KR0136799B1 - 인체 i형 인터페론 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

없음

Description

인체 I형 인터페론 펩타이드의 제조방법

제1도 : 클론 E76E9 의 제한 지도

제2도 : 클론 p9A2 의 제한 지도

제3도 : 클론 p9A2 의 DNA 서열

제4도 : 클론 E76E9 의 DNA 서열

제5도 : 탐색침(probe)으로서 클론 p9A2의 DNA를 이용한 클론 p9A2의 게놈성 사더블럿(Southern Blot)분석.

제6도 : 발현 클론 pRHW12의 제조.

제7도 : Ⅰ형 인터페론들 사이의 아미노산과 뉴클레오티드의 차이점.

제8a도 : IFN-αA 유전자의 개개의 뉴클레오티드위치의 목록

제8b도 : IFN-오메가1 유전자의 개개의 뉴클레오티드위치의 목록

제8c도 : IFN-αD 유전자의 개개의 뉴클레오티드위치의 목록

제9도 : 특정 샘플의 인터페론-서브타입(subtype)의 합성에 관한 도식적 표현

제10도 : 특정 mRNA의 인터페론-서브 타입의 검출

제11도 : IFN-오메가1 유전자의 DNA 서열

제12도 : IFN-슈도-오메가2 유전자의 DNA 서열

제13도 : IFN-슈도-오메가3 유전자의 DNA 서열

제14도 : IFN-슈도-오메가4 유전자의 DNA 서열

제15도 : IFN-오메가 유전자의 정정된 목록

제16도 : 시그날 서열의 동족체

제17도 : 증식프로테인 서열의 동족체

제18도 : 서로 관련있는 4 DNA 서열의 동족체

본 발명은 재조합체 DNA로서 신규한 I형 인터페론 뿐만아니라 펩타이드의 제조 방법 및 이들 방법에 요구되는 생성물 예를 들어, 유전 서열, 제조합체 DNA 분자, 발현 비이클(vehicle) 및 유기체에 관한 것이다. 인터페론은 생물학적 활성이 부분적으로 중복되고 부분적으로 분기되는 것에 의해 특징지어지는, 인체 세포내에서 생성되는 여러 가지 프로테인을 나타내기 위하여 만들어낸 용어이다. 이들 프로테인은 신체의 면역반응을 변형시키며 인체를 바이러스로부터 보호하는데 기여하는 것으로 믿어진다. 예를 들면, 인터페론은 α-, β 및 γ 인터페론의 세종류로 분류되었다. β- 및 γ- 인터페론의 하나의 아종만이 인체에서 발견된다(참조, 예, S,

ohno et al., Proc, Natl. Acad, Sci. 78, 5305-5309(1981) : Gray et al., Nature 295 503-508(1982) : 또한 인터페론은 두종류로 세분된다 : Ⅰ형 및 Ⅱ형 인터페론. Ⅰ형 인터페론은 α- 및 β- 인터페론으로 더욱 나뉘어진다. 이들 α- 및 β- 인터페론은 통상의 조상프로테인(ancestor protein)으로부터 진화된 것으로 추정된다. Ⅱ형 인터페론은 γ- 인터페론이라 불리워지며 Ⅰ형 인터페론과는 관련이 없다. Taya, et al., EMBO Journal 1/8, 953-958(1982). 한편 γ- 인터페론의 여러 가지의 아종이 밝혀졌다.(참조예 : Phil Trans. R .Soc. Lond.

299, 7-28 (1982))). 증식 γ- 인터페론은 인터페론중에서도 23%의 최대 분기를 나타내며 약 166개 아미노산 길이이다. 주목할 것으로는 또한 드물게 고분자량 [ 참조 : Goren. P .eT al., Virology 130, 273-280 (1983) 에 기술된, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 26,000]을 갖는 인터페론에 관한 보고이다. 이 인터페론을 IFN-γ 26K 라 부른다. 이 IFN-γ 26K 는 가장 잘 알려진 특정의 항-바이러스 성 및 항-세포활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 현재까지 알려진 인터페론은 여러 질병에는 효과적이나 많은 다른 질병에서 효과가 적거나 또는 전혀 효과가 없음이 입증되었다.(참조, 예, Powledge, Bio/Technology, March 1984, 215-228, Interferon On Trial). 또한, 인터페론은 부작용 때문에 말썽이 되고 있다. 예를 들어, 재조합체 α- 인터페론을 항암제로 사용하는 경우에 있어서, 제1기 상태의 치료에는 안전하다고 믿어졌던 약 50밀리은 단위의 용량이, 급성혼수상태, 관절통, 격심한 피로 및 식용부진, 방향감각 소실, 급성발작 및 간성독성의 부작용을 일으킨다. 1982년에, 프랑스 정부는 이 α- 인터페론의 치료를 받은 암 환자가 치명적인 심장발작을 일으킨후에는 이것의 사용을 중지시켰다. 적어도 2건의 심장 사고사가 또한 최근 미국 임상계에 보고 되었다. 점차로 발열 및 권태감과 같은 부작용의 최소한 몇 가지는 그 안에 존재하는 불순물에 의해서가 아니라 인터페론 분자 자체에 의해서 나타난다는 것이 분명해지게 되었다. 부작용이 감소된 새로운 인터페론 - 같은 분자를 개발하려는 커다란 바램 때문에, 본 발명가들은 그와 같은 새로운 물질을 찾아 제조하는데 착수하였다. 따라서 본 발명은 선두 펩타이드(leader peptide)를 함유할 수 있는 신규한 Ⅰ형 인터페론 및 그 들의 N-글리코실화 유도체에 관한 것으로, ( 본 명세서에서는 오메가-인터페론, 또는 IFN-오메가라 부름), 이들은 168내지 174, 바람직하게는 172 아미노산을 함유하며, 이제까지 공지된 α- 인터페론의 서브타입과 비교할 때 30내지 50%, 바람직하게는 40내지 48%의 분기를, β- 인터페론과 비교할 때 약 70%의 분기를 나타내고, 반면에 α- 인터페론과 유사한 효과를 나타내면서도, 이들 α-, β-분자가 나타내는 많은 공지의 치료적 단점이 소실되었다. 따라서 본 발명은 완전히 정제된 형태의 신규한 인터페론, 그 의 비글리코실화 및 글리코실화형, 이들을 코드화하는 유전 서열 뿐 아니라, 이 서열들을 함유하는 재조합체분자를 제공한다. 본 발명은 또한 발효 또는 조직 배양법에 의해서 신규한 인터페론을 생성할 수 있는 미생물 또는 조직배양 숙주와 같은 여러 가지 숙주 뿐만아니라, 전술된 바와 같은 유전 서열을 함유하는 플라스미드와 같은 발현 비이클을 제공한다. 바람직한 배양에 있어서, 본 발명은 다음 구조를 갖는, 상응하는 유전 서열 뿐만 아니라 오메가 -인터페론을 제공한다.

제 111위치에서, 서열 GGG(gly를 코드화함)는 GAG(glu를 코드화함)로 치환될 수 있다. 바람직한 분자에는 또한 아미노산 제 78위치에서 N-글리코실화된 그의 유도체가 포함된다. 상기에서 언급된 두 개의 오메가-인터페론은 다음식의 선두서열을 함유할 수 있다: Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly 본 발명에 따른, 새로운 오메가 인터페론 및 이들을 코드화하는 DNA서열은 다음과 같이 얻어진다: 인체 B-세포 림포이드계, 예를 들어, 나말와 세포(Namalwa cells) (참조:G klein dt al., Int. J. Cancer 10, 44(1972))를 바이러스, 예를들어, 센다이 바이러스(Sendai Virus) 로 자극하여 α- 및 β-인터페론을 동시에 생성시킬 수 있다. 이공정중에, 생성되는 mRNA를 자극된 나말와 세포로부터 단리시키고, 이어서 이것을 cDNA합성을 위한 모체(template)로서 사용할 수 있다. 클로닝 공정중에 인터페론-특정 서열의 수율을 증가시키기 위하여, mRNA제제를 수크로즈 밀도 구배중에서 서로 다른 길이의 개개의 mRNA분자를 갖는 부분으로 분리한다. 바람직하게는, 약 12s(약 800 내지 1,000 염기 길이의 mRNA)부분중의 mRNA를 모은다. α-인터페론 및 β-인터페론에 특이성을 갖는 mRNA를 이 부분에 고정시킨다. 이 구배부분의 mRNA를 침전을 통해 농축시키고 물에 용해시킨다. cDNA 라이브러리(library)의 제조공정에는 문헌(참조, 예, E. Dworkin-Rastl. M. B. Dworkin and P. Swetly., Journal of Interferon Research. 2/4, 575-585 (1982))에 공지된 방법의 공정이 포함된다. mRNA는 올리고-di의 부가를 통해 제조된다. 그후에, 적절히 완충화된 용액중의 4개의 데옥시뉴클레오사이드트리-포스페이트(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 및 역 전사효소를 가하므로써, cDNA를 45℃에서 1시간동안 합성한다. 클로로포름 추출 및 겔 칼럼, 예를들어, 세파덱스 G50을 이용한 크로마토그라피를 통해, cDNA/mRNA 하이브리드를 정제한다. 알칼리 처리(0.3M NaOH로 50℃에서 1시간동안)로 RNA를 가수분해시키고, 산 나트륨 아세테이트용액으로 중화시킨후 에탄올로 cDNA를 침전시킨다. 네 개의 데옥시뉴클레오사이드트리-포스페이트 및 적절히 완충화된 용액중의 이. 콜라이 DNA-폴리머라제Ⅰ을 가한 후에 이중 나선을 합성하며, 여기에서 cDNA를 그의 3'말단에 헤어핀(hairpin)구조를 형성하기 위한 모체(template)로서 도화선(primer)로서 사용한다.(15℃에서 6시간)(참조:A. Eftratiadis et al., Cell I, 279(1976)). 페놀 추출, 세파덱스 G 50크로마토그래피 및 에탄올 침전 공정후에, DNA를 적절한 용액중에서, 외가닥에 특이성을 갖는 엔도뉴클레아제 S1으로 처리한다. 이중나선으로 전환되지않는 cDNA 뿐 아니라 헤어핀 구조가 분해된다. 클로로포름 추출 및 에탄올 침전 공정 후에, 이중나선 DNA(ds DNA)를 수크로즈 밀도 구배상에서 크기에 따라 분리한다. 그후 단계의 클로닝공정에 있어서는, 600bp 이상길이의 ds DNA만을 사용하여 새로운 인터페론을 완전히 코드화 할 수 있는 서열을 함유하는 클론만이 수득될 가능성을 높이는 것이 바람직하다. 600bp 이상길이의 ds DNA를 에탄올 침전시키고 물중에 용해시켜 구배로부터 농축시킨다. 수득되는 ds DNA 분자의 수를 증가시키기 위하여, 그들을 먼저 적절한 벡터중에 위치시키고, 이어서 이·콜라이로 이입시킨다. 벡터는 플라스미드 P^BR322(F. Bolivar et al., Gene 2, 95(1977))가 바람직하다. 이 플라스미드는 하나의 리플리콘(replicon) 및 두 개의 선택 마커(marker)로 구성된다. 그들은 숙주를 항생물질 암피실린 및 레트라사이클린(Ap^r, Te^r)에 내성으로 만든다. β-락타마제(Ap^r)에 대한 유전자는 제한 엔도뉴크레아제 Pst I에 대한 인식 서열을 함유한다. 따라서 P^BR322는 Pst I으로 절단될 수 있다. 중복 3'-말단을 적절히 완충된 용액중에서 예비혼합된 양의 dGTP와 함께 터미널 데옥시뉴클레오리드 트랜스퍼라제(idi)로 연장시킨다. 동시에, ds DNA를 마찬가지로 3'-말단에서 dCTP를 사용하여, 효소 idi로 연장시킨다. 상기 플라스미드와 ds DNA의 호모폴리머 말단은 상보적이며 플라스미드 DNA 및 ds DNA가 적절한 염, 완충액, 및 온도조건하에서 적절한 농도 비로 혼합되면 하이브리드화된다(T. Nelson et al., Merhods in Enzymology 68, 41-50(1980)). 이·콜라이. HB101균주(유전자형-F, hsds 20(r-B, m-B) recA13 ara-14, proA2, lacY1, golk2, rps L 20(Smr),xyl-5, mtl-1, SUPE44. 람다-)를 CaCl₂용액으로 세척하여 제조합체 벡터-ds DNA 분자의 형질 전환 공정에 사용한다. 콥피턴트 이·콜라이. HB101을 상기 DNA와 혼합하고, 0℃에서 인큐베이션 시킨 후에, 수득된 플라스미드 DNA를 42℃에서 2분간 열쇼크(heat shork)로 형질 전환시킨다.(M, 6, 23-28(1979)). 이어서 형질전화된 세균을 테트라사이클린이 함유된 한천 평판(㎖당 10㎍)상에 퍼뜨린다. 벡터 또는 제조합체 담체 분자(Tc^r)를 받아들인 이·콜라이. HB101만이 이 한천상에서 성장할 수 있다. 제조합체 벡터- ds DNA 분자는 숙주에 Ap^sTc^r인자형만을 줄수 있는데 이는 ds DNA를 β-락타마제내로 이입시키면 β-락타마제에 대한 정보가 파괴되기 때문이다. 이어서 클론을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 한천 평판으로 옮긴다. 약 3%성장이란 클론의 97%가 ds DNA 분자를 삽입하고 있음을 의미한다. 따라서, 0.5㎍ ds DNA 로 출발하면, 30,000이상의 클론이 수득되며, 그의 28,600클론을 개별적으로 영양배지, 10㎍/㎖ 테트라사이클린이 함유된 마이크로리터평판의 컵으로 옮긴다. 클론이 성장한 후에, 평판을 -70℃에서 유지시켜 보관한다(cDNA 라이브러리). cDNA 라이브러리에서 새로운 인터페론-유전자를 함유하는 클론을 찾아내기 위해서, 클론을 녹인후에 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 이들 필터를 테트라사이클린-함유 영양한천상에 놓는다. 세균 콜로니를 성장시키고 이어서 세균의 DNA를 필터상에 고정시킨다. 탐색침으로써, 유리하게는 IFN-α2-Arg에 대한 유전자를 함유하는 클론 PER33(E. Rastl er al., Gene 21, 237-248(1983)-참조, 유럽 특허원 제2.115.613)의 삽입체를 사용할 수 있다. 닉 형질전환(Nick translation)에 의해서 DNA-폴리머라제 I. dATP, dGTP, dTTP 및 X- 32P- dCTP를 사용하여 DNA의 이부분을 방사적으로 표식한다. 니트로셀룰로즈 필터를 먼저 완화한 하이-브리드화 조건하에서, 방사성 샘플을 가하지 않고, 예비처리한후에, 방사성 샘플을 가하고 약 16시간동안 하이브리드화 시킨다. 이어서, 마찬가지로 필터를 완화한 조건하에서 세척한다. 하이브리드화 및 세척 공정이 엄격하지 않기 때문에 수득된 클론이 인터페론 α2-Arg를 함유하는 클론뿐만아니라, 그의 서열이 이제까지 알려진 α-인터페론의 서열과는 상당히 다른 인터페론을 함유하는 다른 클론이 수득된다. 건조시킨 후에, 필터를 X-선 필름상에 노출시킨다. 배경의 수준이 거의 상기와 같은 암전(暗轉)효과 (blackening effect)는 인터페론-특정 서열을 갖는 클론이 존재함을 보여준다. 이어서 방사성 시그날을 다른 성질이기 때문에 양성 클론 또는 양성 결과가 예측되는 방법으로 반응하는 클론들을 소규모로 배양시킨다. 플라스미드 DNA분자를 단리하여, 제한 엔도뉴클레아제Pst I으로 제한하고, 크기에 따라 아가로즈 겔상에서 전기 영동적으로 분리한다(Birnboim et al., Nucl. Acid. Res. I, 1513(1979)). 아가로즈 겔중의 DNA를 사딘의 방법(E. M. Southern, J. Mol. Biol 98, 503-517(1975))의 방법에 따라 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 이 필터중의 DNA를 방사 활성의, IFN-유전자를 함유하는 비변성된 샘플로 하이-브리드화 시킨다. 양성 조절로서 인터페론 α2-Arg에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 1F7(DSM 에기탁됨. 기탁번호, DSM 2362)이 사용된다. 오오토라디오그람으로 두 개의 클론 E76 E9 및 P9 A2에는 완화된 조건하에서 인터페론 α2-Arg 유전자와 하이브리드화되는 서열이 함유되어 있음을 분명히 확인한다. 클론 E76 E9 및 P9 A2의 ds DNA 삽입체를 더욱 명확히 기술하기 위해서, 이들 클론의 플라스미드를 대규모로 제조한다. 그 DNA를 여러 가지 제한 엔도뉴클레아제, 예를들어, AluⅠ, Sau3A, BglⅡ, HinfⅠ, PstⅠ 및 HaeⅢ로 분해한다. 생성된 단편을 아가로즈 겔에서 분리한다. 상응하는 크기의 마커, 예를들어 P^BR322를 제한 엔도뉴클레아제 HinfⅠ또는 HaeⅢ로 분해한 결과 생성되는 단편과의 비교를 통해, 단편의 크기를 측정할 수 있다. Smith 및 Birnsteil (H. O. Smith et al., Nucl. Acid. Res. 3, 2387-2398(1967))이 작성한 지도에 의해, 이들 단편의 서열을 측정할 수 있다. 그 제한 효소지도(제 1도 및 제 2도)로부터 클론 E76 E9 및 P9 A2의 삽입체에 이제까지 밝혀지지 않았던 인터페론 유전자, 즉, 오메가-인터페론 유전자가 포함되어 있다는 놀라운 사실을 발견하였다.

오메가-인터페론에 관한 이 정보는 cDNA삽입체를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하는데 이용될 수 있다. 이 단편들은 박테리오파지 M13 mp9(J. Messing et al., Gene. 19, 269-276(1982))의 ds DNA형(복제형)으로 연결되며 Sanger의 디데옥시법(F. Sanger. et. al., Proc. Natl Acad. Sek. USA 74, 5463-5467(1977))의 도움으로 서열화 된다. 재조합체 파지의 가닥 DNA를 단리한다. 합성 올리고머를 결합시킨 후에, 이·콜라이로부터 얻어지는 DNA-폴리머라제 I의 거대 단편(클레노우 단편)을 이용하여 4개의 분리 제제로 2차나선 합성을 수행한다. 4개의 부분 반응의 각각을 위하여 4개의 디데옥시 뉴클레오사이드-트리포스-페이트(ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP)중의 하나를 가한다. 이것은 특정의 뉴클레오사이드-트리포스-페이트에 관하여 상보적인 염기가 모체-DNA중에 존재하는 그들 위치에서 통계적으로 분배된 사슬을 분해시킨다. 방사성의 표식된 dATP를 또한 사용한다. 합성 반응을 종료시킨 후에, 생성물을 변성시키고 변성 폴리아크릴 아미드겔(F. Sanger et al., FEBS Lerrers 87,107-111(1978))중에서 외가닥 DNA 단편을 크기에 따라 노출시킨다. 오오토라디오그램으로 재조합체 M13파지의 DNA서열을 읽을 수 있다. 여러 가지 재조합체 파지의 (R. Stadem. Nucl. Acid. Res. 10, 4731-4751(1982))에 의해서 진행된다. 제 1 도 및 제 2도는 서열화 방법을 나타낸다. 제 3도는 클론 P9 A2의 삽입체의 DNA서열을 나타내며, 제 4도는 클론 E76 E9 의 DNA서열을 나타낸다. 비코드화 DNA나선은 5'→3'방향과 함께 그로부터 유도되는 아미노산 서열을 나타낸다. 오메가(Glu)-인터페론에 대한 클론 E76 E9 의 단리된 cDNA 는 858 염기쌍 길이이며 3'비해독 부위를 갖는다. 증식 오메가(Glu)-인터페론을 코드화하는 부위는 뉴클레오티드 9내지 뉴클레오티드 524로 연장된다. 오메가(Gly)-인터페론에대한 클론 P9 A2의 단리된 cDNA은 877염기쌍 길이이며, 그 서열은 뉴클레오티드 8내지 뉴클레오티드 523으로 연장된 증식 오메가(Glu)-인터페론을 서열을 코드화한다. P9 A2의 경우 3' 비해독 부위는 폴리-A 단편으로 연장된다.

증식 오메가-인터페론을 코드화하는 DNA서열은 클론 E76 E9 및 P9 A2중에 완전히 함유된다. 증식 오메가(Glu)-인터페론 및 증식 오메가(Gly)-인터페론은 모두 시스테인-아스파르트산-로이신을 갖는 N-말단에서 출발한다. 매우 놀랍게도, 발견되는 두 개의 증식 오메가-인터페론은 172 아미노산 길이이며; 이들은 이제까지 알려진 다른 공지의 인터페론, 즉, α-인터페론의 경우에 166(또는 165)아미노산 길이에서 분명히 벗어난다. 매우 놀랍게도, 두 개의 오메가-인터페론은 아미노산 78위치(아스파라긴-메티오닌-트레오닌)에서 잠재성 N-글리코실화부위를 갖는다. 클론 E76 E9 및 P9 A2의 DNA를 비교하면 하나의 차이점이 발견된다. 아미노산111을 코드화하는 클론 E76 E9중의 트리플렛은 GAG이고 글루탐산을 코드화한다. 클론 P9 A2 중의 이 트리플렛은 GGG이고 글리신을 코드화한다. 따라서 그 두 개의 오메가-인터페론 프로테인은 하나의 아미노산에 의해서 서로 달라지며 본 명세서에서는 오메가(Glu)-인터페론(E76 E9) 및 증식 오메가(Gly)-인터페론(P9 A2)로서 언급한다. 이 두 개의 오메가-인터페론을 이제 까지 알려진 인체 α-인터페론 서브타입과 비교하면 다음과 같다:

*인터페론 알파A는 165개 아미노산만을 갖는다.

**인터페론 알파H는 75위치에서 잠재성 N-글리코실화 부위를 갖는다(D. Goeddel et al., Nature 290, 20-26(1981)). 플라스미드 E76 E9가 포함된 이·콜라이 HB101과 플라스미드 E76 E9 가 포함된 이·콜라이 HB101은 독일의 미생물 기탁 기관(DSM Gottigen)에 각각, 기탁번호 DSM 3003 및 3004로 기탁되어 있다(기탁일; 1984년 7월 3일).

새로이 발견된 클론이 활성이 유사한 인터페론을 생성하는 것을 입증하기 위하여, 클론 E76 E9를 배양시키고, 세균의 분해물을 성장시키고 이어서 반점감소 실험을 실시한다. 기대한데로, 그 세균은 인터페론과 같은 활성 물질을 생성한다(참조: 실시예 3).

또한, 새롭게 발견된 두 개의 인터페론이 새로운 인터페론족의 그룹임을 입증하기 위하여 나말와 세포로부터 모든 DNA를 단리하고 여러 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다. 이 방법으로 클론 E76 E9 및 P9 A2의 cDNA에 의해 코드화되는 다수의 유전자에 접근할 수 있다. 이를 위하여, 수득된 DNA단편을 사던의 방법(E. M. Southern er al., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975))을 이용하여 아가로즈겔상에서 분리하고 니트로 셀룰로즈 필터상에 놓은후 비교적 엄격한 조건하에서 클론 P9 A2의 방사성 표지된 특정 DNA와 하이브리드화시킨다. 플라스미드 P9 A2 및 PER33을 DNA와 하이브리드화시켜 얻어진 결과는 제 5a도에 나타낸다:

개개의 흔적은 분해된 여러 가지 DNA샘플을 나타내는 글자로 표시한다(E=ECORI H=HindⅢ B=BamHⅠ S=SphⅠ P=PstⅠ C=ClaⅠ). 필터의 좌측절반은 α-인터페론 유전자 탐색칩(A)과 하이브리드화시키고 우측절반은 클론 P9 A2의 cDNA 삽입체(O)와 하이브리드화시킨다. α-인터페론 유전자 탐색침 또는 새로운 인터페론 유전자 탐색침의 어느것과 하이브리드화되는 밴드는 서로 다르다. 어떤 교차 하이브리드화도 상응하는 흔적에 의해 두 개의 다른 탐색침으로 검출될 수 없다.

제 5b도는 클론 P9 A2의 cDNA 및 하이브리드화에 사용된 단편을 나타낸다. 몇 개의 제한 효소의 인식부위가 나타나있다(P=PstⅠ, S=Sau3A, A=AluⅠ)탐색침에는 세 개의 가능한 PstⅠ단편들중의 2개만이 포함된다. 하이브리드화 패턴은 동형 유전자에 속하는 약 1300염기쌍(bp)을 갖는 오직 하나의 하이브리드화 단편만을 보여준다. 훨씬 짧은 단편, 120bp길이는, 겔을 모두 소모시켰다. 유전자의 5'부에 속하는 밴드는 탐색침이 이 부위를 포함하지 않으므로 발견할 수 없다.

PstⅠ흔적중에서는 6개 이상의 다른 밴드들을 발견할 수 있다. 이것은 새로운 서열과 관련된 몇 개의 다른 유전자가 인체의 제놈(genome)중에 존재해야 한다는 것을 위미한다. 하나이상의 PstⅠ인식부위가 이들 유전자중에 존재하면, 적어도 3개 이상의 추가 유전자를 분리할 수 있다. 이들 유전자는 바람직하게는 플라스미드 벡

터, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터 중에 포함된 인체 유전자 라이브러리로부터 하이브리드화에 의해 단리될 수 있다(실시예 4e 참조).

이 시점에서, 본 발명에 따른 오메가-인터페론은 특별하게 기술된 두 개의 증식 인터페론을 망라하고 있을뿐아니라 IFN-오메가 활성을 나타내는 이들 폴리펩타이드의 어떤 변형에 의해서도 영향을 받지 않음이 언급되어야 한다. 이들 변형에는 분자를 그의 N- 또는 C-말단에서의 단축시키는 것, 활성에는 거의 영향을 주지 않으면서 아미노산 잔기를 다른 잔기와 교환하는 것, 또는 그 분자를 다른 분자에 화학적으로 또는 생화학적으로 부착시키는것(이것은 삽입 또는 그외의 방법일 수 있다)등이 포함된다. 후자중에서도 하나이상의 오메가 인터페론 및/또는 공지의 α-또는 β-인터페론으로부터 제조된 하이브리드 분자가 언급될 수 있다. 신규한 인터페론 특히 오메가(Gly) 및 오메가(Gly)인터페론의 아미노산의 뉴클레오티드 서열사이의 차이점을 이미 α-인터페론 또는 β-인터페론이라 알려진(C. Weissmann et al., Phil, Trans. R. Soc. London. 299, 7-28(1982); A. ullrich er al., J. Molec. Biol. 156, 467-468(1982); T. Taniguchi et al., Proc. Nat. Acad. sci. 77, 4003-4006(1980); K, Tokodoro et al., EMBO J, 3, 669-670(1984))아미노산 및 뉴클레오티드 서열과 비교할 수 있기 위하여, 상응하는 서열을 쌍으로 배열하고 개개 위치에서의 차이를 체크한다. 제 7도에 나타낸 결과는 클론 P9 A2 및 E76 E9의 DNA 서열이 I형 인터페론(예, α- 및 β-인터페론)의 서열과 관계되어 있음을 입증해준다. 그것은 또한 개개의 α-인터페론과 새로운 서열 사이의 아미노산 서열중의 차이가 41.6% 보다는 크고, 47.0%보다는 작음을 보여준다. 새로운 서열 모두와 개개의 α-인터페론의 서열 및 β-인터페론의 서열사이의 차이는 약 70% 정도이다. 관련된 유전자의 모든 존재가 입증된 실시예 4의 결과 및 또한 인터페론에 대해서 제안된 명명법(J. Vilceck et al., J. Gen Virol. 65, 669-670(1984))을 고려함으로써, 클론 P9 A2 및 E76 E9의 cDNA삽입체가 인터페론-오메가로서 언급되는 새로운 I형 인터페론을 코드화한다는 가정에 도달한다. 또한 그것은 오메가-인터페론 유전자 발현은 I형 인터페론 유전자의 발현과 동일하게 일어남을 보여준다. S1 지도작성법(A. J. Be가 et al., Cell 12, 721(1977))에 의한 α- 및 오메가-β-인터페론의 다수-유전자 족의 개개 그룹의 전사(transcription)를 조사하면 (참고: 실시예 7)발현 오메가-1-mRNA가 바이러스-유도성임을 알수 있다. 이 종류의 유전자족의 잔사는 약 1000중에서 오지 수개의 염기만 달라지기 때문에, 하이브리드화만으로는 여러 가지 IFN mRNA'S들을 구별하기에 충분히 민감한 기준이 되지 못한다.

구별을 하기위하여, 9α-인터페론, 인터페론-오메가-1 및 β-인터페론의 mRNA서열을 대문자를 사용하여 선두 서열을 특정지우는 그들 염기를 나타낸다. 그와 같은 특정 부위는 간단한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 쉽게 찾아낼 수 있다. 그와 같은 특정 부위로부터 출발하는 선두 서열에 상보적인 하이브리드화 탐색침은 특정 서브타입의 mRNA와만 완전히 하이브리드될 수 있다. 모든 다른 mRNA는 서브타입의 특정부위에서 하이브리드화 시킬 수 없다. 하이브리드화 탐색침이 그의 특정 말단에서 방사성으로 표지되면, 외가닥의 특정 뉴클레아제(바람직하게는 S1 뉴클레아제)로 분해되지 않도록 보호된 그들 방사성 표지는 오직 탐색침으로 예정된 인터페론 서브타입 mRNA와 하이브리드화된 것들이다. 이 원칙은 인터페론에 한정되지 않고 제 8도에 기술된 특정 부위를 갖는 그룹의 공지 서열에 적응될 수 있다.

서브 타입의 상기 언급된 특정 부위는 제한 부위가 아니며, 대부분의 경우에, 그것은 cDNA을 제한효소로 절단하여 서브타입-특정하이브리드화 탐색침을 생성할 수 없음을 의미한다. 따라서 이 실험에 사용된 탐색침은 특정 부위 위의 인터페론-오메가 1의 mRNA에 상보적인 5'말단에서 방사성 표지된 올리고-뉴클레오티드를 연장시키므로써 제조된다. 제 10도는 예상한대로, 오메가-1-mRNA가 나말와 세포 및 NC37세포중에 유도될 수 있음을 보여 준다. 따라서 본 발명은 언급된 오메가 인터페론을 특별히 코드화하는 유전 서열뿐아니라, 돌연변이삭제(deletion), 전위 또는 추가에 의해 쉽고 일정하게 얻어지는 변형에 관한 것이다. 전술된 바와 같이 인체 오메가-인터페론을 코드화하고(즉 본 명세서에서 나타낸 바와같은 생물학적 활성의 스펙트럼을 갖는)실제로 발견된 인체 오메가-인터페론으로 퇴화되는 특정의 서열이 또한 본 발명에 포함된다. 그 분야의 전문가들이면 코드화부분의 DNA서열을 퇴화시키는 방법을 이해할 것이다. 또한, IFN-오메가에 대해서 본 명세서에서 보인 활성 스펙트럼을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하고, 엄격한 하이브리드화 조건하에서(즉, 상동성이 약85% 보다 좋은 것을, 바람직하게는 약 90%보다 좋은 것을 선택하여) 본 명세서에서 나타낸 서열(또는 그의 부분)과 하이브리드화되는 특정서열이 또한 포함된다.

하이브리드화는 65℃의 6X SSC/5X 덴하르트 용액/0.1% SDS중에서 수행한다. 엄격한 정도는 세척 단계에서 측정된다. 따라서, 약 85% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 DNA를 선택하기 위하여, 0.2×SSC/0.01%, SDS/65℃ 조건이 적합하며 약 90%또는 그 이상의 상동성을 갖는 DNA서열을 선택하기위하여는, 0.1×SSC/0.01%, SDS/65℃ 조건이 적합하다.

이들 조건하(0.2×SSC)에서 코스미드 라이브러리를 스크리닝해보면 IFN-오메가 1탐색침과 하이브리드화된 다수의 코스미드가 발견된다. 이들로부터 단리된 제한 효소 단편의 서열을 분석해보면 확실한 IFN-오메가 1유전자(제 11도참조) 및 IFN-슈도-오메가 2, IFN-슈도-오메가 3 및 IFN-슈도-오메가 4(제 12내지 14도 참조)로 언급된 세 개의 다른 관련된 유전자가 얻어진다. 본 발명은 또한 이들 및 코드화된 펩타이드에 관한 것이다.

이들은 특허청구범위에서 다시 언급된다.

DNA비교는 슈도 유전자가 IFN-슈도-오메가 1 유전자 (인터페론-오메가-1유전자)와 약 85%상동성을 나타낸다.

또한, IFN-오메가 1 유전자는 전사공정 중에 mRNA가, 작용성 인터페론 프로테인, 즉, 172 아미노산 길이인 증식 IFN-오메가 1 이 뒤에 연결되는 다음식의 시그날 펩타이드 23 아미노산 길이가 코드화되는 정보를 함유함을 보여준다:

Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly

인터페론-오메가 유전자는 높은 수율이 얻어지는 조건하에서 특정 미생물로 유도될 수 있다. 적절한 숙주 및 벡터는 그 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며; 예를들면, EP-A-0,093,619호를 참고할 수 있다. 특히 원핵 생물이 발현에 바람직하다. 예를들어, 이·콜라이^k12 균주 294(ATCC 31,446)가 특히 유용하다. 이용할 수 있는 다른 미생물에는 이·콜라이^x1776(ATCC 31,537)이 포함된다. 상기 언급된 균주뿐만아니라 이·콜라이^w3110(F- 람다-;기본유기영양성, ATCC번호 27325), 바실루스 서브릴리스와 같은 바실리, 및 살모넬라 타이피무리움 또는 세라티아 마르세센스와 같은 다른 엔테로박테리아 및 여러 가지의 슈도모나스 균종이 사용될 수 있다.

일반적으로, 리플리콘을 함유하는 플라스미드 벡터 및 숙주 세포와 적응할수 있는 균종으로부터 유도된 대조서열이 이들 숙주와 관련되어 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위뿐아니라 형질전화된 세포중에서 표현형의 선택을 제공할 수 있는 표식서열을 함유한다. 예를들어, 이·콜라이는 이·콜라이균주로부터 유도된 플라스미드, PER322를 (Bolivar, et al., Gene 2, 95(1977))사용하여 형질전화 시킨다. PER322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하며, 따라서 형질전환된 세포를 쉽게 구별할 수 있게된다. PER322플라스미드 또는 다른 플라스미드는 또한 발현을 위하여 미생물에 이용될 수 있는 프로모터를 함유하거나, 또는 함유하도록 변형되어야 한다. 제조합체 DNA제조에 가장 일반적으로 사용되는 그들 프로모터에는 β-락타마제(페니실리나제) 및 락토즈프로모터시스템(Chang et al., Nature 275, 615(1978)): Itakuta et al., Science 198 1056(1977); Goeddel et al., Nature 281,544(1979)) 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al., Nucleic Acids Res. S, 4057(1980); EP-A-0.036.776)이 포함된다. 이들이 가장 통상적으로 사용되는 동안, 다른 미생물의 프로모터가 발견 및 이용되었다. 예를들어, IFN-오메가에 대한 유전 서열은 박테리오파지 람다(P_L)의 왼쪽 프로모터의 조절하에 높일 수 있다. 이 프로모터는 조절될 수 있는 가장 잘 알려진 프로모터의 하나이다. 람다 억제인자(λ repressor)에 의해서 조절을 발휘할 수 있으며 인접된 제한 부위는 알려져 있다. 이 억제유전자의 온도 민감성 대립인자는 완전한 IFN-오메가서열을 함유하는 벡터상에 놓일수 있다. 온도가 42℃로 높아지는 경우에는, 억제인자는 불활성화되며, 프로모터는 그의 최대 수준에서 발현될 것이다. 이들 조건하에서 생성된 mRNA의 양은 P_L프로모터로부터 개시된 그의 새롭게 합성된 RNA의 약 10%를 함유하는 세포를 만들어내기에 충분해야 한다. 이렇게 하여, 작용성 IFN-오메가 서열이 리보조옴 결합 서열에 인접하여 위치하고, 람다 P_L프로모터로부터의 거리도 다른곳에클론의 은행을 제조할 수 있다. 이어서 이들 클론은 스크린될 수 있으며 가장 높은 수율을 주는 것이 선택된다. IFN-오메가 서열의 발현 및 해독은 또한 형질 전환되지 않은 상태의 미생물과 상동일수 있는 다른 조절인자의 조절하에 놓일 수 있다. 예를들어, 락토즈 의존 이·콜라이 크로모좀성 DNA는 락토즈 또는 효소 β-갈락토시다제를 발현시키므로써 락토즈를 분해시키는 락오페론을 함유한다. 락 조절원소는 이·콜라이에 감염성인, 박테리오파지 람다 Plae⁵로부터 얻어질 수 있다. 파지의 락 오페론은 동일한 세균으로부터 형질도입에 의해서 유도될 수 있다. 본 발명의 방법에서 용도에 적합한 조절인자는 미생물에서 생성된 플라스미드 DNA로부터 유도될 수 있다. 락 프로모터-오퍼레이터 시스템은 IPTG에 의해서 유도될 수 있다. 다른 프로모터-오퍼레이터 시스템또는 그의 부분이 마찬가지로 이용될 수 있다: 예를들어, 아라비노즈-오퍼레이터, 콜리신 E1-오퍼레이터, 갈락토즈-오퍼레이터, 알카리 포스파타제-오퍼레이터, trp-오퍼레이터, 크실로즈 A-오퍼레이터, tac-프로모터등이 이용될 수 있다. 원핵생물외에, 효모 배양물과 같은 진핵생물이 또한 이용될 수 있다. 다수의 다른 균주가 이용될수 있지만, 삭카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces Cerevisiae)가 진핵 미생물중에서 가장 통상적으로 사용된다. 삭카로마이세스중에서 발현시키기 위해서는, 플라스미드 YRp7(Stinchcomb, et al., Nature. 282,39(1979); Kingsman et al., Gene7, 141(1979); Tschumper, et al., Gene 10, 157(1980)) 및 플라스미드 YEp13(Bwach et al., Gene 8, 121-133(1979))가 통상적으로 사용된다. 플라스미드 YRp7은 트립토판에서 성장하는 능력이 부족한 효모의 돌연변이주, 예를들어 ATCC 44076을 위한 선택 마커를 제공하는 TRP1유전자를 함유한다. 효모 숙주 세포 제놈의 특징으로서 TRP1부위의 존재는 트립토판의 부재중의 성장에 의해서 형질전환 검출에 효과적인 환경을 제공한다. 마찬가지로, 플라스미드 YEp13은 LEU₂마이너스 돌연변이균주를 상보하는데 사용될 수 있는 효모 LEU₂유전자를 함유한다. 효모 벡터중의 적절한 촉진 서열에는 ADH I유전자의 5'-부위(Ammerer, G., Methods of Enzymology. 101, 192-201(1983)), 3-포스포글리세레이트 키나제(Hitzeman et al., J, Biol. chem 255, 2073(1980)) 또는 에눌라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트, 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이드 이소모라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 다른 당 분해 효소(Kswasaki Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112(1982))가 포함된다. 적절한 발현 플라스미드를 제조함에 있어서, 이들 유전자와 관련된 종료 서열은 또한 발현되는 서열의 3'말단에서 발현 벡터로 연결되어 mRNA의 폴리아데닐화를 제공한다. 성장조건에 의해서 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 다른 프로모터는 알코올 데하이드로게나제-2, 이소사이토크롬C, 산 포스페이트, 질소대사와 관련된 탈수 효소, 상기 언급된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 관여하는 효소에 대한 유전자의 프로모터 부위이다. 유전자 BAR1, MFα1, STE2, STE3, STE5 의 프로모터와 같은 효모 교배형부위에 의해 조절되는 프로모터는 온도의 시브(Siv)돌연변이(Rhine, Ph, D. Thesis, University of Oregon, Eugene Oregon(1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Part I, 181-209(1981), Cold Spring Harbor Laboratory)를 이용하므로써 온도 조절된 계를 위해 사용될 수 있다. 이들 돌연변이는 효모의 무성 교배형카세트의 발현에 직접적으로 영향을 미치며, 그러므로 교배형 의존 프로모터에는 간접적이다. 그러나, 일반적으로, 효모-적응성 프로모터, 개시 복제 및 종료서열을 함유하는 특정의 플라스미드 벡터가 적합하다. 미생물 외에, 다세포 생물로부터 유도되는 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 원칙적으로, 특정의 그와같은 세포 배양물은 척추 또는 무척추 배양물이건 간에 사용할 수 있다. 그러나 척추 세포에 관심이 집중 되었으며, 배양(조직배양)중의 척추 세포의 증식은 최근에은 일상적인 공정이 되었다(Tissue Culture, Academic Press, Kruse.. and Pattersov. Editors(1973)). 그와 같은 유용한 숙주 세포계의 예에는 VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(CHO)세포계, 및 W138, BHK, COS-7 및 MDCK 세포계가 있다. 그와 같은 세포를 위한 발현 벡터에는 통상적으로(필요하다면)복제의 기원, 발현될 유전자 앞에 있는 프로모터, RNA결합부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종료서열이 포함된다. 포유동물 세포에 사용하기 위하여, 발현 벡터상의 조절 기능은 자주 바이러스 물질로부터 제공된다. 예를들어, 통상 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노 바이러스 2, 및 가장 빈번하게는 시미안 바이러스 40(SV 40)으로부터 유도된다. SV 40의 초기 및 후기 말단 프로모터는 이 두 개가 모두 복제의 SV 40 바이러스성 기원(Fiers et al., Nature.237, 1123(1978))을 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 얻어지기 때문에 특히 유용하다. 보다 작거나 또는 보다 큰 SV 40단편이 또한 이용될 수 있으나, 단 복제의 바이러스성 기원의 HindⅢ 부위로부터 BglⅠ 부위로 연장된 약 250bp서열이 포함된다. 추가로, 또한, 프로모터 또는 목적하는 유전자 서열과 관련된 조절 서열을 이용할 수 있으나, 단 그와 같은 조절 서열은 숙주 세포계와 조화될 수 있어야 한다.

복제의 기원은 SV 40 또는 다른 바이러스성(예;폴리오마, 아데노, VSV, BPV 등)공급원으로부터 유도될 수 있는 것과 같은 의인성 기원이 포함된 벡터의 제조 또는 숙주 세포 크로모좀성 복제 메카니즘의 어느하나에 의해서 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 크로모줌으로 삽입된 경우에는, 자주 후자만으로 충분하다. 그러나, 이들 벡터는 클론화된 유전자의 높은 발현율을 가져오는 모든 레글론을 함유하고 있기 때문에, 유전자는 바람직하게는 발현 플라스미드 PER103(E. Rastl- Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983) 및 EP-A-0.115.613-DSM에 기탁됨(DSM기탁번호: 2773, 기탁일 1983.12.20))에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 플라스미드 PBR322 에 속하는 보다 짧은 EcoRI/BamHI단편을 다음식의 DNA서열로 대치시켰다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 다음공정, 예를들어, 제 6도에 따른 공정을 이용한다.

Ⅰ. 필요한 개개의 DNA단편의 제조:

단편 a

단편 a)를 제조하기 위하여 IFN-오메가를 위한 유전자(예, 플라스미드 P9 A2)를 함유하는 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 AVAⅡ로 분해한다. 생성된 cDNA삽입물을 크로마토그래피 및 정제시킨 후에, 이를 제한 엔도뉴클레아제 NCOⅠ및 AluⅠ으로 다시 분해하고 이어서 크로마토그래피 및 전기용출시킨다. 이 단편은 상응하는 오메가-인터페론 유전자의 대부분을 함유한다. 따라서, 예를들어, 클론 P9 A2의 오메가(Gly)인터페론 유전자의 단편은 다음 구조를 갖는다:

단편 b

단편 b)를 제조하기 위하여 플라스미드 P9 A2를 제한 엔도뉴클레아제 AVAⅡ로 분해한다. 생성된 cDNA삽입체의 크로마토그래피 및 정제후에, 이를 제한 엔도뉴클레아제 Ssu3A 로 다시 분해시키고 목적하는 단편 189bp길이를 크로마토그래피 및 전기용출로 단리시킨다. 그것은 다음 구조를 갖는다:

단편 c

단편 c)를 제조하기 위하여 플라스미드 PER33(참조: E. Rastl- Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983) 및 EP-A-0.115.613을 제한 엔도뉴클레아제 ECORI 및 PVuⅡ 로 2회 분해시킨다. 아가로즈 겔 분별법 및 정제에 의해 얻어지고, Trp프로모터, 리보좀성 결합 부위 및 출발 코돈을 함유하는 단편 389bp길이를 그후에 Ssu3A 로 분해시킨다. 아가로즈 겔 전기용동, 전기용출 및 엘푸팁(elutip)칼럼 정제에 의해 목적하는 단편 108bp길이를 수득한다. 그것은 다음 구조를 갖는다:

단편 b와 c의 연결:

단편 b와 c를 T4 라가제로 연결하고, 효소를 파괴시킨 후에 HindⅢ로 절단한다. 이 연결 단편은 다음 구조를 갖는다:

선택적으로, 플라스미드 PRHW 10의 제조에 필요한 이 DMA단편은 또 한 두 개의 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오티드를 사용하므로써 제조될 수 있다: 식 5'-AGCTTAAAGATGTGT-3'의 올리고 뉴클레오티드는 그의 5'말단에서 탈인산화 된다.

식 5'-AGCTTAAAGATGTGT-3'의 올리고 뉴클레오티드는 그의 5'말단에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 ATP에 의해 인산화 된다.

이 두 개의 올리고 뉴클레오티드가 하이브리드화되는 경우에는, 다음의 짧은 DNA 단편이 얻어진다:

이것은 한쪽 말단에 HindⅢ에 의한 5' 중복을 나머지 다른 말단에 Sau3A 에 의한 5' 중복을 생성한다.

단편 b)를 송아지의 장관 포스파라제를 사용하여 탈인산화시킨다. 단편 b) 및 상기 기술된 단편을 혼합하여 T4리가제로 결합시킨다. 리가제는 5'-포스페이트를 함유하는 말단을 적어도 하나 필요로 하기 때문에, DNA의 합성조각을 단편 b)에 결합시킬 수 있거나 또는 2개의 합성 단편을 그들의 Sau3A말단에서 연결시킬 수 있다. 생성된 두 개의 단편은 길이가 다르기 때문에, 이들은 선택적 이소프로파놀 침전법으로 분리될 수 있다. 정제된 단편을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 ATP를사용하여 인산화 시킨다.

Ⅱ. 발현 플라스미드의 제조

a) 플라스미드 PRHW 10의 제조:발현 플라스미드 PER103(E. Rastl- Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983) 및 EP-A-0.115.613, DSM에 기탁됨 기탁번호: 2773)를 HindⅢ에 의해 직선화하고 이어서 송아지의 장관 포스파타제로 처리한다. 수득된 DNA를 단리 및 정제한 후에, 탈인산화시키고, 이어서 연결된 단편 b및 c와 연결한다(이들을 HindⅢ로 분해한 후에)이어서 생성된 연결 혼합물로 이·콜라이 HB101을 형질전환시키고 50㎍/㎖의 암피실린이 든 LB한천상에서 배양시킨다. 목적하는 구조를 갖는 플라스미드를 PRHW 10(제 6도 참조)이라 하며 복제시킨 후에 다른 플라스미드를 제조하기 위한 중간체로서 사용하였다.

b) 플라스미드 PRHW 12의 제조 : DNA 플리머라제 I의 클레노우 단편 및 4데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 BamHI으로 절단된 플라스미드 PRHW 10에 가한다. 인큐베이션 후에 수득된 직선화-블런트 엔드 플라스미드를 정제하고 이어서 NCOⅠ으로 절단한다. 아가로즈 겔 전기영동;전기용출 및 엘루팁 정제(Messrs Schle, cher 및 Schuell 의 엘푸팁 칼럼으로 수행된)에 의해 수득된, 보다 큰 단편을 단편a와 연결한다. 이어서 연결 혼합물로 이·콜라이 HB101을 형질전환시키고 50㎍/㎖의 암피실린이 든 LB한천상에서 배양시킨다. 이 구조를 갖는 플라스미드를 목적하는 오메가(Gly)인터페론을 발현하는 PRHW 12라 하였다(제 6도 참조). 예를들어, 수득된 1ℓ의 인큐베이션된 세균배양물(광학 밀도: 600nm에서 0.6)은 1×10⁶Iu의 인터페론을 함유한다.

c) 플라스미드 PRHW 11의 제조 : DNA폴리머라제Ⅰ의 클레노우 단편 및 4 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 BamhⅠ으로 절단된 플라스미드 PRHW 10에 가한다. 인큐베이션후에 수득된 블런트 엔드 플라스미드를 정제하고 이어서 NCOⅠ으로 절단한다. 아가로즈 겔 전기영동;전기용출 및 엘루팁 정제에 의해 수득된 보다 큰 단편을, 아미노산 (Gly)를 코드화하는 GGG코돈만이 GAG코돈(Glu)으로 대치된 플라스미드 E76 E9로부터 유사하게 수득된 단편 a)와 연결한다. 그 후에 생성된 연결혼합물로 이·콜라이 HB101을 형질전환시키고 LB한천상에서 배양시킨다. 목적하는 구조를 갖는 플라스미드를 목적하는 오메가(Glu)인터페론을 발현하는 PRHW 11(제 6도 참조)라 부른다.

세포를 벡터로 형질전환시키는 것은 다수공정에 의해서 영향을 받을 수 있다. 예를들어, 칼슘에 의해 수행될 수도 있는데, 이것에는 세포를 마그네슘중에서 세척하고 DNA를 칼슘중에 현탁된 세포에 가해주거나 세포를 DNA 및 인산칼슘의 공침전물에 노출시키는 것이 포함된다. 유전자 발현에 따라, 세포를 형질전환체가 선택되는 배지상에 피복한다. 숙주의 적절한 형질전환, 그 안의 유전자의 발현 및 IFN-오메가가 발현되는 조건하에서의 발효 또는 배양후에, 생성물을 통상적으로 공지의 크로마토그라피 분리공정으로 추출하여 서열을 이끌거나 추적함이 없이 IFN-오메가를 함유하는 물질을 수득한다. IFN-오메가는, 몇가지 숙주세포에서는 제거될 수 있는, 그의 N-말단에서 선두서열을 발현할 수 있다(프리(pre)-IFN-오메가를 수득함). 제거하지 않는 경우에는 선두 폴리펩타이드(존재하는 경우에)를 분리하여 증식 IFN-오메가를 수득할 수 있다. 또한 IFN-오메가 클론을 증식 프로테인이 pre-IFN-오메가 대신 미생물중에서 직접 생성되는 그와같은 방법으로 변형시킬 수 있다. 이 관점에 있어서, 융합 프로테인의 정확한 증식을 위해, 생성물의 성장 배지 또는 의질 공간으로의 분비를 위해 효모교배형 MF-α-1의 전구체 서열이 사용될 수 있다. 작용성 또는 증식 IFN-오메가에 상응하는 DNA서열을 개시 코돈 ATG(Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943(1982))으로부터 256위치에서 추정된 카렙신-양(like)절단 부위(lys-arg 이후의)에서 MF-α-1에 결합시킬 수 있다. 그들의 생물학적 작용을 바탕으로하여 본 발명에 따른 신규한 인터페론은 공지의 인터페론이 사용되었던 특정한 상태의 치료에 적합하다. 이들에는 허피스 리노바이러스, 기회주의적 AIDS감염, 암과 같은 상태가 포함된다. 본 발명의 신규한 인터페론은 그 자체만으로 또는 IFN-α, IL-2, 다른 면역 조절제등과 같은 다른 공지의 인터페론 또는 다른 생물학적으로 활성인 생성물과 병용하여 사용될 수 있다. IFN-오메가는 항 종양 또는 항바이러스치료를 필요로하는 환자에 그리고 면역 억제상태를 나타내는 사람들에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 용량 및 용법은 IFN-α물질의 임상 연구가들이 최근 사용하는 용법 및 용량, 예를들어 1일 약(1-10)×10⁶단위 및 순도가 1% 이상인 물질의 경우에는 1일 5×10⁷단위까지에 맞출 수 있다. 비 경구형의 본질적으로 균질한 세균성 IFN-오메가에 적합한 제형의 한 예로서, 3㎎ IFN-오메가를 25㎖의 5N 인체 혈청 알부민중에 용해시키고, 이 용액을 세균학적 필터에 통과 시킨 후, 여과된 용액을 무균적으로 100바이알에 분배시키면, 각각은 비 경구 투여에 적합한 6×10⁶단위의 순수한 IFN-오메가를 함유할 수 있다. 그 바이알은 사용전에는 냉소(-20℃)에 보관하는 것이 좋다.

본 발명의 화합물을 공지의 방법에 따라 제형화하여 약제학적으로 유용한 조정물을 제조할 수 있으며, 이때 그의 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체 비이클(Vehicle)과 혼합된다. 적절한 담체 및 그들의 제형은 Remington's Pharmaceuticol Sciences (E,W Martin)에 밝혀져 있다. 환자에 효과적으로 투여할 수 있는 약제학적으로 허용되는 조성물을 제조하기 위하여 IFN-오메가를 적당의 비이클과 함께 혼합한다. 투여 방법은 비경구투여가 바람직하다.

다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하고 있으며, 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

IFN-서열-특정 클론 발견

a) cDNA의 제조

센다이(Sendai)-바이러스로 자극된 세포에서 얻어지는 mRNA를 출발물질로 사용하여 문헌(E. Dworkin-Rastl et al., Journal of Interferon Research Vol 2/4, 575-583(1982))에 공지된 방법에 따라 cDNA을 제조한다. 수득되는 30,000클론을 개별적으로 마이크로리터 평판의 통으로 옮긴다. 다음 배지를 사용하여 콜로니를 증식 및 동결시킨다.

10g 트립톤 5g 효모추출물

5g NaCl 0.51g Na시트레이트×2H₂O

7.5g KH₂PO₄×2H₂O 1.8g KH₂PO₄

0.09g MgSO₄×7H₂O 0.9g (NH₄)₂SO₄

44g 글리세린 0.01g 테트라사이클린×Hcl

1ℓ H₂O를 가함

개개의 클론이 들어있는 마이크로리터 평판을 37℃에서 밤새 인큐베이션 시킨후 -70℃에서 보관한다.

b) 하이브리드화(hybridisation)실험

하이브리드화실험용 출발 물질로서 재조합체 플라스미드 PER33(E. Rastl- Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983)을 사용한다. 이 플라스미드는 증식 인터페론 IFN-α2와 3' 비해독된 부위의 190염기를 코드화하는 부위를 함유한다. 20㎍ PER33을 200㎕ 반응 용액(10nM 트리스-HCL, pH-7.5, 10nM MgCl₂, 1nM 디리오트레이톨(DTT), 50nM NaCl)중의 30단위 HindⅢ 제한 엔도뉴클레아제와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 1/25용적의 0.5M 에틸렌디니트릴로 테트라아세트산(EDTA)을 가하여 반응을 종결시키고 70℃에서 10분간 가열한다. 1/4용적의 5×완충(80% 글리세린, 40nM 트리스 아세테이트 pH 7.8, 50mM EDTA, 0.05% 나트륨 도데실설페이트(SDS), 0.1% 브로모페놀 블루)을 가한 후에, 생성된 단편들을 1% 아가로즈겔 중에서 크기에 따라 전기영동으로 분리한다.

〔겔 및 전기영동 완충액(TBE):10.8g/ℓ 트리스하이드록시메틸아미노-메탄(트리스-염기), 5.5g/ℓ 붕산, 0.93g/ℓ EDTA〕 0.5㎍/㎖에티듐 브로마이드 용액중에서 겔을 인큐베이션시킨 후에 DNA조각을 uv-광선중에서 보이게 한 다음, IFN-유전자-함유 DNA 단편(약800bp 길이)이 함유된 겔부분을 절단해 낸다. 그 DNA를 1/10×TBE 완충액중으로 전기용출시킨다. DNA 용액을 페놀로 1회, 에테르로 4회 추출하고, -20℃에서 1/10 용적 3M 나트륨 아세테이트(NaAc) pH 5.8 및 2.5용적의 수성 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. 원심분리한 뒤, DNA를 70% 에탄올로 세척하고 진공하에서 5분간 건조시킨다. DNA를 50㎕의 물중에 용해시킨다(약 50㎍/㎕).

◎ 형질전환(nick translation)(T. Maniatis et al., Molicular Cloning Ed. CSH에 따라 변형됨)에 의해 그 DNA를 방사적으로 표식한다.

또한 50㎕의 인큐베이션용액에는 다음 성분들이 포함된다: 3단위의 DNA 폴리머라제Ⅰ(이·콜라이)뿐만 아니라, 50nM 트리스(pH-7.8), 5nM MgSO₄10nM 더캅토에탄올, PER33으로부터 얻어지는 100㎎ DNA 삽입물, 16pg DNaseⅠ, 25μM dATP, 25μM dGTP, 20μCi α-³²P-dCTP(〉3,000 ci/m Mol) 14℃에서 45분간 배양시킨다. 1용적 50nM EDTA, 2% SDS, 10nM 트리스(pH=7.6)용액을 가하고 70℃에서 10분간 가열하여 반응을 종결시킨다. 세파덱스 G=100을 사용한 크로마토그라피에 의해 비삽입된 방사능으로부터 상기 DNA를 TE완충액(10nM 트리스 pH=8.0, 1nM EDTA)중으로 분리시킨다. 방사성 표지된 샘플은 약 4×10⁷cpm/㎍의 특정 방사성을 갖는다.

c) IFN-유전자-함유 삽입물에 대한 클론의 스크리닝

마이크로리터 평판의 통중에 동결보관된 세균 배양물을 녹인다(a). 상응하는 크기의 (Schieicher Schull, BA 85, 0.45μm 기공 크기) 니트로셀룰로즈 필터조각을 LB-한천(LB-한천:10g/ℓ 트립톤, 5g/ℓ MgCl, 15g/ℓ 박토한천, 20㎎/ℓ 테트라사이클린-HCl)상에 놓는다. 마이크로리터 평판에 부착된 피스톤을 이용하여 개개의 클론을 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 세균을 37℃에서 밤새 증식시켜 약5mm 직경의 콜로니를 형성시킨다. 세균을 파괴하고 DNA를 변성시키기 위하여, 다음 용액으로 적셔진 와트만 3MM필터더미상에 니트로 셀룰로즈 필터를 번갈아 놓는다:(1)0.5M NaOH에서 8분, (2)1M 트리스(pH=7.4)에서 2분, (3)1M 트리스(pH=7.4)에서 2분 및(4)1.5M NaCl, 0.5M 트리스(pH=7.4)에서 4분. 상기 필터를 공기중에서 건조시키고 이어서 80℃에서 2시간 동안 유지시킨다. 필터를 6×ssc(1×ssc는 0.15M NaCl:0.015M 트리소디움 시트레이트: pH=7.0에 해당한다), 5×덴하르트(Denhardt's)용액(1×덴하르트용액은 0.02% PVP(폴리비닐피롤리돈)에 상응한다); 0.02% 피콜(MG:40,000D); 0.02% BSM(소 혈청 알부민) 및 0.1% SDS(나트륨 도데실설페이트)로 구성된 하이브리드화 용액중 65℃에서 4시간 동안 전처리한다. 만들어지 샘플(b)의 필터당 약1×10⁶cpm을 비등시켜 변성시키고 하이브리드화 용액에 가한다. 65℃에서 16시간 동안 하이브리드화공정을 수행한다. 필터를 3×ssc/0.1% sds로 65℃에서 1시간 동안 4회 세척한다. 필터를 공기중에서 건조시키고, 사란 랩(Sarn Wrap)으로 싸서, 코닥×-오매츠(kodak x-omats)필름상에 노출시킨다.

실시예 2

IFN-유전자-함유 재조합체 플라스미드를 확인하기 위한 사던 전이(Southern transfer) 양성적으로 반응하는 콜로니 또는 양성적으로 반응시킨 그들 콜로니의 5㎖ 배양물을 37℃에서 L-육즙(10g/ℓ 트립톤, 5λ/ℓ 효모 추출물, 5g/ℓ NaCl, 20㎎/ℓ 테트라사이클린×HCl) 중에서 증식시킨다. 비른보임 및 돌리(NuCl, Acid. Res. 7, 1513(1979)에 따른 변형 프로토콜로 플라스미드-DNA를 분리한다. 1.5㎖ 현탁액중의 세포를 원심분리(Eppendorf Centrifuge)시키고 50mM 글루코즈, 10nM EDTA, 25nM 트리스-HCl pH=8.0 및 4㎎/㎖의 라이소자임으로 구성된 100㎕ 라이소자임 용액중에 0⁶c에서 재현탁시킨다. 실온에서 5분간 인큐베이션시킨 후에, 빙냉 0.2M NaOH, 1% SDS용액을 가하고 다시 5분간 인큐베이션시킨다. 이어서 150㎕ 의 빙냉 나트륨 아세테이트 용액(pH 4.8)을 가하고 5분간 인큐베이션시킨다. 침전된 세포 성분을 원심분리시킨다. 이 DNA 용액을 1용적 페놀/CHCl₃(1:1)로 추출한후, 2 용적 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. 원심분리시킨 후에, 거환을 70% 에탄올로 1회 세척하고, 진공하에서 5분간 건조시킨다. 그 DNA를 50㎕(TE)-완충액중에 용해시킨다. 그 양중의 10㎕를 50㎕ 반응용액(10nM 트리스-HCl, pH=7.5, 10nM MgCl2, 50nM NaCl, 1mM DTT)중에서 10단위 PstⅠ-제한 엔도뉴클레아제로 37℃에서 1시간 동안 분해시킨다. 1/4 용적의 5×완충액(실시예 1b)참조)뿐만 아니라 1/25용적의 0.5mM EDTA를 가한 후에, 10분간 가열하고 이어서 1% 아가로즈 겔 (TBE-완충액)중에서 전기영동으로 DNA를 분리한다. 아가로즈 겔중의 DNA를 사던의 방법(E. M. Southern, J. Mol. Biol 98, 503-517(1975))에 따라 아가로즈 겔중의 DNA를 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 이 겔을 1,5M NaCl/0.5M NaOH용액중에서 1시간 인큐베이션시켜 겔중의 DNA를 변성시킨다. 이어서 1M 트리스×HCl pH=8/1.5M MgCl용액으로 1시간동안 중화시킨다. 상기 DNA를 10×ssc(1.5M MgCl, 0.15M 나트륨 시트레이트, pH=7.0)의 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 완전히 옮긴후에(약16시간), 필터를 6×ssc 완충액중에서 간단히 헹구고 이어서 공기중에서 건조시키며; 최종적으로 80℃에서 1시간 동안 구워 말린다. 이 필터를 /5×덴하르트 용액/0.1% SDS(실시예 1c)참조)로 65℃에서 4시간 동안 예비처리한다. 100℃의 온도로 가열하여 약 2×106cpm의 하이브리드화 샘플 (실시예 1b)참조)을 변성시키고 이어서 하이브리드화 용액에 가한다. 이어서 필터를 3×ssc/0.1% sds용액으로 65℃에서 1시간씩 4회세척한다. 공기-건조시킨 후에, 필터를 사란 랩

으로 덮고 코닥×-오매츠

필름상에 노출시킨다.

실시예 3

클론 E76 E9에서의 인터페논 활성의 검출

클론 E76 E9의 100㎖ 배양물으 A₁₀₀=0.8의 광학 밀도까지 37℃에서 L-육즙(10g/ℓ 트립톤, 5g/ℓ 효모 추출물, 5g/ℓ NaCl, 5g/ℓ 글루코즈, 1ℓ당 20㎎ 테트라사이클린×HCl) 중에 배양시킨다. 세균을 7,000rpm에서 10분간 원심분리시키고, 50mM 트리스×HCl pH=8.0, 30mM NaCl 용액으로 1회 세척한 뒤 1.5㎖ 세척용액중에 재현탁시킨다. 1㎎/㎖의 라이소자임과 함께 0℃에서 1시간 반 동안 인큐베이션시킨후에, 세균 현탁액을 동결시키고 5분간 녹인다. 4,000rpm에서 1시간 동안 원심분리시켜 세포를 펠릿화한다. 상등액을 멸균 여과시키고 인터페론 활성을 실험한다. 이용된 실험은 V3세포 및 소포성 위염 바이러스(G. R. Adolf et al., Arch. Virol 72, 169-178(1982))를 이용한 반점 감소 테스트(Plaque Reduction Test)이다. 놀랍게도, 클론은 개시 배양물 ℓ당 인터페론을 9,000 Iu 까지 생성한다.

실시예 4

새로운 서열과 관련된 유저자의 수를 측정하기 위한 제놈성 사던 블럿(Genomic Southern Blot)

a) 나말와(Namalwa)세포로부터 DNA를 분리함

400㎖ 의 나말와 세포 배양물을 JA21원심분리기에서 1,000rpm 로 원심분리시켜 세포를 펠릿화한다. 생성된 펠릿을 NP40 완충액(NP40 완충액:140mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 10mM 트리스/Cl pH=7.4)중에 재현탁시키고 다시 1,000rpm에서 펠릿화 시키므로써 세밀하게 세척한다. 수득된 펠릿을 다시 20㎎/ℓ의 NP40 완충액중에 현탁시키고 1㎖ 의 10% NP40 용액과 혼합하여 세포 벽을 파괴시킨다. 빙욕중에서 5분간 정치시킨후에 접촉 세포 핵을 1,000rpm에서 원심분리시켜 펠릿화하고 상등액은 폐기한다. 세포 핵을 50mM 트리스/Cl pH=8.0, 10mM EDTA 및 200mM NaCl로 구성된 10㎖의 용액중에 재현탁시키고, 이어서 1㎖의 20% SDS를 가하여 프로테인을 제거한다. 생성된 점성 용액을 동일한 양의 페놀로(10mM 트리스/Cl pH=8.0로 포화된), 2회 세척하고 크로로포름으로 2회 세척한다. 에탄올을 가하고 원심분리시켜 DNA를 침전시킨다. 이어서 생성된 DNA 펠릿을 70% 에탄올로 1회 세척하고, 진공하에서 5분간 건조시킨후 6㎖ 의 TE 완충액(TE 완충액:10mM 트리스/Cl pH=8.0 1mM EDTA)중에 용해시킨다. DNA의 농도는 0.8㎎/㎖이다.

b) 나말와 세포로부터 얻어진 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 분해공정은 제조업자(뉴 잉글랜드 바이오 랩스)에 의해 특정화된 조건에 따라 수행한다. 1㎍의 DNA를 10㎕ 용적중의 2단위의 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 37℃에서 2시간 이상 분해시킨다. ECORI, HindⅢ, BamHⅠ, SphⅠ PstⅠ 및 ClaⅠ을 제한 엔도뉴클레아제로서 사용한다. 각 분해 공정에 20㎍의 DNA를 사용한다. 분해공정이 완결되었는지를 모니터하기 위해, 10㎕(분취량)를 반응을 시작할 때 따로 취하여 0.4㎍의 람다 파지-DNA와 혼합한다. 2시간 인큐베이션시킨 후에, 이들 분취량부분을 아가로즈 겔 전기영동법으로 모니터하고, 분해의 완결은 염색된 람다 파지 DNA단편의 보조로 정한다. 이러한 체크를 한 다음에, 20mM의 최종 농도까지 EDTA를 가하고 용액을 70℃에서 10분간 가열하므로써 반응을 중단시킨다. 0.3M NaAc (pH=5.6) 및 2.5 용적의 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. -70℃에서 30분 인큐베이션시킨 후에, DNA를 에펜도르프(Eppendorf)원심분리기중에서 펠릿화하고, 70% 에탄올로 1회 세척하고 건조시킨다. 생성된 DNA를 30㎕의 TE 완충액중에 취한다.

c) 겔 전기영동법과 사던 전이

분해된 DNA샘플을 그들의 크기에 따라 TBE 완충액(10.8g/ℓ 트리스염기, 5.5g/ℓ 붕산, 0.93g/ℓEDTA)중의 0.8% 한천 겔중에 분별시킨다. 이를 위해, 15㎕의 DNA샘플을 4㎕의 완충액(0.02% SDS, 5×TBE 완충액, 50mM EDTA, 50%글리세린, 0.1% 브로모페놀 블루)과 혼합하고 70℃로 간단하게 가열한 다음 겔중에 예비된 통에 넣는다. ECORI 및 HindⅢ로 절단되 람다-DNA를 상응하는 통에 각각 넣고, DNA 크기에 대한 마커로서 사용한다. 겔 전기영동은 약 1v/㎝에서 24시간 동안 수행한다. 이어서 사던 법(Southern Schuell, BA 85) 및 1×ssc:150mM 트리소디움 시트레이트, 15mM NaCl, pH=7.0)를 이용하여 DNA를 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 주위온도에서 필터를 건조시킨 후에, 80℃로 2시간 동안 가열하여 DNA를 필터에 고정시킨다.

d) 하이브리드화 탐색침(probe)

20㎍의 플라스미드 P9 A2를 AvaⅡ로 절단하여, cDNA 전체 삽입물을 함유하는 약1100bp길이의 단편을 생성시킨다. 이 DNA단편을 다시 Sau3A 및 AluI으로 절단하고 전기용출 및 엘루팁 칼럼 크로마토그라피에 의한 아가로즈 겔 전기영동 (제 5b도 참조)후에 가장 큰 DNA단편을 분리시킨다. 생성된 DNA (1.5㎍)을 15㎕의 물에 용해시킨다. 20㎍의 플라스미드 PER33을 HindⅢ로 절단하고, IFN-α2-Arg용의 이 발현 플라스미드((E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983))를 2회 절단한다. 보다 작은 DNA단편은 인터페론-α2-Arg의 유전자를 함유하며, 플라스미드 P9 A2와 동일한 방법으로 분리된다.

피. 더블유. 제이. 릭바이동(Rigby et al.)이 제안한 방법을 이용하여 (J. Mol Biol. 113,237-251(1977)) DNA 모두를 닉 형질전환시킨다. 닉 형질전환은 1×닉 완충액: 50mM 트리스/Cl, pH=7.2, 10mM MgSO₄, 0.1mM DTT 50㎍/㎖ BSA), 각각 100μmol 의 dATP, dGTP 및 dTTP, 150μci α-³²P-dCTP(아더샴, 3000ci/mMol) 및 5단위의 DNA폴리머다제Ⅰ(베링거-만하임, 닉 형질전환 성질)으로 구성된 50㎕의 용액중에서 0.2㎕의 DNA와 함께 수행한다. 14℃에서 2시간 후에 동일양의 EDTA용액(40mMol)을 가하여 반응을 중지시키고 비반응된 방사성 물질을 TE 완충액중의 G50칼럼 크로마토그라피를 이용하여 분리한다. 잔유하는 특정 방사능은 약100×10⁶cpm/㎍ DNA 이다.

e) 하이브리드화 및 방사선 자동 사진법

니트로셀룰로즈 필터를 두조각으로 자른다. 각각의 반쪽은 실시예 4a에서 언급된 제한 효소로 처리된 나말와 DNA와 동일한 조의 미량원소를 함유한다. 상기 필터를 6×ssc, 5×덴하르트, (1×덴하르트:0.02% 소 혈청 알부민(BSA), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈(PVP), 0.02% 필콜 400), 0.5% SDS, 0.1㎎/㎖의 변성된 소 타이무스 DNA 및 10mM EDTA를 함유하는 용액중, 65℃에서 2시간 동안 프리(pre)-하이브리드화시킨다. 하이브리드화는 6×ssc, 5×덴하르트, 10mM EDTA, 0.5% SDS 및 약10×10⁶cpm 의 닉 형질전환된 DNA로 구성된 용액중, 65℃에서 16시간 동안 수행한다. 필터의 1/2을 인터페론-α2-Arg-DNA로 하이브리드화시키고 다른 절반은 폴라스미드 P9 A2 로부터 단리된 인터페론-DNA로 하이브리드화시킨다. 하이브리드화후에, 모든 필터를 주위 온도에서 2×SSC 및 0.1% SDS로 구성된 용액으로 4번 65℃에서 45분간 0.2×SSC 및 0.01% SDS로 구성된 용액으로 2번 세척한다. 이어서 필터를 건조시키고 코닥×-오매츠 에스 필름에 노출시킨다.

실시예 5

발현 플라스미드 PRHW12 및 PRHW11의 제조개요:

발현 플라스미드의 제조는 제 6도에 설명되어 있으며, 또한 모든 제한 효소 분해는 효소 제조업자의 지시에 따라 수행한다.

a) 플라스미드 PRHW10의 제조

100㎍ 의 플라스미드 P9 A2를 100단위의 제한 엔도뉴클레아제 Ava Ⅲ(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 분해한다. 분해후에, 70℃로 가열하여 효소를 불활성화시키고, 수득된 단편을 TBE 완충액(TBE 완충액:10.8g/ℓ 트리스염기, 5.5g/ℓ 붕산, 0.93g/ℓEDTA)과 함께 1.4% 아가로즈 겔상에서 그들의 크기에 따라 분별시킨다. 전체 삽입물을 함유하는 밴드를 전기 용출시키고 엘루팁칼럼(Scheicher Schuell)을 이용하여 정제한다. 수득된 20㎍ 중에서, 6㎍을 추가로 제한 효소 Sau3a (총 100㎕ 용액중 20단위)로 분해한다. TBE 완충액중의 2% 아가로즈 겔을 사용하여 단편을 분리한다. 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색한 후에 189bp길이의 DNA단편을 전기용출시키고 상기에 기술된 바와 같이 정제시킨다(제6도중의 단편b).

인터페론 유전자를 프로모터, 리보좀성 결합부위 및 출발코돈과 연결시키기 위하여, 상응하는 DNA단편을 발현 플라스미드 PER33(E. Rastl- Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983))으로부터 단리시킨다. 이를 위해, 50㎍ PER33을 제한 효소 ECORI 및 PVuⅡ 로 2회 분해시키고, 생성된 단편을 TBE 완충액중의 1.4% 아가로즈 겔상에서 그들의 크기에 따라 분별시킨다. 389bp길이이고, Trp프로모터, 리보좀성 결합 부위 및 출발 코돈을 함유하는 DNA단편을 전기용출시키고 엘루팁칼럼을 사용하여 정제시킨다. 이어서 수득된 단편을 Sau3A 로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동법, 전기용출 및 엘루팁 칼럼 정제에 의해 목적하는 단편 108bp를 약 100㎎(제6도중의 단편c)으로 수득한다. 50mM 트리스/Cl, pH=7.5, 10mM MgCl₂, 1mM DTT 및 1mM ATP를 함유하는 용액중의 10단위 T4리가제를 사용하여 20㎎의 단편b를 40㎖ 용적중의 20㎍의 단편 c와 14℃에서 18시간 동안 연결시킨다. 이어서 70℃로 가열하여 효소를 파괴시키고 생성된 DNA를 총 50㎕ 용적중에서 HindⅢ로 절단한다.

10㎍의 발현 플라스미드 PER103(E. Rastl- Dworkin et al., Gene 21, 237-248(1983))를 총용적 100㎕ 중에서 HindⅢ로 직선화한다. 37℃에서 2시간 후에 1용적의 2×포스파타제 완충액(200mM 트리스/Cl, pH=9.2, 0.2mM EDTA)를 1단위의 소의 장관포스파타제(CIP)와 함께 가한다. 45℃에서 30분후에, 추가로 1단위의 CIP를 가하고 인큐베이션을 30분간 계속한다. 수득된 DNA를 페놀로 2회, 클로로포름으로 1회 추출하고 0.3M 나트륨 아세테이트(pH=5.5) 및 2.5용적의 에탄올을 가하여 침전시키므로써 정제 시킨다. 이어서 탈인산화시켜 다음 연결 단계 동안에 벡터가 다시연결되는 것을 막는다. 100㎎의 직선화 PER103 및 연결된 단편 b 와 c(HindⅢ 분해후에)를 리가제 완충액을 함유하는 100㎕의 용액에 가하고 Td-DNA 리가제를 사용하여 14℃에서 18시간 동안 연결시킨다.

200㎕의 콤피턴트 이·콜라이 HB101(E. Dworkin et al.,Dev. Biol. 76, 435-448(1980))을 20㎕의 연결혼합물과 혼합시켜 빙상에서 45분간 인큐베이션시킨다. 이어서 40℃에서 열쇽을 2분간 취하여 DNA를 완전히 흡수시킨다. 세포 현탁액을 빙상에서 추가로 10분간 인큐베이션시키고 최종적으로 50㎎/ℓ 암피실린이 함유된 LB한천(10g/ℓ트립톤, 5g/ℓ NaCl, 효모 추출물, 5g/ℓ, 1.5% 한천)에 적용한다. 수득된 24생성콜로니중에 함유된 플라스미드를 비른보임 및 돌리의 방법(참조:NuCl, Acid. Res. 7, 1513(1979)을 이용하여 단리시킨다. 여러 가지 제한 효소로 분해시킨 후에 하나의 플라스미드는 목적하는 구조를 갖는다. 이것을 PRHW10(제 6도참조)으로 명명한다.

b) 플라스미드 PRHW12의 제조

약 10㎍의 플라스미드 PRHW10을 BamH으로 절단한다. 이어서 DNA를 폴리머라제Ⅰ의 클레노우 단편 및 4데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 가하고 주위 온도에서 20분간 인큐베이션시킨다. 수득된 직선화 및 직선-종결된 플라스미드를 페놀 추출 및 침전에 의해 정제시키고 이어서 100㎕ 용적중의 제한 엔도뉴클레아제 NCOⅠ로 절단한다. 보다 큰 단편은 아가로즈 겔 전기영동법, 전기용출 및 엘푸팁 칼럼 정제에 의해서 얻어진다. P9 A2-cDNA삽입물(상기 참조)을 함유하는 4㎍의 Ava Ⅱ 단편을 NCOⅠ 및 AluⅠ으로 분해시켜 약 2㎍의 단편 a)(제 6도 참조)를 수득한다.

최종 연결 단계에서, 가해진 BamHI/NCOⅠ으로 2회 분해된 단편 a) 및 PRHW10을 10㎎의 각각의 DNA를 사용하여 10㎕ 용적중에서 연결시킨다. 충진된 BamHI 절단부위를 AluⅠ에 의해 절단된 DNA에 연결하면 BamH 절단부위가 복원된다. 생성된 연결 혼합물로 전술한 바와같이 콤피턴트 이·콜라이 HB101을 형질전환시킨다. 수득된 40콜로니중에서, 하나를 선택하여: 이것을 PRHW12라 명명한다.

그 플라스미드를 단리하고 Sanger의 방법(F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci 74, 5463-5467(1979))을 이용하여 ECORI /BamHI삽입물을 서열화한다. 이것이 목적하는 서열이다.

c) 플라스미드 PRHW11의 제조

이 공정은 실시예 5b와 유사하게 수행한다. 1㎍의 플라스미드 PRHW10을 BamH으로 분해한다. 생성된 DNA의 점성 말단(Sticky end)을 폴리머라제Ⅰ의 클레노우 단편 및 4데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 사용하여 블런트 엔드(blunt end)가 되게하고 이어서 직선화 DNA를 NCOⅠ로 절단한다. 보다 큰 단편을 아가로즈 겔 전기영동법, 전기용출 및 엘푸팁 칼럼 크로마토그래피에 의해 수득한다.

NCOⅠ/AluⅠ 단편을 실시예 5b와 유사하게 클론 E76 E9로부터 분리한다. 이어서 10㎎의 벡터부를 1단위의 T4리가제를 사용하여 적절한 조건하에서 10㎕ 용적중의 10㎎ 의 cDNA부와 연결한다. 이·콜라이 HB101중에서 생성된 DNA혼합물의 형질질환 및 암피실린을 함유하는 LB평판상에서의 45 생성된 콜로니의 선택후에, PRHW11이라 명명된 클론을 선택한다. 상응하는 클론을 배양시킨후에 플라스미드 DNA를 분리한다. 그의 구조는 여러 가지 특정 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(AluⅠ, ECORI, HindⅢ, BamHⅠ, SphⅠ PstⅠ)에 의해서 확인된다.

d) 플라스미드 PRHW12를 함유하는 이·콜라이 HB101에 의한 인터페론 활성의 발현 100㎖의 세균배양물을 트립토판(아미노산 ㎖당 20㎍), 1㎍/㎖의 티아민, 0.2% 글루코즈 및 트립토판 오페론의 유도체인 20㎍/㎖의 인돌-(3)-아크릴산(IAA)을 제외하고 다른 모든 아미노산을 함유하는 M9최소 배지중에서 600nm에서 0.6의 광학 밀도까지 인큐베이션시킨다. 이어서, 세균을 원심분리(7000rpm에서 10분간)시켜 펠릿화하고, 50mM 트리스/Cl pH=8, 30mM MaCl로 1회 세척한 다음, 최종적으로 1.5㎖ 의 동일한 완충액에 현탁시킨다. 빙상에서 1㎎/㎖의 하이소자임과 함께 30분 인큐베이션시킨 후에, 세균을 동결시키고 5시간 녹인다. 40,000rpm 의 속도로 1시간 원심분리하여 세포 부스러기를 제거한다. 상등액을 멸균 여과하고 인체 A 549 세포 및 심근염 바이러스를 이용한 반점 감소 검정법으로 인터페론 활성을 실험한다.

결과: 생성된 세균 배양물 1ℓ는 1×10⁶Iu의 인터페론을 함유한다.(A, Billiau, Antiviral Res 4075-98(1984))

실시예 6

I형 인터페론들의 아미노산과 뉴클레오티드 서열사이의 차이점의 요약

a) 아미노산 서열의 비교

아미노산 서열의 페어식(pairwise)비교는 증식 α-인터페론의 첫 번째 시스테인 잔기를 플라스미드 P9 A2 및 E76 E9의 cDNA 삽입물에 의해 코드화되는 아미노산 서열의 첫 번째 시스테인 잔기와 일렬로 나열시키므로써 이루어진다. 얻어진 값에 있어서 P9 A2 또는 E76 E9클론의 특정 서열 사이에서 차이점을 발견할 수 없었으므로 이 두 개의 서열을 IFN-오메가로서 제 7도에 나타낸다. 정정한 것은 오직, 잘못 짝지은 것으로서 기록된 인터페론-αA 의 45위치에 갭을 삽입하는 것이었다. 오메가-인터페론의 서열이 상대가되는 경우에는, 통상 166개 아미노산을 참고하여 비교한다. 이 값은 클론 P9 A2 또는 E76 E9에 의해 코드화되는 추가의 6개의 아미노산과 함께 제 7도에 나타낸다. %차이는 그 차이를 1.66의 수로 나누어주므로써 얻어진다. 따라서 추가의 아미노산은 0.6%를 나타낸다. 이것은 그 %에 이미 함유된 IFN-오메가에 6개 추가 아미노산에 대해서는 3.6%이다.

β-인터페론과의 비교는 증식 β-인터페론의 3번째 아미노산을 증식 α-인터페론의 첫 번째 아미노산 또는 폴라스미드 P9 A2 또는 E76 E9에 의해 코드화되는 첫 번째 시스테인과 일렬로 나열시키므로써 이루어진다. α-인터페론의 구조와 β-인터페론의 가장 긴 비교 구조는 162 아미노산 이상이며, 이는 α-인터페론과 β-인터페론 각각에 대해 2개의 아미노산이 추가된다.

이들은 에러로서 기록되며 제 7도에서 따로 나타내지나 %에는 포함된다. β-인터페론의 클론 P9 A2 또는 E76 E9의 아미노산 서열과의 비교는 동일한 방법으로 수행한다. 그러나, 이들은 총 10개의 아미노산이 추가된다.

b) 뉴틀레오티드 서열의 비교

비교 하고자하는 서열을 실시예 6a와 유사하게 열거한다. 증식 α-인터페론의 DNA의 첫번째 뉴틀레오티드는 시스테인을 코드화하는 증식 α-인터페론의 트리플렛의 첫번째 뉴클레오티드이다. 플라스미드 P9 A2 또는 E76 E9의 DNA의 첫번째 뉴클레오티드는 또한 시스테인-1을 위한 코돈의 첫번째 뉴클레오티드이다. α-인터페론의 개개의 DNA를 β-인터페론의 DNA와 비교할 경우에는 총 498 뉴틀레오티드 이상에서, 개개의 α-인터페론 또는 β-인터페론의 DNA서열을 플라스미드 P9 A2 또는 E76 E9의 DNA 서열과 비교할 경우에는 516뉴틀레오티드 이상에서 비교한다. 갭의 절대수는 제 7도 표의 좌측에 주어지며 이어서 상응하는 %를 괄호안에 표시한다.

실시예 7

오메가-1-mRNA 및 NC 37세포의 바이러스-유도성발현

a) 오메가-인터페론 특정 하이브리드화 탐색침(hybridizaticn probe)의 합성

10pMol의 올리고 뉴클레오티드d(TGCAGGGCTGCTAA)를 12pMol의 감마-32P-ATP(특정 활성:〉5000ci/밀리몰) 및 총 용적 10㎕(70mM 트리스/cℓ) pH=7.6, 10mM MgCl₂, 50mM DTT)중의 10단위 폴리뉴클레오티드키나제와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 정치시킨다. 이어서 70℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 생성된 방사성 표지된 올리고 뉴클레오티드를 50℃에서 1시간 동안 정치시키므로써 총용적 35㎕(100mM NaCl)중의 5pMol의 M13pRHW 12SSDNA(제9도 참조)로 하이브리드화시킨다. 주위 온도로 냉각시킨후에, 닉 혈질전환 완충액, 4데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 10단위의 클레노우 폴리머라제를 가하여 총용적 50㎕가 되게한다.(50mM 트리스/Cl pH=7.2, 10mM MgCl₂, 50㎍/㎖ BSA, 뉴클레오티드 당 1㎖). 주위온도에서 1시간동안 정치시키므로써 폴리머화 공정을 수행하고 이어서 70℃에서 5분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 이 반응에서, 부분적으로 이중 나선의 DNA가얻어진다. 이어서 이것을 시판중인 완충액을 사용하여 25 단위의 Ava Ⅱ로 총용적 500㎕가 되게 절단한다. 이중나선 부분을 일정한 크기로 절단한다. 이어서, 70℃에서 5분간 가열하여 반응을 중단시킨다.

b) 바이러스 감염된 세포로부터 RNA의 제조

100×10⁶세포(0.5×10⁶/㎖)를 100pMol의 덱사메타손으로 48내지 72시간동안 처리한다. -대조그룹은 덱사메타손을 함유하지 않는다. 인터페론을 유도하기위하여, 세포를 5×10⁶/㎖ 농도중의 혈처이 들어있지 않은 배지레 현탁시키고 2¹⁰단위/㎖의 센다이 바이러스(Sendai Virus)로 감염시킨다.

세포 배양 상등액의 분취량을 취하여 반점 감소 검정법(실시예5b)으로 IFN활성을 실험한다. 바이러스 감염후 6시간만에 원심분리(1000g, 10분)하여 세포를 모으고, 50㎖의 NP40완충액(실시예4a)중에서 세척하여 빙냉 NP40완충액중에 재현탁시킨후 빙상에서 0.5㎖의 10% NP40을 5분간 가하여 용해시킨다. 원심분리(1000×g, 10분)로 핵을 제거한 후에, 상등액을 50mM 트리스/Cl, 0.5% 사코신 및 5mM EDTA에 의해 pH=8로 조절하고 이어서 -20℃에서 보관한다. 상등액으로부터 총 RNA를 분리하기 위하여, 페놀로 1회, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 1회 그리고 클로로포름/이소아밀 알코올로 1회 추출한다. 수상을 4㎖의 5.7몰 CsCl 완충물의 상부로 옮기고 SW40 회전자(35krpm, 20시간)중에서 원심분리하여 DNA 및 잔유 프로테인으로부터 추출물을 유리시킨다. 생성된 RNA펠릿을 2㎖의 TE(pH=8.0)중에 재현탁시키고 에탄올로 침전시킨다. 이어서 침전된 RNA를 5㎎/

㎖의 농도에서 물중에 용해시킨다.

c) 인터페론-오메가 mRNA의 검출

실시예7a에서 제조된 0.2㎕의 하이브리드화 탐색침을 실시예 7b에 따라 제조된 20내지50㎍의 RNA와 함께 에탄올을 가하여 침전시킨다. 대조 실험에서, 세포성 RNA 대신에, 전달 RNA(tRNA)또는 플라스미드 PRHW 12(실시예5)로 형질전환된 이·콜라이로부터 유래된 RNA를 가한다. 생성된 펠릿을 70% 에탄올로 세척하여 염을 제거하고, 건조시킨후 25㎕의 80% 포름 아마이드(100mM PIPES pH=6.8, 400mM NaCl, 10mM EDTA)중에 용해시킨다. 이어서 샘플을 100℃로 5분간 가열하여 하이브리드화 샘플을 변성시키고, 직접 52℃로 조절하여 이 온도에서 24시간동안 인큐베이션시킨다. 하이브리드화 공정후에, 샘플을 빙상에 놓고 475㎕의 s1반응 혼합물(4mM Zn(Ac)₂, 30mM NaAc, 250mM NaCl, 5%글리세린, 20㎍ SS 소 타이무스 DNA, 100단위 S1뉴클레아제)를 가한다. 37℃에서 1시간 동안 분해시킨 후에 에탄올로 침전시켜 반응을 중단시킨다. 펠릿을 6㎕ 포름아마이드 완충액중에 용해시키고 8M 우레아를 함유한 6% 아크릴아마이드 겔상의 DNA서열화 반응으로부터 샘플과 같이 본질적으로 분리한다(F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. sci. 74, 5463-5467(1979)).

방사선 자동 사진을 위하여, 건조 겔을 -70℃에서 코닥라느브 조절증감스크린(Kadak Lanev reqular intensifying screen)를 사용하여 듀퐁 크로넥스 X-선 필름에 노출시킨다.

제 10도와 관련된 설명

자취A:20㎍ tRNA

자취B:P^ER33으로부터 분리된 10㎍ RNA(이·콜라이-인터페론-α2-Arg의 발현 균주)

자취C:P^RHW12로부터 분리된 1㎎ RNA(인터페론-오메가1을 위한 이·콜라이 발현 균주)

자취D:비처리된 나말와세포로부터 분리된 50㎍ RNA

자취E:바이러스-감염된 나말와세포로부터 분리된 50㎍ RNA

자취F:덱사메타손으로 전처리되고 바이러스로 감염된 나말와세포로부터 분리된 50㎍ RNA

자취G:비처리된 NC 37 세포로 부터 분리된 50㎍ RNA

자취H:바이러스 감염된 NC 37 세포로 부터 분리된 50㎍ RNA

자취I:덱사메타손으로 전처리되고 바이러스로 감염된 NC 37 세포로 부터 분리된 20㎍ RNA

자취M:크기 표식화(P^BR322를 HinfⅠ로 절단)

자취B와C는 기대하는 시그날이 오메가1의 특정 RNA가 RNA분자중에 존재하는 경우에만 검출되는 것을 보여준다. 자취 B와C는 또한 거대 초과량의 잘못된 RNA조차도 배경 시그날을 일으키지 못함을 보여준다. (자취 B 참조), 또한, 하이브리드화 파트너로서 사용된 tRNA역시 시그날을 생성하지 못한다.

(자취 A 참조).

자취 G내지I는 바이러스-감염된 NC 37 세포중의 오메가성 특정 RNA의 유도를 보여준다. 덱사메타손으로 전처리하면 이 효과가 강화된다.

자취 D내지F는 NC 37 세포에서와 본질적으로 동일한 결과가 나말와 세포로 얻어짐을 보여준다. 그러나 오메가1의 특정 RNA로 유도하는 것은 NC 37 세포에서 만큼 크지 않다. 이 결과는 상응하는 세포 상동액중에서 측정된 인터페론 역가와 유사하다.

따라서 인터페론-오메가1가 유전자 발현의 이 성질은 인터페론Ⅰ형 유전자로부터 기대되는 성질이다.

실시예 8

IFA-오메가1또는 그에 관련된 유전자를 코드화하는 유전자의 단리:

a) 코스미드(Cosmid 스크리닝)

인체 코스미드 은행(2×10⁶의 복잡성으로 코스미드 벡터 pcos2 EMBL(A. Ponstka, H-R Rockwitz, A.-M. Frischauf, B. Hohn, H. Lehrach proc. Natl. Acad. Sci. 81, 4129-4133(1984))중에서 클론화된 인체 DNA(남자))에서 IFN-오메가 또는 관련된 유전자를 스크린한다. 이·콜라이 DH1(rk-, mk+, rec A: gyr A 96, sup. E)를 숙주로 사용한다. 무엇보다도 먼저, mg++세포(피복 세균(Plating bacteria))를 제조한다. 이.콜라이 DH 1을 0.2% 말토즈가 보충된 L육즙(10g/ℓ 트립톤, 5g/ℓ 효모추출물, 5g/ℓNaCl)중에서 밤새 증식시킨다. 원심분리하여 세균을 제거하고 10mm MgSO₄용액중에 취하여 광학 밀도 600=2가 되게 한다. 5㎖의 이 세포 현탁액을 수단위의 코스미드로 이루어진 12.5 × 10⁶콜로니와 함께 37℃에서 20분간 인큐베이션시킨다. 이어서 10용적의 LB를 가하고 이 현탁액을 37℃에서 1시간 동안 유지시켜 코스미드에 의해 코드화되는 가나마이신 내성을 발현시킨다. 이어서 원심분리하여 세균을 제거하고, 5㎖의 LB중에 재현탁시킨후 30 ㎍/㎖ 가나마이신이 들어 있는 LB한천( L육즙중의 1.5% 한천)상에 있는 200㎕ 분취량의 니트로셀룰로즈 필터(BA 85, Schleicher Schull 132mm직경)위에 분산시킨다. 약 10,000내지 20,000 콜로니를 각각의 필터상에서 증식시킨다. 이 콜로니들을 4℃에서 보관된 추가의 니트로셀룰로즈 필터상에 복사-피복한다. 콜로니 필터한 조를 실시예 1c )에서 기술된 바와 같이, 즉 세균을 변성시키고, 외가닥 DNA를 니트로셀룰로즈에 고정시킨다. 필터를 50mM 트리스/HCl, pH=8.0, 1M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS 용액중, 65℃에서 4시간 동안 세척한다. 이어서 필터를 5 × 멘하르트(실시예1c 참조), 6 ×SSC, 0.1% SDS용액중에서 65℃에서 2시간동안 인큐베이션시키고 동일한 용액중 65℃에서 약 50×10⁶cpm의 닉-형질전환된 변성 IFN-오메가1의 DNA(클론 PRHW 12의 HindⅢ-BamH 삽입물,

제 6도 참조)로 24시간동안 인큐베이션 시킨다. 하이브리드화 공정후에, 필터를 먼저 2×SSC, 0.01% SDS용액중, 주위온도에서 3×10분간 세척하고, 이어서 0.2×SSC, 0.01% SDS용액중에서 3×45분간 세척한다. 필터를 건조시키고 -70℃에서 증감제 필름을 사용하여 코닥×-오매트 에스 필름에 노툴시킨다. 양성적으로 반응하는 콜로니를 복제 필터상에 편제시키고, 긁어모아서, 가나마이신(30㎍/㎖)이든 L육즙중에 재현탁시킨다. 현탁액중에서, 수 ㎕를 30㎍/㎖가나마이신이 들어있는 LB한천상에 분산시킨다. 생성된 콜로니를 니트로셀룰로즈필터상에 복사-피복한다. 이들 필터는 상술한 바와 같이³²P-표식된 IFN-오메가 1-DNS로 하이브리드화 된다. 각각의 하이브리드화 콜로니로 부터, 비른 보임 및 돌리의 방법 (Nucl. Acids Res. 7, 1513(1979))을 이용하여 코스미드를 단리시킨다. 이 코스미드 DNA제조와 함께, 이.콜라이 DH 1을 형질전환시키고 그 형질전환체를 30㎍/㎖의 가나마이신이든 LB한천상에서 분리한다. 양성적으로 반응하는 클론을 위해서 이 형질전환체를³²P- 방사성 표지된 IFN-오메가1 DNA로 실험한다. 단리된 기원 물질로부터 출발하는 각각의 경우에서 하나의 클론을 분리하고 그의 코스미드를 대규모로 생성시키다.(Clewell, D. B. and Helinski, D. R., Biochmistry 9, 4428(1970)). 세 개의 단리된 코스미드를 cos 9, cos10 및, cos B라 명명한다. b) PUC 8중의 하이브리드화 단편의 서브 - 클로닝 (sub - cloning)

1㎍의 코스미드 cos 9, cos10 및, cos B 를 설명서에 기재된 조건하에서(뉴 잉글랜드 바이오랩스) HindⅢ로 절단한다. 이 단편을 전기영동법에 의해 TBE 완충액중의 1% 아가로즈 겔상에서 분리하여 사던(실시예 dc)에 따른 니트로셀룰로즈 필터로 옮긴다. 이 두 개의 필터를 실시예4d에서와 같이 닉-형질전화된 오메가 DNA로 하이브리드화시키고 세척 및 노출시킨다. 각 코스미드의 약 20㎍를 HindⅢ로 절단하고 생성된 단편을 겔 전기영동법에 의해 분리한다. 예비실험에서 오메가 1-DNA 로 하이브리드화된 단편을 전기 용출시키고 엘루팁 칼럼(Schleicher Schull)으로 정제한다. 이들 단편을 HindⅢ-직선화 탈인산화된 puc 8(Messing, J., Vieira, J., Gene 19,269-276(1982))와 연결시키고, 이 라가제 반응 용액으로 이·콜라이 JN101(supE, thi, (lac-pro AB), 〔F', tra D 36, pro AB, lac 9 z M15〕(예: P. L. Biochemical))을 형질전환시킨다. 이세균을 50㎍/㎖의 암피실린, 250㎍/㎖의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(BCIG, Sigma) 및 250㎍/㎖의 이소프로필-β-D-갈락토-피라노사이드(IPTG, 시그마)가 함유된 LB한천상에 퍼뜨린다. 생성된 코로니의 블루 칼라는 puc 8중에 삽입물이 부재함을 나타낸다. 몇 개의 백색 클론으로부터 플라스미드 DNA를 소규모로 단리하고, 이어서 HindⅢ로 절단하여 1% 아가로즈겔 상에서 분리한다. DNA 단편을 니트로셀룰로즈 필터로 옮기고 상기와 같이³²P- 오메가- DNA와 하이브리드시킨다. cos 9 및 cos10으로부터 출발하여, 각 경우에서 서브클론을 선택하여 P^RHW22또는 P^RH57 이라 명명한다. cos B로 부터, 오메가 탐색침과 잘 하이브리드화 되는 두 개의 단편을 서브클론화시키고 이를 P^RH51 및 P^RH52 라 명명한다.

c) 서열분석

puc 8중에 삽입된 DNA를 HindⅢ로 절단하고 그후에 겔 전기영동시켜 벡터부로부터 분리해낸다. 이 DNA 약10㎍을 T4 DNA리가제를 사용하여 50㎕ 의반응 용액중에서 연결시키고 닉 형질전환 완충액(실시예 4d)으로 용적을 350㎕로 조절한 다음 얼음으로 냉각시키면서 초음파를 이용하여 분해시킨다. (MSE 100와트 초음파 파쇄기, 20㎑에서 최대 출력, 5×30초)이어서, 1/100용적의 0.5mM dATP, dGTP 및 dTTP 및 dCTP 및 DNA폴리머라제Ⅰ의 10단위 클레노우 단편을 14℃에서 2시간동안 가하여 상기 단편의 말단을 재생시킨다. 생성된 직선 말단의 DNA단편을 1% 아가로즈 겔상에서 크기에 따라 분리한다. 500내지1000bp 크기의 단편을 단리하여 SmaⅠ으로 절단되고 탈인산화된 파지 벡터 m 13 mp 8에 서브클론시킨다. 재조합체 파지의 외가닥 DNA를 단리하고, Sanger에 의해 개발된 방법을 이용하여(Sanger, F, et al., Proc. Natl. Acad. Sci 74, 5463-5467(1976))서열화한다. 개개의 서열을 함께 놓고 컴퓨터를 이용하여 총 서열을 만든다. (Staden, R., Nucl. Acids Res. 10, 4731-4751(1982)).

d) 서브클론 P^RH57의 서열(IFN-오메가 1)

이 서열은 제 11도에 나타나있다. 1933bp 길이인 이 단편은 인터페론-오메가 1를 코드화하는 유전자를 함유하고 있다. 프로테인 코드화하는 유전자를 함유하고 있다. 프로테인 코드화부위는 뉴클레오티드 576내지 1163을 함유한다. 그 서열은 cDNA 클론 P9 A2 의서열과 완전히 동일하다. 뉴클레오티드부 576내지674는 시그날 텝타이드 23 아미노산 길이를 코드화한다. TATA박스는 출발 코돈 ATG(제 476내지 482위치)앞에서 인터페론Ⅰ형 유전자의 특징적 거리에 존재한다. 이 유전자는 전사되는 도중에 폴리아데닐화될 수 있는 다수의 시그날 서열을 갖으려(1497-1502 또는 1764-1796 위치에서 ATTAAA;1729-1734 또는 1798-1803 위치에서 AATAAA), 이의 첫 번째것이 클론 P9 A2에 사용된다.

e) 서브클론 P^RHW22의 서열(IFN-슈도-오메가2)

제 12도는 오메가 1-DNA 샘플과 하이브리드화 되는 코스미드 cos 9로부터 얻어지는 HindⅢ단편의 서열, 2132bp 길이를 나타낸다. 개방 판독대(open reading frame)는 뉴클레오티드 905 내지 뉴클레오티드1366에 존재한다. 그로부터 유도된 아미노산 서열을 나타낸다. 처음 23개 아미노산은 통상의 Ⅰ형 인터페론의 시그날 텝타이드의 아미노산과 유사하다. 그 다음의 131개 아미노산은 아미노산 65까지의 오메가 1 인터페론과 유사함을 나타내며, 이때 타이토신은 증식 프로테인의 첫 번째 아미노산으로 간주할 수 있다. 다음 아미노산 제 66위치는 잠재의 N-글리코실화 부위의 서열(Asn-Phe-Ser)이다. 이 위치 이후의 아미노산 서열은 Ⅰ형 인터페론의 아미노산 서열과 다르다. 그러나, IFN-오메가 1과의 유사성은 적절한 삽입 및 생성된 프로테인 판독대의 치환에 의해 이루어질 수 있음을 입증할 수 있다(실시예 9참조). 따라서, Ⅰ형 인터페론의 견지에서는, 단리된 유전자는 슈도유전자(pseudogene)이다.

IFN-슈도-오메가2

f) 서브클론 P^RH51의 서열(IFN-슈도-오메가3)

오메가 1 탐색침과 하이브리드시킨 코스미드 B로부터 기원된 약3500bp길이의 HindⅢ단편을 부분적으로 서열화한다(제 13도). 뉴클레오티드 제92 내지 394위치로부터 공개 판독대를 얻는다. 처음 23개 아미노산 시그날 텝타이드의 특징을 나타낸다. 그후의 서열은 트립토판으로 출발하며 아미노산 42까지 IFN-오메가 1과 유사하다. 그후에, 유도된 서열은 IFN-오메가 1과 다르며 아미노산78뒤에서 끝난다. 이 서열은 삽입에 의해 변형시켜 IFN-오메가 1와 완전히 일치되도록 할 수 있다(실시예 9). 이 유전자를 IFN-슈도-오메가3라 한다.

g) P^RH52의 삽입체의 서열(IFN-슈도-오메가4)

3659bp길이인 HindⅢ단편의 서열을 오메가 1-DNA와 하이브리드된 코스미드B로부터 단리시킨다(제 14도).

그의 해독 생성물이 IFN-오메가 1에 부분적으로 일치하는 공개 판독대를 뉴클레오티드 제 2951과 3250위치 사이에 편재시킨다. 시그날 텝타이드 23개 아미노산 이후의, 추가의 아미노산 서열은 페닐알라닌으로 시작한다.

IFN-1의 동족체는 16번째 아미노산이후에서만 차단되며 22번째 아미노산에서 계속되어 41번째 아미노산에서 끝난다. 해독은 아미노산 77까지 가능하다. 실시예 8 f) 및 8g)와 마찬가지로, 좋은 동족체는 삽입의 도입에 의해 IFN-오메가 1로 될 수 있다(실시예 9). 여기에서 분리된 슈도 유전자를 IFN-슈도-오메가4라 한다.

실시예 9

4그룹의 IFN-오메가 족에 대한 유전자의 평가

제 15도는 아미노산 해독과 함께 IFN-오메가 1 내지 IFN-슈도-오메가4를 코드화하는 유전자의목록을 나타낸다. 보다 완전히 일치시키기 위하여, 점(dot)으로 나타내지는 개개의 유전자에 갭을 삽입한다. 어떤 염기도 빠진 것이 없다. 염기의 넘버링에는 갭이 포함된다. IFN-오메가 1의 아미노산 해독은 유지된다(예;제 352-355위치에서:C·AC는 His를 코드화한다). 슈도 유전자의 경우에는, 해독이 확실하게 가능한 곳에서만 아미노산으로 해독된다. 이 표는 4개의 단리된 유전자가 서로 관련이 있음을 나타낸다. 따라서, 예를들어, 잠재성 N-글리코실화 위치(뉴클레오티드 301 내지 309위치)는 4개의 유전자 모두에서 얻어진다. 유사하게는, IFN-슈도-오메가4의 경우와는 달리, 뉴클레오티드 제611 내지 614위치에서, 정지코돈을 나타내고, IFN-오메가 1의 경우에는, 172 아미노산길이의 증식 프로테인을 종료시키는 트리플렛이 있다. 확실히, 이 배열에 있어서는 IFN-슈도-오메가2(뉴클레오티드 제 497 내지 499위치)와 IFN-슈도-오메가4(뉴클레오티드 제 512 내지 514 위치)중에 조(早)증식된 정지코돈이 있다.

유전자 또는 아미노산 해독사이의 관련의 정도는 제 15도에 나타낸 배열로부터 산출할 수 있다. 제 16도는 IFN-오메가족의 그룹 사이의 DNA동족체를 나타낸다. 쌍으로 비교할 경우에는, 두 개 파트너중의 하나 또는 두 개 모두가 갭을 갖는 그들 위치는 계산에 포함되지 않는다. 비교 결과 IFN-오메가 1 -DNA와 슈도 유전자 서열은 약 85%의 상동성을 갖는다. IFN-슈도-오메가2-DNA는 IFN-슈도-오메가3와 IFN-슈도-오메가4의 DNA에 약 82%상동성을 나타낸다. 제 17도는 시그날 서열의 비교결과를 나타내고 제 18도는 증식프로테인의 비교 결과를 나타낸다. 후자는 72 내지 88%로 광범위하다. 그러나 이 유사성은 IFN-오메가 1과 IFN-α's 및 IFN-β사이의 상동성보다 본질적으로 훨씬 크다(실시예 6). IFN-오메가족의 개개 그룹은 IFN-α족의 그룹보다 서로 훨씬 상동성 적다는 사실은 4개의 단리 IFN-오메가-유전자중의 3개가 슈도 유전자이며, 작용성 유전자로서 동일한 선택 압력을 가할 수 없다는 사실에 의해 설명될 수 있다.

실시예 10

발효

균주보관;

LB-한천(25㎎/ℓ 암피실린)상의 균주 HB 101/pRHW12의 하나의 콜로니를 25㎎/ℓ 암피실린을 함유하는 트립톤-소야-육즙(O x OID CM 129)에서 인큐베이션시키고 광학밀도(546nm)가 약 5에 이를 때까지(log-상) 250rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이션시킨다. 이 배양물에 10%(w/v)의 멸균 글리세롤을 가하고, 이어서 1.5㎖ 용량의 멸균 앰풀로 옮긴후 -70℃로 냉동시킨다.

접종단계:

배지는 15g/ℓ Na₂HPO₄, 12H₂O; 0.5g/ℓ NaCl; 1.0g/ℓ NH₄Cl; 3.0g/ℓ KH₂PO₄; 0.25g/ℓ MgSO₄, 7H₂O;

0.011g/ℓ CaCl₂; 5g/ℓ 카스아미노산(머크 2238); 6.6g/ℓ글루토즈-일수화물; 0.1g/ℓ 암피실린; 20㎎/ℓ 시스테인 및 1㎎/ℓ 지아민-하이드로클로라이드를 함유한다. 200㎖의 이 배지를 함유하는 1000㎖의 삼각플라스크 4개의 각각에 HB 101/pRHW 12의 녹은 배양물을 1㎖씩을 접종하고 37℃에서 16 내지 18시간동안 250RPM으로 진탕시켜 인큐베이션시킨다.

생성 단계:

배지는 10g/ℓ (NH₄)₂HPO₄; 4.6g/ℓ K₂HPO₄·3H₂O; 0.5g/ℓ NaCl ;0.25g/ℓ MgSO₄, 7H₂O; 0.011g/ℓ CaCl₂;

11g/ℓ 글루코즈-일수화물; 21g/ℓ 카스아미노산(머크 2238); 20㎎/ℓ 시스테인, 1㎎/ℓ 지아민-하이드로클로라이드 및 20㎎/ℓ 3-β-인돌아크릴산으로 이루어져 있다. 14ℓ 발효기 (높이:반경=3:1)중의 8ℓ의 멸균 배지에 800㎖의 상기 배지를 접종한다. 28℃, 1000 RPM의 진탕기, 1vvm(용적/용적/분)의 통기 속도 및 개시 pH를 6.9에서발효시킨다. 발효도중에 pH를 6.0으로 감소시키고 이어서 3N NaOH로 이수준에서 자동적으로 조절한다. 광학 밀도(546nm)가 18 내지 20에 도달한 후에 (통상 8.5 내지 9.5시간 발효시킨 후에)배양물을 통풍 및 진탕하에서 20℃로 냉각시키고 이어서 통풍없이 6N H₂SO₄를 가하여 pH를 2.2로 만든다. 800 RPM 및 20℃에서 1시간 진탕시킨후에배양된 생물체를 30,000RPM으로 CEPA 실험 원심분리기 type GLE 중에서 원심분리시킨다.

세포 평판을 동결시키고 -20℃에서 보관한다.

실시예 11

인터페론-오메가-gly의 정제

a) 부분정제

모든 단계는 4℃에서 실시한다. 140g의 생물체(발현 플라스미드 PRHW12 로 형질전환된 이·콜라이 HB101)를 1150㎖의 미리 냉각된 1% 아세트산중에 재현탁시키고 30분간 교반한다. 현탁액에 5M NaOH를 가하여 pH를 10.0으로 높인다. 현탁액을 다시 2시간동안 교반한다. 이어서 5M HCl을 사용하여 pH를 7.5로 재조정하고 15분 더 교반을 계속한다. 그 현탁액을 10,000rpm (J 21 원심분리기(벡크만), JA10-rotor)으로 1시간동안 4℃에서 원심분리시킨다.

맑은 상동액을 50㎖/h의 유속에서 150㎖ CPG(Controlled pore glass: 조절된 공극 유리)에 적용시킨다. 1ℓ 25mM 트리스(pH 7.5)/1M NaCl을 사용하여 칼럼을 세척하고 결합된 물질을 25mM 트리스(pH 7.5)/1M KCNS/50% 에틸렌 글리콜을 함유하는 용액으로 50㎖/h의 유속에서 용출시킨다. 인터페론 활성을 함유하는 분획을 모아서 약 100용적의 0.1M Na-포스페이트/10% 폴리에틸렌 글리콜 40,000에 대해서 밤새 투석시킨다. 생성된 침전물을 4℃에서 10,000rpm (J 21 원심분리기, JA20 회전기)(표 1 참조)으로 1시간동안 원심분리하여 제거한다.

b) 추가의 정제

투석 및 농축된 CPG-용출물 5 용적의 완충액 A(0.1M Na-포스페이트 pH=6.25/25% 1,2-프로필렌 글리콜)로 희석한다. 이 용액을 슈퍼루프(파마시아)를 사용하여 완충액 A로 평형화된 Monos 5/5(파마시아, 양이온 교환기)칼럼에 적용시킨다. 총 20㎖의 완충액 A 증의 0 내지 1M NaCl 직선구배를 이용하여 0.5㎖/h의 유속에서 용출시킨다. 1㎖씩의 분획을 모아서 CPE-감소 검정법을 이용하여 인터페론 활성을 실험한다. 활성 분획을 모은다.

표 1

*CPE-감소 검정법; A 549 세포, EME-바이러스

ft: 통과(flow through)

u: 표준품으로서 인터페론-α2를 이용한 단위

실시예 12

HuIFN-오메가 1의 특징

A. 인체 세포상에서의 항바이러스 활성

B. 원숭이 세포상에서의 항바이러스 활성

C. 인체 Burkitt's 임파종 세포(세포 Daud 1)상에서의 항증식 활성

D. 인체 경부(頸部)암종 세포(세포 Hela)상에서의 항증식 활성과 HuIFN-r alc 인체 종양괴사 인자와의 상승효과

E. 낮은 pH에서의 안정성

F. 혈청학적 특징

A. 인체 세포상에서의 항바이러스 활성

검정용 세포: 인체폐암 세포 A549(ATCC CCL 185) 공격 바이러스:흰쥐의 뇌심근염 바이러스(EMCV) 검정법:세포병리 효과의 억제 9.4㎎/㎖의 프로테인을 함유하는 HuIFN-오메가 1의 부분적으로 정제된 제제를 세포 배양 배지중에서 희석시키고 검정 평판에 적용시킨다. 8300 IE/㎎ 특정 활성의 항바이러스 효과를 나타내는 제제는 참고 표준 제제 GO-23-901-527와 관련이 있다(내셔널 보건기구, Bethesda, Md., USA)

B. 원숭이 세포상에서의 항바이러스 활성

검정용 세포: GL-V3 버어빗(Vervet)원숭이의 신장세포(Christofinis G. J., J. Med. Microbiol. 3, 251-258;1970). 공격 바이러스: 수포성 위염 바이러스(VSV) 검정법: 프라그(Plaque)감소, HuIFN-오메가 1의 부분적으로 정제된 제제(실시예 12A참조)를 배양배지중에서 희석시키고 검정용 세포에 적용한다. 제제는 580단위/㎎의 특정 활성을 나타낸다.

C. 인체 Burkitt's 임파종 세포(세포 Daud 1)상에서의 항증식 활성

인체 Burkitt's 임파종 세포 Daud 1 여러 가지 농도의 HuIFN-오메가 1의 존재하에서 증식시킨다(참조:실시예 12A). 100,000세포/㎖에서 배양을 시작하고;배양물 중에서(37℃) 2,4 및 6일 후에 세포 밀도를 측정한다. 비처리된 배양물을 대조로서 이용한다. 모든 배양은 3조로 수행한다. 다음 도면은 발효의 결과를 나타낸다. 세포 증식은 10 Iu/㎖에서 부분적으로 및 일시적으로 억제되고 100Iu/㎖에서 강력하게 억제된다.

다음 기호를 도면에 사용한다;

○ 대조군, 1 IE/㎖, □ 10 IE/㎖, 100 IE/㎖

D. 인체 경부 암종 세포(세포 Hela)상에서의 항증식 활성

인체 경부 암종 세포 Hela를 다음 프로테인 또는 다음 프로테인들의 혼합물의 존재하에서 성장시킨다: HuIFN-오메가 1(참조;실시예 12A) 100Iu/㎖

HuIFN-감마(참조;실시예 12A) 100Iu/㎖ 인체 종양 괴사 인자(Hu TNF), 98% 순도, 미국 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인토퍼레이티드사 제품(참조:Pennica D. et al., Nature 312, 724-729, 1984) 100㎍/㎖상기 프로테인중 두 개의 배합은 모두 상기와 동일한농도를 갖는다. 2가지 배양을 각각 50,000세포/3㎝ 페트리접시에서 출발하고 37℃에서 6일간 인큐베이션시킨후에 세포 밀도를 측정한다. HuIFN-오메가 1 및 Hu TNF는 세포증식에 약하게 작용하나, 반면에 HuIFN-감마는 분명한 세포성색전 활성(Cytostatic activity)을 나타낸다. IFN-감마와 IFN-오메가 1의 배합물은 상승적 세포성 색전/세포독 활성을 나타낸다. 다음 그림은 이 실험 결과를 나타낸다.

상기 그림에는 다음 기호가 사용된다.

C 비처리된 대조그룹, T HuTNF,

O HuIFN- 오메가 1 G HuIFN-감마

E. 낮은 pH에서의 안정성

HuIFN- 오메가 1제제(참조 실시예 12A)를 세포 배양 배지(10% 갓태어난 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지)중에서 희석시키고 염산으로 pH 2로 조절한다. 4℃에서 24시산동안 인큐베이션시키고, 수산화 나트륨으로 중화시킨다음 실시예 12A에서와 같이 적정하여 그의 항바이어스 활성을 측정한다. 그 제제는 중성 pH에서 인큐베이션된 대조군에서 나타나는 활성의 75%를 나타낸다: 따라서 HuIFN- 오메가 1은 낮은 pH에서 안정하다고 간주 될 수 있다.

F. 혈청학적 특징

HuIFN- 오메가 1과 Hu-α2의 혈청학적 특징을 비교하기 위하여, 이 두가지 프로테인 모두의 샘플(참조: 실시예 12)을 희석하여 100iu/㎖로 만들고, 동일용적의 여러 가지 항혈청 또는 모노클로날 항체의 용액과 혼합한 다음 37℃에서 90분간 인큐베이션 시킨다. 이어서 이들 샘플의 항바이러스 활성을 비처리된 대조군의 항바이러스 활성과 비교한다. 표 1은 이 실험의 결과를 나타낸다. HuIFN- 오메가 1 의 항바이러스 활성은 비교적 고 농도에서 인체 백혈구-유도된 IFN에 대한 항혈청에 의해서만 중화되며, HuIFN-β, HuIFN-α2 또는 HuIFN-α2를 중화시키는 여러 가지 모노크로날 항체에 대한 폴리클로날 항혈청에 의해서는 중화되지 않는다. 따라서 HuIFN- 오메가 1은 혈청학적으로 HuIFN-β뿐만아니라 HuIFN-α2와는 관련이 없다. 다음도표에 사용되는 기호: -실험하지 않음, ○중화되지 않음, +부분적, +++완전히 중화됨

표 1

1) EP-A-0.119.467

2) Drug Research 35 364-369(1985)

3) Research reference reagent catalog no, G-026-502-568

Research reference reagent catalog no, G-028-501-568

4) Research Resources Brangh, National Institute of

Allergy and Infectious Diseases, Bethesca, Mo, USA.

Claims (13)

1. 적절한 발현부위에 인체Ⅰ형 인터페론 폴리펩타이드의 코드화 서열을 함유하는 발현벡터로 적합한 숙주세포를 형질전환시키고, 수득된 형질전환체로부터 목적하는 폴리펩타이드를 분리시킴을 특징으로하여 선두펩타이드 Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly에 융합될 수 있는 하기 서열식의 신규한 인체 Ⅰ형 인터페론 펩타이드 및 제 78위치의 아미노산에서 N-글리코실화된 유도체를 제조하는 방법.

   

   상기식에서 Y는 아미노산 잔기 Gly 또는 Glu를 나타낸다.
2. 제 1항에 있어서, 코드화서열이 이·콜라이 HB101중의 플라스미드 E76E9(DSM에 기탁번호 DSM 3003으로 기탁됨)또는 이·콜라이 HB101중의 플라스미드 P9A2(DSM에 기탁번호 DSM 3003으로 기탁됨)의 Pst-1 절단부위중의 삽입체 또는 이 삽입체의 퇴화변형체로서 존재함을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 코드화서열이 하기 서열식으로 표시됨을 특징으로 하는 방법.

   

   상기식에서 X는 뉴클레오티드 G또는 A를 나타낸다.
4. 제 1항 내지 제 3항중의 어느하나에 있어서, 코드화 서열이 선두 펩타이드를 코드화하는 하기 서열식의 DNA서열을 추가로 함유함을 특징으로 하는 방법.

   
5. 제 4항에 있어서 IFN-오메가 1을 코드화하는 서열이 하기 서열식으로 표시됨을 특징으로 하는 방법.

   

   상기식에서 X는 뉴클레오티드 G또는 A를 나타낸다.
6. 제 1항에 따르는 숙주 유기체내에서 복제가능한, 유전정보를 함유하는 발현 벡터로 유기체를 형질전환시킴을 특징으로하여, 적합한 숙주 유기체를 제조하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 발현 벡터로서 발현 플라스미드 pRHW11 및 pRHW12를 사용함을 특징으로 하는 방법.
8. 클론 P9A2 또는 E76E9의 AvaⅡ 단편을 Nco Ⅰ및 AluⅠ 으로 분해시킴으로써 수득되는 하기 서열식(Ⅰ)의 단편을, 플라스미드 PER103의 Hind Ⅲ의 부위에 하기 서열식(Ⅱ)의 DNA 단편을 함유하는 단편을 플라스미드 pRHW10를 Hind Ⅲ에 의해 제한 에도뉴클레아제 분해시키고, 그 절단부위를 DNA폴리머라제의 클레노우 단편 및 4 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트에 의해채운 다음 계속해서 Nco Ⅰ로 절단함으로써 수득되는 플라스미드 pRHW10의 큰 단편에 리가제 반응에 의해 삽입하고, 생성된 플라스미드로 이·콜라이 HB101을 형질전환시킨 후 이를 배양하여 복제시킴을 특징으로하여, 발현 플라스미드 pRHW11 및 pRHW12를 제조하는 방법.

   

   상기식 (Ⅰ)에서 X는 뉴클레오티드 G또는 A를 나타낸다.
9. 제 8항에 있어서, X가 뉴클레오티드 A인 클론 P9A2를 사용하여 플라스미드 pRHW12를 제조하는 방법.
10. 제 8항에 있어서, X가 뉴클레오티드 G인 클론 E76E9를 사용하여 플라스미드 pRHW11을 제조하는 방법.
11. 하기의 서열식(Ⅱ)의 DNA 단편을 리가제 반응에 의해 플라스미드 pER103의 Hind Ⅲ의 부위에 삽입하고 생성된 플라스미드로 이·콜라이 HB101을 형질전환시킨 후 배양하여 복제시킴을 특징으로하여 플라스미드 pRHW10를 제조하는 방법.

    

    
12. 상동성이 85%이상 인식될 수 있는 엄격한 조건하에서 나말와 세포로부터의 DNA를 이·콜라이 HB101중의 플라스미드 E76E9(DSM 3003) 또는 이·콜라이 HB101중의 플라스미드 P9A2(DSM 3004)의 Pst-1 절단부위내의 삽입체 및 플라스미드 PER33의 Pst-1 절단부위내의 삽입체와 하이브리드화시킨 후, 목적하는 DNA 분자를 분리시킴을 특징으로하여 제 50항 내지 제54항중의 어느 하나에 따르는 신규한 인체Ⅰ형 인터페론 펩타이드, 인터페론-슈도-오메가 2(제12도), 인터페론-슈도-오메가 3(제13도), 인터페론-슈도-오메가 4(제14도)를 코드화하는 서열을 함유하는 DNA 분자를 제조하는 방법.
13. 센다이 바이러스로 유도된 나말와 세포 또는 NC 37 세포로부터 수득된 cDNA을 IFN-α2-Arg유전자를 함유하는 플라스미드 pER33의 삽입체와 하이브리드화시킨 후, 목적하는 DNA 분자를 분리시킴을 특징으로하여, 이·콜라이 HB101중의 플라스미드 E76E9(DSM 3003) 또는 이·콜라이 HB101중의 플라스미드 P9A2(DSM 3004)를 제조하는 방법.

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