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KR0136642B1 - 메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 생산하는 새로운 미생물 및 그 미생물을 이용하는 엘-류신의 제조방법 - Google Patents

메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 생산하는 새로운 미생물 및 그 미생물을 이용하는 엘-류신의 제조방법

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KR0136642B1
KR0136642B1 KR1019950005878A KR19950005878A KR0136642B1 KR 0136642 B1 KR0136642 B1 KR 0136642B1 KR 1019950005878 A KR1019950005878 A KR 1019950005878A KR 19950005878 A KR19950005878 A KR 19950005878A KR 0136642 B1 KR0136642 B1 KR 0136642B1
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KR
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leucine
methyl isobutyl
isobutyl ketone
acetone
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정선미
김용식
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김흥기
금호석유화학주식회사
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Abstract

본 발명은 아세톤 자화능을 갖는 미생물을 이용하여 메틸이소부틸키톤과 같은 알파위치에 카보닐기를 갖는 메틸키톤류 물질을 산화시켜 엘-류신(L-Leucine)을 제조하는 방법과 메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 생산하는 새로운 미생물에 관한 것이다. 즉, 토양으로부터 아세톤을 단일 탄소원으로하여 성장하는 미생물을 분리하고 미생물 촉매에 트리톤엑스-100을 처리하여 세포의 투과성을 증진시킨 후, 용매로서 많이 사용되는 메틸이소부틸키톤으로부터 직접 아미노산 엘-류신을 생합성하는 방법에 관한 것이다. 메틸이소부틸키톤으로부터 미생물 촉매를 이용하여 엘-류신을 생산하는 제조방법으로서는 최초의 것이다.

Description

메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 생산하는 새로운 미생물 및 그 미생물을 이용하는 엘-류신의 제조방법
본 발명은 아세톤(Acetone)을 단일 탄소원으로 사용하여 성장하며 메틸이소부틸키톤(Methl Isobutyl Ketone)으로부터 엘-류신(L-Leucine)을 생산하는 새로운 미생물과 그 미생물을 이용하여 메틸이소부틸키톤으로부터 아미노산의 일종인 엘-류신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 엘-류신은 여러 가지 방법으로 만들어질 수 있다. 유기합성을 통하여 류신을 합성하는 방법은 공지의 사실이다. 그러나 이 경우 주로 먼저 디,엘-류신(D,L-Leucine)의 광학적 이성질체의 혼합물로 만들어지며 이를 이후 여러 가지 방법으로 분리하여 엘-류신만을 얻을 수 있다. 엘-류신은 역시 코리네폼 박테리아(Coryneform bactera) 등을 이용하여 발효를 통하여서도 만들어지기도 한다. 엘-류신은 공업적으로 단백질을 가수분해하여 만들어진다. 이 과정에서 유사한 엘-이소류신(L-Isoleucine)과의 분리를 위하여 여러 가지의 방법이 개발되어있다(미합중국특허 4562153, 4731476, 4820869 참조) 미생물 촉매를 이용하여 전구물질을 공급하는 방법으로 메틸이소부틸키톤의 메틸기가 산화된 형태의 아래의 분자식(I)로 표시되는 키토-이소카프록산(keto-isocarproic acid)에서 미생물의 아미노(transaminase)에 의하여 키토-이소카프록산의 카보닐를 아미노기로 치환하여 아래의 분자식(III)으로 표시되는 엘-류신을 생산하는 방법이 알려져 있다.(Biotech. Bioeng., 27(II) : 1616-1619, 1985) 그러나 키토-이소카프록산은 쉽게 저가로 얻을 수 있는 물질이 아니므로 원료 물질로서 부적합하다는 단점이 있다. 동시에 아미노기의 전이에 필요한 에너지를 공급하기 위하여 연속적으로 조효소를재생시켜 주어야 한다는 단점이 있다. 이와같은 문제점을 고려하여 본 발명에서는 현재 용매로서 많이 사용되는 아래의 분자식(II)로 표시되는 메틸이소부틸카톤을 출발 물질로하여 아래의 분자식(III)으로 표시되는 엘-류신을 생합성하는 미생물을 자연계의 토양에서 순수 분리하였다. 메틸이소부틸키톤은 키토-이소카프록산의 탄산기가 환원된 형태로써 용매로서 사용되며 본 발명에서는 이 메틸기를 직접 산화시킬 수 있는 능력을 가지며 미생물 즉, 아세톤을 탄소원으로 성장하는 미생물을 분리하여 메틸이소부틸키톤으로 직접 아미노산을 생합성하는 법이다. 그러나 본 발명에서 주장하는 메틸이소부틸키톤으로부터 미생물 촉매로 엘-류신을 생산하는 방법은 아직 보고된 바가 없는 신규의 것이다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 아세톤을 유일한 탄소원으로하여 성장하는 미생물은 아세톤의 메틸기를 산화시켜 차례로 아세톨로 만들고 이를 차례로 산화시켜 아세탈을 만들고 이를 계속 산화시켜 생성되는 피루빅산을 이용하여 성장한다. 즉, 말단의 메틸기를 연속적으로 산화시켜 생합성한 피루빅산을 이용하여 세포의 여러 구성성분을 합성한다. 본 발명은 아세톤을 자화하는 상기의 새로운 미생물의 특징을 이용하여 메틸이소부틸키톤과 같이 알파 위치의 카보닐기를 가지는 메틸키톤류 물질을 같은 방법으로 산화시켜 엘-류신을 직접 행합성하는 엘-류신의 제조방법에 관한 것이다. 다음에는 본 공시균주의 제조방법에 대하여 설명한다. 우리나라 각지의 토양 시료를 아세톤을 유일한 탄소원으로하여 0.5% 아세톤이 포함된 최소배지에서 30℃로 2일에서 10일간 배양후 배양액을 역시유일한 탄소원으로 메틸에틸키톤(methyl ethyl ketone)이 0.5% 포함된 최소배지에서 다시 배양하여 이를 한천 영양 배지에 도말하였다. 이후 영양 배지에서 자란 미생물 콜로니(Coloy)를 분리하여 아세톤을 0.5% 포함한 최소 배지에서 배양하여 아세톤 자화능력을 점검하였다. 이 균주들을 아세톤이 유일한 탄소원인 최소배지에서 성장 시킨 후 여기에 메틸이소부틸키톤을 5% 첨가하여 30℃에서 진탕 배양하였다. 이후 상등액을 얇은 막 크로마토그라피(Thin-Layer Chromatography ; TSC)를 통하여 분석하여 류신과 같은 전개치를 가지는 물질을 생산하는 미생물을 분리하였다. 이와같은 발명자가 분리한 공시 균주의 세균학적 성질은 다음과 같다.
(1) 콜로니의 성상 : 황색, 원형
(2) 그람 염색 : 그람 음성
(3) 운동성 : 음성
(4) 생화학적 성질
생육온도 37℃ 이하
카탈라아제(catalase)생성 양성
인돌(Indole)의 생성 음성
젤라틴 가수분해능 음성
셀로비오스(cellobiose)로부터 산 생성 양성
글리세롤(Glycerol)로부터 산 생성 음성
말토오스(Maltose)로부터 산 생성 음성
만니톨(D-mannitol)로부터 산 생성 음성
라피노오스(Raffinose)로부터 산 생성 양성
람노오스(L-Rhamnose)로부터 산 생성 양성
살리신(Salicin)로부터 산 생성 양성
슈크로오스(Sucrose)로부터 산 생성 양성
라이신 탈탄산효소(Lysine decarboxylase) 음성
알지닌 탈수소료소(Arginine dehydroxylase) 음성
오르니틴 탈탄산효소(Ornithine decarboxylase) 음성
질산환원능(Nitrate reduction) 양성
에스큘린 가수분해능(Esculin hydrolysis) 양성
요소 가수분해능 음성
이상의 세균학적 성질에 근거하여 대표적인 미생물 동정방법인 버기스 시스테마틱 오브 마이크로바이오러지(Bergey's Systematics of Microbiology)에 의해 동정한 결과 본 균주는 엔테로박타속으로 인지되며 엔테로박타 속 엠케이오 62(Enterobacter sp. MKO62)로 명명되어 1994년 11월 18일자로 한국과학기술원 유전공학연구소에 기탁번호 KCTC8634P로 기탁되어 있다.
한편, 본 발명에 따르면 상기의 균주의 배양은 pH 4.5∼0에서 실시하며, 바람직하게는 pH 6.0∼7.5에서 실시한다. 이때 배양은 20-40℃의 온도에서서, 바람직하게는 25-35℃에서 통상 실시한다. 성장에 필요한 탄소원으로서 아세톤은 통상 초기농도로 1%(V/V)를 사용한다. 이하에는 본 균주 엔테로박타 속 MKO62를 이용한 류신의 생산실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 실시예에 국한되는 것은 아니다. 사용된 아세톤과 메틸이소부틸키톤의 분석은 기체 크로마토그라피(GS)를 이용하였다. 생성된 아미노산의 분석은 크로마토그라피(Thin-Layer Chromatography 또는 High Performance Liquid Chromatography)를 이용하였다.
실시예 1
공시균주를 배양하고 다량의 균체를 얻기 위하여 다음과 같은 방법으로 실시하였다.
(배지조성)
효모추출물 0.1%, 인산칼륨 0.5%, 황산암모늄 0.5%, 황산마그네슘 0.001%(pH 7.0, 121℃의 온도에서 15분간 가압멸균하여 식힌후 아세톤 용적비 1% 첨가)
(배양)
2ℓ의 날개달린 삼각 플라스크에 200ml의 상기 배지를 넣고 여기에 토양에서 분리한 엔토박타속 MKO62를 접종시키고 20℃에서 36시간 동안 200rpm으로 진탕 배양한다. 600nm에서의 흡광도가 2정도에서 회수하여 배양액을 500rpm에서 20분동안 원심분리하여 상등액을 제거한후 균체를 영하 70℃에 얼려 보관하였다.
(반응조건)
완충용액(인산칼륨 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 염화나트륨 0.01%, pH 7.0)으로 균체를 녹여 세적한후 균체를 600nm에서 흡광도가 20정도가 되도록 농축하여 반응용액 각각에 아세톤과 메틸이소부틸키톤을 2% 첨가하여 30℃에서 진탕 배양하였다. 6시간 동안 배양하면서 2시간마다 시료를 채취하여 아미노산을 분석하여 엘-류신의 생산성을 표1에 나타내었다.
표 1. 엘-류신의 생성(단위 : 엘-류신 g/ℓ)
실시예 2
동일한 반응조건하에서 초기의 메틸이소부틸의 농도를 분산된 미생물 촉매상에 0%, 1%, 2%, 4%, 8%, 16%, 32% 첨가하여 30℃에서 6시간 동안 반응하였다.
실시예 3
미생물 세포막의 투과성을 증가시키는 물질로 알려져 있는 비이온성 계면활성제의 일종인 트리톤 엑스-100(TRITON X-100), 트윈(TWEEN)80, 염화칼슘, 이.디.티.에이(EDTA)등으로 미생물을 전처리하여 같은 방법으로 2%의 메틸이소부틸키톤을 첨가하여 30℃에서 6시간동안 반응하였다. 전처리하지 않은 대조군에 비하여 엘-류신의 생산의 증가를 확인하였다.
트리톤 엑스-100 1%(v/v) 엘-류신생산 증가
트윈 80 1%(v/v) 영향없음
염화칼슘 (10mM) 영향없음
EDTA (10mM) 영향없음
소듐도데실황산(0.1%) 엘-류신생산 증가
실시예 4
반응용액에 트리톤 엑스-100을 0.1%, 0.5%, 1% 첨가하여 30℃에서 6시간동안 반응하였다. 대조군에 비하여 트리톤 엑스-100의 첨가에 의한 엘-류신의 생산의 증가를 확인하였다.

Claims (5)

  1. 아세톤 및 메틸에틸키톤을 단일 탄소원으로 자라며 메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 생산하는 균주 엔테로박타 속 MKO62(Enterobacter sp, MKO62, KCTC8634P)
  2. 제1항의 균주 엔테로박타 속 MKO62를 배양하여 메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 수득하는 엘-류신의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 메틸이소부틸키톤의 초기농도가 2% 이상인 엘-류신의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 트리톤 엑스-100, 소디움도데실설페이트 중 어느 하나를 미생물 세포막 투과성 증가물질로 사용하는 엘-류신의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 1% 이하의 트리톤 엑스-100을 0.1%(v/v)에서 1%(v/v)까지 첨가하여 엘-류신을 제조하는 방법.
KR1019950005878A 1995-03-20 1995-03-20 메틸이소부틸키톤으로부터 엘-류신을 생산하는 새로운 미생물 및 그 미생물을 이용하는 엘-류신의 제조방법 KR0136642B1 (ko)

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