JPS6192566A - 抗体産生細胞の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗体産生細胞の調製方法に関し、さらに具体的
にはリン／臂系細胞と抗原とを試験管内において混合し
抗原刺激を行うことによシ、特定の抗原に対して特異的
な抗体を産生ずる細胞を調製する方法に関する。

（従来の技術） 最近、免疫学の飛躍的な進歩とあいまって細胞工学も注
目を浴びつつあるが、なかでも細胞融合法がケラ−及び
ミルシュタイン等（Ｎａｔｕｒ＠。

２５６．４９５（１９７５））　　によって初めて報告
されて以来、種々のモノクローナル抗体の製造が可能と
なった・ このモノクローナル抗体は、従来の抗血清に比べて特定
の抗原に対する特異性が著しく高いため、医学分野にお
いては臨床診断薬、治療薬等として利用され（ＣａｎＣ
＠ｒ　Ｒ＠１１．１４　ｐ　４７４９　（１９８１）：
　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　１１１　ｅ　１　（
１９８１）　：１生体防御のしくみ１化学増刊、１２１
頁（１９８１））、また生化学の分野においては、物質
精製手段としてアフィニティークロマトグラフィーに応
用されておシ、さらには細胞表面構造の構造解析等に利
用されておシ、今後もその利用分野が拡大され、需要が
増加するものと予想される。

このモノクローナル抗体の製造は一般に、上記の細胞融
合法によって、抗体産生細胞と長期間自己増殖可能な腫
瘍細胞とを融合せしめて抗体産生能を有し且つ長期間自
己増殖可能な細胞融合株を造成し、この細胞融合株を培
養することによって行なわれる。この細胞融合法に用い
る抗体産生細胞の調製は一般に、マウス等の実験動物を
抗原で感作した後、この動物を殺し、そして牌細肥を無
菌的に取シ出すことによって行われている（特開昭５７
−５０２０９０、同５８−５０２１３２、同５８−２０
６５３２、同５８−１７９４８６、同５Ｂ−１９２８３
１、同５８−２１６１２５、同５ｊ−２０２２８、同５
９−３９８３２、同５９−４４３２号各公報等）。

しかしながら、上記の抗体産生細胞においては動物を用
いることに起因する種々の問題点が存在する０例えば、
動物の飼育中に動物が微生物の自然感染を受け、この微
生物によシ感作される可能性があるーまだ、強すぎる毒
性、又は発癌性を有する抗原を用いることができないの
みならず、動物の正常な機能を損う程強い毒性を有する
不純物を含有する抗原液を用いることができない。さら
に、免疫のために多量の抗原を必要とし、免疫期間も一
般に２週間以上を有する。また追加免疫時に動物がシ冒
ツク死する場合がおる。その上、ヒト戯のモノクローナ
ル抗体を作るにはヒトを免疫しなければならないが、ヒ
トに人為的な免疫操作を施すことはできないから、ヒト
型のモノクローナル抗体を任意に作ることはできない。

動物感作法が有するこれらの問題点を解決すべく試験管
内免疫法〔例えば、ＭｏｌｓｃｏｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ　＊　１７　、６３５−６３９（１９８０）　）
が提案されているが、この方法において使用されている
抗原は分子［９０００以下の蛋白質ω「（Ｏｍｔ＊ｏｃ
ｌａａｔ　Ａｃｔｌｖａｔｉｎｇ　Ｆａｒｔｏｒ　）で
あって、シュードモナスーエルギノーサ（Ｐｓ＠ｕｄｏ
ｍｏｎａ謳ａｅｒｕｇｉｎｏａｍ　）　（以下縁膿昭と
称する）、及びヒト由来の蛋白質であるヒト抗体１ｇＧ
のＦａｂ部分を抗原として用いる方法については記載さ
れていない。また、Ｊ、Ｃ１１ｎｌｃ、Ｉｎｖｅｓｔ、
、　７１　ｒ　１０３２−１０４０　（１９８３）　；
　Ｊ、　Ｉｍ＋ｎｏｎｏ１．１３１　、　１２２９−１
２３３　（１９８３）　：　Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ・、１
３２　、９２８−９３５（１９８４）：及びＪ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、　１３２ｔｌ１９２−１２０１（１９８
４）　　には試験管内免疫法による抗体産生細胞の調製
が記載されているが、これらの抗体産生細胞を用いる細
胞融合株の造成については記載されていない拳　　　　
　　　　゛（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、試験管内において、ヒト由来の抗原を含む各
種の抗原によシＢリンツタ系細胞を免疫処理して、モノ
クローナル抗体を産生じ得る細胞融合株の造成の材料と
して使用し得る抗体産生細胞を調製する方法を提供する
ことを目的とする。

（問題点を解決するための手段） この発明の上記の目的は、Ｂリン／４’系細胞と抗原と
を試験管内で混合し、次にこれを培養し、そして培養液
から抗体産生細胞を回収することを特徴とする抗体産生
細胞の調製方法によって達成される。

なお、ここで「試験管内」なる語は、試験管、ウェルグ
レート等を用いて、生体外において処理する場合につい
て用いる。

Ｂリンパ系細胞の調製 本発明において使用する抗体産生細胞の材料としてのＢ
リン／４系細胞としては膵臓細胞、リンパ節細胞、末梢
血液から単離したリン／４′球等が考えられるが、通常
は膵臓細胞を用いる。例えば、マクスのごとき実験動物
から肺臓を摘出し、これを度の調整を行う。

抗原 抗原としては、生体に対して免疫反応を誘発するもので
あればいかなるものでもよく、例えば核酸、蛋白質（糖
蛋白質を含む）、多糖類、糖脂質等の化合物、又はこれ
らを含有するものであシ、これらは毒性又は発癌性を有
していてもよい。前記の化合物は分子量１０００以上の
ものが一般に好ましい・なお、本発明においては緑膿菌
及びヒ）　ＩｇＧのＦａｂ部分を用いて具体的に説明す
る。

免役処理及び培養 前記のＢリンパ系細胞と抗原とを試験管内で混合するこ
とによシ免疫処理し、そして培養する。

この場合、抗原を培地に浴解又は懸濁し、これをリンＡ
？系細胞（Ｍ濁液と混合する。上記の培地としては動物
細胞の試験管内培養に一般に使用されているもの、例え
ばＲＰＭＩ　−１６４０培地を使用することができる。

培養は一般に炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、５
％ＣＯ２の存在下で行う。培養期間は２〜７日間とする
。なお、この培養においては免疫効果をあげるため、Ｔ
細胞由来のＢ細胞分化誘導因子、Ｂ細胞増殖因子等を添
加することができる。このような添加物として、例えば
ＴＣＣＭ　（Ｔｈｙｍｕｓ　Ｃｓ１ｌ　Ｃｏｎｄ１ｔｉ
ｏｎ＠ｄ　Ｍｅｄｉｕｍ　）を挙げることができる。

次に、この培養液から、目的とする抗体産生細胞を選択
する・この選択は通常酵素免疫測定法、例えばＥＬＪＳ
Ａ法ＣＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　ｅ　８　＋融
合せしめることによシ、モノクローナル抗体産生能を有
する融合細胞を調製することができる。

（発明の効果） この発明の方法によれば、下記の諸効果が得られる・ （イ）　Ｂ細胞を免疫するために必要な抗原の量が、動
物を用いる方法に比べて極めて少量でよく、例えばマウ
スを使用する場合に比べて約１０分の１〜１０００分の
１で足シる。

（ロ）免疫期間が著しく短縮される。一般に動物を使用
する方法においては２週間以上を後するが、本発明の方
法においては４〜５日間で足シる。

Ｃウ　　動物を飼育する必要がないから、操作が比較的
簡単である。

に）毒性物質、及び発癌性物質に対する抗体産生細胞の
調製が可能である。

（ホ）　ヒト型抗体産生細胞の調製が可能である。

（実施例） 次に実施例によシ、この発明の方法をさらに具体的に説
明する。

実施例１゜ （１）抗体産生細胞の調製 約１０退的の正常Ｂｕｌｂ／ｅマウスから無菌的に牌＋
１％を摘出し、これをほぐしてＩＩｆｌ胞懸濁液（ＲＰ
ＭＩ　−１６４０培地）とし、これをナイロンメツシュ
でＦ遇することによシマワス肺臓細胞懸濁液（２ｘｌＯ
’１固／＋＋Ａ’）を調製した。能力、緑膿菌（フィッ
シャー分類によるＦ３タイプ）を培養し、この菌体をホ
ルマリン固定処理し、これをＴＢＳ（−）　ＲＴＭＩ　
−１６４０によシ洗沖した後、ＲＰＭＩ　−１６４０培
地（１０チウシ胎児血清（Ｆｅ２　）、５×１０Ｍ２−
メルカプトエタノール、１００Ｕ／継ペニシリン、及Ｕ
Ｏ，１４億ストレグトマイシンを含有〕に懸濁し、細胞
縦波を１×１０　個／ｄに調整した。次に前記のマウス
月１ヤｊ減細胞！節濁液１００μノと緑膿菌懸濁液１０
０μｌとを９６ウエルのグレート上で混合し、炭酸ガス
インキュベーター中で３７℃、５％Ｃ０２のもとて３日
間培ズした。

（２）放射性ラベルチミジンによる検定一般に、抗原刺
激を受けたＢ細胞は細胞増殖が活発になシ、抗体を産生
ずることが知られている。

従って、細胞増殖が活発に行われているか否かをＤＮＡ
合成レベルで確認することによシ抗体産生細胞ができて
いるか否かを検定することができる。

ＤＮＡの合成は　Ｃ−チミジンの細胞への取シ込みを指
標として調べることができる。

前記のようにして培養した後、各ウェルにＩ＋７エル当
シ０．２μＣＩの１４０−チミジンを添加し、さらに１
５時間培養を行った。培養後、ウェル中の培養液をグラ
スフィルターペーパーに移し、そして５％トリクロロ酢
酸、生理食塩水及びエタノールで洗浄し、これをバイア
ルに移し、さらにシンチレータ−を加えた後、液体シン
チレーションカウンターで測定した。この結果を次の第
１表に示す。

以下余白 Ｍ１表 注（１）：抗原（緑膿菌懸濁’ｔ’１１．　）の代シに
ＲＴＭＩ−１６４０培地を加えて上記と同様の処理を行
ったもの０ （２）：抗原としての緑膿菌濃度５Ｘ１０’個／ゴ。

上記の表において、抗原の添加により１４ｃｍチミジン
Ｏ取シ込みが増加していることから、抗原によってマウ
ス肺臓細胞（Ｂリンノや球）が活性化（免疫化）された
ことが明らかである。

実施例２゜ （１）　　抗体産性細凪の調製 実施例１に記載した方法と同様にして調製した緑膿菌懸
濁液（ＩＸ１０’ｉ固／ゴ）１００μｌとマツス牌１１
哉細胞（２Ｘ１０’ｌ固／ｄ　）　１００　ｆｉｌ　、
！：　全９６クエルグレートのフェル中で混合し、これ
を３７′Ｃ，５％ＣＯ２のもとて５日間培養した。

また、これと並行して、ＴＣＣＭを最終濃度が棒になる
ように添加したものを上記と同様に培養した。ここで、
ＴＣＣＭ　（Ｔｈｙｍｕ＠Ｃｓ１ｌ　Ｃｏｎｄｌｔｌｏ
ｎｅｄＭ１５　ｄｉ　ｕｍ　）は、Ｂａ１ｂ／ｃマワス
（１０〜１４日齢）の胸腺細胞１０’ｉ’Ｌ［ｌ胞を１
４のＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣ８，５ｘｌＯ
−５Ｍ　２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン
、１００　Ｕ／ｒａｌペニシリン、及び０４１〜〜スト
レプトマイシン含有）中で２日間培養して得た培養液の
上ｄ液でらる・さらに、上記２種類の培養の対照として
緑膿菌懸濁液の代シにＲＴＭＩ　−１６４０培地を添加
した区分を同様にＮ養した。

次に、マウス膵臓細胞をＲＰシ１１−１６４０培地で洗
浄し、細Ｅｌ濃度をＲＰＭＩ　−１６４０（１０％ＦＣ
３。

２−メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマ
イシン含有）中２　Ｘ　１０’個／ｄとしてさらに７日
間培養した。

（２）特異抗体の検定 Ｂ＃１ｌｊｌｘが抗原で免疫化されておればその抗原に
対する特異抗体が産生されるはずであるから、特異抗体
産生の有無を調べることによってＢ細胞が免疫化されて
いるか否かを知ることができる。

前記の培養細胞が免疫化されているか否かを確認するた
め、本発明者等が特願昭５９−１３３９４２明細省に記
載した方法（ＥＬＩＳＡ法）によシ特異抗体の検出を行
った。緑膿菌を固定化したプレートの各ワエルに、（１
）によシ培養した培養液５０μｌずつを注入したのち、
室温で２時間放置したのちＰＢＳ−Ｔｗ、、ｎで３回洗
浄した。ついで二次抗体としてホースラディッシュノ臂
−オキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロブリン５０
μノを各穴に添加したのち、ＰＢＳ−Ｔｗ＠ｅｎで３回
洗浄した。これに酵素活性測定のため基質として０．１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐ）１４．２）にＡＢＴＳ　［２、
２／−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン）−６
フースルホン０１、３２．５　ｍＭと■２０２５ｍＭと
を溶解したものを使用直前に調製し、これを各ウェルに
１００μｌずつ注入し、室温で５〜１５分間反応を行っ
たのち、２ｍＭアジ化ナトリウムを各ウェルに１００μ
！ずつ添加し、ついでタイターチック・マルチスキャ７
■（７ｏ−社）を用い。Ｄ　４０５□。。吸光ニオ、１
ｊ定した。

なお、前記ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎは次の組成を有する洗浄
液である。

塩化ナトリウム　　　　　　　　８．００：！塩化カリ
ウム　　　　　　　　　　１．１５＃リン酸−水素ナト
リウム（無水物）　　　０．２０．９リン酸二水素カリ
ウム　（無水物）　　　０．２０＆Ｔｖｅ＠ｎ　−２０
０，５１Ｍ 以上を蒸留水に溶解して１１としたもの。

結果を次の第２表に示す。

以下余白 前記の表は、緑膿菌によシ肺臓細胞を免疫化した結果、
ｎ＋藏細胞が緑膿菌に対する特異抗体を産生じたことを
示している。

実施例３゜ （１）抗体産生細胞の調製 実施例１に記載したのと同様の方法により、正常９ａｌ
ｂ／ｃマウスからの肺臓細胞懸濁液（総数１．４６Ｘ１
０８個；よ度３．５　ｘ　１０’個／ｒａｇ　）、及び
緑膿菌Ｆ３の１ｉ８Ｊ液（ＩＸＩＯ８個／ｄ）ｔ−、Ｊ
Ｊｔ、、これらを混合してＴＣＣＭの存在下（混合後濃
匪がμになるように添加）、ＲＰＭＩ　−１６４０（１
０％ＦＣ８１２−メルカプトエタノール、ペニシリン及
びストレプトマイシン含有）４２ｍ／中で、炭酸ガスイ
ンキュベーター（３７℃、５％ｃｏ２）において４日間
培養した。培養終了後、前記の実θａ例と同様の方法に
よシフ。６４Ｘ１０’個の生細胞を回収した（回収率５
２％）。

（２）細胞融合 前記（１）によって得られた免疫化肺臓細胞及びマクス
ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・Ｕ、１〔以下Ｐ
３Ｕｌと略す（フロー社）〕のそれぞれをＲＰＭＩ　−
１６４０によシ数回洗浄し、この両者を細比数の比とし
て１０：１となるように混合し、次にこれを遠心分離し
て上清を除去し、遠心管底部に細胞４レツトを拡げ、３
７℃にて１分間放置し、次に３７℃のＰＢＳ（→中ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ４０００　）　４０％溶液
１ｄをゆりくシ滴加した。これを４分間、３７℃で静置
したのち、ＲＰＭＩ　−１６４０（１０％ＦＣ８含有）
でＰＥＧを徐々に希釈した。

遠心して上清を除き、最終的にｐ３ｕ、濃度が１、ｏ　
ｘ　ｔｏ５１１．ｚ、／ｎＬｌになるようにＥｔＰＭＴ
　−１６４０（１０％ＦＣ３含有）で希釈後、９６ワエ
ルのグレートに２００μｌ／ウエルの割合で分注した。

なお、この培地にはフィーダー細ｌＩ巳として３週令以
内のＢａ１ｂ／Ｃマウスのノ胸腺細胞を１．０Ｘ１０’
個／ｄとなるように添加した〔以上融合操作〕。細胞融
合の翌日から４日間毎日、各ウェルの半ｉ　（１００μ
ｌ）ずつをＨＡＴ培地に交換した。その後１日おきに培
地の交換を行った。

なお、前記ＨＡＴ培地は、ＲＰＭＩ　−１６４０培地に
１００μＭヒポキサンチン、０．１μＭアミノプテリン
、１６μＭチミジン、１０％ＦＣ８，５Ｘ１０　　Ｍ２
−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ
／ａ／ペニシリン、及び０．１！ｎ９／／ｎｌストレク
トマイシンを添加したものである。

１４日間培養した後、３８４ウエル中２８５ワエルにコ
ロニーが形成された。この２８５個を前記特許出願明細
書に記載のＥＬＩＳＡ法によって抗只抗体についてスク
リーニングした。

２個のコロニーが緑膿菌Ｆ３に対する抗体を、帝生じて
いた・この抗体のサブクラスはｒｇＭでラシ、その経鎖
はカツノや一鎖（ｒｇＭ／に）であった。

実施例４゜ （１）抗体産生細胞の調製 実施例３の方法上同様にして、Ｉｌ’４！臓細胞（１，
４刈０８個：終濃度３　Ｘ　１０’個／ｍｅ）とヒト抗
体ＩｇＧのＦａｂ部分〔カベル社、１０　ｆｉｌｌ／ｒ
ｕｔ　）とをＴＣＣＭ存在下、ＲＰＭＩ　−１６４０４
０ｄ中で４日間培養することにょシ免疫化を行った。培
養終了後、６．８　Ｘ　１０７ｉｌＩＳＩＩの生細胞を
回収した。

（２）　　細胞融合 上記で免疫化した牌誠細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ　
、Ｕｌとを用い、実施例３と同様にして４＠胞融合を行
った０ 細胞融合から１４日後、ヒト軽鎖［ＩＭｉ！ペンス・ノ
ヨン蛋白（カツノや−及びラムダ鎖）タコ９社〕を抗原
として前記ｘｍｍｕｎｏｃｈｅｍｔｓｔｒｙ記載のＥＬ
ＩＳＡ法によυ抗体のスクリーニングを行ったところコ
ロ＝−出ｍの４８０ウエル中８ウエルでヒト軽鎖に対す
る抗体を産生じていた。なおこの抗体のサブクラスはＩ
ｇＭ／にであった。また、この抗体はヒト軽鎖（カッパ
ー鎖及びラムダ鎖）にのみと反応しヒ）ＩｇＧの重鎖や
ヒ）ＩｇＧのＦｃ部分とは反応しないものであった。

以下余白 実施例５ ＥＢＶの調製 ＥＢＶを、Ｂ９５−８細胞をＲＰＭＩ−１６４０（２０
％ＦＣ８含有）培養液中、３７℃、５　％　Ｃｏ□存在
下、炭酸ガスインキュベーター内で１１日培養を行った
のち、培養液を遠心分離することによりＢ９５−８細胞
を除きその上清として得た。なお、このようにして調製
されたＥＶＢの活性はＴＤ５ｏ１０／−であった。

抗体産生細胞の調製 正常人より採血した末梢血２０−からファイコール・コ
ンレイ比重遠心法によってリンパ球細胞を分離し４　Ｘ
　１０個のリンパ球を得た。ついでこの細胞２Ｏ−（２
×１０６個／７りとオートクレーブ処理（１２０℃、２
０分）した緑膿菌Ｆ７（５×１０７個／ゴ）とをＲＰＭ
Ｉ−１６４０（１ｏ％ＦＣ３，ペニシリン、ストレグト
マイシン含有）中、３７℃、５チ゛ＣＯ□存在下、炭酸
ガスインキュベーター内で４日間培養を行った（試験管
内免疫操作）。ついで遠心によりリン／４’球細胞を集
めたのち、ＲＰＭＩ−１６４０（２０％ＦＣ８，２ｍＭ
グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン貧有）で
Ｉ　Ｘ　１０６個／−とした。

形質転換 上記抗体産生細胞（Ｉ　Ｘ　１０’個／−）１−ずつを
２４ウエルプレートに分注し、これに上記ＥＢＶ上清１
００′μｌを加えたのち３７℃、５４　Ｃｏ□存在下、
炭酸ガスインキュベーター中で培養することにより形質
転換を行った。

抗体産生細胞の選別 培養開始後２週間以降、経時的に抗体産生を追跡（ＩＩ
ＥＬＩＳＡ法）しながら細胞の増殖を行った。このＥＬ
ＩＳＡ法は、緑膿菌菌体を固定化したプレートを用い特
願５９−１３３９４２の明細書に従って行った。すなわ
ち形質転換した細胞の培養上清を上記で用意したグレー
トに各ウェルごとに５０μｌずつ注入したのち、南温で
２時間放置し、ついでＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　１３回洗
浄した。次に、二次抗体と洗浄した。ついで、酵素活性
測定のため基質として０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｉ−
１４，２）にＡＢＴＳＣ２，２’−アジノビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸１２．５ｍＭ
とＨ２０□５ｒｒＬＭとを溶解したものを使用直前に調
製し、これを各ウェルに１００μｌずつ注入して室温で
５〜１５分間反応を行なったのち反応の停止（２ｍＭア
ジ化ナトリウムを各ウェルに１００μｌずつ深加する）
を行い、ついでタイターチック・マルチスキャン■（フ
ロー社）によりＯＤ　４０５を測定することにより行っ
た。

上記操作で陽性を示したウェルから細胞をとり出したの
ち軟寒天法によりクローニングを行った。

そしてクローニング操作を行いながら再度上記ＥＬＩＳ
Ａ法を行うことにより特異抗体を産生じているクローン
を得た。

なお、この際に得たクローンはＦ７に対して特異的に反
応する抗体を産生じていた（第３表のＥＬＩＳＡ法の結
果を参照）。

以下余白 第３表 クローン化によって得られた抗体産生細胞をＲＰＭＩ−
１６４０（２０％ＦＣ８含Ｍ）培地中で、３７℃、５チ
ＣＯ２存在下、炭酸ガスインキ−ベータ中で培養したの
ち、培養上清を硫安分画法によυＦ７に対するモノクロ
ーナル抗体を得た。なお、この抗体の特徴づけを行った
ところサブクラスはＩｇＭ／にであった。

実施例６ 手術の際に摘出されたヒト腹腔内リンノン節から、前記
と同様の操作によってリンパ球細胞を傅、２×１０　個
／−に調整した。ついでこれにオートクレーブにより滅
菌した緑膿菌Ｆ１〜Ｆ７を各々の最終濃度が２．５Ｘ１
０　個／１ｒＬｔになるように加え、３７℃、５％ＣＯ
２存在下、炭酸ガスインキュベーターで２日間培養を行
った。

培養終了後、遠心によりリンパ球を回収しＲＰＭＩ−１
６４０（２０４ＦＣ８，２ｍＭグルタミン、イニシリン
、ストレプトマイシン含有）によ、９１　Ｘ　１０’個
／−になるように調製したのち、これを９６ウエルのプ
レートに１００μｌずつ分注した。ついでこのプレート
の各ウェルに前記ＥＢＶ上清液を１００μｌ加えたのち
、前記実施例と同様に経時的に抗体産生をＥＬＩＳＡ法
で追跡しながら細胞を増殖させた。

ＥＬＩ　ＳＡ法で陽性を示すウェルを限界希釈法により
クローニングし特定抗原に対する特異抗体を産生じてい
るクローンを４棟類得た。このときの各々のクローンの
種類を各々クローン３，４．５お↓び６とした（　ＥＬ
ＩＳＡの結果は第４表に示す）。

以下余日 上衣よりクローン３はＦ６、クローン４はＦ４、クロー
ン５はＦ　　クローン６はＦ３に対して特異一 的な抗体を産生じていることがわかった。

また、ここで得た細胞を前記実施例と同様に培養し、抗
体の回収を行ったのち、回収嘔れた抗体の特徴づけを行
ったところ、これら抗体のサブクラスはいずれもＩ　ｇ
Ｍ　／　ｇであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｂリンパ系細胞と抗原とを試験管内で混合し、次に
   これを培養し、そして培養液から抗体産生細胞を回収す
   ることを特徴とする抗体産生細胞の調製方法。 ２、前記抗体産生細胞が腫瘍細胞との融合によって前記
   抗体に特異的なモノクローナル抗体を産生し得る細胞融
   合株を形成することができる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。