KR0152100B1

KR0152100B1 - 분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙한 t세포를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR0152100B1
Application number: KR1019930700661A
Authority: KR
Inventors: 와따나베 요시히로
Original assignee: 시게루 미즈노; 재팬-타바코 인코퍼레이티드
Priority date: 1991-07-04
Filing date: 1992-07-01
Publication date: 1998-10-01
Also published as: EP0552372B1; US5792655A; EP0552372A4; CA2090677C; US5476780A; WO1993001277A1; KR930702508A; CA2090677A1; ATE180830T1; DE69229333D1; EP0552372A1

Abstract

T 전구세포계를 영양배지중의 용존산소농도가 통상의 대기하에 있어서의 영양배지중 용존산소농도보다 높은 조건하에 배양하는 것을 특징으로 하는 T 전구세포계의 배양방법이 제공된다.

본 발명의 방법에 의하면 세포 또는 조직의 일반적인 배양방법인 침강(현탁)배양법을 사용하여 T 전구세포의 분화항원표현형상 또는 기능상분화, 성숙된 T 세포에의 유도가 재현, 달성된다.

Description

[발명의 명칭]

분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙한 T세포를 제조하는 방법

[기술분야]

본 발명은 T전구세포계로부터 분화, 성분한 T 세포를 유도, 생성시키는 방법 및 이 방법을 사용하여 얻어지는 T 세포에 관한 것이다.

[배경기술]

T세포의 가장 초기의 세포는 주로 골수 중 또는 태아 간장에 있어서 다분화기능을 갖는 혈액 간(幹)세포로부터 분화된 임파구계 간세포로서 존재하나, 주로 흉선에 이주된 후, 일련의 분화단계를 거쳐 T 세포로 숙성해간다. 이 T전구세포의 분화, 성숙은 흉선 스트로마세포에 기인하는 영향을 강하게 받고 있으며, T전구세포는 흉선피질내에 들어간 후, T세포의 분화, 성숙에 관여하는 흉선상피세포를 주체로 하는 기질세포 및 마크로파아지 등의 미에로이드계 세포와의 접착 및 그 것들이 생산하는 액성인자 등의 제어하에, 급속히 분열 및 증식을 하면서 T 세포로 분화, 성숙해간다. 몇 개의 분화단계를 거친 흉선세포는 흉선피질과 흉선수질의 경계부로 부터 혈류를 타고 말초 임파조직으로 이주하고 더욱 분화, 성숙해 간다.

이와 같은 T 전구세포의 분화, 성숙의 상세한 과정을 연구하기 위해서는 생체 밖(in vitro)에서 T 세포의 증식, 분화 및 성숙이 달성되는 배양계가 필요하다.

한편, 알레르기 질환 또는 여러 가지의 자기면역 질환은 그의 발증 원인으로서 감염균이나 외래항원의 감작에 기인하는 T 세포의 분화, 또는 기능이상이 큰 원인이라고 생각되고 있다.(Animesh A. et al, Science, 248, 1380-1388, 1990, Irun R. Cohen et al, Immunology Today, 12, No4, 105-110, 1991 및 Lars Klareskog et al, Immunological Reviews, No118, 285-310, 1990 등)

현재 이와 같은 질환의 치료제로서 비특이적인 항염증제나 T세포 기능억제제로서의 면역 억제제가 응용되고 있으나 그의 비특이성 때문에 질환의 근본적인 치유를 달성하지 못하고 있다.

그래서, 이와같은 문제를 극복하기 위하여 질환의 원인이 되고 있는 항원을 특정하고 이 항원을 사용하는 백신요법이나 이 항원에 대한 항체 등으로 대표되는 질환 특이적인 억제인자를 사용하는 혈청백신 요법에 관한 연구가 진행되고 있다. 또, 항원특이성이 명백해진 T 세포를 사용한 세포백신요법이 T 세포 분화기능이상이 원인이라고 생각되는 질환에 대하여 유효한 치료방법이 될 수 있다고 생각되고 있다.(Jose C. Gutierrez-Ramos et al, Nature, 346, 271-274, 1990판 및 Kohei Ota et al, Nature, 346, 183-187, 1990등). 그러나 임의의 항원특이성을 갖는 T세포를 생체 밖에서 유도할 수가 있는 방법은 특정의 방법에 한정되고 있었다.

사실, 세포 또는 조직을 배양하는 일반적으로 사용되고 있는 방법으로서, 세포 또는 조직을 영양배지중에 침강 또는 현탁시켜서 배양하는 침강(현탁)배양법(submerged(suspension) culture)이 종래부터 널리 알려져 있으나, 이러한 종래법에 의해서는 T 전구세포를 T 세포로 분화, 성숙시키는 것은 불가능하였다.

현재 T전구세포의 분화, 성숙을 달성시킬 수 있는 유일의 배양방법으로서, 태아흉선을 이산화탄소농도를 5%로 조절한 대기하에서, 기상과 영양배지의 기액계면상에서 배양하는 이른바 부유배양법(afloat culture)이 알려져 있을 뿐이다.(Jenkinsen E.T. et al, Enr, J, Immunology, 12, 583, 1982 및 Osamu Mazda et al, J. Exp. Med., 173, 539-547, 1991 등) 그러나 이 방법은 특수한 기구를 필요로 하는데다가 액면측의 세포의 분화가 불충분하며, 또 세포의 대폭적인 증식을 수반하는 T전구세포의 배양에는 적합치않아 대량 배양이 곤란하다는 결점을 갖고 있었다.

따라서, 세포 또는 조직의 일반적인 배양방법인 침강(현탁)배양법(submerged(suspension) culture)을 사용하여 T 전구세포가 분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙한 T 세포에의 유도가 재현, 달성되는 배양방법의 개발이 강하게 요망되고 있다.

또, 일본특허공개공보 평 3-504329호 공보에는, 밀폐용기 중에 배치된 배지중에 필요한 산소량을 함유하는 혼합가스를 봉입한 가스봄브와 연결한 실리콘관을 통하여 배지중에 정상적으로 필요한 산소량을 공급하고 배지중의 용존산소농도를 높임으로써 사람B아구세포주를 증식시키는 방법이 개시되어 있으나, 이 방법으로는 사람B아구세포주의 증식은 인정되나, 세포의 분화 및 성숙은 달성되고 있지 않다. 본 발명은 이 명세서에 개시되어 있는 방법에 비하여 보다 간편한 방법에 의해 또 더욱 높은 배지중 용존산소농도하에서 T 전구세포의 증식, 분화항원 표현상 또는 기능상의 분화 및 성숙을 달성시킬 수가 있다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 목적은 세포 또는 조직의 일반적인 배양방법인 침강(현탁)배양법을 사용하여 T 전구세포의 분화항원 표현형상 또는 기능상분화, 성숙된 T 세포에의 유도가 재현, 달성되는 배양방법 및 이 배양방법을 사용하여 얻어지는 T 세포를 제공하는 것이다.

이 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 생체 밖에서의 T 전구세포계의 배양방법에 관하여 예의 연구를 거듭한 결과 T 전구세포체를 영양배지 중의 용존산소농도 보다 높은 조건하에 즉, 고농도 산소조건하에 배양함으로써 분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙된 T세포가 극히 효율좋게 또 간편하게 유도, 생성되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 의한 T 전구세포계의 배양방법은 T 전구세포계를 영양배지중의 용존산소농도가 통상의 대기하에 있어서의 영양배지중 용존산소농도보다 높은 조건하에 배양하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명에 의하면 세포 또는 조직의 일반적인 배양방법으로서 널리 알려져 있는 침강(현탁)배양법(submerged(suspension) culture)에 의해 T 전구세포를 정상으로 분화항원 표현형상 또는 기능상분화, 성숙된 T 세포로 유도하고, 증식시킬 수가 있다. 또 본 발명에 의하면 특수한 기구를 필요로 하지않고 극히 용이하게 배양할 수가 있으며 또 대량배양이 가능하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서 사용되는 「T 전구세포계」, 「T 전구세포」, 「T 전구세포를 함유하는 조직」, 「임파조직간질세포계」, 「영양배지」, 「영양배지중 용존산소농도」 및 「분화항원 표현형상 또는 기능상분화, 성숙한 T 세포」 인 용어는 하기와 같은 의미로써 정의된다.

a) 「T전구세포계」

본 발명에서 사용되는 「T 전구세포계」란 「T전구세포」, 「T 전구세포를 함유하는 조직」 또는 「T 전구세포 및 임파조직간질세포계와의 조합」을 의미하고, 경우에 따라 증결간세포를 함유하고 있어도 좋다.

이 「T 전구세포계」는 종차, 성차 및 연령에 한정되는 일이 없이 T 전구세포를 갖는 조직으로부터 채취할 수가 있고, 바람직하게는 예컨대, 쥐, 마우스, 토끼, 말 또는 소 등의 포유동물로부터 채취할 수가 있고, 더 바람직하게는 상기 포유동물 또는 사람의 태아 또는 신생아로부터 채취할 수 있다.

면역응답에 관여하는 세포군은 면역담당세포라고 총칭되고 그 중에서도 T 계열 및 B 계열의 임파구는 항원기억에 관여하여 면역응답의 중심적 역할을 하고 있다.

본 발명은 이중의 T 계열세포에 관한 것이다. 이 T 계열세포는 주로 골수 또는 태아 간장에 존재하는 조혈간세포로부터 분화된 임파구계 간세포에 그의 기원을 가지며, 분화에 의해 T 세포계 간세포를 발생 시킨다. 이 T 세포계 간세포는 흉선에 이주하여 증식을 수반하는 분화의 각 단계를 거쳐 세포성 면역을 담당하는 능력을 갖는 T 세포로 성숙한다.

즉, 본 발명에서 사용되는 「T 전구세포」란 상기와 같이 임파구계 간세포로부터 성숙 T세포에 달하는 일련의 과정에 있어서의 모든 분화단계에 있는 T계열세포를 의미한다. 예를 들면, 본 명세서 중에서 사용되는 「태아흉선세포」군은 흉선에 이주한 T세포계 간세포를 많이 포함하고 있으며, 「T 전구세포」원으로써 극히 유용한다. 「T 전구세포를 함유하는 조직」이란, 상기와 같은 「T 전구세포」를 함유하는 조직을 의미하고, 구체적으로는 예컨대 흉선, 골수 또는 간장유래의 조직을 의미하고, 특히 바람직하게는 흉선 또는 골수를 의미한다. 「임파조직간질세포계」란 상기와 같은 「T 전구세포를 함유하는 조직」에 있어서 「T 전구세포」를 지지하고 에워싸고 있는「T 전구세포」 이외의 세포계(예컨대, 흉선상피세포, 섬유아세포 및 세포간물질 등)을 의미하고 본 발명에서는 각각 동일 또는 상이한 동물종의 동일 또는 각각 상이한 개체로부터 취득한「T 전구세포」와 「임파조직간질세포계」를 조합하여 실시할 수가 있고, 예컨대 태아흉선세포와 흉선간질세포계를 조합하여 실시할 수가 있고, 더 구체적으로는 예컨대 사람 T 전구세포와 마우스 흉선간질세포계, 마우스 T전구세포계와 사람흉선간질세포계, 사람 T 전구세포와 쥐흉선간질세포계 또는 쥐 T 전구세포와 사람흉선간질세포계 등의 조합에 의해 실시할 수가 있다.

b) 「영양배지」

본 발명에서 사용되는 「영양배지」란 a)에서 정의되는 T 전구세포계를 분화, 증식, 성숙, 유지 또는 보존시키기 위하여 사용되는 것이며, 통상 세포배양에 사용되는 여하한 배지라도 좋다. 예시한다면 RPMI-1640 배지 또는 MEM 기본배지 등을 들 수가 있다.

기본 성분으로서 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 아미노산, 비타민, 호르몬, 항생물질, 혈청 또는 목적에 따라 그외의 화학성분을 함유할 수 있다.

또 목적에 따라 인터로이킨-1, 인터로이킨-2, 인터로이킨-3, 인터로이킨-4, 인터로이킨-5, 인터로이킨-6, 인터로이킨-7, 인터로이킨-8, 인터로이킨-9, 인터로이킨-10, 인터로이킨-11, 인터로이킨-12, TNT(Tumour Necrosis Factor), γ-인터페론, 과립구마크로파아지콜로니 자극인자(GM-CSF), 과립구콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 마이크로 파아지콜로니 자극인자(M-CSF) 등의 사이트카인을 함유할 수 있다. 또 간염비루스 또는 HIV(Human Immuno-deficiency Virus) 등에 의한 감염증, 알레르기질환 및 자기면역질환을 야기하는 항원을 함유하는 영양배지를 사용함으로써, 이 항원이 야기하는 감염증, 그것에 기인하는 염증 또는 알레르기 및 자기면역질환의 증상을 억제 또는 치료할 수가 있는 T 세포백신을 유도, 생성시킬 수가 있다.

c) 「영양배지중 용존산소농도」

본 발명에서 사용되는 「영양배지중 용존산소농도」란, a)에 있어서 정의되는 T 전구세포계를 배양하기위한 영양배지(액상)중에 용존하는 산소의 농도를 의미한다. 또, 「통상의 대기하에 있어서의 영양배지중의 용존산소농도」란, 인위적으로 손을 가하고 있지 않은 자연상태의 대기에 대하여 포화상태하에 있는 영양배지중의 용존산소농도를 의미하는 것이다. 따라서, 예컨대「영양배지중의 용존산소농도가 영양배지와 접하는 기상의 전압이 1 atm, 이 기상의 산소분압이 0.4 atm이며, 온도가 37℃의 상태하에 있어서의 영양배지중 용존산소농도」란 압력이 그다지 높지않은 범위에 있어서는 일정온도에서 기체의 용해도는 그의 분압에 비례한다는 헨리(Henry)의 법칙에 따른다면, 통상의 즉, 1atm의 공기에 대한 용존산소농도의 약 2배의 농도라고 말할 수가 있다.

용존산소농도를 높이는 수단으로서는 영양배지중에 용존하는 산소량을 높일 수가 있는 산소공급능력을 갖는 수단이면 여하한 수단도 본 발명에 사용할 수가 있고, 바람직하게는 영양배지(액상)가 접하고 있는 기상에 있어서의 산소농도를 40 용량% 내지 95 용량%의 범위로, 특히 60 용량% 내지 95 용량%의 범위로 높임으로써, 실질적으로 영양배지(액상)중에 용존하는 용존산소농도를 높이는 것이 바람직하다.

산소농도는 경우에 따라 %, atm(기압), mmHg 또는 M(몰) 등의 상이한 단위로 표시되나 어느단위로 환산할 수가 있고, 본 발명을 구성하는 산소농도는 어느 단위로 표시된 산소농도 만으로 한정되는 것은 아닌 것은 말할 나위도 없다.

또, 산소의 용해도는 기상의 산소분압과 비례관례에 있으므로, 산소 농도가 60 용량% 이하, 또는 40 용량% 이하이어도 기상의 압력을 약간 높임으로써 용존산소농도를 높이는 것도 가능하다는 것은 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.

또 배양중의 배지의 일부를 교환할 필요가 있는 경우에는 교환배지도 미리 용존산소농도를 배지중의 용존산소농도로 조절해두는 것이 바람직하다. 교환 후, 바로 산소함량이 높은 기류를 가지고 조정하여도 좋다.

d) 「분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙된 T 세포」

조혈 간세포에 유래하는 임파구계 간세포로부터 분화하여 발생한 T 세포계 간세포는 흉선간질세포계의 접착이나 생체내 액성인자의 제어하에 증식하고, 분화 및 성숙의 각 단계를 거쳐 성숙해 간다.

이 분화 성숙의 각 단계는 세포의 막표면에 발현하는 분화항원의 종류의 차이로 기인하는 표현형상 또는 분화, 성숙의 각단계에 있어서, 각각의 세포가 갖고 있는, 예를 들면 항원특이적인 증식능, B세포 활성화능, 세포장해능 및 면역억제능의 생물학적 기능상에서 식별, 분류할 수가 있다.

본 발명의 방법을 사용함으로써 생체 밖에서 a)로 정의되는 「T 전구세포계」를 사용하여 이것들의 모든 분화, 성숙단계를 재현, 달성하는 것이 가능하며, 본 발명에서 사용되는 「분화 항원표현형상 또는 기능상 분화, 성숙된 T 세포」란 상기와 같은 모든 분화, 성숙단계에 있는 T 계열세포를 의미한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 각 배양조건하에 있어서의 배양 후의 회수 생세포수와 영양배지중 용존산소농도의 상관관계를 나타내는 그래프.

제2도 내지 제7도는 플로우사이트미터를 사용하여 세포의 크기에 의거하여 식별되는 하기에 표시한 각종 세포의 분포를 나타내는 그래프이며, 종축은 측방산란광에 의한 세포의 상대적인 복잡성을, 횡축은 전방산란광에 의한 세포의 상대적인 크기를 나타낸다. 즉,

제2도는 마우스 성숙 T세포의 세포분포를 나타내는 그래프.

제3도는 채취 직후의 마우스태아흉선세포의 세포분포를 나타내는 그래프.

제4도는 산소농도 20% 조건하에서 마우스태아흉선을 부유배양(afloat culture)한 후의 세포분포를 나타내는 그래프.

제5도는 산소농도 5% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 세포분포를 나타내는 그래프.

제6도는 산소농도 20% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 세포분포를 나타내는 그래프.

제7도는 산소농도 60% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 세포분포를 나타내는 그래프.

제8도 내지 제13도는 플로우사이트미터를 사용하여 형광색소표지항체법에 의해 식별되느 마우스 T 세포막상의 분화항원인 CD4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프이며, 종축은 CD 4의 발현상태를, 횡축은 CD 8 의 발현상태를 나타낸다. 즉,

제8도는 마우스 성숙 T 세포의 CD 4 및 / 또는 CD 8 의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제9도는 채취직후의 마우스 태아흉선세포의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제10도는 산소농도 20% 조건하에서 마우스 태아흉선을 부유배양(afloat culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제11도는 산소농도 5% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제12도는 산소농도 20% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제13도는 산소농도 40% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제14도는 산소농도 60% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제15도는 산소농도 80% 조건하에서 마우스 태아흉선을 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분열을 나타내는 그래프.

제16도는 트리튬표지사이미진(³H-TdR) 취입시험을 사용하여 측정한 Con A 반응성 기능적 T 세포의 증식의 정도를 나타내는 그래프이다. 종축은 T 세포증식에 수반하는 DNA 합성의 지표인³H-TdR의 세포에의 취입량(cpm)을, 횡축은 배양후의 세포군 흉선 근처의 세포수의 희석율을 나타낸다.

제17도는 트리튬표지사이미진(³H-TdR) 취입시험을 사용하여 측정한 알로 반응성 기능적 T 세포의 증식의 정도를 나타내는 그래프이다. 종축은 T 세포증식에 수반하는 DNA 합성의 지표인³H-TdR의 세포에 취입량(cpm)을 횡축은 배양후의 세포군 흉선 근처 세포수의 희석율을 나타낸다.

제18도는 마우스 태아흉선세포를 포함하지 않은 마우스 흉선 간질세포계를 산소농도 6% 조건하에서 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타낸 세포분포를 나타내는 그래프.

제19도는 각각 따로따로 채취한 마우스 흉선 간질세포계 및 마우스 태아 흉선세포 300개를 산소농도 60% 조건하에서 침강배양(submerged culture)한 후의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제20도는 마우스 성숙 T 세포의 CD 4 및 / 또는 CD 8의 발현상태를 나타내는 세포분포를 나타내는 그래프.

제21도는 영양배지와 접하는 기상산소농도와 이 영양배지중 용존 산소농도와의 상관관계를 나타내는 그래프.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명이 이하에 기재되는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1-1 마우스 흉선의 취득

안정하게 조절된 조건하에서 사육된 출생후 6주째의 C57BL/6계 마우스(B6계 나이가 어린 마우스), 및 수정일을 일치시킨 복수의 C57BL/6계 임신 마우스(B6계 임신 마우스)로 부터 꺼낸 태아연령 15일 째의 B6계 태아마우스(일본 SLC사(제))로부터 일반적인 방법에 의해 흉선을 무균적으로 채취하였다.

1-2 마우스흉선세포의 취득 및 계수

1-1에서 취득한 어린 연령의 마우스 흉선 및 마우스 태아흉선(Fetal Thymus : FT)을 스테인레스제 메스를 사용하여 가늘게 잘라서 어린 연령의 마우스흉선세포 및 마우스태아흉선세포를 각각 취득하였다.

이것들의 흉선세포를 RPMI-1640 완전배지(Gibco 사(제))에 현탁하고 트리판-블루 염색 저지법(tripan-blue dye exclusion test)에 의해 생세포수를 계수하였다.

1-3 각 산소농도 조건에 의한 T 전구세포의 배양

태아연령 15일째의 B6계 마우스 태아로부터 취득한 태아 흉선세포(7.0×10⁴cells/lobe)를 24 구멍 미세적정-판을 사용하여 피르브산나트륨, 탄산수소나트륨, 비필수아미노산(Gibco사(제)), 2-메르캅토에탄올, 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 태아소혈청(Fetal calf serum : FCS)을 함유하는 RPMI-1640 완전 배지중에 가하고 판을 플라스틱용기(Gaspack : BBL사(제) 또는 테드라백 : 생화학공업사(제))내에 보입하여 용기내의 공기를 이산화탄소를 5%, 산소를 각각 5%, 20%, 30%, 40%, 60% 및 80% 함유하는 혼합가스(이와야산교사(제))로 치환하고, 37℃에서 침강배양법(submerged culture)에 의해 5일간 배양하였다.

그리고 본 발명과 종래기술과의 비교를 위하여 태아연령 15일 째의 B6계 마우스 태아로부터 취득한 태아 흉선세포(7.0×10⁴cells/lobe)를 24구멍 미세적정-판을 사용하여 피르브산나트륨, 탄산수소나트륨, 비필수아미노산(Gibco 사(제)), 2-메르캅토에탄올, 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 태아소혈청(Fetal Calf Serum : FCS)을 함유하는 RPMI-1640 완전배지중에 부유시킨 필터(직경 13mm, 세공사이즈 8㎛ : Nucleopore 사(제))상에서, 37℃ 이산화탄소 농도 5% 및 산소농도 20% 조건하에서 부유배양법(afloat culture)에 의해 5일간 배양하였다.

배양후의 세포수는 상기 1-2와 동일하게 트리판 블루 염색저지법에 의해 계수하였다.

결과를 표1에 표시하였다. 또 각 배양세포군의 배양후의 회수 생세포수와 영양배지중 용존산소농도의 관계를 조사하기 위하여 배양후의 배지중 용존산소농도를 혈액가스농도배양장치(Stat Profile : 바이오 메티칼사(제))에 의해 측정하고 결과를 제1도에 표시하였다.

종래기술인 부유배양법(afloat culture)에서는 배양 5일째에서 약 33.2×10cells/lobe로 증식하여 배양전에 비하여 약 5배의 세포증식이 인정되었다.

한편, 침강배양법(submerged culture)에서는 산소농도가 5% 및 20% 이상인 경우에는 약 2.4×10cells/lobe 및 3.7 ×10cells/lobe의 세포증식이 인정되는 정도이지만, 이것들과는 대조적으로 산소농도가 40% 이상의 하에서는 유의하게 세포증식이 인정되었다. 산소농도가 40%, 60% 및 80% 하에서는 각각 약 9.3×10cells/lobe, 23.5×10cells/lobe 및 28.8×10cells/lobe의 세포증식이 인정되고 특히 산소농도가 80% 하에서는 배양전에 비하여 약 4배의 세포증식이 달성되고 번잡함을 수반하여 대량 배양에는 적합치 않은 종래의 부유배양법(afloat culture)에 비하여 손색이 없었다.

[실시예 2]

T 전구세포의 분화(분화항원의 발현)

상기 1-3과 동일하게하여 용기내의 공기를 이산화탄소를 5%, 산소를 각각 5%, 20%, 40%, 60% 및 80% 함유하는 혼합가스(이와야산교산(제))로 치환하여 침강배양법(submerged culture)을 사용하여 배양하여 세포의 분화의 상태를 조사하였다.

그리고, 본 발명과 종래 기술과의 비교를 위하여 상기 1-3과 동일하게 하여 부유배양법(alfoat culture)를 사용하여 배양하여 분화의 상태를 조사하였다.

또, 대조로서 마우스 성숙 T 세포를 사용하였다.

2-1 세포의 분포

배양후의 T 전구세포의 분화의 향상을 포착하기 위하여 플로우사이트미터(FACS can : Becton Dickinson 사(제))를 사용하여 세포의 분포를 측정하였다.

결과를 제2도 내지 제7도에 표시하였다.

본 실험에서는 분화, 성숙을 완료하고 있지 않은 상태에 있는 임파아구(유약세포 : blastic lymphoid cell) 및 분화, 성숙을 완료한 직경 약 5 내지 10㎛의 소임피구(small lymphoid cell)로 대별할 수가 있는 세포의 분포를 조사함으로써 T 전구세포의 분화, 성숙의 상태를 인식할 수가 있다.

마우스 성숙 T 세포군(제2도)은 거의 대부분이 소임파구(small lymphoid cell)로서 관찰되고 동일하게 마우스 태아흉선을 산소농도 20% 조건하에서 부유배양(afloat culture)한 세포군(제4도)도 거의가 소임파구(amall lymphoid cell)로서 관찰되었다.

한편 마우스 태아흉선을 산소농도가 5% 및 20%의 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군(각각 제5도, 제6도)는 채취직후의 마우스 태아 흉선세포군(제3도)과 동일하게 거의 대부분이 임파아구(유약세포 : blastic lymphoid cell)로서 관찰되어 분화, 성숙이 달성되어 있지않은 것이 표시되었다.

한편, 이것들과는 대조적으로 산소농도가 60% 조건하에서 침강배양(submerged culture)를 한 세포군(제7도)은 마우스성숙 T 세포군(제2도) 및 산소농도가 20% 조건하에서 부유배양(afloat culture)을 한세포군(제4도)과 동일하게 거의가 소임파구(small lymphoid cell)로서 관찰되고 T 전구세포의 분화, 성숙의 달성이 인정되었다.

2-2 분화항원의 발현

배양후의 T 전구세포의 분화의 양상을 포착하기 위하여 마우스 T 세포의 각각의 분화항원에 대한 단클론성항체를 사용한 형광색소표지항체법에 의해 플로우사이트미터(FACScan : Becton Dickinson 사(제))를 사용하여 일반적인 방법에 의해 마우스 분화항원 CD 4 및 CD 8의 발현상태를 측정하였다.

그리고 본 실험에서 사용한 단클론성항체는 피코에리트린(phycoerythrine : PE) 표지 마우스 CD 4 단클론성항체(쥐 하이브리도마 GK 1.5 : Becton Dickinson 사(제)) 및 플루오레스세인(fluorscein isothiocyanate : FITC) 표지 마우스 CD 8 단클론성 항체(쥐 하이브리도마 53. 6. 7 : Becton Dickinson 사(제))이다.

결과를 표2 및 제8도 내지 제15도에 표시하였다.

마우스 성숙 T 세포군(제8도)의 대부분은 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성이었다. 그 중의 거의는 CD 4 양성 CD 8 양성이며, 동일하게 마우스 태아 흉선세포를 산소농도가 20% 조건하에서 부유배양(afloat culture)을 한 세포군(제10도)도 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성인 세포는 전체의 90% 이상이었다.

한편, 마우스 태아 흉선세포를 산소농도가 5% 및 20% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군(각각 제11도, 제12도)에 서는 거의가 CD 4 음성 CD 8 음성이며, 채취직후의 마우스 태아 흉선세포군(제9도)과 동일하게 분화항원 표현형상, 미분화세포인 채로이었다.

이것들과는 대조적으로 산소농도가 40% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군(제13도)에서는 전체의 80% 이상이 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성이며, 산소농도가 60% 및 80% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군(각각 제14도, 제15도)에서는 마우스성숙 T 세포군(제8도) 및 산소농도가 20% 조건하에서 부유배양(afloat culture)을 한 세포군(제10도)과 동일하게 전체의 90% 이상이 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성이며 게다가 그 중의 거의가 CD 4 양성 CD 8 양성이며, 분화항원 표현형상, T 전구세포의 분화, 성숙의 달성이 인정되었다.

또, 침강배양법(submerged culture)에 있어서, 산소농도가 높게됨에 따라 임파아구(유약세포 : balstic lymphoid cell)군에 차지하는 분화항원 발현세포의 비율이 증가하고 산소농도가 60% 및 80% 조건하에서의 침강배양(submerged culture) 세포군에서는 임파아구(유약세포 : blastic lymphoid cell)군의 70 내지 80%가 분화항원을 발현하였다.

이 결과는 산소농도가 20% 조건하에서 부유배양(afloat culture)을 한 세포군중의 임파아구(유약세포 : blastic lymphoid cell)군 중에 차지하는 분화항원발현세포의 비율에 근사하고 있으며, 분화항원 표현형상의 분화가 거의 완전히 달성되고 있는 것이 표시되었다.

2-3 T 세포 수용체의 발현

T 전구세포는 분화, 성숙의 하나의 단계로서 세포막상에 항원수용체(T cell receptor : TcR)를 발현시킨다. 이 TcR은 α, β, γ 및 δ쇄라고 호칭되는 부 유니트로 구성되고, 분화항원의 하나이며 세포내에 증식 시그날을 전달하는 분자인 CD 3와 회합하여 CD 3-TcR을 형성하고 있다. 따라서 TcR α β 및 TcRγ δ의 발현과 CD 3의 발현을 조사함으로써 그의 분화단계와 기능적 성숙의 정도를 평가할 수 있다. 또 생체내에서 외래항원에 대한 인식기구를 구성하는 T 세포는 주로 TcR α β를 발현하고 있는 세포이며, 흉선은 TcRγ δ계 T 세포보다 훨씬 많은 TcR αβ계 T 세포를 생산하여 말초에 공급하고 있다.

본 실험에서는 마우스 T세포의 분화항원 CD 3, TcR αβ 및 TcR γδ의 발현상태를 측정하였다. 그리고 본 실험에서 사용한 단클론성 항체는 항마우스 CD 3 단클론성 항체(햄스터 하이브리도마 145-2C11 : 생화학공업사(제)), 항 마우스 TcRαβ 단클론성 항체(햄스터 하이브리도마 H57-597) 및 항 마우스 TcRγδ 단클론성 항체(햄스터 하이브리도마 3A10)이다. 또, 2차 항체로서 플루오레스세인표지 토끼 항 햄스터-면역글로블린(caltag 사(제))을 사용하였다.

결과를 표3에 표시하였다.

CD 3의 발현에 관해서는 산소농도가 60% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군은 63.2%가 CD 3 양성이며, 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군에서는 TcRαβ 및 TcRγδ의 발현은 각각 48.8% 및 4.7% 이며 TcRαβ계 T 세포의 분화가 선택적으로 일어나고 있는 것을 나타내고 있다.

한편 산소농도가 5% 및 20% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군에서는 각각 TcRαβ의 발현이 11.3% 및19.3%, 또 TcRγδ의 발현이 28.5% 및 24.3% 이며 주로 TcRγδ계 T세포에의 분화가 지지되고 있으며, TcRαβ계 T세포에의 분화는 불충분하였다.

이것들과는 상대적으로 산소농도가 60% 조건하 침강배양(submerged culture)을 한 세포군에서는 TcRαβ 및 TcRγδ의 발현이 각각 46.9% 및 14.4%이며, 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군과 동등하게 TcRαβ계 T세포에의 분화가 선택적으로 일어나고 있으며, T 전구세포의 정상적인 분화가 달성되고 있는 것이 표시되었다.

또, 각 배양조건에서 생성된 CD 3 발현세포, TcRαβ 발현세포 및 TcRγδ 발현세포의 생성세포수를 계수한 결과, 산소농도가 5% 및 20% 조건하에 침강배양(submerged culture)을 한 세포군에서는 CD 3, TcRαβ 및 TcRγδ 모두 충분한 생성이 인정되지 않은데 대하여, 60% 조건하에 침강배양(submerged culture)을 한 세포군에서는 CD 3, TcRαβ 양성세포수가 각각 7 내지 13배, 14내지 39배 생성되었다. 이 결과는 산소농도가 20% 조건하에 부유배양(afloat culture)을 한 세포군의 결과와 동등하였다.

[실시예 3]

기능성 T 세포의 생성

3-1 기능성 T 세포의 마이토젠에 의한 증식능

임파구를 활성화하고, DNA 합성 및 세포증식을 유인하는 물질은 마이토젠(mitogen : 분열촉진인자)로 총칭되고, 그중의 하나인 콘카나발린 A(concanavalin-A : con A)는 2-3에 표시한 T 세포의 증식을 유발한다. Con A에 의해 유발되는 T 세포의 증식은 Con A 자극에 의해 T세포로부터 배양액 상청에 생산되는 인터로이킨-2(Interleukin-2 : IL-2) 등의 사이트카인에 의해 유지되고 있다.

그래서 본 실험에서는 상기 2-3에 표시한 방법에 의해, 24 구멍 미세적정-판을 사용하여 각 산소농도 조건하에서 5일간 배양한 흉선으로부터 생성된 T 세포를 Con A(15㎍/ml : Vetor 사(제)) 및 IL-2(50 eksdnl : Genzyme 사(제)) 존재하, 10% FCS를 함유하는 RPMI-1640 완전배지 중에서 96 구멍 미세적정-판을 사용하여 배양하고, Con A 반응성을 갖는 기능적으로 성숙한 T 세포의 유도, 생성을 검토하였다.

그리고, T 세포의 Con A 반응성은 3일간의 배양을 하고, 배양 종료 6 시간전에 각각 1.04μCi의 트리튬 표지 사이미진(3H-TdR)을 배지중에 가하고 세포를 유리필터 상에 회수하여 신틸레이터(Clear-Sol 1: 나카라이테크스사(제))를 가하여 3H-TdR의 세포에의 취입을 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다.

결과를 제16도에 표시하였다.

산소농도가 5% 및 20% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군은 증식은 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군의 증식은 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군의 증식의 1/4 내지 1/3이지만, 이것들과는 대조적으로 산소농도가 60% 조건하 침강배양(submerged culture)을 한 세포군의 증식은 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군의 증시과 같은 정도이며, Con A 반응성을 갖는 기능적으로 성숙된 T 세포가 어린 마우스 흉선 내에서의 분화 및 부유배양(afloat culture)에서의 태아 흉선 내에서의 분화와 같은 정도로 유도, 생성되는 것이 표시되었다.

3-2 기능성 T 세포의 알로(BALB/C 마우스)

비장세포에 대한 반응성

T 세포는 흉선 중에서 교육을 받고, 비자기인 이종(알로)마우스 세포에 대한 반응성을 획득하고, 예컨데 이식편거절을 일으킨다. 이 반응도 상기 3-1에 기재한 Con A의 작용과 동일하게 흉선내에서 성숙하여 통과한 T 세포상의 TcR-CD 3 복합체를 개재시킨다.

그리하여, 본 실험에서는 상기 2-3에 표시한 방법에 의해 24 구멍 미세적정-판을 사용하여 각 산소농도조건 하에서 6일간 배양한 흉선으로부터 생성된 T 세포를 출생 후 6주간째의 BALB/C 마우스로부터 채취한 비장세포를 마이토마이신 C(25㎍/ml, 37℃, 30분간)으로 미리 처리한 후 RPMI-1640 배지에서 3회 세정하여 얻어진 세포 부유를 가한 96 구멍 미세적정-판(5×10cells/well)을 사용하여 알로 세포에 대하여 반응성을 갖는 T 세포의 생성을 검토하였다.

그리고, T세포의 알로 반응성은 5일간의 배양을 하고, 배양종료 시간전에 각각 1.0 μCi의 트리튬표지사이미진(H-TdR)을 배지중에 가하고 세포를 유리필터상에 회수하고 신틸레이터(Clear-Sol I : 나카리이텍스사(제))를 가하여H-TdR의 세포에의 취입을 액체신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다.

결과를 제17도에 표시하였다.

산소농도가 5% 및 20% 조건하에서 침강배양(submerged culture)을 한 세포군의 증식은 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군의 증식의 1/10 내지 1/5 이지만 이것들과는 대조적으로 산소농도가 60% 조건하 침강배양(submerged culture)을 한 세포군의 증식은 산소농도가 20% 조건하 부유배양(afloat culture)을 한 세포군의 증식과 같은 정도이며, 알로 반응성을 갖는 기능적으로 성숙된 T 세포가 어린 마우스 흉선 내에서의 분화 및 부유배양(afloat culture)에서의 태아 흉선 내에서의 분화와 같은 정도로 유도, 생성되는 것이 표시되었다.

[실시예 4]

T 전구세포 및 임파조직 간질세포계와의 조합에 의한 T 전구세포의 분화, 성숙

실시예 1 내지 3에 있어서 본 발명의 기술에 의한 마우스 태아흉선을 사용한 T 전구세포의 정상적인 분화, 성숙의 달성을 나타냈으나, 본 발명에 있어서는 각각 동일한 또는 상이한 동물종의 동일한 또는 각각 상이한 개체로부터 채취한 T 전구세포 및 그와 같은 T 전구세포를 에워싸는 임파조직 간질세포계(흉선상피세포, 선유아세포, 그외의 임파조직 간질세포 및 / 또는 세포간 물질 등)을 사용함에 의해서도 T 전구세포의 정상적인 분화, 성숙을 달성시킬 수가 있다. 여기에 그의 1형태를 기재한다.

태아연령 15일째의 B6계 태아 마우스(일본 SLC사(제))로부터 취득한 흉선을 1.35mM의 2'-데옥시구아노신(dGuO)및 10% 태아소혈청(Fetal Calf Serum : FCS)을 함유하는 RPMI-1640 완전배지중에서 일간 부유배양(afloat culture)을 하고, 배양 후 또는 dGuO를 함유하지 않은 상기 완전배지 중에서 12시간 부유배양(afloat culture)을 하고, 혈액계 세포가 소실된 흉선간질세포계를 취득하였다.

이 흉선간질세포계를 96 구멍의 바닥이 둥근판에 뿌리고, RPMI-1640 완전배지를 가하고(200 ㎕/well), 또 실시예 1-2와 동일하게 하여 취득한 T 전구세포(마우스태아흉선세포)를 각각 30 cell/well 또는 300 cell/well씩 가하고, 판을 플라스틱용기(Gaspack : BBL사(제))내에 봉입하여 용기내의 공기를 이산화탄소를 5%, 산소를 60% 및 질소를 35% 함유하는 혼합가스(이와야산교사(제))로 치환하여 침강배양(submerged culture)에 의해 7일간 배양하였다.

배양 후, 회수한 세포 및 흉선조직을 스테인레스제 망을 사용하여 완만하게 세절하여 T세포를 취득하고, 배양 후의 T 전구세포의 분화, 성숙의 양상을 포착하기 위하여 실시예 2-2와 동일하게 하여 마우스 T 세포분화항원인 CD 4 및 CD 8의 발현상태를 측정하였다.

그리고 T 전구세포(마우스태아흉선세포)를 가하지 않고 흉선간질세포계만을 산소농도가 60% 조건하에서 침강배양(submerged culture)한 배양군을 대조하여 사용하고, 또 비교를 위하여 마우스성숙 T 세포를 사용하였다.

결과를 제 18도 내지 제20도에 표시하였다.

마우스 성숙 T 세포군(제20도)의 거의는, CD 4 양성 및/ 또는 CD 8 양성이며, 또한 그 중의 대부분은 CD 4 양성 CD 8 양성이었다.

T전구세포(마우스태아흉선세포)를 가하지 않고 산소농도가 60% 조건하에 침강배양(submerged culture)을 한 군(제18도)에서는 회수된 세포(흉선상피세포 또는 선유아세포 등도 포함함)도 극히 약간이며 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성인 세포도 거의 인정되지 않았다.

한편, 각각 따로따로 채취한 마우스 흉선간질세포계와 T 전구세포(마우스 태아 흉선세포) (각각 30개 및 300개)를 산소농도가 60% 조건하에 침강배양(submerged culture)을 한 세포군에서는 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성세포가 많이 인정되고, 마우스태아흉선세포가 30개의 경우에는 30 내지 40%가 CD 4 양성 및 / 또는 CD 8 양성이며, 300개의 경우(제19도)에는 90% 이상이 CD 4 양성 CD 8 양성이었다.

이 결과는 마우스 성숙 T 세포군의 결과와 필적되고 있으며, 각각 따로따로 취득한 마우스 태아 흉선세포와 마우스 흉선간질세포계를 조합하여도 분화항원 표현형상 T전구세포의 분화, 성숙이 달성되고 있다는 것이 인정되었다.

[실시예 5]

성숙 T 세포결손동물모델에 있어서의 이종 T 전구세포의 배양 B 전구세포 및/ 또는 T 전구세포를 증식, 분화 및 성숙시키는 흉선기능이 결손되고 있거나 또는 선천적으로 성숙 B 세포 및 / 또는 성숙 T 세포가 결손되어 있는 경우에는 면역계에 관여하는 여러가지의 질환이 야기된다. 이와같은 동물종에, 성숙 B 혹은 성숙 T 세포를 양자 면역요법적으로 투여하였다고 하더라도 임파구계 전구세포(B 전구세포 및 T 전구세포 등)가 결손 혹은 흉선에서의 증식, 분화 및 성숙과정의 이상에 의해, 임의의 항원특이성을 갖는 성숙 B 혹은 성숙 T세포를 유도할 수가 없기 때문에 치료학적 의미는 극히 작다. 그래서 이와같은 모델에 있어서의 본 발명의 치료학적 의의를 검토하기 위하여 이하의 실험을 하였다.

B 전구세포 및 T 전구세포의 분화, 성숙등에 장해가 있고, 성숙 B 및 성숙 T 세포를 결손하고 있는 마우스모델이다. 출생후 6주째의 SCID 마우스(severe combined immune deficient mouse : 중증 복합 면역부전증 마우스, Fox Chase 사(제))로부터, 실시예 1-1과 동일하게 하여 무균적으로 흉선을 취득하였다. 취득한 흉선을 4 분할하고 각 단편을 96 구멍 미세적정-판을 사용하여 RPMI-1640 완전배지에 가하였다.

또 태아 연령 14일째의 C57BL/6계 마우스(일본 SLC 사(제))로부터 실시예 1-1 및 1-2와 동일하게 하여 T 전구세포로서 태아흉선세포를 취득하고, 상기 SCID 마우스흉선단편 함유 RPMI-1640 완전배지에 5×10cells/well씩 가하였다.

이 배양판을 37℃ 조건하, 이산화탄소농도 5%, 산소농도가 각각 20%(대기조건하), 80% 조건하에서 7일간 침강배양(submerged culture)을 하였다.

그리고 T 전구세포의 분화 및 성숙효율을 향상시키기 위하여 방사선처리(2.5 Gr)에 의해 SCID마우스흉선내에 존재하는 분화 및 성숙등을 갖지 않는 T 전구세포를 제거한 SCID 마우스흉선을 사용하여 상기와 동일한 조건하에서 배양을 하였다.

배양 후의 세포수는 트리판 블루 염색저지법에 의해 계수하였다.

결과를 표 4에 표시하였다. 그리고 값은 4분할 흉선단편을 사용한 각 실험치의 평균치이다.

방사선처리 및 미처리의 흉선을 사용한 실험에서는 모두 산소농도가 80% 조건하에서 배양을 한 세포군은 산소농도가 20% 조건하(대기조건하)에서 배양을 한 세포군에 비하여 2배이상의 T 전구세포의 생존율을 나타냈다.

또 방사선처리 또는 미처리의 흉선을 사용하여 산소농도가 80% 조건하에서 배양을 한 세포군에서는 방사선처리 흉선을 사용한 세포군의 쪽이 T전구세포의 뜻있는 생존율을 나타냈다. 생존된 세포중에는 분화, 성숙된 T 세포가 보였다.

[실시예 6]

고산소농도 조건에 있어서의 사람 T 전구세포의 배양 2살 연령의 심장질환환자의 외과수술시에 심장에 근접하는 흉선의 일부가 절제되었다. 이 때에 취득한 사람흉선을 일정중량(약 10mg)으로 단편화하였다.

작성된 흉선단편(5×10cells/흉선단편)을 실시예 1과 동일하게 조작하여 37℃에서 이산화탄소농도 5%, 산소농도가 각각 20%, 70% 조건하에서 14일간 침강배양(submerged culture)을 하였다.

배양후의 세포수는 트리판 블루 염색저지법에 의해 계수하였다.

결과를 표 5에 표시하였다.

마우스 흉선세포를 사용한 실시예 1의 결과와 동일하게 사람 흉선 세포를 사용한 본 실험에 있어서도 산소농도가 20% 조건하(대기조건하)에서의 배양에 비하여 산소농도가 70% 조건하(고산소농도조건하)에서는 뜻있게 2배이상의 세포의 생존유지가 인정되었다.

실시예 5 및 6으로부터 얻어진 결과에 의해, 본 발명이 SCID마우스 등의 성숙임파구결손모델동물 및 사람흉선 등의 조직에 있어서도 다른계 또는 동일계의 T 전구세포로부터의 정상 성숙 T 세포를 유도할 수가 있다는 것이 표시되었다.

따라서, 여러 가지의 자기면역질환 혹은 AIDS(acquired immune deficiency syndrome) 등의 비루스감염에 의한 면역질환에 대한 세포 백신이나 치료약의 연구개발에 있어서의 본 발명의 응용가치는 높다고 할 수 있다.

[실시예 7]

기상 산소농도와 액상용존산소농도와의 상관관계

영양배지와 접하는 기상산소농도와 이 영양배지중 용존산소농도와의 상관성을 검토하기 위하여 이하의 실험을 하였다.

실시예 1에서 취득한 마우스태아흉선(7×10cell/10be)을 함유 또는 비함유하는 RPMI-1640 완전배지를 가한 96 구멍 미세적정-판을 플라스틱 밀폐용기(Gaspack : BBL 사(제) 또는 테드라백 : 생화학공업사(제)) 내에 봉입하여 제21도에 표시한 바와 같이 이산화탄소농도를 미리 일정하게 (5%) 유지하고, 산소농도(%) 및 질소농도(%)의 혼합비를 미리 조정한 혼합가스(이와야산교사(제))를 이 용기의 가스교환구로 불어넣어 용기내의 공기를 충분히 치환하고, 37℃에서 1 내지 5일간 정치하였다.

기상과 액상과의 사이에서 이산화탄소, 산소 및 질소 각각의 농도가 평형에 달한 후, 영양배지(액상)의 용존산소농도(mmHg, μM)를 가스 자동분석계(Nova 사(제))를 사용하여 측정하였다.

결과를 제21도에 표시하였다.

영양배지(액상)의 체적에 비교하여 이 영양배지와 접하는 혼합가스(기상)의 체적이 상대적으로 충분히 많은 경우에는 기상산소농도와 액상용존산소농도와의 사이에는 비례관계가 성립하였다. 또 기상의 체적이 상대적으로 충분히 많지 않은 경우에는 이 비례직선하부(제21도 사선부)에 포함되는 대응관계도 발생할 수 있다는 것이 표시되었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 T 전구세포계를 영양배지중의 용존산소농도가 통상의 대기하에 있어서의 영양배지중의 용존산소농도보다 높은 조건하에, 예를 들면 바람직한 1 수단으로서 영양배지와 접하는 기상의 산소농도를 40 용량 % 내지 95 용량 %로 높여, 영양배지중의 용존산소농도를 높인 조건하에 배양함으로써 생체 밖에 있어서 특수한 기구를 필요로 하지 않고, 세포 또는 조직의 일반적인 배양방법인 침강(현탁)배양법(submerged(suspension) culture)에 의해, T 계열세포의 대량배양법은 물론 T 전구세포의 증식 및 분화항원 표현형상 또는 기능상의 정상적인 분화, 성숙의 과정을 재현하고 또한 분화항원 표현형상 또는 기능상 성숙된 임의의 항원인 식능을 갖는 T 세포를 유도, 생성시킬 수가 있고, T 계열세포의 분화, 성숙기구의 상세를 해명할 수가 있다.

더 나아가서는 본 발명의 방법을 사용하여, T 전구세포계를 감염 비루스 혹은 HIV(human immune deficiency virus) 등에 의한 감염증, 알레르기질환 또는 자기면역질환을 야기시키는 항원을 함유하는 영양배지중에서 배양함으로써 이 항원을 인식하는 T 세포를 유도할 수가 있고, 이 항원이 야기하는 감염증, 알레르기질환 및 자기면역질환의 증상을 억제 또는 치료할 수가 있는 임의의 T 세포백신을 제조할 수가 있다.

Claims

분화항원 표현형상 또는 기능상 분화, 성숙한 T 세포를 제조하는 방법에 있어서, T 전구세포를 영양배지중의 용존산소농도가, 통상의 대기하에 있어서의 영양배지중의 용존산소농도보다 높은 조건하에 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, T 전구세포계가 T 전구세포를 함유하는 조직인 제조방법.
제1항에 있어서, T 전구세포계가 T 전구세포 및 임파조직 간질세포계로 이루어진 제조방법.
제1항에 있어서, T 전구세포계가 T 전구세포인 제조방법.
제3항에 있어서, T 전구세포 및 임파조직 간질세포계가 각각 동일 개체 또는 동일 동물종의 상이한 개체유래인 제조방법.
제3항에 있어서, T 전구세포 및 임파조직 간질세포계가 각각 상이한 동물종의 개체 유래인 제조방법.
제1항에 있어서, 영양배지중의 용존산소농도가 통상의 대기하에 있어서, 온도가 36℃내지 38℃의 상태하에 있어서의 영양배지중의 용존산소농도보다 높은 조건하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 영양배지중의 용존산소농도가 영양배지와 접하는 기상의 전압이 1atm, 이 기상의 산소분압이 0.4 atm이며, 온도가 36℃ 내지 38℃의 상태하에 있어서 영양배지중의 용존산소농도보다 높은 조건하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 영양배지와 접하는 기상의 산소농도가 40 용량 % 내지 95 용량 % 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제9항중의 어느한항에 있어서, 영양배지가 감염증, 알레르기질환 또는 자기면역질환을 야기하는 항원을 함유하고 있는 영양배지인 제조방법.