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KR0128341B1 - 고체-상 방법에 따른 펩타이드 아미드 합성을 위한 산-불안정한 앵커 그룹 - Google Patents

고체-상 방법에 따른 펩타이드 아미드 합성을 위한 산-불안정한 앵커 그룹

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Publication number
KR0128341B1
KR0128341B1 KR1019880017020A KR880017020A KR0128341B1 KR 0128341 B1 KR0128341 B1 KR 0128341B1 KR 1019880017020 A KR1019880017020 A KR 1019880017020A KR 880017020 A KR880017020 A KR 880017020A KR 0128341 B1 KR0128341 B1 KR 0128341B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formula
hydrogen
compound
cooh
acid
Prior art date
Application number
KR1019880017020A
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English (en)
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KR890009973A (ko
Inventor
브라이폴 게르하르트
조센크놀레
스튀버 베르너
Original Assignee
베른하르트 벡크, 하인리히 벡커
훽스트 아크티엔게젤샤프트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베른하르트 벡크, 하인리히 벡커, 훽스트 아크티엔게젤샤프트 filed Critical 베른하르트 벡크, 하인리히 벡커
Publication of KR890009973A publication Critical patent/KR890009973A/ko
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Publication of KR0128341B1 publication Critical patent/KR0128341B1/ko

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Abstract

내용없음.

Description

고체-상 방법에 따른 펩타이드 아미드 합성을 위한 산-불안정한 앵커 그룹
본 발명은 스페이서(spacer), 이의 제조방법, 및 산에 불안정한 이들 앵커(anchor) 그룹을 이용한 고체-상 방법(solid-phase method)으로 펩타이드 아미드를 합성하는 방법에 관한 것이다.
고체-상 합성 방법에 의한 펩타이드 아미드의 제조에 있어 문헌[참조 : J.P. Tam et al., Tetrahedron Lett. 22, 2851(1981)]에 기술되어 있는 벤즈하이드릴아민 수지 또는 메틸벤즈하이드릴아민 수지가 통상적으로 사용되고 있다. 또다른 방법은 담체-결합된 펩타이드 벤질 에스테르의 가암모니아 분해를 특징으로 하는 것이다[참조 : C. Ressler et al., J.Am. Chem. Soc. 76, 3107(1954)]. 두 방법은 모두 스페이서의 제거에 필요한 강산(액체 불화수소 또는 트리플루오로메탄 설폰산), 부반응 또는 불완전한 제거가 특징이다.
그러므로 본 발명의 목적은 지지체 수지로부터 펩타이드 아미드의 제거를 온화하고 더욱 양호하게 하는 신규한 스페이서를 발견하는 것이다.
본 발명의 목적은 일반식( I )의 화합물에 의한 본 발명에 의해 성취된다.
Figure kpo00001
상기식에서, R1은 (C1-C8)-알킬이고, R2는 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 우레탄 보호 그룹으로 보호된 아미노산 잔기이거나, 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 아미노 보호 그룹이며, R3는 수소 또는 (C1-C8)-알킬이고, Y1내지 Y9는 수소,(C1-C8)-알킬, (C1-C8)-알콕시 또는 -O-(CH2)n-COOH(여기에서, 이들 라디칼은 동일하거나 상이할 수 있으나 하나의 라디칼은 -O-(CH2)n-COOH를 나타낸다)이거나, Y1,Y2,Y5,Y6,Y7,Y8및 Y9는 수소, (C1-C8)-알킬 또는 (C1-C8)-알콕시(여기에서, 이들 라디칼은 동일하거나 상이할 수 있다)이고, Y3는 (C1-C8)-알콕시 또는 수소이며, Y4는 -(CH2)n-COOH 또는 -NH-CO-(CH2)n-COOH이고, n은 1 내지 6의 정수이다.
바람직한 일반식(I )의 화합물은 R1이 메틸이고, n이 1 내지 3의 정수인 화합물이다.
마찬가지로 R2가 Fmoc로 보호된 아미노산 잔기이거나, 우레탄 보호 그룹, 특히 Fmoc이고 R3이 수소인 일반식(I )의 화합물이 바람직하다.
또한, 라디칼 Y1내지 Y9가 특히 메틸 또는 메톡시이나 이들 라디칼중 하나가 -O-(CH2)n-COOH이고, 이들 라디칼 중 4개 이상이 수소이거나, 라디칼 Y1,Y2및 Y5내지 Y9가 메틸 또는 메톡시이나 이들 라디칼중 4개 이상이 수소이고 Y3이 메톡시이며, Y4가 -(CH2)n-COOH을 나타낸다. 바람직하게는 라디칼 Y1,Y3,Y5,Y7및 Y8중 하나는 -O-(CH2)n-COOH을 나타낸다.
Y4가 -(CH2)n-COOH이고, Y3이 (C1-C8)-알콕시, 특히 메톡시이고 n이 2인 화합물에서 Y4가 -NH-CO-2)n-COOH인 경우, Y1및 Y3은 바람직하게는 메톡시이며 n은 2이다. 알킬 및 알콕시는 직쇄 또는 측쇄일 수 있다.
R2는 염기 또는 약산에 불안정한 보호 그룹, 예를 들어 우레탄 보호 그룹[예 : Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse 및 Tse, 바람직하게는 Fmoc(참조 : Hubbuch, Kontakte(Merck) 1979, No.3, pages 14-23)]이거나, 키랄 아미노산인 경우, D 또는 L 형태로 존재할 수 있는 아미노산의 잔기, 바람직하게는 α-아미노산이다. 천연 아미노산 및 이의 에난티오머, 동족체, 유도체 및 단순한 대사 산물의 잔기가 바람직하다(참조 : W
Figure kpo00002
nsch et al., Houben-Weyl 15/1 and 2, Stuttgart, Thieme 1974). 따라서, 적합한 예는 하기와 같다.
Aad, Abu, YAbu, ABz, ZABz,εAca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, BAib, ALa, BALa, ΔALa, ALg, ALL, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dtc, FeL, GLn, GLu, GLy,Guv, hCys, His, hSer, HyL, Hyp, 3Hyp, ILe, Ise, Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu, Lsg, Lys, BLys,ΔLys, Met, Mim, Min, nArg, NLe, Nva, OLy, Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, Pro, ΔPro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem, Ser, Thi, BThi, Thr, Thy, Thx, Tia, TLe, TLy, Trp, Trta, Tyr, VaL 및 상응하는 D-아미노산 에난티오머의 잔기.
상기 아미노산 잔기의 측쇄에 있는 작용 그룹은 보호된 형태로 존재할 수 있다. 적합한 보호 그룹이 문헌[참조 : Hubbuch, Kontakte(Merck)1979, No.3, pages 14-23,and by Bullesbach, Kontakte(Merck) 1980, No.1, pages23-35에 기술되어 있다.
또한 본 발명은 (a) 일반식(Ⅱ)의 화합물을 일반식(Ⅲ)의 화합물과 반응시키거나 (b) 일반식(Ⅳ)의 화합물을 하이드록실아민과 반응시켜 일반식(V)의 화합물을 수득하고, 이어서 옥심을, 바람직하게는 빙초산 중의 아연 또는 암모니아성 에탄올 중의 아연을 사용하여 아민으로 환원[참조 : S. Gaehde, G. Matsueda, Int. J. Peptide Protein Res. 18, 451(1981)]시킨 후, 필요한 경우 아민을 적합한 시약(예 : 클로로포름산 유도체 또는 탄소산 유도체)에 의해 R2가 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 아미노 보호 그룹이고 R3이 수소인 일반식( I )의 화합물로 전환시킴을 포함하여, 일반식( I )의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00003
상기식에서, R1은 (C1-C8)-알킬이고, Y1내지 Y9는 수소, (C1-C4)-알킬, (C1-C4)-알콕시 또는-O-(CH2)n-COOH(여기에서, 이들 라디칼은 동일하거나 상이할 수 있으나 하나의 라디칼은 -O-(CH2)n-COOH이다)이거나, Y1, Y2, Y5, Y6, Y7, Y8및 Y9는 수소, (C1-C4)-알킬 또는 (C1-C4)-알콕시(여기에서, 이들 라디칼은 동일하거나 상이하다)이고, Y3은 (C1-C8)-알콕시 또는 수소이며 Y4는 -(CH2)n-COOH 또는 -NH-CO-(CH2)n-COOH이며, n은 1 내지 6의 정수이고, R2는 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 우레탄 보호 그룹으로 보호된 아미노산 잔기이거나, 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 아미노 보호 그룹이며 R3는 수소 또는 (C1-C8)-알킬이다.
일반식(Ⅱ)의 화합물과 일반식(Ⅲ)의 화합물과의 반응은 바람직하게는 0℃ 내지 반응 혼합물의 비점에서 극성 양성자성 용매(예 : 아세트산)중에서 수행한다.
일반식(Ⅱ)의 화합물은, 예를 들어 일반식(Ⅳ)의 벤조페논 유도체를 적합한 환원제, 즉 케토 그룹에 대해 선택적인 환원제(예 : 나트륨 보로하이드라이드)로 환원시켜 수득한다.
Figure kpo00004
상기식에서, R1및 Y1내지 Y9는 상기 정의한 바와 같다.
일반식(Ⅳ)의 벤조페논 유도체는 (a) R1이 상기 정의한 바와 같고, Y1내지 Y9가 수소, (C1-C8)-알킬 또는 (C1-C8)-알콕시이며, 라디칼 Y1내지 Y9중 하나가 하이드록실인 일반식(Ⅳ)의 벤조페논을, 일반식(Ⅵ)의 ω-할로게노지방산 또는 이의 에스테르와 반응시키고, 에스테르의 경우, 계속해서 에스테르 그룹을 예를 들어 수산화나트륨 용액으로 알칼리 가수분해[참조 : M. Prashad et al., Indian J. Chem. 17B, 496-498(1979)]시키거나, (b) 예를 들어 일반식(Ⅶ)의 벤조일 클로라이드를 루이스 촉매(예 : 삼염화 알루미늄 또는 사염화티난)를 사용하여 일반식(Ⅷ)의 ω-페녹시알칸산과 반응[참조 : Organikum. 13th edition, page 354(1974)]시키거나, (c) 일반식(Ⅶ)의 적합한 벤조일 클로라이드를 일반식(Ⅸ)의 적합하게 치환된 페놀과 반응시켜 일반식(X)의 상응하는 페닐 에스테르를 수득하고, 이어서 루이스산(예 : 사염화티탄)으로 프리즈(Fries) 재배열[참조 : R. Martin et al., Monatsh. Chemie 110, 1057-1066(1979)]시킨 후, 일반식(Ⅵ)의 ω-할로게노 지방산과 반응시켜 수득한다.
Figure kpo00005
상기식에서, Hal은 할로겐이고, n은 상기 정의한 바와 같고, R1은 상기 정의한 바와 같고, Y1내지 R9는 수소, (C1-C8)-알킬 또는 (C1-C8)-알콕시이고, Y1내지 R9중의 하나는 하이드록실이고, Y3는-O-(CH2)n-COOR4이고, Y4는 상기 정의한 Y4와 같거나, Y3는 상기 정의한 Y3과 같고 Y4는 -(CH2)n-COOR4이며, R4는(C1-C8)-알킬, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이다.
Y3가 수소 또는 (C1-C8)-알콕시이고 Y4가 -(CH2)n-COOR4인 일반식(Ⅷ)의 화합물은, 예를 들어, Y4가 CHO인 적합한 벤즈알데히드를 피리딘/피페리딘 중의 말론산 모노에스테르와 반응시켜 상응하는 신남산 에스테르를 생성시키고, 이어서 수소화시켜 수득한다. 이 경우, n이 2인 일반식(Ⅷ)의 화합물이 수득된다. 또한 적합한 벤즈알데히드를 아연 존재하에 할로게노아세트산 에스테르와 반응시키고, 이어서 탈수시켜 신남산 에스테르를 수득한 후 수소화시킬 수 있다.
Y3가 -O-(CH2)n-COOR4이고 Y4가 Y4를 나타내는 일반식(Ⅷ)의 화합물은 일반식(Ⅸ)의 적합한 페놀을 적합한 ω-할로게노알칸산 에스테르(예 : 디메틸포름아미드(DMF) 중의 수소화나트륨 또는 아세톤 중의 탄산 칼륨)와 반응시켜 제조한다.
Figure kpo00006
또한 일반식(I)의 화합물에 관련된 일반식(Ⅶ),(Ⅷ),(Ⅸ) 및 (X)의 화합물도 유사하게 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 일반식(Ⅸ)의 화합물의 고체-상 합성 방법에서 일반식(I)의 화합물의 용도뿐만 아니라, 일반식(I)의 화합물을 펩타이드 화학 분야에서 통상적으로 사용되는 커플링제를 사용하여 -O-(CH2)n-COOR4, -NH-CO-(CH2)n-COOR4또는 -(CH2)n-COOR4그룹을 통하여 수지에 커플링시키고, 이어서 아미노산 잔기 R2의 보호그룹 또는 보호 그룹 R2를 제거한 다음, 염기 또는 약산에 불안정한 아미노 보호 그룹에 의해 일시적으로 보호되고, 필요한 경우 이들의 활성화된 유도체 형태인 q-pα-아미노산을 단계적으로 커플링시켜, 합성을 완결한 후, 일반식(XI)의 펩타이드를 온화한 강산으로 처리하여 수지로부터 분리시킴과 동시에 또는 분리시킨 후에 적합한 방법으로 일시적으로 도입된 측쇄 보호 그룹을 재차 제거시킴을 특징으로 하는, 일반식(XI)의 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
P-R2-NH-R3(XI)
상기식에서, P는 q≤p-α-아미노산으로 구성된 펩타이드 잔기이고, R2는 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 우레탄 그룹으로 보호된 아미노산 잔기, 또는 약산 또는 염기에 의해 제거될 수 있는 아미노 보호 그룹을 나타내고, R3은 상기 정의한 바와 같다.
부반응을 방지하거나 특정한 펩타이드의 합성이 필요한 경우, 아미노산의 측쇄에 있는 작용 그룹을 적합한 보호 그룹에 의해 추가로 보호되는데[참조 : T.W. Gree ne, Protective Groups in Organic Synthesis'', New York, John Wiley Sons(1981)], 주로 Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(C1-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl) 및 Thr(But)를 사용한다.
지지체 물질로서 사용되는 수지는 시판되는 것을 사용하거나 사용자에 의해 제조될 수 있다(예 : 알콕시벤진알콜 수지, 아미노메틸 수지 또는 벤즈하이드릴아미노 수지). 아미노메틸-, 벤즈하이드릴아미노-(BHA) 및 메틸벤즈하이드릴아미노-(MBHA) 수지가 바람직하다. 하중은 아미노산 분석 및/또는 원소 분석으로 측정한다.
일반식(I)의 화합물 및 다른 아미노산 유도체용 커플링체로서 펩타이드 합성에 사용되는 모든 가능한 활성화제를 사용할 수 있으나[참조 : Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie(Methods of Organic Chemistry),Volume15/2], 특히 카보디이미드(예 : N,N'-디사이클로헥실카보디이미드, N, N-디이소프로필카보디아미드 또는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디아미드)를 사용할 수 있다. 이 커플링 반응은 아미노산 유도체를 활성화제 및, 필요한 경우, 라세미화 억제제[예 : 4-디메틸아미노피리딘, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(참조 : W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2054(1970)]을 수지에 가하여 직접적으로 수행하거나, 이와는 달리 대칭성 무수물, HOBt 에스테르 또는 HOObt 에스테르로서 아미노산 유도체의 예비 활성화를 따로 수행한 후, 적합한 용매 중의 활성화된 아미노산의 용액을 커플링 반응이 준비된 펩타이드 수지에 가할 수 있다.
상술한 활성화제 중의 하나를 사용하여 일반식(I)의 화합물 및 아미노산 유도체의 커플링 및 활성화를 디메틸포름아미드 또는 메틸렌 클로라이드 또는 이 둘의 혼합물 중에서 수행할 수 있다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상적으로 1.5 내지 4배의 과량으로 사용된다. 커플링이 불완전할 경우, 커플링 반응을 서열 중의 후속하는 아미노산의 커플링에 필요한 펩타이드-수지의 α-아미노 그룹을 미리 탈차단시키지 않고 반복한다.
커플링 반응이 성공적으로 수행되었는가를 문헌[참조 : E. Kaiser et al. Anal. Biochem. 34595(1970)]에 기술된 바와 같이 닌하이드린 반응으로 확인할 수 있다. 합성은 또한, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사의 모델 430A 펩타이드 합성기를 사용하여, 기기 제작자가 제공하는 합성 프로그램이나 사용자 자신이 작성한 프로그램을 사용하여 자동적으로 수행할 수 있다. 특히 Fmoc 그룹으로 보호된 아미노산 유도체가 사용되는 경우 후자를 사용한다.
펩타이드 아미드는 펩타이드 합성에서 통상적으로 사용되는 온화한 강산(예 : 트리플루오로아세트산)및, 추가로, 양이온 포착제로서 페놀, 크레졸, 티오크레졸, 아니졸, 티오아니졸, 에탄디티올, 디메틸 설파이드, 에틸 메틸 설파이드 또는 고체상 합성에서 통상적으로 사용되는 유사한 양이온 포착제는, 이들 보조제 각각으로 또는 2개 이상의 혼합물로 처리하여 수지로부터 분리시킨다. 트리플루오로아세트산을 적합한 용매(예 : 메틸렌 클로라이드)로 희석시켜 사용할 수도 있다. 수지로부터의 스페이서의 제거는 측쇄 보호 그룹의 제거와 동시에 수행된다.
이러한 방법으로 수득된 미정제 펩타이드는 세파덱스(RSephadex), 이온 교환수지 또는 HPLC 상의 크로마토그래피로 정제한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이며 본 발명을 이에 한정시키려는 것이 아니다.
실시예 1
메틸 4-페녹시부티레이트
티오닐 클로라이드 16ml은 빙냉된 무수 메탄올 160ml에 적가하고, 이어서 페녹시 부티르산 36g을 분할하여 가한다. 이어서, 혼합물을 1시간 동안 40℃에서 교반시킨다. 이어서 과량의 메탄올을 진공하에 제거한 후, 잔류하는 잔사를 (-20℃로 냉각된) 석유 에테르로부터 재결정화한다. 수율 34.5g, 융점:25.5 내지 26.5℃.
실시예 2
메틸 4[4-(4-메톡시벤조일)페녹시]부티레이트
무수 알루미늄 트리클로라이드 25.6g을 1, 2-디클로로에탄 64ml중에 현탁시키고 4-메톡시벤조일클로라이드 28.6g을 가한다. 이어서, 격렬하게 교반시키면서, 메틸 4-페녹시부티레이트 31g을 서서히 가한다. 이어서, 반응 혼합물을 4시간 동안 50℃에서 교반시킨 후, 냉각하고, 빙수 중에 붓는다. 오일성 유기층 및 수성상을 분리시킨 후, 유기상을 물로 세척하고, 소량의 매탄올을 가하여 결정화를 유도한다. 분리시킨 생성물을 흡인 여과하고 에틸 아세테이트로부터 재결정화한다. 수율 41g, 융점:117 내지118℃
실시예 3
4[4-(4-메톡시벤조일)페녹시]-부티르산
실시예 2로부터 메틸 4-[4-(4-메톡시벤조일)페녹시]부티레이트 41g을 디메톡시에탄/물(4:1)600ml 중에 용해시키고 2N 수산화나트륨 용액 63ml 가한다. 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반시키고, 이어서 3N 염산으로 pH 3으로 산성화한후, 유기 용매를 진공하에 제거시킨다. 분리시킨 산을 여과하고, 진공하에 오산화인 상에서 건조시킨다. 수율:38.7g, 융점:141 내지 142℃.
실시예 4
[4-(3-카복시프로필옥시)페닐]-4-메톡시페닐카비놀
4-[4-(4-메톡시벤조일)페녹시]부티르산(실시예 3) 18.9g을 40℃에서 메탄올 600ml 중에 용해시키고 1N 수산화나트륨 용액 60ml 및 나트륨 보로하이드라이드 3.4g을 분할하여 가한다. 이어서, 혼합물을 1시간 동안 40℃에서 교반시켜 용적을 줄인 후, 3N 염산에 의해 pH 2.8로 조절한다. 이어서 메탄올을 회전 증발기를 사용하여 제거시키고, 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출한 후, 유기 용액을 포화된 염화나트륨 용액으로 세척한다. 황산나트륨 상에서 건조시켜 용매를 제거한다. 무정형 물질 18.2g이 잔류하면, 이를 즉시 추가로 반응시킨다.
Fmoc-아미드(9-플루오레닐메틸카바메이트)를 카비놀 유도체상으로 커플링시키는 일반적 방법.
Fmoc-아미드 20mmol 및 갓 제조된 카비놀 20mmol을 뜨거운 빙초산 50ml 중에 용해시킨다. 이어서 농축된 황산 5방울을 가하고 혼합물을 실온이나 40℃에서 교반시킨다. 반응의 진행을 박층 크로마토그래피로 점검한다. 반응이 완결된 후, 빙초산 용액을 빙수 중에 붓고, 분리시킨 생성물을 흡인 여과시킨후, 재결정화한다.
실시예 5
N-Fmoc-[4-(3-카복시프로필옥시)페닐]-4-메톡시페닐 메틸아미드
실시예 4에서 제조된 [4-(3-카복시프로필옥시)페닐]-4-메톡시페닐카비놀을 상기 공정에 의해 반응시킨다. 수율:91%, 융점:186 내지 187℃
C33H31NO6에 대한 원소분석 :
계산치 : C73.73 H 5.81 N 2.61
실측치 : C73.6 H 6.0 N 2.6
실시예 6
N-Fmoc-[4-(3-카복시메틸옥시)페닐]-4-메톡시페닐메틸아미드
독일연방공화국 특허원 제P37 11 866.8호에 기술된[4-(3-카복시메틸옥시)페닐]-4-메톡시페닐카비놀(실시예 3)을 상기 공정에 의해 반응시킨다. 수율:60%, 융점:176 내지 179℃
C31H27NO6에 대한 원소분석 :
계산치 : C 73.15 H 5.35 N 2.75
실측치 : C 73.3 H 5.3 N 2.95
실시예 7
실시예 5에 기술된 앵커를 사용한 H-Leu-Gly-Gly-Gly-Gln-Gly-Lys-Val-Leu-Gly-NH2의 합성
합성은 래보텍(Labotec) 펩타이드 합성기를 사용하여 수행한다.
먼저, 보호 그룹을 메틸렌 클로라이드 중의 트리플루오로 아세트산을 사용하여 Boc-Val-수지(0.76mmol/g)로부터 제거한다. 수지를 디클로로메탄 및 에틸디이소프로필아민으로 세척하고 이어서 다시 디클로로메탄으로 세척한 후, 건조시킨다. 이어서 실시예 5에서 제조된 앵커 2.1mmol을 무수 DMF20ml 중에 용해시킨 HOBt 3.15m mol과 함께 수지에 가하고 이어서 디이소프로필카보디이미드 2.3mmol을 가한다. 혼합물을 서서히 혼합하면서, 밤새 실온에서 반응시킨다. 반응이 완결되었는가를 닌하이드린 반응(Kaiser 시험)으로 점검한다. 이어서 수지를 흡인 여과시키고, DMF로 세척한 후, 펩타이드를 수지(상기 제조된 수지 1g을 합성에 사용한다)상에서 합성하고, 다음 단계들을 순환적으로 수행한다.
-DMF 중의 20% 피페리딘으로 Fmoc 보호 그룹 제거
-수지를 DMF로 세척
-동일 반응계 내에서 활성화 시약으로서 디이소프로필카보디 이미드를 사용하여 HOBt 에스테르로서 활성화(아미노산 1.5mmol, HOBt 2.25mmol, 디이소프로필카보디아미드 1.6mmol)시키면서, Fmoc-아미노산을 커플링시킴.
커플링이 불완전한 경우(Kaiser 시험), 커플링 단계를 반복한다. 사용된 맨 마지막 순서의 아미노산은 Boc-Leu-OH이다.
합성이 완결된 후, 수지를 DMF 및 이소프로판올로 세척하고 고진공하에 건조시킨다. 제거 반응은 2.5시간 동안 실온에서 트리플루오로아세트산 20ml/이클로로메탄 15ml/티오아니솔 5ml/에탄디티올 0.5ml의 혼합물로 수행한다. 이어서, 혼합물을 디에틸 에테르 중으로 흡인 여과시킨 후, 디클로로메탄 중의 50% 농도 트리플루오로아세트산으로 세척한다. 분리시킨 미정제 펩타이드를 흡인 여과시키고, 디에틸 에테르로 3회 세척한 후, 고진공하에 건조시킨다.
수율:미정제 펩타이드 91%
아미노산분석:Gly5.1 ; Glu 0.98 ; Leu 1.78 ; Val 0.81 ; Lys 1.01.
실시예 8
에틸 2, 4-디메톡시신나메이트
2, 4-디메톡시벤즈알데히드 83g 및 모노에틸말로네이트 66g을 무수 피리딘 100ml 중에 용해시키고, 피페리딘 1ml 및 분자체 40g을 가한 후, CO2발생이 멈출때까지 환류시킨다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 분쇄된 얼음상으로 부은 후, 농축된 염산으로 교반시키면서 pH 1 내지 2로 조절한다. 20분 동안 교반시키고, 분리시킨 생성물을 흡인 여과시킨 후, 1N 염산 및 물로 세척하고, 건조기 내에서 건조시킨다.
수율 : 100.2g, 융점 : 58℃.
실시예 9
에틸 2, 4-디메톡시하이드로신나메이트
에틸 2, 4-디메톡시신나메이트 100.2g을 메탄올 400ml 중에 용해시키고 대기압하에 팔라듐/목탄으로 수소화시킨다. 촉매를 흡인 여과시키고 여액을 진공하에 농축시킨다.
수율 : 황색 오일 94.7g.
실시예 10
에틸 3-[2, 4-디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)페닐]프로피오네이트
알루미늄 트리클로라이드 52g을 1, 2-디클로로에탄 200ml중에 현탁시키고 0℃로 냉각시킨다. 이어서, 이 온도에서, 4-메톡시벤조일 클로라이드 66.5g을 적가하고 이어서 1, 2-디클로로 에탄 30ml1 중의 에틸 2, 4-디메톡시하이드로신나메이트 94. 7g을 적가한다. 이어서 혼합물을 반응이 완결될 때까지 수분을 제거시키면서 50℃에서 가열한다. 이어서, 반응 혼합물을 빙수 중에 붓고, 유기상을 분리 제거시킨 후, 메틸렌 클로라이드 200ml으로 희석시키고, 중탄산나트륨 용액 및 물로 추출한다. 황산 마그네슘상에서 건조시키고 농축시킨다. 회갈색 고체가 잔류하면 즉시 추가로 반응시킨다.
수율 : 128.9g, 융점 89℃.
실시예 11
3-[2, 4-디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)페닐]프로피온산
에틸 3-[2, 4-디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)-페닐]프로피오네이트 55.8g을 2N 수산화 나트륨 용액 300ml 및 디옥산 300ml과 혼합하고 밤새 교반시킨다. 이어서, 디옥산을 진공하에 제거시키고, 알칼리 수용액을 에틸 아세테이트 100ml로 1회 추출한다. 생성물의 일부가 분리되었을때, 수성상을 농축된 염산에 의해 pH 2로 조절한다. 혼합물을 각각 에밀 아세테이트 200ml로 3회 추출하고, 유기상을 물로 세척한 후, 황산 나트륨 상에서 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트/아세톤/헥산으로부터 재결정화한다.
수율 : 37g, 융점 : 177 내지 180℃
실시예 12
메틸 2, 4-디메톡시신나메이트
2, 4-디메톡시벤즈알데히드 105.6g, 메틸 칼륨 말로네이트 93.6g, 피리딘(KOH 상에서 건조시킴)200ml, 피페리딘 1.2ml, 아세트산 36ml 및 3A 분자체 48g의 혼합물을 CO2발생이 멈출 때까지 150℃에서 가열한다. 뜨거운 용액을 얼음 상에 붓고, 혼합물을 농축된 염산에 의해 pH 1 내지 2로 조절한후, 20분 동안 빙욕 내에서 교반시킨다. 침전물을 흡인 여과시키고, 1N HCl 및 물로 세척한 후, 건조시킨다.
수율 : 113.8g, 융점 : 78℃
실시예 13
2, 4-디메톡시신남산
무수 피리딘 180ml을 자기 교반기, 환류 응축기 및 내부 온도계가 구비된 1
Figure kpo00007
들이 삼구 플라스크 내에 넣고, 그안에서 말론산 124.9g을 교반에 의해 용해시킨다. 이어서 2, 4-디메톡시 벤즈알데히드 166.18g을 분할하여 가하면, 이 과정 동안 내부 온도가 25
Figure kpo00008
로 떨어진다. 무수 피페리딘 9.9ml을 생성 혼합물에 가하고, 이어서 서서히 가열한다. 욕(bath) 온도를 130℃로 조절한다. 1.5시간 후 CO2발생이 완결되면, 혼합물이 107℃에서 비등한다. 이어서 뜨거운 혼합물을 얼음 1kg 중에 붓는다. 혼합물을 교반시키면서 농축된 HCl에 의해 pH 2로 산성화시키고, 20분 동안 얼음중에서 냉각시키면서 계속 교반시킨후, 침전물을 흡인 여과시킨다. 이것을 매회 2N HCl 200ml 및 물 200ml로 3회 세척하고 건조시킨다. 여전히 잔류하는 알데히드는 침전물을 뜨거운 사이클로헥산 600ml 중에 현탁시킨 후 다시 흡인여과시켜 제거한다. 이어서 생성물을 뜨거운 사이클로헥산 100ml로 세척하고 건조기 내에서 건조시킨다. 알데히드는 냉각시 여액으로부터 결정화된다. 또 다른 가능한 정제 방법은 메탄올/물로부터의 재결정화를포함한다. 이를 위하여, 생성물을 최소량의 뜨거운 메탄올 중에 용해시키고 물을 단백광에 가한다. 냉각시, 알데히드는 용액 중에 잔류하나 신남산은 분리된다.
수율 : 신남산 181.4(사이클로헥산으로 처리됨)
알데히드 14.5g(사이클로헥산으로부터 침전됨)
융점 : 182 내지 184℃
실시예 14
메틸 3-(2, 4-디메톡시페닐)프로피오네이트
2,4-디메톡시신남산 20.8g을 메탄올 500ml 및 에틸아세테이트 100ml의 뜨거운 혼합물에 용해시키고, 촉매(10% Pd/c) 1g을 가한 후, 대기압하에 수소화한다. 수소 흡수는 3시간 후에 완결되어야 한다. 수소화가 불완전한 경우, 더욱 많은 새로운 촉매를 가한다. 반응이 완결된 후, 촉매를 제거하고, 용액을 약 200ml로 농축시킨 후, 약 2.4M 메탄올성 염산 용액 20ml을 가하고, 혼합물을 약 2일 동안 실온에서 정치시킨다. 그러면 에스테르화가 완결된다. 메탄올을 진공하에 제거하고, 잔사를 에틸 아세테이트 200ml 중에 용해시킨 후, 유기상을 NaHCO3용액 및 포화된 NaCl 용액으로(매회 50ml씩 3회) 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고 농축시킨다.
수율 : 오일 20.0g
실시예 15
메틸 3-(2, 4-디메톡시페닐)프로피오네이트
메틸 2, 4-디메톡시신나메이트 113.8g을 가열시키면서 메탄올 1.5
Figure kpo00009
중에 용해시키고 촉매(10% Pd/c) 5g 상에서 수소화시킨다. 촉매를 여과로 제거시키고 여액을 농축시킨다. 오일 113g이 잔류하면, 이를 후속하는 프리델-크래프츠(Friedel-Crafts) 아실화 반응에 즉시 사용한다.
수율 : 오일 113g.
실시예 16
메틸 3-[2, 4-디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)페닐]프로피오네이트
삼염화 알루미늄 36.6g을 1, 2-디클로로에탄 130ml 중에 현탁시키고, 4-메톡시벤조일 클로라이드 42.65g을 0℃로 냉각시킨 혼합물에 가한다. 이어서, 이 온도에서,1, 2-디클로로에탄 30ml 중에 용해시킨 메틸 3-(2, 4-디메톡시페닐)프로피오네이트(실시예 17) 56g을 적가하고, 이어서 혼합물을 반응이 완결될 때까지(약 36시간) 수분을 제거하면서 50℃에서 교반시킨다. 물 200ml을 냉각된 반응 혼합물에 가한 다음 CH2Cl2400ml로 희석시키고 중탄산염 및 물로 추출한 후, 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 디이소프로필 에테르 중에 용해시키고 헥산으로 침전시킨다. 흡인 여과하여 생성물 62.1g을 수득하고 모액(mother liquor)으로부터 10.5g을 추가로 수득한다.
수율 : 72.6g, 융점 : 114 내지 117℃
실시예 17
3-[ 2, 4 -디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)페닐]프로피온산
메틸 3-[2, 4-디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)페닐]프로피오네이트 60.9g을2N 수산화나트륨 용액 300ml 및 디옥산 300ml와 혼합하고 밤새 교반시킨다. 이어서, 디옥산을 진공하에 제거하고 알칼리 수용액을 에틸아세테이트 100ml로 1회 추출한다. 생성물의 일부가 분리된 경우, 수성상을 농축된 염산에 의해 pH 2로 조절한다. 혼합물을 매회 에틸 아세테이트 200ml로 3회 추출하고, 유기상을 물로 세척한후, 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트/아세톤/헥산으로부터 재결정화한다.
수율 : 51.3g, 융점 : 177 내지 180℃
실시예 18
5-카복시에틸-2, 4-디메톡시-4'-메톡시벤조페논 옥심
3-[2, 4-디메톡시-5-(4-메톡시벤조일)페닐]프로피온산 37g,하이드록실아민 하이드로클로라이드 22.4g 및 (무수) 아세트산 나트륨 21g을 무수 에탄올 300ml에 가하고, 혼합물을 24시간 동안 습기를 배재하면서 환류시킨다. 불용성 물질을 흡인 여과시켜 제거하고, 여액을 농축시킨 후, 물을 잔사에 가한다. 이어서, 1N 염산에 의해 pH 2로 조절하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출한다. 유기상을 물로 세척하고 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화한다.
수율 : 34.4g, 융접 : 124 내지 128℃
실시예 19
N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-(5-카복시에틸-2, 4-디메톡시페닐)-4-메톡시페닐메틸아민
5-카복시에틸-2, 4-디메톡시-4'-메톡시벤조페논 옥심 34g을 에타올 10 0ml 및 25% 농도 암모니아 용액 500ml의 혼합물에 가하고, 이어서 아연 분말 29.5g을 가한 후, 혼합물을 밤새 50℃에서 교반시킨다. 이어서, 추가로 아연 30g 및 25% 농도 암모니아 260ml를 가하고, 혼합물을 추가의 24시간 동안 50℃에서 교반시킨다. 뜨거운 상태에서 아연을 흡인 여과로 제거시키고, 에탄올을 진공하에서 제거시킨다. 냉각된 수성상을 농축된 염산으로 중화시키고 에틸 아세테이트로 1회 추출한다.
생성된 아민을 분리시키지 않고 수용액을 즉시 추가로 반응시킨다. 이를 위하여, 용액을 고체 중탄산나트륨으로 pH 8로 조절하고, 테트라하이드로푸란 250ml를 희석시킨 후, 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카보네이트 31g을 가하고, 혼합물을 밤새 교반시킨다. 이어서 불용성 물질을 여과시켜 제거하고, 테트라하이드로푸란을 진공하에 제거시킨 후, 수성 상을 1N 황산으로 산성화시킨다. 이를 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 포화된 염화나트륨 용액으로 세척한 후, 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 뜨거운 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 잠시 냉각시킨 후, 에테르를 가하고, 이어서 헥산을 단백광에 가한다. 혼합물을 밤새 냉각실에 정치시키고, 분리시킨 생성물을 흡인 여과시킨 후,다시 상술된 방법으로 1회 결정화된다.
수율 : 37.1g, 융점 : 149 내지 151℃
이와는 다른 방법으로, 생성물을 암모니아성 에탄올 중의 10% 팔라듐/목탄 상에서 옥심을 촉매 수소화시킨 후, 상기한 방법으로 9-플루오레닐메틸 숙신이미딜 카보네이트와 반응시켜 수득할 수도 있다.
실시예 20
Fmoc-아미드-수지의 제조
아미노메틸화된 폴리스티렌 수지(g당 NH21.04mmol) 30.7g 및 N-(9-플루오레닐메톡시카보닐)-(5-카복시에틸-2, 4-디메톡시페닐)-4'-메톡시페닐메틸아민 28g(49.5mmol)을 디메틸 포름아미드 210ml 및 디클로로메탄 90ml의 혼합물 중에 현탁시킨다. HOObt 6.4g 및 디이소프로필카보디이미드 23ml을 가하고 혼합물을 밤새 진탕시킨다. 반응이 완결된 후, 수지를 흡인 여과시키고 DMF, DCM 및 MTB 에테르로 세척한다. 고진공하에 건조시켜 0.57mmol/g(원소 분석으로 측정) 또는 0.54mmol/g (Fmoc-NH2를 시험적으로 제거시켜 HPLC로 정량화)이 부하된 생성물 46.5g을 수득한다.
펩타이드 합성
하기 반응 공정이 펩타이드 합성에 사용된다: DMF 중의 20% 피페리딘을 사용한 Fmoc 보호 그룹의 제거하는 단계, NMP로 세척하는 단계, NMP 중에 용해된 HOObt 에스테르로서 또는 DMF 또는 NMP중의 디이소프로필카보디이미드로 동일 반응계 내에서 미리 활성화시킨 HOObt 에스테르로서 후속하는 Fmoc-아미노산을 커플링 단계, 및 NMP로 세척하는 단계. 이 사이클을 펩타이드를 수지상에 합성할때까지 실시한다. 커플링 반응의 효율을 닌하이드린 시험으로 점검할 수 있다.
실시예 21
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
펩타이드를 상기 제조된 수지 877mg 상에서 합성한다. 미정제 펩타이드를 1시간 동안 실온에서 TFA/에탄디티올/티오아니솔(90/5/5)을 사용하여 제거한다. 미정 재 생성물 450mg을 수득하여 HPLC로 확인한 결과 진짜 샘플과 동일한 것으로 판명됐다.
FAS MS(Tg, TFA) : 1182(M+M+)
실시예 22
H-Leu-Leu-Gln -Gly-Leu-Val-NH2
펩타이드를 상기 제조된 수지 877mg 상에서 합성한다. 미정제 펩타이드를 1시간 동안 실온에서 TFA/물 95/5를 사용하여 제거한다. 미정제 생성물 38mg을 수지 100mg으로부터 수득하여 확인한 결과 진짜 샘플과 동일한 것으로 판명됐다.
FAB MS(3-NBA) : 641(M+H+)
실시예 23
H-Ile-Pro-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH
이 펩타이드를 상술된 바와 같은 수지 877mg 상에서 합성한다. 커플링된 제1 아미노산은 Fmoc-Glu-OtBu이다. 수지를 95% TFA/물로 제거한 후, C-말란 글루타민을 갖는 펩타이드를 수득한다.

Claims (4)

  1. 일반식(I)의 화합물.
    Figure kpo00010
    상기식에서, R1은 메틸이고, R2는 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카보닐)이고, R3은 수소이고, Y1, Y2및 Y4내지 Y9는 수소이고, Y3은 -O-(CH2)n-COOH이거나, Y2및 Y5내지 Y9는 수소이고, Y1및 Y3은 메톡시이며, Y|4는 -(CH2)n-COOH이고, n은 1 내지 3의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 라디칼 Y2및 Y5내지 Y9가 수소이고, Y1및 Y3이 메톡시이며, Y4가 -(CH2)2-COOH인 일반식( I )의 화합물.
  3. (a) 일반식(Ⅱ)의 화합물을 일반식(Ⅲ)의 화합물과 반응시키거나 (b) 일반식(Ⅳ)의 화합물을 하이드록실아민과 반응시켜 일반식(V)의 화합물을 수득한 다음 생성된 일반식(V)의 옥심을 아민으로 환원시킨 후 아민을 R2가 Fmoc이고, R3이 수소인 일반식(I)의 화합물로 전환시킴을 특징으로 하여, 제1항 또는 제4항에 따른 일반식( I )의 화합물을 제조하는 방법.
    Figure kpo00011
    상기식에서, R1은 메틸이고, R2는 Fmoc이며, R3은 수소이고, Y1, Y2및 Y4내지 Y9는 수소이고, Y3은 -O-(CH2)n-COOH이거나, Y2및 Y5내지 Y9는 수소이고, Y1및 Y3은 메톡시이며, Y4는 -(CH2)n-COOH이고, n은 1 내지 3의 정수이다.
  4. 제1항에서 정의된 바와 같은 일반식(I)의 화합물을 펩타이드 화학 분야에서 통상적으로 사용되는 커플링 시약을 사용하여 -O-(CH2)2-COOH 또는 -(CH2)|n-COOH 그룹을 통하여 수지에 커플링 시키고, 이어서 보호 그룹 R2를 제거한 후, 염기 또는 약산에 불안정한 아미노 보호 그룹에 의해 일시적으로 보호되고 이들의 활성화된 유도체 형태로 존재할 수 있는 q-pα-아미노산을 단계적으로 커플링시켜, 합성을 완결한 후, 일반식(XI)의 펩타이드를 온화한 강산으로 처리하여 수지로부터 분리시킴과 동시에 또는 분리시킨 후에 적합한 방법으로 일시적으로 도입된 측쇄 보호 그룹을 재차 제거시킴을 특징으로 하여, 고체-상 합성 방법으로 일반식(XI)의 펩타이드를 제조하는 방법.
    P-R2-NH-R3(XI)
    상기식에서, P는 q≤p+1α-아미노산으로 구성된 펩타이드 잔기이고, R2는 Fmoc이고, R3은 수소이다.
KR1019880017020A 1987-12-22 1988-12-20 고체-상 방법에 따른 펩타이드 아미드 합성을 위한 산-불안정한 앵커 그룹 KR0128341B1 (ko)

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DEP3743620.1 1987-12-22
DE3743620 1987-12-22
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DEP3818576.8 1988-06-01

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