백질을 SDS-폴리아미드 겔 전기 영동한 후 웨스턴 블로팅 분석함으로써 측정된 약 5,000 내지 6,000달톤의 분자량을 갖는 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11의 외막 단백질과 특이적으로 반응함.
본래, 장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11의 외막 단백질은 약 13,000달톤의 분자량을 갖는다고 생각되었다. 분자량은 단백질을 용해시키기 위한 15% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)계를 사용하여 측정하였다. 단백질은 이중선, 즉 두 개의 가까이 근접한 밴드로서 나타난다. 이중선은 약 13,000달톤의 분자량을 갖는 미생물의 외막내의 한 단백질을 나타내는 것으로 생각된다.
이제, 상기 계가 저분자량 단백질을 용해시키기에 충분하지 않다는 것을 나타내는 증거가 있다(Padhye, N. V. and M. P. Doyle, Jan. 1991, J. Clin, Microb., 29(1):99-103 참조). 외막 단백질은 약 5,000 내지 6,000 달톤의 겉보기 분자량을 갖는 것으로 보여진다. Mab 4E8C12와 반응하는 이. 콜리 0157:H7 및 026:H11의 세포 성분을 트리신-SDS-PAGE(문헌[Schagger, M. and G. Jagow, 1987, Anal. Biochem. 166:368-379] 참조)에 이어서 웨스턴 면역 블로트 분석법에 의해 결정하였다.
이. 콜리 0157:H7 균주 932, 이. 콜리 HA1, 이. 콜리 0157:H16, 이. 콜리 0157:H45 및 이. 콜리 026:H11로부터 외막 단백질(OMP)을, 고분해능으로 저분자량 단백질을 분리시켜야 하기 때문에 특별히 트리신-SDS-PAGE법에 의해 분리하였다. 제1(a)도를 참조한다. 제2겔로부터 분리된 단백질을 폴리비닐 디플루오라이드 막으로 옮기고, Mab 4E8C12에 의해 인지되는 항원의 위치를 웨스턴 블로트 분석법에 의해 결정하였다. Mab는 제1(b)도에 설명된 바와 같이 이. 콜리 0157:H7 균주 932, 이. 콜리 HA1 및 이. 콜리 026:H11의 두 5,000 내지 6,000 분자량 OMP와 반응하였다. 이. 콜리 0157:H16 또는 이. 콜리 0145:H45 중 어느 하나와도 교차-반응은 관찰되지 않았다.
분자량 측정은 밴드의 아미노선 조성에 대해 부가적으로 시험함으로써 확인하였다. 두 밴드의 아미노산 조성은 하기 표 1에 설명된 바와 같이 단지 약간의 편차를 가지면서 거의 동일하다.
표적이 되는 외막 단백질의 아미노산 조정
가수 분해시에 일부 아미노산은 다양한 정도로 산화되어 각 시기에서 상이한 잔류 수효를 나타내므로 특정한 퍼센트의 불일치가 예상된다. 그러나, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 리신 및 아르기닌과 같은 안정한 아미노산의 수효는 3개의 단백질 모두에서 일정하다.
따라서, 표적이 되는 외막 단백질은 약 5,000 내지 6,000의 겉보기 분자량을 갖는 적어도 하나의 단백질이라고 추측된다. 외막 단백질의 아미노산 조성은 차치하고라도, 외막 단백질이 약 5,000 내지 6,000의 분자량을 갖는 하나의 단백질이라는 기타 증거로서는 공통 등전점; 단일클론 항체 4E8C12에 의해 인지되는 두 단백질 밴드 모두에서의 공통 에피토프가 있다.
ELISA는 시험물 시료 중에서 항원의 존재를 분석하는 통상적인 방법이다. 본 발명의 샌드위치 ELISA는 시험물 시료 중의 장출혈성 이. 콜리 0157:H7의 존재를 조사하는 데 이용되고 다음의 단계를 포함한다. 첫째, 이. 콜리 0157에 대한 공지의 항체를 적당한 흡착체 기질에 결합시킨다. 96-웰 폴리스티렌 배양 플레이트(Costar, Cambridge, Mass. Model No. 3596)와 같은 플라스틱 배양 플레이트를 사용하는 것이 바람직하다. 이. 콜리 0157에 대한 항체의 용액을 직각의 웹에 넣고, 이. 콜리 0157에 대한 항체가 웰 표면에 흡착될 수 있는 조건으로 유지시킨다. 이어서, 미흡착 항체 용액을 세척해서 제거하고, 웰의 흡착성 벽에 결합된 이. 콜리 0157에 대한 항체를 남기고 이것을 흡착체 기질 단위로 명명한다. 여기에 흡착된 이. 콜리 0157에 대한 항체를 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질단위로 명명한다. 이어서, 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위를 무지방 건조유와 같은 적당한 차단제로 처리하여 비특이성 결합 부위를 차단한다. 적당히 배양한 후, 이 시약을 제거한다.
다음으로 기지량의 시험물을 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위에 적당한 시간 동안 노출시키고 이어서, 세척하여 제거한다. 시험물 중의 이. 콜리 0157:H7은 모두 이. 콜리에 대한 항체-충전된 기질 단위에 결합될 것이다.
유사하게는, 이. 콜리 0157:H7의 표준 준비물을 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위의 또다른 세트에 노출시켜 대조용으로서 이용한다.
상기 단일클론 항체를 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질단위에 첨가하여 이. 콜리 0157:H7 모두와 결합시킨다. 적당히 배양한 후에, 결합되지 않은 단일클론 항체를 세척하여 제거한다.
이어서, 시험 시료 또는 이. 콜리 0157:H7과 반응시킨, 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위를 단일클론 항체의 존재에 대해 분석한다.
이것을, 시험 시료 또는 이. 콜리 0157:H7을 그 위의 단일클론 항체와 반응시킨 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위를 마커-결합된 항-생위 항체에 노출시켜서, 마커-결합된 항체를, 존재하는 모든 단일클론 항체와 결합시킴으로써 행하는 것이 바람직하다. 이어서, 결합되지 않은 마커-결합된 항체를 제거하고, 이. 콜리 0157에 대한 항체-충전된 기질 단위 상에 잔류하는 마커의 양을 측정한다. 마커는 선택된 시약, 형광 물질, 방사성 물질, 또는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 또 다른 마커에 대한 효과에 의해 효소 측정될 수 있다. 단일클론 항체 자체를 마커와 직접 결합시킬 수 있을뿐더러 마커-결합된 항-생쥐 항체를 반응시키는 단게를 생략할 수 있다.
또한, 단일클론 항체를 또 다른 통상적인 ELISA에도 사용할 수 있다. 예를 들면, 시험물 시료를 흡착제 기질에 결합시킨 후, 상기 단일클론 항체에 노출시킬 수 있다. 이 항체는 시험물에 존재하는 이. 콜리 0157:H7 또는 이. 콜리 026:H11 어느 것과도 결합한다. 이어서, 단일클론 항체의 결합되지 않은 부분을 제거한다. 다음으로, 결합된 단일클론 항체의 존재에 대하여 상기 언급된 것에 필적하는 조사를 수행한다.
본 발명의 단일클론성 항체를 실질적인 응집성, 비유동성 시험물, 예를 들면 세포 또는 조직 시료를 조사하는 면역조직학적 기술에서 이와 같은 항체가 사용되는 일반적으로 알려진 모든 방법에서도 사용할 수 있다. 시료는 식품 제품 또는 분변 시료인 것이 바람직하다. 시험물을 단일클론 항체와 함께 배양하여 시험물 중에 존재하는 이. 콜리 0157:H7 또는 이. 콜리 026:H11에 항체를 결합시킨다. 이어서, 이 시험물을 세척하여 결합되지 않은 단일클론 항체 부분을 제거한다. 이어서, 항체를 시각적으로 그 존재를 명확히 하는 방법으로 반응시킨다. 함유된 이. 콜리 0157:H7 또는 이. 콜리 026:H11에 결합된 단일클론 항체를 함유하는 시험물을 상기한 바에 필적하는 마커-표지된 항-생쥐 항체와 함께 배양시키는 방법이 대표적이다. 마커 표지된 항체는 단일클론 항체와 결합한다. 마커로서는 시각적으로 명확한 것을 선택한다. 형광 및 효소 마커가 대표적으로 사용된다. 이어서, 시험물을 마커가 시각적으로 인지될 수 있는 조건하에서 현미경으로 관찰한다. 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 단일클론 항체는 특히 식품 및 임상학적 시료중의 이. 콜리 0157:H7 및(또는) 이. 콜리 026:H11 존재를 신속하게 검출하는 데 유용한 시약이다.
시험물 중의 항원이 존재를 분석하는 방법은 선택적 농축 배지를 사용하여 분석 이전에 시험물을 농축시킴으로써 향상될 수 있다. 농축배지는 개질된 트립티카제 대두 브로쓰(mTSB, Doyle와 Schoeni에 의해 제조됨, 상기 문헌(1987년) 참조)이고, 아크리플라빈-HCI 및 카자미노산을 함유시켜 더 개질되었다. 본 발명자들은 아크리플라빈-HCI 및 카자미노산이 이. 콜리 0157:H7에 의한 항원 발현을 실질적으로 증진시키는 것을 발견하였다. 그 밖에도 카자미노산은 이. 콜리 0157:H7의 성장을 증가시키며, 아크리플라빈-HCl은 그람 양성균의 성장을 억제한다. 아크리플라빈-HCl이 이. 콜리 0157:H7에 의한 항원 발현을 증진시키는 정확한 기작은 알려져 있지 않지만, 세포벽 리포폴리사카라이드의 형성을 억제하여서 단일클론 항체에 의해 인지되는 항원이 더 잘 발현되는 것으로 생각된다.
상기한 바와 같은 직종 분석 기술을 농축 배지의 조절에 이용할 수 있지만, 바람직한 분석 기술은 당업계에 공지된 샌드위치 ELISA법이다. 본 특허 출원을 목적으로, 본 명세서에 기재된 분석기술은 농축-샌드위치 ELISA법이라고 명명한다. 이 방법에는 선택적 농축 배지 중의 식품과 같은 시험 시료 또는 기질을 37℃에서 교반하면서(150 rpm), 약 16 내지 18시간 동안 농축시키는 것이 포함된다. 이 농축 배양물을, 나포 항체로서 이. 콜리 0157:H7 항원에 대하여 특이적인 다가클론 항체 및 검출 항체로서 혈청형 0157:H7 및 026:H11의 장출혈성 이. 콜리에 대하여 특이적인 단일클론 항체를 갖는 샌드위치 ELISA에 적용한다. ELISA는 3시간 내에 완료될 수 있다.
상기한 이. 콜리 0157:H7의 검출을 위한 농축-샌드위치 ELISA법은 신속하고 민감하며, 수행이 용이하다. 이 방법은 분쇄된 쇠고기 1g당의 0.2 이. 콜리 0157:H7까지도 검출할 수 있다. 이. 콜리 0157:H7은 농축 과정을 포함하여 20시간 미만 내에 검출될 수 있다. 따라서, 이 방법은 식품 시료의 일정한 스크리닝에 매우 유용할 수 있다.
또한 본 발명에는 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 단일클론 항체를 이용하여 상기 방법을 수행하기 위한 키드, 예를 들면, 진단 분석 키트가 포함된다. 어떤 실시 태양에서는, 진단 키트에는 통상적으로 1개 이상의 용기 중의 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11에 대한 단일클론 항체, 단일클론 항체에 대해 특이적인 결합짝의 결합체(conjugate), 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지, 및 이것의 사용을 위한 지침이 포함된다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이 키트는 표지와 결합할 수 있다. 각종 표지에는 효소, 방사성 동위 원소, 미립자 표지, 색소원, 형광 물질, 화학 발광 물질, 보효소, 자유 라디칼, 및 박테리오파아지가 포함된다. 또한 단일클론 항체는 지지체에 결합될 수도 있다.
특정 진단 키트는 계량봉 형태일 수 있다. 여기에서 다가클론 이. 콜리 0157 면역글로블린이 소수성 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)-기재 막에 흡착된다. 이어서, PVDF 막을 5% 소혈청 알부민으로 처리하여 비특이성 결합 부위를 차단한다. PVDF 막을, 이. 콜리 0157:H7이 함유될 수 있는 식품의 농축 배지 중에 30분 동안 침지시킨다. 세척 후, PVDF 막을 단일클론 항체 4E8C12로 처리한다. 이 항체는 PVDF 막에 결합된 이. 콜리 0157:H7 세포 모두에 결합될 것이다. 이 결합된 단일클론 항체 4E8C12를, 니트로 블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 기질과 반응하여 양성 반응으로서 자주색 반점을 나타내는 알칼리성 포스파타제-결합된 염소 항-생쥐 면역글로블린을 이용하여 검출한다.
이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11의 외막에서 발견되는 분자량 약 5,000-6,000 달톤의 단백질은 생물학적 시약으로서 단리될 수 있고, 시료 중의 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11 검출용 단일클론 항체의 제조에 사용될 수 있다. 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 026:H11 오염이 의심되는 경우에 이것을 진단하기 위한 시험 키트에 단일클론 항체를 이용할 수 있다.
다음의 실시예는 본 명세서에 기재된 발명의 특성 실시예를 제공한다.
[실시예 I]
[글로닝된 세포 주의 제조]
[세균성 균주]
단일클론 항체의 동정에 사용된 세균성 배양물:이들 실시예에서 다음의 세균성 균주를 조사하였다:이. 콜리(E. Coli) 0157:H7 균주 932; 이. 콜리 HA1(이. 콜리 0157:H7 932로부터 유도된 조(rough) 균주), 하기 표 2에 기재된 또다른 34종의 이. 콜리 0157:H7의 균주, 5조의 이. 콜리 026:H11 균주, 및 다음 표 2에 기재된 0157:H7 또는 026:H11 이외의 다른 37종의 이. 콜리 균주.
모든 세균을 37℃의 TRYPTICASE 대두 브로쓰(TSB, BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD) 중에서 교반하면서(100rpm) 16 내지 18시간 동안 성장시켰다.
[독소]
이. 콜리 0157:H7 균주 932로부터의 베로톡신-1(VT-1) 및 베로톡신-2(VT-2)를 패드하이(Padhye) 등의 상기 방법(상기 문헌)에 따라서 정제하였다.
접종용 항원의 제조:이. 콜리 HA1 세포를 37℃의 TSB 중에서 교반하면서(100rpm) 16시간 동안 성장시켰다. 이 세포를(3500rpm으로 10분 동안) 원심 분리하여 수거하고, 0.01M 인산염 완충액 염수(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 이. 콜리 HA1 세포를 2% 포르말린으로 처리하고 1주일 동안 37℃에서 유지시켰다.
BALB/c 생쥐(수컷, 생후 6-8주) 10마리를 포르말린-처리된 이. 콜린 HA1 2×10 세포를 복강내 주사하여 면역화시켰다. 그 후에, 쥐의 주기적인 출혈에 의해 얻어진 혈청이 1:400을 넘는 역치를 갖게 될 때까지 매 4주마다 동일 개수를 포르말린-처리된 이. 콜린 HA1의 세포를 생쥐의 복강내 주사하였다. 여기에는 보통 3회 접종이 필요하였다. 세포 융합 4일 전에 최종적으로 포르말린 처리된 이. 콜리 HA1이 세포 1×10 을 정맥재 부스터(booster) 주사하였다. 최초로 주사한 지 4 내지 5개월 후에, 쥐를 희생시켜 그 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켰다.
[융합 및 클로닝]
문헌(Galfre, G., 1981, Preparation of monoclonal Antibodies:Strategies and Procedures, Methods in Enzymology, vol. 73, pgs. 1-46)의 방법을 약간 변형시켜서 융합 및 클로닝을 수행하였다. 요약하면, 면역화된 생쥐로부터의 비장 세포를, 40% 폴리에틸렌 글리콜(분자량 1,300 내지 1,600)(J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ)을 사용하여 Sp2/O-Ag-14 골수종 세포와 융합시키고 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 선택적 배지(HAT) 중에서 0.3% 생쥐 적혈구 세포 존재 하에 성장시켰다. 하이브리도마가 성장된 웰로부터 얻어지는 상징액을 하기의 직접적 ELISA에 의해서 이. 콜리 0157:H7에 대한 항체 생성에 관하여 스크린하였다. 목적하는 하이브리도마를 문헌(Kohler Milstein(1975), Nature, Vol. 256, pags. 495-497)의 방법에 의해서, 20% 소 태아 혈청(Gibco, Grand Island, NY)을 함유하는 배지 중의 웰당 세포수를 0.5 및 0.1로 제한함으로써 2회 부클로닝(subcloning)하고 항체 생산에 대하여 재분석하였다.
[직접적 ELISA]
96-웰 스티렌 EIA-RIA 플레이트(Gibco, Grand Island, NY) 중에서 ELISA를 수행하여 항체 생성을 측정하였다. 각 웰을 50mM 탄산염 완충액(pH 9.6)중의 세균 세포(이. 콜리 0157:H7 균주 932, 이. 콜리 0157:H16, 이. 콜리 02:K1:H7, 또는 이. 콜리 K-12(음성대조용) 또는 640nm에서 0.5의 광학 밀도를 나타내는 10 세포) 100μl로 도포하고, 실온의 궤도 진탕기 상에서 철야회전시켰다. 50mA NaCl을 첨가한 50mM 트리스-HCl(pH 7.5)(TBS)로 세포를 4회 세척한 후, 잔류 결합 부위를 TBS 중의 5% BSA로 차단시켰다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 차단용 완충액을 제거하고, 단일클론 항체(하이브리도마 상징액) 100μl를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양하고 난 후, 0.05% Tween-20을 첨가한 TBS(TBS-T)로 각 웰을 4회 세척하였다. 고추냉이 퍼옥시다제-결합된 염소 항-생쥐 IgG 100μl/웰;(TBS 중의 1:1400)(Kirkegaard Perry Laboratory, Inc. Gaithersburg, MD)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 TBS-T로 4회 세척한 후, ABTS-퍼옥시다제 기질(Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 100μl를 각 웰마다 첨가하였다. 실온에서 15분동안 배양한 후, 각 웰당 TBS 중의 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 50μl를 사용하여 효소적 반응을 중지시켰다. 각 웰에서의 반응물의 광학 밀도를 410nm에서 Dynatech(MR 300) 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 2회의 시험을 통하여 조사의 재생성을 결정하였다.
[복수액]
BALB/c 생쥐 10마리에게 2, 6, 10, 14-테트라메틸 펜타데칸(pristane)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 0.5ml를 복강내 주입시켰다. 10일 후 이들 생쥐에게 2×10 하이브리도마 세포를 주사하였다. 주사한 지 10 내지 20일 후 생쥐의 복수액을 수집하였다. 세포 파편 및 피브린 덩어리를(8000×g로 10분 동안) 원심분리시켜 제거하고, -20℃에서 항체 함유액을 저장하였다.
[단일클론 항체의 정제]
복수액으로부터의 단일클론 항체를, 단백질 A 컬럼(Immunopure와 IgG 정제 키트, Pierce, Rockford, IL)을 사용하되 제조자의 지시를 변형하여 정제하였다. 간단하게는, 복수액을 10,000×g로 20분 동안 원심분리시키고, 상징액에 IgG-결합완충액을 첨가하였다(3:1 비율). 이 용액 4ml를 컬럼에 걸고 단일클론 항체를 IgG-용출 완충액을 사용하여 용출시켰다. 1ml 분획을 수집하고(280nm에서의 광학 밀도로) 단백질의 농도를 측정하여 모니터하였다. 단백질 함유 분획을 합하여, 4℃에서 20mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 대하여 철야 투석하였다. 마지막으로, 문헌(Smith et al., 1985, Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid, Analytical Biochemistry. Vol. 150, pgs. 76-85)의 방법에 따라서 피어스(Pierce) BCA 단백질 시약(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)을 사용하고, 표준물로서 소 혈청 알부민을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 정제된 항체의 활성을 직접적 ELISA를 통하여 측정하고 SDS-PAGE에 의해 순도를 측정하였다.
[면역글로블린 이소타이핑(isotyping)]
종 특이성 항혈청을 사용하여 ELISA에 의해 면역글로블린 이소타이핑을 행하였다. EIA 플레이트의 웰을 50mM 탄산염 완충액(pH 9.6) 중의 이. 콜리 0157:H7 균주 932(10 세포/ml)로 도포하였다. TBS를 사용하여 4회 세척한 후, 비특이성 결합 부위를 TBS 중의 5% 소 혈청 알부민(w/v)으로 차단시켰다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후에, 단일클론 항체 4E8C12를 함유한 상징액 0.1ml을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 더 배양을 계속하였다. 웰을 TBS-T로 4회 세척한 후에, 각각 생쥐 IgG, IgGa, IgGb, IgG, IgM, IgA, 카파 또는 람다 경 사슬(생쥐타입 이소타이핑 키트, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)에 대하여 각각 특이적인 토끼의 항혈청을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. TBS-T로 웰을 4회 세척하고 알칼리성 포스파타제-표지된 염소 항 토끼 IgG 0.1ml(TBS 중에 1:800으로 희석시킨 것)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. TBS-T로 웰을 4회 세척한 후, 1.0M 2아미노-2-메틸-1-프로판올 중의 포스타파제 기질(p-니트로페닐 포스페이트)(pH 9.9) 1.0mg/ml를 첨가하고, 37℃에서 배양한 지 1시간 후에 410nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
[외막 단백질의 제조]
외막 단백질(OMP)을 한콕(Hancock) 및 나이까이도(Naikaido)에 의한 문헌(Hancock, R.E.W. and H. Naikaido, 1987, Outer Membrances of Gram-Negative Bacteria, Journal of Bacteriology, Vol. 36, pgs. 381-3900에 기재된 방법을 약간 변형시켜 단리하였다. 이. 콜리 0157:H7 균주 932, 이. 콜리 HA1, 이. 콜리 0157:H16, 이. 콜리 0157:H45, 및 이. 콜리 CL-5 026:K-60:H11 각각을 2리터의 TSB 중에서, 37℃에서 18시간 동안 교반하면서(150rpm) 성장시켰다. 세포를 원심분리하여(4℃, 10,000×g에서 10분 동안) 수거하고 4℃에서 후속 조작을 수행하였다. 세포를 170mM NaCl을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(pH 7.2)(PBS)로 세척하고, 원시분리에 의해 침전시키고, 펠릿을 640nm에서의 광학 밀도가 40이 될 때까지 동일한 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 프렌치프레스(1400 1b/in )(American Instrument Company, Silver Spring, MD) 중에서 파괴하고, 세포 파편을 원심분리하여(5000×g로 5분 동안) 제거하였다. 펠릿을 0.01M HEPES(N-2 히드록시에틸 피페라진-N'2에탄 설폰산) 완충액(pH 7.4) 중에 약 20mg/ml의 적당한 단백질 농도를 재현탁시켰다. 단백질 용액을 0.01M HEPES 완충액 중에서 제조한 35-55%(w/v) 수크로오스 구배에서 층화시키고 131,000×g로 36시간 동안 원심분리시켜서 OMP를 펠릿화하였다. OMP를 1Mm MgCl를 함유하는 0.01M HEPES 완충액 중에 재현탁시키고, 원심분리시켜(200,000×g로 1시간 동안) 침전시켰다. 펠릿을 동일한 완충액 중에 재현탁시키고 -20℃에서 저장하였다. 상기 방법에 따라 단백질 농도를 측정하였다.
[면역 블로팅]
OMP(50ug) 및 정제된 VT-1 및 VT-2(3-5 ug)를 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 각각의 단백질 밴드로 분리하였다. 이중 평판 전기영동 전지(Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) 중에서 브로모페놀 염료가 겔 바닥에서 1cm에 도달할 때까지 200V의 일정 전압을 걸어 겔을 주행시켰다. 전기영동 후에, 단백질 밴드를 트랜스블로트장치(Bio-Rad Laboratories, Richmond, VA)를 30V로 18시간 동안 사용하여 25mM 트리스, 192mM 글리신 및 20% 메탄올(w/v)을 함유하는 완충액 중의 PVDF 막(IMMOBILIM , Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼다. 이 막을 다음과 같이 면역 화학적으로 염색하였다. 비특이성 결합 부위를 TBS 중의 5% BSA를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 배양시켜 차단시켰다. 겔을 TBS 중의 1% BSA를 사용하여 헹군 후에, PVDF 막을 단일클론 항체 4E8C12(TBS 중에 1:6000으로 희석시킨 복수액)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 이 막을 0.04% Tween-20을 함유한 TBS(TBS-T)로 3회 세척하고, 알칼리성 포스파타제-표지된 염소-항 생쥐(TBS 중에 1:2000으로 희석시킨 IgG)와 함께 37℃에서 30분 동안 배양시켰다. 이 막을 TBS-T[+0.05% SDS]로 철저히 세척하고, BCIP/NBT 포스파타제 기질(Kirkegaard Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)로 처리하여 단백질 밴드를 검출하였다. 저분자량 표준물(Electrophoresis Calibration Kit, Pharmacia, Piscataway, NJ)을 각 겔상에서 주행시키고, 각각을 이동 전후에 0.25% 코매시 브릴리언트 블루 R-250(Imperial Chemical, London)으로 염색하여 단백질 이동을 증명하였다.
[실시예 II]
[단일클론 항체의 민감성 측정]
이. 콜리 0157:H7의 상이한 8종의 균주의 농도를 다양하게 하여 직접적 ELISA를 사용하여 단일클론 항체의 민감성을 측정하였다. 검출 한계는 10 내지 10 세포/ml의 범위였다. 예로서, 이. 콜리 0157:H7, 균주 932를 검출하는 직접적 ELISA에서 단일클론 항체의 민감성을 예시하는 제2도를 제시한다.
[실시예 Ⅲ]
[단일클론 항체의 특이성]
상이한 장내 세균과의 교차-반응성을 조사함으로써 단일클론 항체의 특이성을 측정하였다. 실시예 Ⅰ의 표 2에 기재된 다음의 세균을 실시예 Ⅰ의 방법으로 시험하였다.
그 결과를 다음 표 2에 기재하였다.
[결과의 토론]
단일클론 항체(Mab)는 ELISA에 의하여 측정하는 경우에 시험된 모든 균주에 대하여 1.0을 넘는 광학 밀도(O. D.)를 갖고, 이. 콜리 0157:H7의 36종의 모든 균주와 고도의 반응성이 있었다. Mab 4E8C12의 특이성을 혈청형 0157:H7 이외의 다른 이. 콜리 균주, 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter Cloacae), 캄필로박터 제주니(c. jejuni), 쉬겔라 다이센테리아에(S. dysenteriae), 프로테우스 종(Proteus sppp), 에로모나스 히드로필라(A. hydrophila), 하프니아 알베이(Hafnia alvei), 폐렴 간균(K. pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 영균(S. marcescens) 및 시트로박터 종(Citrobacter spp.) 등의 몇가지 균주를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 혈청형 0157:H7이외의 다른 5종의 균주, 즉 모든 이. 콜리 026:H11 균주는 Mab와 반응하였다(표 2). 이들 균주는 용혈성 요독증 또는 출혈성 대장염에 걸린 환자로부터 단리되었고, 이. 콜리 0157:H7에 의하여 생성되는 것과 동일한 베로톡신을 생성한다.
설명된 실시예로부터, 당업자는 상기한 단일클론 항체가 그에 대해 특이적인 것으로 나타났던 항원에 대하여 다양한 방법으로 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 단일클론 항체는 상기 설명한 종류의 샌드위치 ELISA 이외의 다른 ELISA로 이. 콜리 0157:H7 및 026:H11을 분석하는데 사용할 수 있다. 단일클론 항체는 분석 및 다른 목적을 위하여 항체를 사용하는 다른 통상적인 방법 이외에도, 면역형광법, 면역퍼옥시다제 반응법 또는 다른 유사한 기술에 사용할 수 있다.
[실시예 Ⅳ]
[이. 콜리 0157:H7을 검출 및 단리를 위한 신속성 및 민감성이 있는 방법의 개발]
[세균성 균주]
이. 콜리 0157:H7 균주 933, 505B, 932, CL-8 및 32381을 증진성-ELISA 방법의 민감성을 결정하기 위하여 접종 연구에 사용하였다. 균주 932 및 505B를 쇠고기로부터 단리하는 반면, 균주 932, CL-8 및 32381을 인체로부터 단리하였다. 이 균주들에 이. 콜리 0157:H7, 이. 콜리 혈청형 0157:H16, 0157:H19, 0157:H25, 0157:H45 및 이. 콜리 K-12 등 20종의 다른 균주들을 합하여 단지 ELISA 방법을 평가하기 위하여 사용하였다.
[단일클론 항체 제조 방법]
장출혈성 이. 콜리 0157:H7 및 026:H11에 대하여 특이적인 단일클론 항체 4E8C12 IgG2a의 복수액을 10 하이브리도마 세포(4E8C12)를 주입한 BALB/C 생쥐로부터 얻었다. 복수액을 사용하기 전까지 -20℃에서 저장하였다.
Mab 4E8C12에 의하여 인지되는 이. 콜리 0157:H7 항원의 발현 증진:이. 콜리 0157:H7 균주 932를 1리터당 트립티카제 대두브로쓰 배지(TSB;30g)[비비엘 마이크로바이올로지 시스템(BBL Microbiology Systems)제품, 매릴랜드주 콕케이스빌 소재」, 담즙염 No. 3(1.5g), KHPO(1.5g) 및 노보바이오신(20mg)으로 이루어진 개질된 트립티카제 대두 브로쓰 배지(mTSB) 중에서 37℃에서 16시간 동안 교반하면서 성장시켰다. 몇종의 다른 성장 인자들을 ELISA의 민감성을 증진시키기 위하여 독립적으로 또는 mTSBdp 혼합하여 첨가시켰다. 시험된 성장 인자에는 1% 글루코오스, 람노오스, 만노오스, 락토오스 또는 수크로오스, 0.5-5%의 양의 적혈구 세포, 5-50mg/L의 FeCl, 0.5mg/L의 FeSO또는 50mg/L의 Fe(NH)(SO)등의 철 성분의 첨가제, 5g/L의 Chelex 100[바이오래드(Biorad) 제품, 캘리포니아주 리치몬드 소재」 또는 0.01 및 0.05%의 EDTA 등의 양이온 킬레이트제, 0.5, 2, 5, 8 및 10mg/L의 아크리플라빈-HCl 및 0.5 및 1%의 카자미노산이 포함되어 있다. 추가로, TSB, mTSB 및 항생제 배지 No. 3(PAB) 등의 다른 종류의 성장 배지를 사용하고, 다른 성장 온도(30℃, 37℃ 및 42℃)에서 150rpm으로 교반하거나 또는 교반하지 않으면서 시험하였다. 세포를 성장시킨 후에, 원심분리(1500×g, 10분)로 침전시키고, 이어서 pH 9.6의 50mM의 탄산염완충액 중에 재현탁시키고, 640nm의 파장에서 0.5의 광학 밀도(약 10 세포/ml)로 조절하였다. 세포 현탁액을 약 10 세포/ml이 될 때까지 탄산염 완충액 중에서 연속적으로 1:10으로 희석시키고 각각의 연속 희석액 100μl를 96-웰 폴리스티렌 EIA-RIA 플레이트「기브코(GIBCO) 제품, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재」의 웰에 중복하여 적용하였다. 이와 같은 세포 준비물을 Mab 4E8C12와 반응하는 이. 콜리 0157:H7 항원의 발현 정도를 결정하기 위하여 직접적 ELISA 방법에 사용하였다. 항원의 발현이 높을수록 ELISA의 검출 한계가 더 낮아지고 민감성이 더 높아진다.
[배지 제법]
카자미노산(10g/L) 및 아크리플라빈-HCl(10mg/L)이 첨가되고 노보바이오신이 없는 mTSB 농축 배치(dmTSB)를 우선 카자미노산을 첨가한 dmTSB를 121℃에서 15분 동안 가압 멸균함으로써 제조하였다. 실온에서 냉각되도록 한 후에, 필터로 멸균한 아크리플라빈-HCl의 수용액을 첨가하였다. 유제품에서 이. 콜리 0157:H7를 농축시키기 위하여, 1.35g/L의 KHPO및 12g/L의 NaHPO로 이루어진 완충액이 첨가된 dmTSB-CA를 1.5g/L의 KHPO대신에 사용하였다.
농축 배지로부터 이. 콜리 0157:H7을 단리하기 위하여 4-메틸움벨리페론 β-D-글루큐로니드(0.1g/L)가 첨가된 맥콩키-소르비톨(McConkey-Sorbitol) 한천 배치(MSA-MUG)[디프코 래보라토리즈(Difco Laboratories)를 제품, 미시간주 디트로이트 소재」를 사용하였다.
[접종 연구]
소매상의 신선한 분쇄된 쇠고기, 생우유, 저온 살균된 전유 및 탈지유, 및 체더(chedda), 스위스(swiss), 콜비(colby) 및 벽돌형(brick) 치이즈에 검출 방법의 민감성을 결정하기 위하여 다른 농도의 이. 콜리 0157:H7로 접종하였다. 플레이트 계수 한천 배지를 사용하여 접종하고, 플레이트를 30℃에서 48시간 동안 배양하기 전에, 공기 중에서 플레이트 당 세균 수를 각각의 제품상에서 계수하였다. 5종의 균주를 각각 TSB 중에서 37℃에서 16시간 동안 성장시킴으로 이. 콜리 0157:H7의 접종물을 준비하였다. 세포를 1500×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전시키고, pH 7.2의 0.01M 인산염 완충액 염수(PBS) 중에 재현탁시켜 640nm에서 0.5의 O.D.(약 10 css CFU/ml)가 되도록 하였다. 세포를 PBS 중에서 적절히 희석시켜서 300μl당 5 내지 22.5CFU의 이. 콜리 0157:H7를 얻어 제품 25g에 접종하였다. 접종물의 희석액을 TSA 플레이트 상에서 37℃에서 16시간 동안 배양함으로써 실제적인 접종 농도를 결정하였다. 이. 콜리 0157:H7 균주의 각각을 독립적으로 시험하였다. 비접종된 각 제품의 시료를 각 연구에서 대조용으로서 포함시켰다.
분쇄된 쇠고기 시료(각각 25g)를 독립적으로 1리터 엘렌메이어 플라스크에 들어있는 dmTSB-CA 브로쓰 225ml에 첨가시키고, 유제품(각각 25g)을 이. 콜리 0157:H7을 농축시키기 위한 dmTSB-CA-완충액 225ml에 첨가하였다. 모든 시료를 37℃에서 16-18시간 동안 150rpm으로 교반하면서 접종하였다. 배양한 후에, 이. 콜리 0157:H7을 샌드위치 ELISA 방법에 의하여 농축 배지 중에서 검출하였다.
ELISA를 96-웰 폴리스티렌 EIA-RIA 플레이트(기브코 제품)중에서 수행하였다. 각각의 웰은 이. 콜리 0157:H7에 대한 친화성 크로마토그래피로 정제된 염소 항체 100μl(50mM의 탄산염 완충액 중의 10㎍/ml, pH 9.6)[키르케가르드 및 페리 래보라토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories) 제품, 매릴랜드주, 가이테르스버그 소재」로 피복시키고, 실온에서 1시간 또는 철야 배양하였다. 항체 용액을 흡인시켜 제거하고, 잔존 결합 부위를 우유로 희석시킨 차단 용액(키르케가르드 및 페리 래보라토리즈 제품)을 사용하여 15분 동안 실온에서 차단시켰다. 차단제를 제거하고, 농축 배지 300μl를 웰마다 첨가시키고, 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 웰을 150mM NaCl 및 0.05% 트윈-20(TBS-T)를 함유하는 pH 7.5의 50mM 트리스로 3회 세척한 후에, Mab 4E8C12 100μl(TBS 중에서 복수액을 1:6000으로 희석시킴)를 첨가하고, 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 웰을 TBS-T로 3회 세척한 후에, 고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 염소의 항-생쥐 IgG 100μl(TBS 중에서 1:1400으로 희석)(키르케가르드 및 페리래보라토리즈 제품)를 첨가하고, 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 웰을 TBS-T로 4회 세척한 후에, 2,2'-아지노-디「3-에틸벤즈티아졸릴설페이트」-퍼옥시다제 기질을 웰 당 100μl로 첨가하고, 실온에서 20분 동안 유지시켰다. 웰 당 TBS 중의 1% 소듐 도데실 설페이트 50μl를 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 각각의 웰을 OD를 410nm에서 Dynatech MR 600 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 0.2 이상의 배경 OD를 나타내면 양성으로 고려하였다. 각각의 분석에서, 접종된 이. 콜리 0157:H7이 없는 식품 시료의 농축 배지를 대조용으로서 포함시키고, 이것을 배경 판독을 확립하기 위하여 사용하였다.
샌드위치 ELISA에 의한 양성 시료는 이. 콜리 0157:H7에 대하여 양성으로 추정하였다. 이어서, 이. 콜리 0157:H7을 배양 방법에 의하여 농축 배지로부터 단리하였다. 농축 배지의 십진법 희석을 0.1% 펩톤수 중에서 10-6으로 하였다. 10-5 및 10-6에서의 희석액(0.1ml)을 MSA-MUG 상의 표면에 플레이트하고 37℃에서 16-18시간 배양하였다. 소르비톨 음성(백색) 및 MUG-음성(자외선 하에서 형광성 없음)인 콜로니의 수를 기록하였다. 5개의 소르비톨-음성이고 MUG-음성인 콜로니를 임의로 선택하고, API 20E 소형화된 분석 키트「어낼리탭 프로덕츠(Amalytab Products) 제품, 뉴욕주 플레인뷰 소재」를 사용하는 생화학적 성질, 0157 및 H7 항혈청「디프코(Difco) 제품, 이. 콜리 레퍼런스 센터(Reference Center), 펜실바니아주 유니버시티 팍 펜실베니아 주립 대학 소재」을 사용한 혈청학 및 베로 세포 세포독성 분석에 의하여 이. 콜리 0157:H7로서 확인하였다.
10 내지 10 CFU/ml의 농도의 5종의 이. 콜리 0157:H7 균주의 순수 배양물을 사용하여 샌드위치 ELISA의 민감성을 결정하였다. 각각의 균주를 독립적으로 시험하였다. 이. 콜리 0157:H7의 동일한 5종의 균주를 각각 다른 농도로 농축시킨 후에 반응시키는 분쇄된 쇠고기 및 유제품의 농축 배양물을 사용하여 유사한 연구를 수행하였다. 비접종된 농축 배양액을 대조용으로 사용하였다. 이. 콜리 0157:H7을 시판되는 분쇄된 쇠고기 및 농장의 생우유로부터 검출 및 단리하였다. 5주 동안(90년 12월-91년 1월)에 위스콘신주매디슨에 소재하는 몇 개의 식품점으로부터 전체 10 개의 신선한 분쇄된 쇠고기 시료를 얻었다. 또한 69개의 다른 농장의 대형탱크로부터 115개의 생우유 시료를 얻었다. 시료를 얼음이 있는 냉각기 중에 놓고, 실험실로 가져온 후 1-2시간 내에 상기한 방법에 의하여 자연적으로 발생하는 이. 콜리 0157:H7에 대해 분석하였다. 이. 콜리 0157:H7을 양성 시료로부터 단리하고, 단리물들은 상기의 방법들을 사용하여 이. 콜리 0157:H7로 확인하였다. 양성의 분쇄된 쇠고기 시료에서 이. 콜리 0157:H7의 수를 정량화하는 데에는 3개의 튜브로 된 가장 적합한 수의 절차(three-tube most probable number precedure)를 사용하였다.
분쇄된 쇠고기 시료(25g, 2.5g 및 0.25g)을 각각 스토마커(stomacher) 주머니(시료 크기 당 3개) 중의 dmTSB-CA 225ml, 247.5ml 및 250ml에 가한 후 스토마커로 5분 동안 유화시켰다. 시료들을 멸균 1-L 엘렌메이어 플라스크로 옮겨서 37℃에서 18시간 동안 교반(150 rpm)하에 배양시켰다. 양성 배양물(플라스크) 중의 이. 콜리 0157:H7의 존재는 1루우프의 농축 배양물을 사용한 MSA-MUG 플레이트 상의 도밀평판법에 의해 확인하였다. 이 플레이트들을 37℃에서 16-18시간 동안 배양시킨 후 백색(소르비톨-음성), MUG-음성 콜로니들을 선별하여 상기의 확인 분석에 의해 이. 콜리 0157:H7로서 입증하였다.
[결과]
샌드위치 효소면역분석법(ELISA)을 식품의 농축 배양물중의 이. 콜리 0157:H7을 검출하기 위해 개량시켰다. ELISA의 특이성은 이. 콜리 0157:H7 및 이. 콜리 0157:H7의 몇몇 균주를 사용하여 측정하였다. 모두 25종의 이. 콜리 0157:H7 균주들은 ELISA에 강하게 반응한 반면, 이. 콜리 0157:H16, 0157:H19, 0157:H25 및 0157:H45는 모두 음성이었다. 이 분석법의 민감성은 순수 배양물 및 식품의 농축 배양물 중에서 이. 콜리 0157:H7(5종의 다른 균주를 개별적으로 시험함)로 시험하였다. 순수 배양물에서 검출될 수 있는 세포의 최소수는 제3도에 나타낸 바와 같이 10 -10 CFU/ml의 범위이었고, 농축 후 상이한 농도의 이. 콜리 0157:H7와 반응한 식품의 농축 배양물에서는 10 -10 의 이. 콜리 0157:H7/ml의 범위이었다.
분석법의 민감성을 증가시키기 위해, MAb에 의해 인식되는 세균 표면 상에서 항원의 발현을 증가시키는 연구를 행하였다. 식품으로부터 이. 콜리 0157:H7을 단리하기 위한 표준 농축 조건은 mTSB 중의 37℃에서 교반하에 배양하는 것이었다. 따라서, 이들 조건을 사용한 연구로부터 나온 결과들은 대조 표준으로 사용하였다. 이들 항원의 발현에 미치는 농축 배양물의 두 성장 온도(30˚ 및 37℃) 및 교반의 효과를 표 4에 나타내었다. 이들 변수는 농축을 위한 표준 조건과 비교했을 때 ELISA의 민감성에 있어서 큰 감소가 없는 것으로 입증된 바와 같이 관련 항원의 발현을 증진시키는데 있어서 실질적인 효과를 갖지 못했다. mTSB 중의 42℃에서 이. 콜리 0157:H7의 성장이 불량하였기 때문에, 적절한 수의 ELISA에 의해 검출용 세포를 얻을 수 없었다.
mTSB 중의 아크리플라빈-HCl 및 카자미노산은 둘다 제5도에서 설명한 바와 같이 ELISA의 민감성을 증가시키는데 중요한 영향을 미쳤다. 10mg/L의 아크리플라빈-HCl은 검출 한계를 10 -10 이. 콜리 0157:H7/ml에서 10 세포/ml까지 감소시켰다. 저농도의 아크리플라빈-HCl은 검출 한계를 감소시키는 데 큰 영향을 주지 않았다. 0.5 또는 1%에서의 카자노미노산도 역시 ELISA의 민감성을 증가시켰으나 아크로플라빈의 첨가시 만큼은 증가시키지 못하였다.
그러나, mTSB에 대한 카자미노산의 첨가는 이. 콜리 0157:H7의 성장률을 증가시키는데 특별한 잇점을 제공하였다.
몇몇 다른 기질 및 성장 인자에 대해서도 ELISA의 민감성을 증가시키는 효과에 대해 평가하였다. 여기에는 mTSB에 대한 TSB 또는 항생제 배지 No. 3(PAB) 중의 성장이 포함된다. mTSB는 이. 콜리 0157:H7의 성장 및 ELISA의 민감성에 대해 모두 최상이었다. mTSB에 대한 1% 글루코오스, 람노오스, 만노오스, 락토오스 또는 수크로오스의 첨가는 ELISA의 민감성에 거의 영향을 미치지 않았다. 마찬가지로, 양 적혈구 세포(0.5-5%), FeCl(5-50mg/L), FeSO(0.5g/L) 또는 Fe(NH)(SO)(50mg/L)와 같은 철의 보충에 의해서는 검출할 만한 효과가 나타나지 않았다. 식품 내 낮은 농도의 이. 콜리 0157:H7를 검출하기 위한 농축 샌드위치 ELISA의 효율을 측정하려는 연구는 분쇄된 쇠고기 및 다양한 유제품 중의 g당 0.2 내지 0.9세포의 접종물로 개별적으로 시험된 5종의 상이한 이. 콜리 0157:H7의 균주로 행하였다. 결과를 하기 표 4 및 5에 나타내었다.
접종-회복 연구는 상기 방법에 의해 분쇄된 쇠고기(표 4) 또는 유제품(표 5)의 g당 0.2 내지 0.9 사이의 이. 콜리 0157:H7이 검출될 수 있음을 나타냈다. 이들 연구에 사용된 제품 중 어느 것도 자연-발생적인 이. 콜리 0157:H7을 갖지 않았다. 접종 전의 분쇄된 쇠고기 시료의 호기성 플레이트 수는 1.1×10내지 1×10 CFU/g 범위 이내이었다. 0.2 내지 0.9 CFU/g의 레벨에서 접종된 이. 콜리 0157:H7의 모든 균주는 10개의 분쇄된 소고기 농축 시료중 9개에서 검출되었다. 5개의 접종된 균주중 1개만이 한 개의 분쇄된 쇠고기 시료에서 검출되었으나, 이 쇠고기는 매우 비정상인 예외적으로 높은 APC(1×10 CFU/g)를 가졌었다. 이 정도의 APC를 갖는 분말 소고기는 보통 손상되었다. 이 시료 중의 다수의 손상 세균은 농축동안 이. 콜리 0157:H7의 성장을 억압했을 것으로 보인다.
쇠고기 및 유제품 중에 0.2 내지 0.9 CFU/g으로 접종된 이. 콜리 0157:H7은 농축 배양물 중에서 3.8×10 내지 3.7×10 CFU/g의 레벨까지 성장하였다. 분쇄된 쇠고기에 사용된 농축 배지 dmTSB-CA의 초기 pH는 7.0인 반면, 유제품에 사용된 dmTSB-CA-완충액의 것은 7.4이었다. 농축후, pH값은 6.5 내지 6.8의 범위이었다.
이. 콜리 0157:H7은 위스콘신주 매디슨시에 소재한 식품점에서 구입한 분쇄된 쇠고기 시료 107개중 3개(2.8%)에서 검출되었다. 농축전에 이들 시료의 APC는 4.0×10 내지 7.8×10 CFU/g의 범위이었다. 양성 시료의 농축 배양물 중의 이. 콜리 0157:H7의 수는 2.5×10 내지 8.6×10 CFU/ml의 범위이었고, 양성 농축 배양물의 ELISA의 OD은 0.53 내지 1.10이었다. 생물체를 ELISA에 의한 이. 콜리 0157:H7-양성인 모두 3개의 시료로부터 배양 절차에 의해 단리하였다. MPN 측정에 의해 3개의 시료 중에서 0.4 내지 1.5세포/g의 이. 콜리 0157:H7 집단을 밝혀냈다.
69개의 다른 농장에서 구입한 115개의 살균하지 않은 우유시료를 검사한 결과, 이. 콜리 015:H7이 13개의 시료에서 검출되어 배양 절차에 의해 11개의 시료가 확인되었다. 이들 11개의 시료는 7개는 다른 농장에서 유래한 것이다. 농축 전에 모든 우유 시료의 APC는 2.8×10 내지 2.6×10 CFU/ml 범위이었다. 이. 콜리 0.157:H7-양성 농축 배양물의 ELISA의 OD은 0.55 내지 1.08이었다.
본 발명은 여기에 기재된 특정한 시약, 단계 또는 방법에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 대신에, 본 발명은 다음의 특허 청구의 범위 내에서 유래될 수 있는 바와 같은 모든 변형된 형태를 포함한다.
Claims (19)
- 대장균(E. coil) 0157:H7 및 대장균 026:H11에 대해 특이적인 단일클론 항체.
- 제1항에 있어서, 명세서의 표 2에서 기재된 대장균 0157:H7 및 대장균 026:H11의 균주에 결합됨을 더 특징으로하는 단일클론 항체.
- 제1항에 있어서, 하이브리도마 ATCC HB 10452로부터 제조된 단일클론 항체.
- 대장균 0157:H7 또는 대장균 026:H11 세포로부터 수거할 수 있고, 하이브리도마 ATCC HB 10452로부터 제조된 단일클론 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 외막 단백질에 특이적인 단일클론 항체.
- 제4항에 있어서, 서브 클래스 면역글로블린 G2a의 일원임을 더 특징으로 하는 단일클론 항체.
- 제4항에 있어서, 카파 경쇄를 가짐을 더 특징으로 하는 단일클론 항체.
- 하이브로도마 ATCC HB 10452.
- (a) 대장균 0157:H7 및 대장균 026:H11에 대한 단일클론 항체를 생성할 수 있는 세포를 융합시킴으로써 형성된 항미브리도마 및 (b) 골수종 세포로 이루진, 대장균 0157:H7 및 대장균 026:H11에 대한 단일클론 항체를 생성하는 연속 세포주.
- 1개 이상의 용기내의 제1항의 단일클론 항체 및 그의 사용 지침으로 이루어진 대장균 0157:H7 및(또는) 대장균 026:H11의 존재 여부를 분석하기 위한 진단 키트.
- 제9항에 있어서, 단일클론 항체가 표지에 결합된 진단 키트.
- 제10항에 있어서, 표지의 효소, 방사성 동위원소, 미립자 표지, 색소원, 형광물질, 화학발광물질, 보호소, 자유 라디칼, 및 박테리오 파아지로 이루어진 군에서 선택된 진단 키트.
- 제9항에 있어서, 단일클론 항체가 지지체에 결합된 진단 키트.
- 제1항의 단일클론 항체 및 그의 사용 지침으로 이루어진, 장출혈성 대장균 0157:H7 및 026:H11에 특이적인 외막 단백질에 기초에 기타 대장균 및 장내 병원체로부터 장출혈성 대장균 0157:H7 및(또는) 026:H11을 감별하기 위한 진단 키트.
- 제13형에 있어서, 단일클론 항체가 하이브리도마 ATCC HB 10452에 의해 생성된 진된 키트.
- (a) 대장균 0157:H7 또는 대장균 026:H11을 함유한 것으로 추정되는 시료를 대장균 0157:H7 및 대장균 026:H11에 특이적인 단일클론 항체와 접촉시켜 면역복합체를 형성하고, (b) 복합체의 존재를 결정하여 시료내의 대장균 0157:H7 또는 대장균 026:H11을 검출하는 것으로 이루어진, 대장균 0157:H7 또는 대장균 026:H11 검출을 위한 면역분석 방법.
- 제15항에 있어서, 단일클론 항체가 하이브리도마 ATCC HB 10452로부터 제조된 방법.
- 제15항에 있어서, 단일클론 항체가 표지에 결합된 방법.
- 대장균 0157:H7 및 대장균 026:H11에 대한 단일클론 항체와 특이적으로 반응할 수 있고 대장균 0157:H7 또는 대장균 026:H11의 외막에서 발견되는 실질적으로 순수한 단백질로 이루어진 항체 분석용 생물학적 시약.
- 하이브리도마 ATCC HB 10452로부터 제조된 단일클론 항체와 특이적으로 반응할 수 있으며 대장균 0157:H7 또는 대장균 026:H11 세포로부터 수거할 수 있는 실질적으로 순수한 외막 단백질.
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