JPWO2007020871A1

JPWO2007020871A1 - デプシペプチド含有注射液

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Publication number: JPWO2007020871A1
Application number: JP2007530969A
Authority: JP
Inventors: 戸田　篤志; 篤志戸田; 裕青木; 清樹小島; 中田　克紀; 克紀中田
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2009-02-26
Also published as: WO2007020871A1; US20090105130A1; EP1920779A4; CA2618439A1; EP1920779A1

Abstract

【課題】分子内のジスルフィド結合を有するデプシペプチドを含有し、製造が容易でかつ安定な注射液製剤の提供。【解決手段】塩化第二鉄等の物質を配合し、ｐHを７．０以下ｐH１．０以上とした液を窒素置換することにより、長期間の安定性に優れた注射液製剤の提供が可能となった。【発明の効果】本発明の注射液は、分子内に二重結合を有するデプシペプチドの凝集体、集合体の生成を回避し、保存性にも優れた注射剤の提供を可能とするものとして期待される。

Description

本発明は、（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
を含有するｐH７．０以下ｐH１．０以上のデプシペプチド含有注射液、並びに当該注射液を容器に充填し、空間部を窒素置換したデプシペプチド含有注射液製剤及びその製造方法に関する。

蛋白質においては、銅イオン、あるいは鉄イオンの酸化による血管由来蛋白繊維芽細胞成長因子（FGF−1）の分子内ジスルフィドの結合が起こり、蛋白質の二量体が生成することが報告されている（
）。また、合成化合物においては、SH基が凝集、重合に強く関与しており、そのSH基の位置等が、当該合成物の重合等に若干の影響を及ぼすことが報告されている（）。

二量体、重合体は、ヒトに投与する際の異物と考えられるので、これらの生成を回避する必要がある。しかしながら、蛋白質や合成化合物の二量体、重合体の生成が報告がされる一方で、ジスルフィド結合やSH基を有している物質が全て凝集や重合を起こすわけではなく、それぞれの物質特有の現象であることも知られている。したがって、その凝集や重合に対応し得る画一的な手段は確立されていないのが現状である。

分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することにより癌抑制系遺伝子の発現を上昇させ、細胞増殖阻害、細胞死誘導、血管新生阻害、形態正常化、分化誘導などの多面的な薬理作用により、強力な抗腫瘍作用が期待される新規作用機序を有するペプチドの半合成化合物とも言えるものである（
、）。これまでに知られている当該デプシペプチド化合物を含有する注射剤は、デプシペプチド化合物を有機溶媒等に可溶化した後に凍結乾燥させることにより製した凍結乾燥製剤であった。従って、凍結乾燥製剤の製造時の煩雑性、及び投与の際に溶解させる等の用時調製の煩雑性等を考慮すると、当該デプシペプチド化合物を含有し、製造が容易でかつ安定な注射液、並びに注射液製剤の提供が望まれている。

国際公開第００／４２０６２号パンフレット特開２００１−３１６２８３号公報カートら、「インアクチベーションオブヒューマンフィブロブラストグロースファクター−１（FGF-1）アクティビティバイインターラクションウィズコッパーアイオンズインボルブズ FGF−１ダイマーフォーメーションインデューストバイコッパー−カタライズドオキシデーション」、ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、1992、 Vol 267、 No.16、 p. 11307-11315、(Kurt A. Engleka et al.「Inactivation of Human Fibroblast Growth Factor-1 (FGF-1) Activity by Interaction with Copper Ions Involves FGF-1 Dimer Formation Induced by Copper-catalyzed Oxidation」、 The Journal of Biological Chemistry、1992、 Vol 267、 No.16、 p. 11307-11315）ササキら、「シンセーシス、バイオアクティビティ、アンドクローニングオブザエルタイプカルシウムチャネルブロッカー ω−コノトキシン TxVII」、バイオケミストリー、1999、38、p.12876-12884、（Toru Sasaki et al、「Synthesis、 Bioactivity、 and Cloning of the L-type Calcium Channel Blocker ω- Conotoxin TxVII、 Biochemistry、1999、38、p.12876-12884）

本発明者らは、分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物であり、水難溶解性である以下の式（I）に示す化合物（以下、化合物Aとする）を含有する注射液製剤の検討を進めていたところ、プロピレングリコール等で可溶化した化合物Aを用いて注射液製剤を調製し放置すると、難溶な凝集体、重合体が生成される現象を認めた。また、pHの上昇に伴い化合物Aの定量値の低下を招き、注射液が不安定になる現象も認めた。当該凝集体または重合体生成の回避につき検討を進めたところ、特定の酸化剤、還元剤のみが凝集、重合体生成の回避に効果を奏すること、及び塩酸、硫酸、クエン酸等の酸性物質により液のpHを７．０以下ｐH１．０以上とすることにより、更に長期間の保存安定性を確保できることを知見して本発明を完成するに至った。

（式中Rは、イソプロピル基、sec-ブチル基またはイソブチル基を意味する。）

すなわち本発明は、
１．
（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
を含有するｐH７．０以下ｐH１．０以上のデプシペプチド含有注射液、
２．
デプシペプチド化合物が一般式（I）で示される請求項１に記載のデプシペプチド含有注射液、
３．
可溶化剤がエタノール、メタノール、1-プロパノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、N、N-ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ポリソルベート80、ポピドン、ヒマシ油からなる群より選択される1種以上である請求項２に記載のデプシペプチド含有注射液、
４．
デプシペプチド化合物の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ−１００ｍｇ／ｍＬである請求項３に記載のデプシペプチド含有注射液、
５．
デプシペプチド化合物の濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ−５０mg/mLである請求項３に記載のデプシペプチド含有注射液、
６．
（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
を含有するｐH７．０以下ｐH１．０以上のデプシペプチド含有注射液を容器に充填し、空間部を窒素置換したデプシペプチド含有注射液製剤、
７．
（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
を含有するｐH７．０以下ｐH１．０以上のデプシペプチド含有注射液を調製し、その後容器に充填し、更に空間部を窒素置換したデプシペプチド含有注射液製剤の製造方法、
に関する。

本発明注射液をさらに詳細に説明する。
本発明におけるデプシペプチド化合物とは、構成単位にアミノ基を持たないものが存在し、ペプチド結合のほかにエステル結合が存在するペプチドを意味する。言い換えるとアミノ酸とオキシ酸で構成されるペプチドである。オキシ酸とはアミノ酸のアミノ基をヒドロキシ基に置き換えた化合物である。具体的には、特開２００１−３５４６９４号公報に記載されている化合物群等を挙げることができる。中でも、特開２００１−３５４６９４号公報に記載されている化合物Aが好ましい。

本発明における、分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物の濃度としては、例えば、本願発明デプシペプチド化合物を０．１ｍｇ／ｍＬ−１００ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、０．５ｍｇ／ｍＬ−５０ｍｇ／ｍＬである。５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度の場合、生理食塩液などの生理学的に許容され得る液で希釈して緩徐な静脈内投与、点滴静脈内投与に供することができる他、希釈せずに静注等の局所投与を行うことも可能である。

水難溶解性であるデプシペプチド化合物、特に化合物Ａを可溶化するため、製薬学的に許容される可溶化剤を適宜選択することができる。具体的には、エタノール、メタノール、1-プロパノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類、N、N-ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ポリソルベート８０、ポビドン、ヒマシ油等を用いることができる。
好ましくは、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールである。更に好ましくは、プロピレングリコールである。

なお、本発明者らが測定したこれら可溶化剤に対する化合物Ａの溶解度は、それぞれ、２８ｍｇ／ｍＬ（メタノール）、２１ｍｇ／ｍＬ（1-プロパノール）、２９ｍｇ／ｍＬ（ベンジルアルコール）、３０ｍｇ／ｍＬ（クロロブタノール、エタノールの助溶媒とした場合）、２２ｍｇ／ｍＬ（プロピレングリコール）、１７ｍｇ／ｍＬ（ポリエチレングリコール、M.W.400）、９０ｍｇ／ｍＬ（N、N-ジメチルアセトアミド）、２９ｍｇ／ｍＬ（アセトニトリル）（以上、全て関東化学社製の溶媒を使用）である。

本発明に用いられる凝集体、重合体生成を抑制する酸化剤、還元剤としては、塩化第二鉄、硫酸銅、ジチオスレイトール（DTT）が挙げられる。好ましくは、上市されている注射液に添加物として使用されている経験があり重大な有害作用が報告されていない塩化第二鉄である。塩化第二鉄と硫酸銅は混合して用いてもよく、また、それぞれを単独で用いても良い。これら酸化剤、還元剤は市販のものが使用でき、例えば、塩化鉄（III）（和光純薬工業製）、硫酸銅（II）・五水和物（和光純薬工業製）、ジチオスレイトール（ナカライテスク社製）などが挙げられる。

前記凝集体、重合体生成を抑制する物質の添加量としては、分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物１ｍｇ当たり通常２μｇ以下、好ましくは０．５μｇ−２μｇである。

本発明では、注射液のｐHを７．０以下ｐH１．０以上にするために酸性物質を用いるが、通常製薬学的に許容され当該デプシペプチド化合物の安定化に寄与するものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、コハク酸、酢酸アンモニウム、乳酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、チオグリコール酸、氷酢酸、メタンスルホン酸、無水マレイン酸、リンゴ酸、リン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、酢酸、ニコチン酸などが挙げられる。製造上の観点から望ましいものとしては、塩酸、硫酸、リン酸である。また、最適には塩酸である。これらの酸性物質は一種または二種以上を混合して用いてもよい。酸性物質の添加量としては、本発明におけるデプシペプチド化合物１モル当たり０．０１モル−０．２モル、好ましくは０．０５モル−０．１モルである。

本発明の注射液のpHとしては、好ましくは７．０以下１．０以上であり、さらに好ましくは４．０以下１．０以上である。本発明の注射液のpHは、生理食塩液などの生理学的に許容され得る液で希釈して最終的に当該範囲に調節されるように上述の酸性物質を配合する。

本発明の注射液には、ベンジルアルコール、塩酸メピバカイン、塩酸キシロカイン等の無痛化剤、ベンジルアルコール、パラ安息香酸メチル、パラ安息香酸プロピル、チメロサール、クロロブタノール等の防腐剤などの添加剤を必要に応じて添加することができる。また、局所毒性緩和のためグルコース、塩化ナトリウム、グリシン、マンニトール等の親水性低分子などの添加剤を必要に応じて添加することができる。また、マンニトール、イノシトール、マルトース、シュークロース、ラクトース等の糖類、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン等のアミノ酸等も必要に応じて添加が可能である。
本発明の注射液は、生理食塩液等の塩化ナトリウム注射液、糖類輸液、電解質輸液、及びその他の輸液類、好ましくは、糖類輸液との配合性に優れており、これらの輸液と配合して使用することも可能である。

次に本発明注射液の製造法を説明する。
本発明注射液を製造する工程においては、プロピレングリコール等の可溶化溶媒に塩化第二鉄等の重合体を抑制する物質と注射用水を加え、塩酸等のpH調節剤を加えて攪拌溶解後、化合物A等のデプシペプチド化合物を加えて加温溶解する。その後、注射液製剤とするために、無菌ろ過を行い所定の容器に充填し、窒素を封入する。
また、本発明の注射液は、調製中の分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物の含量低下を可能な限り回避するため、加熱滅菌以外の公知の無菌操作法により製造されることが好ましい。さらに、調製液に窒素ガスを通気したり、アンプルまたはバイアル空間部を窒素ガスなどの不活性気体で満たすなど、製品が酸素に触れぬよう処理することも可能である。また製造中の薬物の光分解を防ぐ目的で暗所で操作しても良い。

以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明の範囲が限定されるものではない。

（プロピレングリコール90%、塩化第二鉄20μg/mL＋塩酸含有20mg/mL注射液）
化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．塩化第二鉄300mgを1mol/Lの塩酸水溶液に溶解し50mLとした。化合物Aを完全に溶解させ、化合物Aが20mg/mL、塩化第二鉄が20μg/mLとなるように混和し、さらに注射用水を加えて全量を1000mLとし、pHが２．２（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は98.5%であった。

（プロピレングリコール90%、硫酸銅18.5μg/mL＋塩酸含有20mg/mL注射液）
化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．硫酸銅277.5mgを1mol/Lの塩酸水溶液に溶解し50mLとした。化合物Aを完全に溶解させ、化合物Aが20mg/mL、硫酸銅が18.5μL/mLとなるように混和し、さらに注射用水を加えて全量を1000mLとし、pHが２．１（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は97.1%であった。

（プロピレングリコール90%、DTT11.4μg/mL＋塩酸含有20mg/mL注射液）
化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．DTT171mgを1mol/Lの塩酸水溶液に溶解し50mLとした。化合物Aを完全に溶解させ、化合物Aが20mg/mL、DTTが11.4μL/mLとなるように混和し、さらに注射用水を加えて全量を1000mLとし、pHが２．１（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は95.4%であった。

比較例１（重合体生成を抑制する物質・液のpHを下げるための酸性物質を添加しない場合）

化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．注射用水10mLに化合物Aを溶解したプロピレングリコール溶液を加えて100mLとし、化合物Aを完全に混和させ、化合物Aが20mg/mLとなる、pHが４．４（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は18.2%であった。

比較例２（重合体生成を抑制する物質を添加しない場合）

化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．1mol/Lの塩酸水溶液0.33gに注射用水を加えて10mLメスアップした液に化合物Aを溶解したプロピレングリコール溶液を加えて100mLとし、化合物Aを完全に混和させ、化合物Aが20mg/mLとなる、pHが１．５（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は91.8%であった。

比較例３（比較例２に対して窒素置換を実施しない場合）

化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．1mol/Lの塩酸水溶液0.33gに注射用水を加えて10mLメスアップした液に化合物Aを溶解したプロピレングリコール溶液を加えて100mLとし、化合物Aを完全に混和させ、化合物Aが20mg/mLとなる、pHが２．１（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填後に打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は48.4%であった。

比較例４（重合体生成を抑制する物質としてo−ヨード安息香酸を添加した場合）

（プロピレングリコール90%、ｏ−ヨード安息香酸18.4μg/mL＋塩酸含有20mg/mL注射液）
22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．ｏ−ヨード安息香酸276mgおよびプロピレングリコール50mLを1mol/Lの塩酸水溶液に溶解し100mLとした。化合物Aを完全に溶解させ、化合物Aが20mg/mL、ｏ−ヨード安息香酸が18.4μL/mLとなるように混和し、さらに注射用水を加えて全量を1000mLとし、pHが２．１（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は91.0%であった。

比較例５（重合体生成を抑制する物質として亜硫酸ナトリウムを添加した場合）

（プロピレングリコール90%、亜硫酸ナトリウム9.3μg/mL＋塩酸含有20mg/mL注射液）
化合物A 22gをプロピレングリコールにて加温溶解し1000mLとする．亜硫酸ナトリウム139.5mgを1mol/Lの塩酸水溶液に溶解し50mLとした。化合物Aを完全に溶解させ、化合物Aが20mg/mL、亜硫酸ナトリウム9.3μL/mLとなるように混和し、さらに注射用水を加えて全量を1000mLとし、pHが２．１（５℃）なる注射液を得た。
この液を常法により除菌ろ過後バイアルに充填し、空間部を窒素置換した後にバイアルを打栓し、注射液製剤を製した。
この製剤を80℃の条件下に3日間保存したときの化合物Aの残存率は92.8%であった。

分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物はこれまで各種有機溶媒等に可溶化した上で凍結乾燥せしめた製剤であったが、本発明により分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物に酸化第二鉄等の物質を配合し、pHを7以下とすることにより、上記デプシペプチド化合物の製造および取扱いが容易で、かつ長期間の安定性に優れた注射液製剤の提供が可能となる。

Claims

（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
含有するｐH７．０以下ｐH１．０以上のデプシペプチド含有注射液。
デプシペプチド化合物が一般式（I）で示される請求項１に記載のデプシペプチド含有注射液。
（式中Rは、イソプロピル基、sec-ブチル基またはイソブチル基を意味する。）
可溶化剤がエタノール、メタノール、1-プロパノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、N、N-ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、ポリソルベート80、ポピドン、ヒマシ油からなる群より選択される1種以上である請求項２に記載のデプシペプチド含有注射液。
デプシペプチド化合物の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ−１００ｍｇ／ｍＬである請求項３に記載のデプシペプチド含有注射液。
デプシペプチド化合物の濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ−５０mg/mLである請求項３に記載のデプシペプチド含有注射液。
（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
含有するｐH７．０以下ｐH１．０以上のデプシペプチド含有注射液を容器に充填し、空間部を窒素置換したデプシペプチド含有注射液製剤。
（１）分子内にジスルフィド結合を有するデプシペプチド化合物、
（２）可溶化剤、
（３）塩化第二鉄及び／または硫酸銅、
（４）（３）に代わりジチオスレイトール
含有するpH7以下のデプシペプチド含有注射液を調製し、その後容器に充填し、更に空間部を窒素置換したデプシペプチド含有注射液製剤の製造方法。