KR0152996B1 - 이.콜라이내에서 펩타이드를 분비시키기 위한 시그날 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자 - Google Patents
이.콜라이내에서 펩타이드를 분비시키기 위한 시그날 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자Info
- Publication number
- KR0152996B1 KR0152996B1 KR1019900000597A KR900000597A KR0152996B1 KR 0152996 B1 KR0152996 B1 KR 0152996B1 KR 1019900000597 A KR1019900000597 A KR 1019900000597A KR 900000597 A KR900000597 A KR 900000597A KR 0152996 B1 KR0152996 B1 KR 0152996B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- phoa
- signal sequence
- gene
- dna
- ptrc99c
- Prior art date
Links
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 61
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title description 19
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 38
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- -1 phosphate toluidine Chemical class 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101000654311 Androctonus australis Alpha-mammal toxin AaH2 Proteins 0.000 description 1
- 101000583076 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1c Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 101000761697 Hemachatus haemachatus Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000588937 Heteractis magnifica Delta-stichotoxin-Rpa1a Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000800755 Naja oxiana Alpha-elapitoxin-Nno2a Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000640206 Tityus serrulatus Alpha-mammal toxin Ts2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
내용 없음.
Description
제1a도 및 제1b도는 각각 플라스미드 pTrc99C-phoA 및 pTrc99c-phoA-Seq의 작제도이다[약어:N:NcoI, S;Sacl, P:PstI, [N]: 연결후 NcoI 부위가 재생되지 않았음, phoA: 시그날 서열이 없는 phoA 구조유전자, 화살표는 전사방향 또는 해독된 영역의 NH2→COOH 배향을 나타내며, 올리고는 합성 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.]
제2도는 플라스미드 pSec-Bp1의 지도이다.
제3도는 플라스미드 pMAC5-8(=pMA5-8 및 pMC5-8)의 지도이다[F1-ORI: 파아지 f1의 복제기원, ORI: ColE1 유형의 복제기원, CAT: 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 암호화 영역, AMP: β-락타마제 암호화 영역]
본 발명은 이종 단백질을 그람 음성 세균종의 내막과 외막 사이의 주변세포질(periplasmic) 공간내로 지향시킬 수 있는, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)로부터의 시그날 펩타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA서열, 이러한 유형의 유전자 구조물을 함유하는 플라스미드, 및 이러한 유형의 플라스미드를 갖는 숙주 유기체애 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 공지된 시그날 서열과 신규한 시그날 서열의 효율을 측정하고 비교가능케 해주는 플라스미드 백터에 관한 것이다. 이러한 비교연구의 결과로서 특히 효율적인 시그날 서열을 동정하고, 클로닝하며, 이종 단백빌을 발현시키기 위한 모든 가능한 3개의 해독 판독 프레임에 사용할 수 있다.
원칙적으로 시그날 서열은 소수성형과 친수성형의 두가지 상이한 유형으로 구별될 수 있다. 시그날 서열의 소수성 그룹은 통상적으로 약 13 내지 30개의 아미노산을 포함하는 반면에 친수성 그룹은 약 12 내지 70개의 아미노산을 포함한다. 소수성형의 시그날 서열은 3개의 구조적인 성분으로 세분될 수 있다.
즉, 하나 또는 두개의 염기성 아미노산을 갖는 비교적 친수성인 NH2말단, 7 내지 8개의 아미노산으로 이루어진 비극성이 거의 소수성인 블럭, 및 작은 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 종결되는 비교적 친수성인 COOH 말단으로 이루어진다. 이러한 소수성 시그날 서열은 소포체(ER) 막 및 세균막을 통해서 단백질을 인도한다. 비록 세균 시그날 서열과 ER 시그날 서열이 상호간에 약간 상이하기는 하지만, 작용적으로는 호환성이다. 친수성 형의 구조는 전술한 소수성형의 구조와는 상당히 상이하다: 친수성형에서는 소수성 아미노산으로 된 긴 비차단부는 없지만, 통상적으로 다수의 염기성 및 하이드록실화된 아미노산이 존재하며 소수의 산성 아미노산이 있거나 없다. 시그날 서열의 친수성형은 단백질을 미토콘드리아, 엽록체 및, 가능하게는 퍼옥시좀내로도 인도한다. 본 발명에 있어서 이들은 그리 중요하지 않다.
비록 전술한 바와 같이 원핵세포 기원 및 진핵세포 기원의 시그날 서열의 소수성형 간에는 공통적인 특징이 있고 작용적으로는 호환성이지만, 관찰가능한 차이점도 있다: 즉, 현재까지 알려져 있는 대부분의 원핵세포성 시그날 서열은 진핵세포성 시그날 서열의 소수성형(=ER형)과 비교한 결과, 비극성 부분내에 낮은 소수성을 가지며 통상적으로 NH2영역에 추가의 염기성 아미노산을 갖는 것으로 나타났다. 이는 이종 단백질에 대한 천연 시그날 서열이 통상적으로 이 단백질 앞에 선행하는 세균성 시그날 서열보다 미생물 중에서 덜 효율적으로 인지되고 프로세싱되는 이유임직 하다.
이.콜라이내 이종 단백질은 통상적으로 내막을 통해 주변세포질 공간내로 수송됨으로써 분비되며; 이종 단백질이 주변 배지내로 분비되는 극소수의 예외가 알려져 있다. 이종 단백질이 이.콜라이내 주변세포질 공간내로 수송되는 과정은 작용면에서 볼 때 단백질이 진핵세포의 소포체 관강내로 수송되는 과정과 거의 일치한다. 이러한 과정의 결과로서 이.콜라이내에서 단백질이 정확하게 폴딩되고 분자내 디설파이드 브리지도 정확하게 생성될 수 있다. 시그날 서열은 특이적 시그날 펩티다제에 의한 가단백분해로 제거될 수 있으며, 따라서 성숙한 프로세싱된 이종 단백질이 이.콜라이내에서 합성된다.
일부 단백질은 세균, 예를 들어 이.콜라이내에서 세포질성 발현된 후에 불안정하며, 프로테아제에 의해 다시 급속히 파괴된다. 이러한 분해과정은 특히, 단백질 서열 앞에 위치한 매우 효과적인 시그날 서열을 사용하여 이들 단백질을 주변 세포질 공간내로 신속히 분비시킴으로써 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 특히 유효한 시그날 서열을 분리하고 이러한 목적에 적합한 공정을 디자인하는 것이다.
그 자체에 시그날 서열을 갖지 않는, 이.콜라이의 주변세포질 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 플라스미드가 문헌[참조:Hoffman and Wright, Proc. Acad. Natl. Sci. USA; (1985) 82, 5107-5111]에 기술되어 있다. 활성 알칼리성 포스파타제는 자신의 시그날 서열을 갖는 융합 파트너와의 시험관내 융합으로 융합 단백질 형태로 분비되는 반면에, 융합되어지는 시그날 서열이 없을 경우 세포질내로 분비된 알칼리성 포스파타제에 대한 검출할만한 활성이 없었다. 만오일 및 백위드[참조문헌: Manoil and Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 8129-8133]는 시그날 서열과 3'쪽에 5개의 연속적인 아미노산이 없는 PhoA 암호화 cDNA를 트랜스포손 Tn5(상기 문헌 참조)의 전방에 배치함으로써 이러한 연구를 계속하였으며, 이로써 분비되는 단백질 뿐만 아니라 막 단백질과의 융합으로 활성 PhoA가 생성됨을 입증할 수 있었다. 전술한 작제물 TnPhoA는 결과적으로 시그날 서열 또는 시그날 서열 유사 구조물을 동정하는데 적합하다.
크납프 및 메칼라노스[참조문헌:S. Knapp and J.Mekalanos, J.Bacteriology (1988) 170, 5059-5066]는 TnPhoA 돌연변이 유발법을 이용해서, 조절시그날(이 경우에서는 니코틴산 및 MgSO4)에 의해 영향을 받는 보르데텔라 페르투시스에 있어서 돌연변이체를 생성시켰으며, 이들 돌연변이체 중 대다수는 억제되어 있고 일부는 활성화되어 있는데, 이러한 사실은 적어도 두개의 트랜스-작용성 조절 유전자가 존재함을 암시한다.
본 발명자들에 의해 돌연변이체 SK6가 매우 유효한 신규한 시그날 서열을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다.
이 신규한 시그날 서열은 보르데텔라 페르투시스로부터의 분비 단백질에 속하며 다음과 같은 서열을 갖는다(표2 및 3참조).
한편으로는 시그날-서열 클로닝 백터로서 매우 적합하고, 다른 한편으로는 분비 효율면에서 각종 시그날 서열을 정량적으로 비교할 수 있게 하는 PhoA-함유 플라스미드도 기술되어 있다. 상기의 두 목적 모두에 특히 유용한 것은 벡터pTrc99C-PhoA(제1도, 표1 및 실시예2)이다. 이 벡터는, pTrc99C[참조문헌: Amann et al. Gene 69 (1988) 301-315] 및 상기 작용을 위해 변형되고 시그날 펩타이드 서열을 갖지 않는 PhoA DNA로부터, PhoA에 대한 구조 유전자가 pTrc99C의 해독 개시 코돈에 대해 정확한 판독 프레임 내에 위치하고, Ncol절단부위가 PhoA 구조유전자(시그날 서열 없음)의 5' 말단에서 바로 생성되도록 하는 방식으로 작제된다.
따라서, 본 발명은
a) 시그날 서열:
b) 이러한 유형의 서열을 함유하는 플라스미드,
c) 단백질을 분비시키기 위한 이의 용도, 및
d) trc 같은 조절될 수 있는 강력한 프로모터에 이어서 lacZ 리보좀-결합부위(RBS)가 따르고 이어서 고 발현을 위해 최적화시킨 lacZ RBS로부터 일정한 거리에 벡터-암호화된 해독 개시 코돈이 뒤따르며 NcoI 절단부위가 시그날 서열을 갖지 않는 PhoA 구조 유전자의 5' 말단에 바로 존재하지만, PhoA 서열내에서 돌연변이에 의해 결실된다는 사실로 인해 시그날 서열의 클로닝 및 정량적 평가에 있어 특히 적합한 플라스미드, 바람직하게는 pTrc99C-PhoA에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 실시예 및 특허청구의 범위에서 더욱 상세히 설명된다.
[실시예1]
보르데텔라 페르투시스 시그날 서열의 동정 및 분리
이하에서 사용된 트랜스포손 TnPhoA는 트랜스포손 Tn5의 유도체이다. TnPhoA는 좌측 IS50 삽입 성분에 시그날 서열이 없는 이.콜라이 PhoA 구조 유전자 유도체를 함유한다. 후자는 TnPhoA가 염색체 또는 플라스미드-암호화된 유전자내로 전위될 때, TnPhoA로부터 수득된 이.콜라이 PhoA 구조 유전자의 판독 프레임과 전위에 의해 영향을 받은 구조 유전자의 시그날 서열이 동시에 같은 공간을 차지할 때만 PhoA-양성 유전자 융합이 일어나도록 하는 방법으로 만노일 및 벡위드(상기문헌 참조)에 의해 작제되었다. 염료 지시제 5-브로모-4-클로로-인독실 포스페이트 톨루이딘(XP)을 사용하여 이러한 PhoA 양성 콜로니를 동정하는 것은 용이하다. 전술한 기술을 이용하여 보르데텔라 페르투시스 야생형 균주 18323에서 TnPhoA 돌연변이 유발을 수행한다[참조문헌: Knapp and Mekalanos (1988), 상기 문헌]. 이와 같이 수행함으로써 특히 PhoA-양성 TnPhoA 돌연변이체 SK6가 생성되며 이의 TnPhoA 유전자 융합물은 vrg6라 불리운다. vrg6 유전자 융합물을 다음과 같이 벡터 플라스미드 pBR322 중의 20kb BamHI 단편상에 클로닝시킨다: 돌연변이체 SK6의 게놈성 DNA를 BamHI로 절단하고 BamHI으로 절단한 pBR322 DNA와 연결시켜 이.콜라이 균주 CC118(=PhoA 음성)에 형질전환시킨다. TnPhoA 유전자 융합물을 갖는 게놈성 단편을 함유하는 클론을 카나마이신/암피실린 한천 평판상에서 선별한다(TnPhoA는 Tn5와 유사하게 TnPhoA의 5'PhoA 부분과 TnPhoA내 유일한 BamHI 절단부위 사이에 위치하는 카나마이신- 내성 유전자를 암호화한다).
따라서, 카나마이신 내성을 지닌 TnPhoA 돌연변이체로부터 수득한 게놈성 BamHI 단편은 뒤에 오는 게놈성 BamHI 절단부위로부터 상부에 위치한 PhoA 구조 유전자 및 게놈성 보르데텔라 페르투시스 DNA도 함유해야 한다. 20kb 크기인 vrg6 유전자 융합물-함유 BamHI 단편에서, 약 14kb는 게놈성 보르데텔라 페르투시스 DNA에 해당하고 약 6kb는 TnPhoA-암호화 DNA에 해당한다. vrg6 유전자 융합물의 전사 및 해독 조절 서열을 추가로 편재 시킨다. 이러한 목적을 위하여, 20kb 크기의 BamHI 단편을 제한 분석하고, TnPhoA로부터의 완전한 PhoA 서열을 함유하지만 20kb 단편에 비해 절단된 보르데텔라 페르투시스 DNA 영역을 함유하는 아단편을 pBR322 및 pUC18에 클로닝시킨다. 이러한 방법은 수득된 결실 유도체를 보르데텔라 페르투시스내에서 복제시킬 수 있는 플라스미드 pLAFR2에 재클로닝시키고[참조문헌: Friedmann et al.(1982), Gene 18, 289-196], 보르데텔라 페르투시스내로 융합이동시킨 후에 조절에 민감한 PhoA 활성에 대해 검사한다. 이러한 방법으로 약 3.2kb 크기의 PstI 단편을 동정하고 pUC18에 아클로닝시키며, vrg6 유전자 융합물의 TnphoA 삽입부위 상부의 보르데텔라 페르투시스 DNA중의 약 500개 염기쌍만을 함유하고 보르데텔라 페르투시스내에서 유도시 PhoA 양성인 pUC-PI을 수득한다. 20kb 크기의 클로닝된 BamHI 단편이나 3.2kb 크기의 PstI 단편을 함유하느 보르데텔라 페르투시스 유도체의 PhoA 활성이 이들의 포스파타제 활성에 있어서 실질적으로 차이가 없으므로, PstI 단편상에 vrg6 유전자 융합물의 전사 및 해독 조절 서열이 여전히 완전하게 존재한다. pUC-PI을 출발물질로 사용하여, 헤니코프의 방법[참조문헌 : Henikoff, Gene 28, 351-359 (1984)]에 의해 효소 엑소뉴클레아제 III 및 S1 뉴클레아제를 사용하여 TnPhoA 삽입 부위로부터 상부로 500개 염기쌍을 위치시킨 DNA 영역에서 결실을 유도한다. 결실을 유도한 결과 특히 두가지의 pUC-PI유도체 vrg6-△12 및 vrg6-△11이 생성되었다. vrg6-△12는 TnPhoA 삽입부위로부터 상부쪽에 약 200개 염기쌍의 보르데텔라 페르투시스-특이적 DNA를 여전히 함유하며 마찬가지로 PhoA 양성이다. DNA 서열 분석으로 상기 재조합 플라스미드상의 보르데텔라 페르투시스 시그날 서열을 결정하였다.
시그날 서열은 다음과 같다(표2참조):
이러한 방법으로 특정화된 보르데텔라 페르투시스의 시그날 서열은 21개 아미노산을 포함하고, 계속해서 실시예3에 기술된 바와 같이 제조하고 클로닝한다. 이는 이종 단백질을 분비시키는데 적합하다.
vrg6-△11는 TnPhoA 삽입부위로부터 상부에 단 4개의 보르데텔라 페르투시스-특이적 뉴클레오티드를 함유하고 pUC18-특이화된 SacI 절단부위가 따른다(표1). vrg6-△11 DNA를 PstI/SacI 절단하면, TnPhoA로부터, 시그날 서열이 없고 약 2.6kb 크기의 단편상에 존재하며 실시예2의 시그날 서열을 함유하지 않는 PhoA 구조 유전자의 공급원 역할을 하는 완전한 PhoA 구조 유전자가 생성된다.
[실시예2]
시그날 서열을 클로닝하고 효율을 비교측정하기 위한 벡터 플라스미드(pTrc99C-PhoA)의 작제
벡터 플라스미드 pTrc99C-PhoA의 작제 방법이 하기에 기술되었다. 이 벡터 플라스미드는 필수성분으로서 전술한 PhoA 구조 유전자를 함유하고 시그날 서열이 없으며 TnPhoA로부터 분리된다. PhoA 구조 유전자는 내부 NcoI 절단부위를 함유한다. 이 절단부위는 아미노산 서열을 유지시키면서 부위-지향성 돌연변이 유발법에 의해 제거시킨다.
이러한 목적을 위해, 먼저에 재조합 PhoA-음성 플라스미드 pvrg6-△11(실시예1 참조)를 EcoRI으로 절단하고, PhoA 구조 유전자의 내부 영역으로부터 330개 염기쌍 크기의 단편을 분리한다. 돌연변이시킬 NcoI 절단부위를 함유하는 상기 단편을 돌연변이 유발 벡터 pMa5-8의 EcoRI 부위에 연결시킨다(제3도). 생성된 플라스미드 pMa5-8-EcoRI 330을 분리하여 일본쇄 제조에 사용한다. 이어서 이러한 방법으로 수득된 클로닝시킨 EcoRI 단편을 갖는 일본쇄를 공지된 방법으로 분리하고, 다음의 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용해서, 공개된 갭핑-듀플렉스 돌연변이 유발법[참조문헌: Kramer et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 9441-9456]을 수행한다.
목적하는 NcoI 돌연변이를 갖는 플라스미드를 적절한 제한분석으로 동정하고, 관련된 영역을 서열분석하여 정확한지 확인한다. 계속해서 이 플라스미드로부터 330개 염기쌍 크기의 EcoRI 단편을 재분리하고 플라스미드 pvrg6-△11 의 상응하는 단편 자리에 위치시킨다. 이러한 목적을 위해, pvrg6-△11을 EcoRI으로 부분 분해시키고, 출발 플라스미드 pvrg-6-△11보다 330개 염기쌍 가량 더 짧아지고 (약 6700bp) EcoRI 부분 분해로 선형화시킨 단편을 분리한다. 이러한 크기(약 6400bp)의 EcoRI 단편을 알칼리성 포스파타제로 처리하여 330개 염기쌍 크기의 돌연변이된 EcoRI 단편에 연결시키고, 연결 혼합물을 이.콜라이에 형질전환시킨다. 정확히 삽입된 330개 염기쌍 EcoRI 단편을 갖는 복구된 PhoA 구조 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 제한분석 및 DNA서열분석으로 동정한다. 이러한 유형의 재조합 플라스미드, pvrg6-△11-△NcoI를 복제시켜 하이브리드 플라스미드 pTrc99C-PhoA 를 작제하는데 사용한다. 이러한 목적을 위해서, pvrg6-△11-△NcoI 로부터 약 2600개 염기쌍 크기의 SacI-ScaI 단편을 분리한다. 다음 단계에서 pTrc99C[참조문헌: Amann et al. (1988) Gene 69, 301-315]로부터 수득된 약 900개 염기쌍 크기의 SacI-ScaI 단편을 약 2600개 염기쌍 크기의 상기 SacI-ScaI 단편으로 대체시킨다. 상기 조작 결과로서 생성된 제조합 플라스미드 pTrc99C-PhoA는 시그날 서열이 없는 PhoA 구조 유전자의 5' 말단에 바로 단일 NcoI 절단부위를 함유하게 되며, 하기 실시예에서 나타나는 바와 같이 특정 목적의 합성 또는 천연 시그날 서열을 클로닝시키는데 사용될 수 있다. pTrc99C-PhoA는 발현 벡터 pTrc99C의 해독 개시 코돈에 대하여 정확한 판독 프레임 중에 PhoA의 구조 유전자를 함유하지만, PhoA 시그날 서열이 존재하지 않기 때문에 형질전환된 이.콜라이 세포내에서 효소학적 활성 알칼리성 포스파타제를 합성시킬 수 없으므로 시그날-서열 클로닝 벡터로 적합하다. 추가로, pTrc99C-PhoA는 하이브리드 trc 프로모터[참조문헌: Amann and Brosius(1985) Gene 40, 183-190]로부터 상부에 lacZ 리보좀-결합부위(RBS) 및 고발현되도록 최적화된 lacZ RBS로부터 일정거리만큼 떨어진 위치에 해독개시 코돈을 함유한다. 재조합 플라스미드 pTrc99C-PhoA를 함유하는 이.콜라이 세포는 상기 플라스미드의 PhoA 구조 유전자가 시그날 서열이 결실되어 있기 때문에 플라스미드-암호화된 생물학적 활성 알칼리성 포스파타제 활성을 나타내지 않는다. 따라서 정확한 판독 프레임내에서 PhoA 구조 유전자의 전방에 시그날 서열을 암호화하는 DNA 단편을 배치시킴으로써 PhoA-양성 콜로니를 생성시킬 수 있다. 이러한 과정은 pTrc99C-PhoA를 NcoI으로 절단하고 시그날 서열을 암호화하는 합성 DNA 단편을 상기 벡터 DNA내에 삽입시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 조작에 의한 하이브리드 플라스미드를 함유하는 세균 콜로니는 이미 전술한 염료 지시제 XP를 사용하여 이들의 새로운 PhoA-양성 표현형에 의해 쉽게 동정될 수 있다. 제시된 기본원리는 이하에서 설명적인 양태 형태로 제시된다. 각종 분비성 단백질의 시그날 서열을 pTrc99C-PhoA 벡터에 클로닝시키면 시그날 서열만 상이한 동인자형(isogenic) 재조합 플라스미드가 생성된다. 이러한 이유로 해서, 이와 같은 작제물을 함유하는 이.콜라이 세포의 PhoA 활성은 관련된 클로닝된 시그날 서열의 효율을 측정하는 수단을 제공한다.
벡터 pTrc99C-PhoA의 다른 가능한 용도는 명료하게 정의된 시그날 서열을 암호화하지는 않지만 시그날 서열의 각각의 위치에 대하여 다수의 아미노산이 존재할 수 있도록 축퇴된 합성 DNA 단편을 클로닝하는 것이다. 이러한 클로닝은 어느 정도는 숏건(shotgun) 클로닝이며, 벡터로 인해 가능한 PhoA 활성 측정은 합성 시그날 서열의 효율 측정을 나타낸다. 이러한 방법을 이용해서 클로닝된 유전자의 이종성 발현을 위해 사용될 수 있는 신규한 시그날 서열을 제조하고 평가할 수 있다.
pTrc99C-PhoA의 작제 원리가 제1도에 나타나 있다. 표1은 pTrc99C-PhoA의 관련된 클로닝 및 해독 개시 영역을 나타낸다.
[실시예3]
보르데텔라 페르투시스 시그날 서열의 DNA 합성 및 클로닝, 및 분비 단백질에 대한 5개의 다른 천연의 미생물 시그날 서열의 DNA 합성 및 클로닝
벡터 pTrc99C-PhoA를 사용하여 아미노산 서열이 표2에 나타난 바와 같은 6개의 상이한 시그날 서열을 클로닝시킨다. 신규의 보르데텔라 페르투시스 시그날 서열외에 5개의 다른 시그날 서열도 다음과 같은 기준에 따라 선별한다:
a) 주변세포질성 단백질의 시그날 서열
- 이.콜라이로부터의 알칼리성 포스파타제(PhoA)[참조문헌: Kikuchi et al.(1981) Nucleic Acid Res. 9, 5671-5678]
b) 외막 단백질의 시그날 서열
- 이.콜라이로부터의 외막 단백질(ompA)[참조문헌: Movva et al. (1980) J. Biol. Chem. 255, 27-29]
c) 배지 중으로 분비되는 3개의 단백질의 시그날 서열
- 이.콜라이로부터의 열안정성 독소 I(STI)[참조문헌: So and McCarthy (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4011-4015]
- 이.콜라이로부터의 열안정성 독소 II(STII)[참조문헌 : Lee et al. (1983) Infect. Immun. 42, 264-268]
- 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 아밀라제[참조문헌: Yang et al (1983) Nucleic Acids Res. 11, 237-249]
이들 시그날 서열을 합성 및 클로닝하는데 다음과 같은 간단한 명명법이 사용되었다.
언급된 6가지 시그날 서열 모두는 DNA 합성에 의해 제조된다. 이러한 목적을 위해 합성된 DNA 단편(표3) 을 클로닝시키고 실시예2에 기술된 알칼리성 포스파타제에 대한 선별을 이용해서 시험 벡터 pTrc99C-phoA 중에서 동정한다. 시그날 서열을 암호화하는 합성 DNA 단편을, 벡터 pTrc99C-phoA 중에 정확한 배향으로 삽입시킨후, 시그날 서열 암호화 영역으로부터 하부에 특이적으로 단 하나의 NcoI 부위만이 재생되도록 디자인한다(제1도, 표3 및 4참조). 즉, 이러한 NcoI 부위는 실시예4에서 더 자세히 설명된 바와 같이, 이종 유전자를 pSEC벡터(pSEC=분비)내로 삽입시키기 위한 클로닝 부위로 사용될 수 있다.
표3에 나타낸 12개의 DNA 단편은 β-시아노에틸 아미다이트를 사용하여 공지된 방법[참조문헌: Sinha et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 4539-4557]으로 합성된다. 바이오써치(Biosearch) 합성기를 사용하여 포스파이트 트리에스테르법[참조문헌: Letsinger (1975) J.Amer. Chem. Soc. 97, 3278; Letsinger (1976) J. Amer. Chem. Soc. 98, 3655]으로 합성시킨다. 담체(CPG)를 실온에서 5 내지 8시간 동안 농 암모니아로 절단시킨 후, 염기상의 보호그룹을 55℃에서 약 12시간 동안 동일 용액중에서 절단한 후에 올리고데옥시뉴클레오티드를 겔 전기영동 또는 역상 HPLC 정제한다. 올리고데옥시뉴클레오티드를 어닐링 완충액(100mM NaCl, 10mM 트리스-Cl(pH 7.8), 0.1mM EDTA) 중에 넣고, 몰량의 각 분쇄를 혼합하여 95℃에서 5분간 항온처리하고 실온으로 서냉시킨다. 이본쇄 DNA단편은 5' 말단에 4개 염기길이이고 NcoI 인지부위에 상보적인 일본쇄 영역을 갖는다. 시험벡터 pTrc99C-phoA를 NcoI로 선형화시키고 하이브리드화 DNA 단편과 각종 혼합물 중에서 연결시킨다. 컴피턴트(competent) 이.콜라이 세포를 공지된 방법으로 연결 혼합물로 형질전환 시키고, LB/amp 한천 평판상에 플레이팅 하여 37℃에서 밤새 배양한다. 콜로니를 레플리카-플레이팅법에 의해 LB/Amp/Xp/IPTG 지시제 평판에 옮기고 37℃에서 다시 배양한다. PhoA-양성 콜로니는 이 지시제 평판에서 청색을 띤다. 이들 콜로니의 플라스미드 DNA를 분리하여 서열분석하고, 합성 DNA단편의 정확한 배향 및 전술한 6개의 예에 대한 예상된 정확한 시그날 서열을 확인할 수 있다.
이러한 방법으로 수득되고 서열분석 결과 정확한 것으로 확인된 특정 시그날 서열을 갖는 플라스미드를 상기의 표에 따라서 pTrc99C-phoA-Seq-1, -2, -3, -4, -5 및 -6으로 명명한다. 따라서, 표준화된 조건하에서 흡광도를 기초로 하여(방출된 염료의 측정), 보르데텔라 페르투시스로부터 상대적으로 가장 강력한 것으로 밝혀진 이들 시그날 서열을 비교 및 평가할 수 있다.
[실시예4]
분비 벡터 pSEC-Bp-1, pSEC-Bp-2 및 pSEC-Bp-3의 작제
클론 pTrc99C-phoA-Seq-1의 플라스미드 DNA를 SacI 및 ScaI로 분해하고 약 3.1kb 크기의 단편을 분리한다. 이 단편은 보르데텔라 페르투시스 시그날 서열외에 pTrc99C-특이 서열만을 함유한다(제1도 참조). 이 단편을 3개의 독립된 혼합물 각각에서 플라스미드 pTrc97A, pTrc97B 및 pTrc97C의 약 0.9kb SacI/ScaI 단편 중 하나와 연결시키고[참조문헌: Amann et al.상기문헌], 생성된 플라스미드를 pSEC-Bp-1, pSEC-Bp-2 및 pSEC-Bp-3으로 명명한다. 이 조작 과정은 플라스미드 pTrc97A, pTrc97B 및 pTrc97C의 긴 폴리링커 영역을 사용함으로써 브르데텔라 페르투시스 시그날 서열을 암호화하는 영역으로부터 하부에 다수의 제한부위를 갖는 세 개의 판독 프레임 모두를 이용할 수 있게 한다(표4). 이들 작제물과 유사하게 플라스미드 pTrc99C-phoA-Seq-2, -3, -4, -5 및 -6을 사용함으로써 이종 단백질을 발현 및 분비시키기 위한 유사한 분비 벡터도 제조할 수 있다. 이러한 방법으로 제조된 분비 벡터는 그들의 상대적인 효율 및 각 경우에 사용된 시그날 서열의 기원에 따라서 발현 생성물의 세포내 위치가 상이하다. 실례로서 제2도는 pSEC-BP1의 플라스미드 구조를 나타내고, 표5는 pSEC-BP1의 완전한 DNA 서열을 나타내며, 여기에서 ***는 출발 또는 정지 코돈을 의미한다. 제3도에서, pMAC5-8는 CAT에서 앰버(amber) 돌연변이(위치 3409에서 A)되었고 pMC5-8는 AMP에서 앰버 돌연변이(위치 2238에 C)되었다.
Claims (3)
- 아미노산 서열 MKKWFVAAGIGAGLLMLSSAA를 갖는, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)로부터의 시그날 펩타이드.
- 제1항에 청구된 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA.
- 제2항에 청구된 DNA 또는 RNA를 관련 구조 유전자의 전방에 위치시킴을 포함하여, 그람-음성 세균내에서 단백질을 분비시키는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DEP3901681.1 | 1989-01-21 | ||
| DE3901681A DE3901681A1 (de) | 1989-01-21 | 1989-01-21 | Signalpeptid fuer die sekretion von peptiden in escherichia coli, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR900011900A KR900011900A (ko) | 1990-08-02 |
| KR0152996B1 true KR0152996B1 (ko) | 1998-10-15 |
Family
ID=6372488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019900000597A KR0152996B1 (ko) | 1989-01-21 | 1990-01-19 | 이.콜라이내에서 펩타이드를 분비시키기 위한 시그날 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5159062A (ko) |
| EP (1) | EP0391022A3 (ko) |
| JP (2) | JP2939283B2 (ko) |
| KR (1) | KR0152996B1 (ko) |
| AU (1) | AU619378B2 (ko) |
| CA (1) | CA2008244A1 (ko) |
| DE (1) | DE3901681A1 (ko) |
| PT (1) | PT92886B (ko) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3130893A (en) * | 1991-11-15 | 1993-06-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| FR2690459B1 (fr) * | 1992-04-23 | 1995-03-03 | Pasteur Institut | Plasmide de B. bronchiseptica, dérivés de ce plasmide et leur utilisation en tant que vecteurs pour la transformation de cellules hôtes. |
| JP2879303B2 (ja) * | 1993-01-14 | 1999-04-05 | 佑 本庶 | ｃＤＮＡライブラリーの作製方法、および新規なポリペプチドとそれをコードするＤＮＡ |
| US6143557A (en) * | 1995-06-07 | 2000-11-07 | Life Technologies, Inc. | Recombination cloning using engineered recombination sites |
| US6720140B1 (en) | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
| US6964861B1 (en) | 1998-11-13 | 2005-11-15 | Invitrogen Corporation | Enhanced in vitro recombinational cloning of using ribosomal proteins |
| AU6045196A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Zymogenetics Inc. | Secretion leader trap cloning method |
| US5753462A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-19 | Zymogenetics, Inc. | Secretion leader trap cloning method |
| US5851808A (en) | 1997-02-28 | 1998-12-22 | Baylor College Of Medicine | Rapid subcloning using site-specific recombination |
| AU752704B2 (en) | 1997-10-24 | 2002-09-26 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
| US7351578B2 (en) * | 1999-12-10 | 2008-04-01 | Invitrogen Corp. | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
| CN101125873A (zh) * | 1997-10-24 | 2008-02-20 | 茵维特罗根公司 | 利用具重组位点的核酸进行重组克隆 |
| US20030124555A1 (en) * | 2001-05-21 | 2003-07-03 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules |
| JP4580106B2 (ja) | 1999-03-02 | 2010-11-10 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 核酸の組換えクローニングにおける使用のための組成物および方法 |
| US6664386B1 (en) | 1999-04-08 | 2003-12-16 | The Research Foundation Of State University Of New York | System for efficient secretion of recombinant proteins |
| DK1250453T3 (da) | 1999-12-10 | 2008-08-11 | Invitrogen Corp | Anvendelse af multiple rekombinations-sites med unik specificitet i rekombinationskloning |
| US7244560B2 (en) * | 2000-05-21 | 2007-07-17 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| CA2444195A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for recombinational cloning of nucleic acid molecules |
| US7112434B2 (en) | 2001-05-02 | 2006-09-26 | University Of South Florida | Vector system for selection of genes encoding secreted proteins and membrane-bound proteins |
| EP2287341B1 (en) | 2003-12-01 | 2013-02-13 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| US20060234360A1 (en) * | 2005-04-13 | 2006-10-19 | Paola Branduardi | Ascorbic acid production from D-glucose in yeast |
| CN101998965B (zh) | 2007-11-01 | 2014-03-12 | 安斯泰来制药有限公司 | 免疫抑制性多肽与核酸 |
| WO2019099615A1 (en) | 2017-11-17 | 2019-05-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of copeptin to modulate the immune response and hematopoiesis, and stimulate bone growth |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030687A (ja) * | 1983-08-01 | 1985-02-16 | Wakunaga Seiyaku Kk | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド |
| ES2007309T3 (es) * | 1987-04-23 | 1994-11-01 | Monsanto Co | Secrecion del factor de crecimiento insulinoide 1 en e.coli. |
| DE3843894A1 (de) * | 1988-12-24 | 1990-06-28 | Behringwerke Ag | Plasmide mit translations-start-stop-start codon-konfiguration zur expression von proteinen in e.coli |
| AU5966790A (en) * | 1989-06-30 | 1991-01-17 | Upjohn Company, The | Genetic elements useful in production of active protein |
-
1989
- 1989-01-21 DE DE3901681A patent/DE3901681A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-17 EP EP19900100891 patent/EP0391022A3/de not_active Withdrawn
- 1990-01-18 PT PT92886A patent/PT92886B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-01-19 AU AU48622/90A patent/AU619378B2/en not_active Ceased
- 1990-01-19 KR KR1019900000597A patent/KR0152996B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-01-19 JP JP2008571A patent/JP2939283B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-19 US US07/467,551 patent/US5159062A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-22 CA CA002008244A patent/CA2008244A1/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-02-07 US US08/385,366 patent/US5580758A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-09 JP JP10349715A patent/JPH11346784A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0391022A3 (de) | 1992-01-29 |
| EP0391022A2 (de) | 1990-10-10 |
| US5580758A (en) | 1996-12-03 |
| US5159062A (en) | 1992-10-27 |
| PT92886B (pt) | 1995-11-30 |
| CA2008244A1 (en) | 1990-07-21 |
| JPH11346784A (ja) | 1999-12-21 |
| JPH02247198A (ja) | 1990-10-02 |
| AU4862290A (en) | 1990-08-16 |
| AU619378B2 (en) | 1992-01-23 |
| JP2939283B2 (ja) | 1999-08-25 |
| KR900011900A (ko) | 1990-08-02 |
| PT92886A (pt) | 1990-07-31 |
| DE3901681A1 (de) | 1990-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0152996B1 (ko) | 이.콜라이내에서 펩타이드를 분비시키기 위한 시그날 펩타이드 및 이를 암호화하는 유전자 | |
| Ito et al. | A temperature-sensitive mutant of E. coli exhibiting slow processing of exported proteins | |
| De Graaf et al. | Production and release of cloacin DF13 and related colicins | |
| KR100530598B1 (ko) | 초내열성 프로테아제 발현계 | |
| Ludwig et al. | Mutations affecting activity and transport of haemolysin in Escherichia coli | |
| Bankaitis et al. | Proper interaction between at least two components is required for efficient export of proteins to the Escherichia coli cell envelope | |
| Mooi et al. | Organization and expression of genes involved in the production of the K88ab antigen | |
| Baty et al. | Extracellular release of colicin A is non‐specific. | |
| Kodaira et al. | The dnaX gene encodes the DNA polymerase III holoenzyme τ subunit, precursor of the γ subunit, the dnaZ gene product | |
| Tsuboi et al. | Characterization of the genes coding for two major cell wall proteins from protein-producing Bacillus brevis 47: complete nucleotide sequence of the outer wall protein gene | |
| Strom et al. | Mapping of export signals of Pseudomonas aeruginosa pilin with alkaline phosphatase fusions | |
| Cavard et al. | Lipoprotein nature of the colicin A lysis protein: effect of amino acid substitutions at the site of modification and processing | |
| HU205386B (en) | Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell | |
| US4914025A (en) | Export of intra-cellular substances | |
| Jacob‐Dubuisson et al. | Amino‐terminal maturation of the Bordetella pertussis filamentous haemagglutinin | |
| Boquet et al. | Use of TnphoA to detect genes for exported proteins in Escherichia coli: identification of the plasmid-encoded gene for a periplasmic acid phosphatase | |
| JPH0811073B2 (ja) | ヒルジンの遺伝子工学的製法 | |
| EP0232229A2 (en) | Cloning and expression of Bordetella pertussis toxin-encoding DNA | |
| IE62257B1 (en) | A process for the preparation of antibodies by genetic engineering | |
| Mooi et al. | Construction and characterization of mutants impaired in the biosynthesis of the K88ab antigen | |
| Traxler et al. | Revised genetic map of the distal end of the F transfer operon: implications for DNA helicase I, nicking at oriT, and conjugal DNA transport | |
| Kornacker et al. | Information essential for cell‐cycle‐dependent secretion of the 591‐residue Caulobacter hook protein is confined to a 21‐amino‐acid sequence near the N‐terminus | |
| Pohlner et al. | Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Secretion and implications for pathogenesis | |
| Sloma et al. | Molecular cloning and nucleotide sequence of the type I β-lactamase gene from Bacillus cereus | |
| CA1301096C (en) | High yield protein production system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 19900119 |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 19950118 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 19900119 Comment text: Patent Application |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 19971027 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 19980422 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 19980701 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 19980701 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20010628 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20020627 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20020627 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |
Termination category: Default of registration fee Termination date: 20040410 |