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JPWO2007010858A1 - 骨格筋組織由来の単一細胞よりクローン化した多能性幹細胞 - Google Patents

骨格筋組織由来の単一細胞よりクローン化した多能性幹細胞 Download PDF

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JPWO2007010858A1
JPWO2007010858A1 JP2007525995A JP2007525995A JPWO2007010858A1 JP WO2007010858 A1 JPWO2007010858 A1 JP WO2007010858A1 JP 2007525995 A JP2007525995 A JP 2007525995A JP 2007525995 A JP2007525995 A JP 2007525995A JP WO2007010858 A1 JPWO2007010858 A1 JP WO2007010858A1
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英正 王
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哲矢 野村
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Abstract

本発明の目的は、少なくとも心筋細胞に分化して心筋を再生できる多能性幹細胞を高純度で単離する技術を提供することである。
(i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、及び(iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程を行うことによって、少なくとも心筋細胞に分化して心筋を再生できる多能性幹細胞を高純度で単離することができる。

Description

本発明は、骨格筋組織由来の単離された多能性幹細胞、及び該多能性幹細胞の単離方法に関する。また、本発明は、該多能性幹細胞を利用した心疾患の治療方法及び医薬組成物に関する。更に、本発明は、該多能性幹細胞を分化誘導又は増幅させる物質をスクリーニングする方法に関する。
心臓の機械的障害、心筋不全、調律異常等による心不全に対する治療としては、従来、利尿薬による血流量の減少、強心薬による心筋収縮力の増強や心房粗細動の脈拍の適正化、血管拡張薬による心臓の負荷の軽減等の対症療法が行われている。これに対して、重症心不全に対しては、上記の対症療法では十分な治療効果が得られず、心臓移植による根本療法が必要とされている。しかしながら、心臓移植は、ドナー不足や拒絶反応等の問題があり、救済医療として充分に機能していないのが現状である。そこで、近年、心臓移植にとって替わる根本療法として、心筋細胞に分化し得る前駆細胞又は幹細胞を移植する方法が注目されている。
しかしながら、これまで報告されている細胞移植では、本質的に心筋細胞を再生できるものはほとんど無く、虚血心筋の修復に重要な微小循環の血行上の改善効果や、生着したドナー細胞から分泌されるサイトカインによる二次的な心筋保護効果により心機能の改善を図っているのが殆どである（例えば、特許文献１参照）。
また、これまで、間葉系幹細胞や骨格筋細胞から心筋細胞に分化する幹細胞を単離する技術が精力的に検討されているが（例えば、特許文献２参照）、従来の技術では、細胞の付着性や特定の細胞表面抗原を指標として細胞を純化しているため、目的の幹細胞以外の細胞が不可避的に混入してしまい、単離される幹細胞の純度は極めて低くなるという欠点があった。このように純度の低い幹細胞を用いて細胞移植を行うと、重篤な副作用を引き起こす蓋然性があるので、臨床上応用できるものではなかった。
更に、これまでに報告されている心筋幹細胞の研究の多くでは、心筋細胞への分化は細胞の拍動の有無のみで判定しており、心筋細胞と未分化の骨格筋芽細胞と区別して、心筋細胞への分化を正確に判定しているものは殆どない。そのため、従来報告されている心筋幹細胞は、筋細胞に分化し得ない細胞である場合や骨格筋芽細胞である場合が多く、臨床的使用に供し得ないものが殆どであるのが現状である。
このような従来技術を背景として、心筋細胞の本質的な再生を行うことができる幹細胞を高い純度で単離し、これを利用して心筋細胞を障害心筋部位に移植することにより、根本的な心筋の再生治療方法を確立することが望まれている。
国際公開第０３／８０７９８号パンフレット 国際公開第０３／２７２８１号パンフレット
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明は、少なくとも心筋細胞に分化して心筋を再生できる多能性幹細胞を高純度で単離することを目的とする。更に、本発明は、上記多能性幹細胞を利用した発明、具体的には、心疾患を治療する方法、各種疾患に有用な医薬組成物、及び該多能性幹細胞を分化誘導又は増幅させる物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、採取した骨格筋組織を酵素処理することにより得られる骨格筋組織由来細胞を培地（serum free medium）において培養し、培養液中に浮遊しているコロニーを単離することによって、高い純度で多能性幹細胞が得られることを見出した。更に、得られた多能性幹細胞が、少なくとも拍動性心筋細胞に分化できることを電気生理学的手法により確認した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる発明である：
項１． c-met陰性、Pax-7陰性、Myf-5陰性、MyoD陰性、Myogenin陰性、及びM-cadherin陰性を示し、ほ乳動物の骨格筋組織由来の単離された多能性幹細胞。
項２． CD105及びCD90が陽性を示し、c-kit及びCD45が陰性を示す、項１に記載の多能性幹細胞。
項３． Sox-2陽性、Cripto陽性、Nanog陽性、Oct-4陽性、Bmi-1陽性、及びBrcp陽性を示す、項１又は２に記載の多能性幹細胞。
項４． 骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、及び神経系細胞よりなる群から選択される１種又は２種以上の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、項１乃至３のいずれかに記載の多能性幹細胞。
項５． 少なくとも拍動性心筋細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、項１乃至３のいずれかに記載の多能性幹細胞。
項６． ほ乳動物が、ヒト、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、イヌ、及びサルよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１乃至５のいずれかに記載の多能性幹細胞。
項７． 下記工程を経て得られる、項１乃至６の何れかに記載の多能性幹細胞：
(i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、及び
(iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程。
項８． 上記工程(iii)が、培養液中に浮遊しているコロニーの内、単一の細胞が増殖して形成したコロニーを１つだけ選択し、分離する工程である、項７に記載の多能性幹細胞。
項９． 項１乃至８の何れかに記載の多能性幹細胞で構成され、単一細胞から増殖して得られることを特徴とする、多能性幹細胞群。
項１０． 下記工程を経て得られる、項９に記載の多能性幹細胞群：
(i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、
(iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程、及び
(iv)上記工程(iii)で分離したコロニーを形成している細胞を増殖させる工程。
項１１． 上記工程(iii)が、培養液中に浮遊しているコロニーの内、単一の細胞が増殖して形成したコロニーを選択し、該コロニーが１つだけ存在する状態に分離する工程である、項１０に記載の多能性幹細胞群。
項１２． 項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を、フォリスタチンを含む培地で培養することを特徴とする、該多能性幹細胞の増殖方法。
項１３． フォリスタチンの、項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を増殖させるための使用。
項１４． 下記工程を含有する、項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞を単離する方法：
(i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、及び
(iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程。
項１５． 上記工程(iii)が、培養液中に浮遊しているコロニーの内、単一の細胞が増殖して形成したコロニーを選択し、該コロニーが１つだけ存在する状態に分離する工程である、項１４に記載の多能性幹細胞の単離方法。
項１６． 下記工程を含有する、項９に記載の多能性幹細胞群を調製する方法：
(i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、
(iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程、及び
(iv)上記工程(iii)で分離したコロニーを形成している細胞を増殖させる工程。
項１７． 上記工程(iii)が、培養液中に浮遊しているコロニーの内、単一の細胞が増殖して形成したコロニーを選択し、該コロニーが１つだけ存在する状態に分離する工程である、項１６に記載の多能性幹細胞群の調製方法。
項１８． 項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞、又は該幹細胞から分化した細胞を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。
項１９． 治療対象疾患が心疾患である、項１８に記載の治療方法。
項２０． 項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞を含有する、医薬組成物。
項２１． 組織又は細胞の再生薬である、項２０に記載の医薬組成物。
項２２． 臓器不全の治療薬である、項２０に記載の医薬組成物。
項２３． 項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用医薬組成物の製造のための使用。
項２４． 医薬組成物が組織又は細胞の再生薬である、項２３に記載の使用。
項２５． 医薬組成物が心疾患治療用である、項２３に記載の使用。
項２６． 項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞を各種細胞へ分化誘導させる物質をスクリーニングする方法であって、
(a)該多能性幹細胞に被験物質を接触させて培養する工程、及び
(b)該多能性幹細胞の分化誘導の有無を観察し、その結果に基づいて、被験物質を選別する工程
を含む、方法。
項２７． 項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞を増幅させる物質をスクリーニングする方法であって、
(a)該多能性幹細胞に被験物質を接触させて培養する工程、及び
(b)該多能性幹細胞の増幅の有無を観察し、その結果に基づいて、被験物質を選別する工程
を含む、方法。
従来報告されている骨格筋組織由来多能性幹細胞は、いずれもその純度が低く、骨格筋芽細胞や繊維芽細胞等の異種細胞を不可避的に含んでいるため、細胞移植において臨床上応用することができなかった。例えば、骨格筋芽細胞が混入している幹細胞を心臓に移植した場合、重篤な催不整脈作用が生じるという臨床上の問題があった。
これに対して、本発明の多能性幹細胞は、骨格筋組織に存在する単一の細胞をクローン化することにより単離されたものであり、異種細胞の混入が極めて少なく、従来報告されている幹細胞では実現し得ない高純度を備えている。それ故、本発明の多能性幹細胞を使用することにより、心疾患等の患者に対して細胞移植を、異種細胞の移植により生じる副作用を回避して安全に実施することが可能になる。
また、本発明の骨格筋組織由来多能性幹細胞は、未分化の状態を保持したまま、長期間、継代により培養することができるので、臨床上の実用性が高く有用である。
また、本発明の多能性幹細胞は、特に心筋細胞への分化能が優れているので、心臓移植に頼らざるを得ない重症心不全患者に細胞移植による新たな治療方法を提供でき、その有用性は極めて高い。心不全患者に細胞移植による治療における当該多能性幹細胞の心筋細胞への分化は、ホスト心筋細胞との細胞融合を介した心筋細胞への分化、及びホスト心筋細胞との細胞融合を介することのない能動的な心筋細胞への分化の双方の機序に基づいていることが解明されている。
実施例１の(2)において、マウス由来の骨格筋組織由来細胞を培養した際に観察される細胞又は細胞のコロニーを示す図である。図中、Ａ及びＢは、培養液中に浮遊している状態の幹細胞のコロニーを示す。また、図中、Ｃは培養ディッシュの基底に付着した、核が小さく細長く伸展した線維芽細胞を示す。更に、図中、Ｄは培養ディッシュの基底に付着した、球状に集団を形成した骨格筋芽細胞を示す。 実施例１の(4)において、野生型マウス骨格筋組織由来細胞とGFP発現マウス骨格筋組織骨格筋組織由来細胞とを混合して培養を行った際に、当該培養の前後において観察された浮遊細胞又はコロニーの写真である。左上図は、non-coating 10cm cell culture dishによる培養開始時に、細胞が浮遊している状態を位相差顕微鏡にて撮影した写真；左下図は左上図と同一視野を蛍光顕微鏡にて撮影した写真；右上図は10cm fibronectin coating dishによる培養後に浮遊しているコロニーを位相差顕微鏡にて撮影した写真；及び右下図は左上図と同一視野を蛍光顕微鏡にて撮影した写真を示す。 実施例１の(3)で単離した幹細胞について、ブロモデオキシウリジン（BrdU）の発現を観察した結果を示す図である。左下図は上記幹細胞のBrdUの発現を観察した結果（蛍光顕微鏡写真）；左上図は、左下図の同一視野における位相差像；右下図は、上記幹細胞を５日間培養増殖させた周辺細胞のBrdUの発現を観察した結果（蛍光顕微鏡写真）；及び右上図は、右下図の同一視野における位相差像を示す。 実施例１の(3)で単離した幹細胞、及び実施例１の(3)で採取した付着細胞について、増殖特性を経時的に観察した結果を示す。図中、Ａは上記幹細胞の培養３日目の状態；Ｂは上記幹細胞の培養７日目の状態；及びＣは上記幹細胞の３回目の継代培養後の状態を示す顕微鏡写真である。また、図中、Ｄは上記付着細胞が増殖した状態；Ｅは上記付着細胞がmyotube tubeを形成している状態；及びＦは上記付着細胞が骨格筋細胞に分化した状態を示す顕微鏡写真である。 実施例１の(3)で単離した幹細胞（コロニー）について、胚性幹細胞のマーカー（Bcrp、Bmi-1、Cripto、UTF-1、Nanog、Oct-4、HNF-3β、Brachyury、Sox 2及びβ-actin）の発現を分析した結果を示す図である。図中、各種マーカーの横の括弧内の表記は、（陽性コロニー数／分析したコロニー数）を示す。 実施例１の(3)で単離したマウス由来幹細胞の各種細胞表面抗原（CD34、Sca-1、CD45、CD90、CD105、CD117、CD13、CD31及びCD38）についてFACS分析した結果である。図中、赤線がマウス由来幹細胞の分析結果であり、青線がコントロール（標識無しの細胞）の分析結果である。 実施例１の(3)で単離した幹細胞について、筋芽細胞C2C12や骨格筋芽細胞のマーカー（Pax-7、Myf-5、c-met、M-cadherin、MyoD、及びMyogenin）の発現をPCRにより分析した結果である。 実施例１の(3)で単離した幹細胞、及び実施例１の(3)で採取した付着細胞について、CD34をAlex Fluor 555により赤色；Myf-5をAlex Fluor488により緑色；細胞内の核をDAPI（4'6-diamino-2-pheny1indo1e）により青色に染色して観察された像である。図８中、Ａは上記付着細胞をCD34で染色した像；Ｂは、Ａと同一視野において上記付着細胞をMyf-5で染色した像；Ｃは、Ａと同一視野において上記付着細胞をDAPIで染色した像；Ｄは、Ａ〜Ｃを重ね合わせた像；Ｅは、上記幹細胞をCD34で染色した像；Ｆは、Ｅと同一視野において上記幹細胞をMyf-5で染色した像；ＧはＥと同一視野において上記幹細胞をDAPIで染色した像；及びＨは、Ｅ〜Ｇを重ね合わせた像を示す。 実施例２において、幹細胞及び骨格筋芽細胞の局在部位を観察した結果である。図中、Ａは細胞基底膜下に存在している骨格筋芽細胞を示し、Ｂは間質に局在している幹細胞を示す。なお、Ａ及びＢにおいて、ラミニンの染色により緑色が、DAPI染色により青色が、またCD34染色により赤色が、それぞれ呈されている。また、図中、Ｃは、細胞基底膜下に存在している骨格筋芽細胞（黄色の矢印）、及び間質に存在している幹細胞（白色の矢印）、を示している。Ｃでは、ラミニンの染色により赤色が、DAPI染色により青色が、またMyf-5染色により緑色が、それぞれ呈されている。 実施例３において、実施例１の(3)で単離した幹細胞が心筋細胞に分化したことを示す顕微鏡写真である。図中のＡにおいて、左上図は、上記幹細胞がprometaphaseの心筋細胞に分化したこと；右上図は、上記幹細胞がearly anaphaseの心筋細胞に分化したこと；左下図は上記幹細胞がlate anaphaseの心筋細胞に分化したこと；及び右下図は上記幹細胞がlate telophaseの心筋細胞に分化したことを示している。なお、図中のＡにおいて、DAPI染色により青色が呈され、心筋特異的トロポニン−I染色により緑色が呈されている。図中のＢは、alpha-心筋重鎖プロモーターで制御されているGFP遺伝子が導入された組換え幹細胞が筋細胞に分化したことを示す顕微鏡写真であり、Ｂにおいて、左上図は位相差顕微鏡により観察した像；右上図は左上図と同一視野を蛍光顕微鏡により観察した像；及び右下図は右上図に示す丸で囲んだ部分を拡大した像を示す。 実施例３において、実施例１の(3)で単離した幹細胞を心筋細胞に分化誘導する前、及び分化誘導開始１４日後の細胞について、心筋細胞に認められる各種マーカー（各種心筋転写因子、構造タンパク、心筋結合タンパク、及びカルシウムイオンチャンネル）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。 実施例３において、実施例１の(3)で単離した幹細胞及び骨格筋芽細胞が呈する種々の分化又は未分化細胞の形態を示す顕微鏡写真である。図中、Ａには骨格筋芽細胞が、シート状に増殖分化して形成された拍動性のmyotubeの状態；Ｂは、骨格筋芽細胞が未分化の状態のまま、律動的拍動を呈する多核の細胞形態；Ｃは、上記幹細胞が分化した単一または二核の形態を呈する拍動性心筋細胞の状態；Ｄは、上記幹細胞が分化した規則性の拍動を示す単核の心筋細胞の状態を示す。 実施例３において、実施例１の(3)で単離した幹細胞及び骨格筋細胞の拍動特性について、電気生理学的検討を行った結果である。図中、Ａには骨格筋細胞の活動電位の振幅パターン；Ｂには骨格筋細胞におけるイソプロテレノール付加前後の活動電位の振幅パターン；Ｃには上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞の活動電位の振幅パターン；Ｄには上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞におけるイソプロテレノール付加前後の活動電位の振幅パターンを示す。 実施例４において、実施例１の(3)で得られた幹細胞が分化した各種細胞を観察した結果である。図中、Ａは該幹細胞が分化した血管平滑筋細胞；Ｂは幹細胞が分化した内皮細胞；Ｃは幹細胞が分化したグリア細胞；Ｄは幹細胞が分化した神経細胞；Ｅは幹細胞が分化した脂肪細胞；Ｆは幹細胞が分化した上皮細胞；Ｇは幹細胞が分化した骨細胞；及びＨは幹細胞が分化した骨格筋細胞を示す。 実施例５において、LacZ発現マウスの骨格筋組織由来幹細胞をマウス梗塞心筋に移植し、該幹細胞のマウスの心筋における生着及び分化の状態を示す図である。図中、Ａ、Ｃ及びＥはLacZを染色した結果；Ｂは、Ａと同一視野において、DAPIによる染色、及び心筋特異的トロポニンIを用いた染色の結果；Ｄは、Ｃと同一視野において、DAPIによる染色、及びCD31を用いた染色の結果；ＦはＥと同一視野において、DAPIによる染色、及びα-smooth muscle-MHCを用いた染色の結果を示す。 実施例６において、ヒト骨格筋組織由来幹細胞の状態を観察した結果を示す。図中、Ａは、ヒト骨格筋組織由来細胞を培養し、培養液中に浮遊して増殖能を示す幹細胞群（コロニー）を示し、ＢはＡの拡大図を示す。また、Ｃは、単離されたヒト骨格筋組織由来幹細胞コロニーを示す。Ｄは、単離されたヒト骨格筋組織由来幹細胞コロニーが培養5日後に同円心状増殖した状態を示す。 実施例６において、得られたヒト骨格筋組織由来幹細胞について、胚性幹細胞のマーカー（Nanog、Oct-4、Rex1、Brachyury及びSox 2）の発現を分析した結果を示す図である。 実施例６において、ヒト骨格筋組織由来幹細胞の各種細胞表面抗原（CD56、CD34、CD45、CD117、CD90、CD105、CD31及びCD38）についてFACS分析した結果を示す。図中、赤線がヒト骨格筋組織由来幹細胞の分析結果であり、青線がコントロール（標識無しの細胞）の分析結果である。 実施例７において、実施例６で得られたヒト骨格筋組織由来幹細胞が分化した各種細胞を観察した結果である。図中、Ａは該幹細胞が分化した心筋細胞；Ｂは幹細胞が分化した骨格筋細胞；Ｃは幹細胞が分化した平滑筋細胞；及びＤは幹細胞が分化した内皮細胞を示す。 実施例８において、実施例６で得られたヒト骨格筋組織由来幹細胞をマウス梗塞心筋に移植し、該細胞のマウスの心筋における生着の状態を示す図である。図中、Ａには心筋型トロポニン-I陽性心筋細胞を赤色に、及びヒト由来の核を緑色に染色した結果を示し；ＢにはＡと同一視野において心筋型トロポニン-I陽性心筋細胞を赤色に、及び全ての核をDAPIにより白色に染色した結果を示し；Ｃにはalpha型smooth muscleミオシン重鎖陽性平滑筋細胞を赤色、ヒト由来の核を緑色に、及び全ての核をDAPIにより青色に染色した結果を示し；ＤにはCD31陽性内皮細胞を赤色に、ヒト由来の核を緑色に、及び全ての核をDAPIにより青色に染色した結果を示す。 実施例９の結果を示す図である。Ａには、6、12及び24週齢のマウスから取得されたマウス骨格筋由来幹細胞のコロニーの数（黒丸）と、Myf5陽性を示すサテライトサテライト細胞の割合（白丸）を示す。また、Ｂには、骨格筋由来幹細胞を、120回継代して400日間培養した際に測定された細胞集団倍加数（population doubling）を示す。 実施例９において、120回継代して400日間培養したマウス骨格筋由来幹細胞の特性を確認した結果を示す。Ａにおいて、左の写真には初期形成した幹細胞コロニー（継代０回）の形態；；中の写真には付着培養で120回継代した細胞の時点の細胞の形態；右の写真には120回継代後もserum free mediumに交換することでコロニーを形成しながら増幅していく幹細胞の形態を示す。また、Ｂには、120回継代して400日間培養したマウス骨格筋由来幹細胞のコロニーに対して、Sca-1、CD34及びNestinを染色した結果を示す。また、Ｃには、胚性幹細胞のマーカーであるNanog及びOct-4の発現についてPCRにより分析した結果を示す。 実施例１０において、骨格筋由来幹細胞の培養にフォリスタチンが与える影響を検討した結果を示す図である。Ａには、ES細胞(mES)、実施例９で得られた初期（継代０回）骨格筋由来幹細胞(primary sphere)、実施例９で得られた３回継代した骨格筋由来幹細胞(tertiary sphere)、マウス筋芽細胞（C2C12）、サテライト細胞(satellite dells)、成人の筋肉由来の成熟細胞(adult muscle)、及び成人の心筋由来の成熟細胞(adult heart)について、フォリスタチン及びマイオスタチンの発現をウエスタンブロッティング解析により分析した結果を示す。また、Ｂにはマイオスタチン0.5μg/mL又は1.0μg/mLを添加した培地で培養した骨格筋由来幹細胞のp21、Cdk2、及びRbの発現をPCRにより分析した結果を示す。なお、Ｂ中、(-)は、フォリスタチン未添加の培地で培養した骨格筋由来幹細胞についての結果である。 実施例１１において、マイオスタチン欠損マウス(mstn-/-)の骨格筋由来幹細胞と、GFP発現マウス(GFP-Tg)の骨格筋由来幹細胞とを共培養した際に観察された浮遊細胞（sphere）と付着細胞（satellite cells）の形態を示す図である。図中、位相差顕微鏡で観察した結果を「phase」、蛍光顕微鏡で観察した結果を「GFP」の欄に示す。 Ａには、実施例１１において、骨格筋由来幹細胞コロニーをフォリスタチン存在下又は非存在下で培養した際に観察された浮遊細胞（sphere）と付着細胞（satellite cells）の形態を示す。浮遊細胞（sphere）の形態の観察結果の内、上の写真には位相差顕微鏡で観察した結果、下の写真には蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。また、Ｂには、骨格筋由来幹細胞コロニーをフォリスタチン存在下又は非存在下で培養した後に、コロニーを構成している幹細胞におけるp-smad2/3、smad2/3、p- smad1/5/8、smad1/5/8、p21、Cdk2及びRbの発現を経時的にウエスタンブロッティング解析により分析した結果を示す。 Ａには、実施例１１において、骨格筋由来幹細胞におけるNodal、Activin（Act A及びAct B）及びGDF11の発現をPCRにより分析した結果を示す。また、Ｂには、骨格筋由来幹細胞におけるactivin受容体及びALK2,3,4,5,7の発現をPCRにより分析した結果を示す。 実施例１２における試験結果、即ち、LacZリポーターマウスから得られた骨格筋由来幹細胞をマウス梗塞心筋に移植し、該幹細胞のマウスの心筋における生着の状態を示す図である。上段の写真は、移植された骨格筋由来幹細胞がホスト心筋との細胞融合をして心筋細胞に分化していることを示している。中段の写真には、移植された骨格筋由来幹細胞が、細胞間融合を介さずに能動的心筋細胞にも分化していることを示している。下段の写真は、移植された骨格筋由来幹細胞の一部が非心筋細胞に分化したことを示している。 実施例１３において、骨格筋由来幹細胞が移植された梗塞心筋における心機能を解析した結果を示す図である。Ａには、梗塞心筋を作成しなかったC57Bl/6Jマウス群（sham群）、心筋梗塞モデルマウスにPBSを注入した群（I＋PBS群）、及び心筋梗塞モデルマウスに骨格筋由来幹細胞を移植した群（MI+sk+MSC群）の典型的な心エコー図を示す。また、Ｂには、sham群（灰色、左）、I＋PBS群（中、白色）及びMI+sk+MSC群（黒色、右）について、左室拡張末期径(LVDd)、内径短縮率(FS)及び左室拡張能(E/A)を測定した結果を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の多能性幹細胞は、ほ乳動物の骨格筋組織由来の単離された多能性幹細胞であって、c-met陰性、Pax-7陰性、Myf-5陰性、MyoD陰性、Myogenin陰性、及びM-cadherin陰性を示すことを特徴とするものであり、骨格筋芽細胞とは明確に区別されるものである。
本発明の多能性幹細胞の具体例として、細胞表面抗原の特性について、CD105及びCD90が陽性を示し、c-kit及びCD45が陰性を示す細胞が挙げられる。また、本発明の多能性幹細胞として、CD13及びCD38については、陰性又は弱陽性を示す細胞が例示される。更に、本発明の多能性幹細胞の特徴として、ヒト由来の場合はCD34が陰性を示し、マウス由来の場合はCD34が陽性を示すことが挙げられる。
更に、本発明の多能性幹細胞の好適な具体例として、Sox-2陽性、Cripto陽性、Nanog陽性、Oct-4陽性、Bmi-1陽性、及びBrcp陽性を示す細胞が例示される。
本発明の多能性幹細胞は、増殖能と共に、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、及び神経系細胞よりなる群から選択される１種又は２種以上の細胞に分化する能力を有している。本発明の多能性幹細胞として、好ましくは上記全ての細胞に分化する能力を有するものある。
また、本発明の多能性幹細胞の１つの特徴として、少なくとも拍動性心筋細胞に分化することを挙げることができる。
本発明の多能性幹細胞の由来ほ乳動物としては、特に制限されず、例えばヒト、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、イヌ、及びサル等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞をヒトの心疾患の治療に使用する場合には、ヒト由来であることが好ましい。
また、本発明の多能性幹細胞は、ほ乳動物の骨格筋組織に由来するものであれば、その骨格筋組織は如何なる身体部位に由来するものであってもよく、例えば、脚部、腕部、肩部、首部、背部、臀部、顔面／頭部、胸腹部等の骨格筋組織が例示される。
以下、本発明の多能性幹細胞に関して、「Ａ．本発明の多能性幹細胞の単離方法」、「Ｂ．本発明の多能性幹細胞の培養（増殖）」、「Ｃ．本発明の多能性幹細胞の目的細胞への分化誘導」、「Ｄ．疾患の治療方法」、「Ｅ．医薬組成物」及び「Ｆ．スクリーニング方法」について、詳細に説明する。「Ａ．本発明の多能性幹細胞の単離方法」及び「Ｂ．本発明の多能性幹細胞の培養（増殖）」に従って、本発明の多能性幹細胞を単離し培養することによって、本発明の多能性幹細胞を高純度で含む細胞群（細胞集団）を得ることができる。
Ａ．本発明の多能性幹細胞の単離方法
１．骨格筋組織由来細胞の取得
まず、ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を取得する（工程(i)）。
ここで、ほ乳動物からの骨格筋組織の採取は、通常の外科的手法により骨格筋組織を摘出することにより行われる。また、摘出された骨格筋細胞は、酵素処理に先立って、骨格筋組織以外の組織（例えば、血管、神経、腱、靱帯、骨組織等）を極力取り除いておくことが望ましい。また、酵素処理の効率を高めるために、採取された骨格筋組織は、約１ｍｍ３以下の断片になるまで細切した後に酵素処理に供することが望ましい。
上記の骨格筋組織は、適切な緩衝液中で酵素処理に供されることにより、目的の骨格筋組織由来細胞が取得される。ここで、使用される緩衝液としては、細胞及び酵素に悪影響を及ぼさない限り特に制限されないが、例えば1重量％のペニシリン−ストレプトマイシン及び2mMのｌ−グルタミンを含有するHanks’ Balanced Salt Solution(GIBCO社製)が挙げられる。
また、酵素処理は、生体組織片から細胞を分離する際に一般的に使用される酵素を使用して行われる。具体的には、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等のプロテアーゼが例示される。これらの中で、好ましくはコラーゲナーゼが挙げられる。かかるコラーゲナーゼとして、具体的には、collagenase type 2（Worthington社製；205U/mg）が例示される。なお、本明細書において、コラーゲナーゼ１Ｕとは、ｐＨ7.5、37℃、５時間で、コラーゲンから１μモルのＬ−ロイシンを遊離できる酵素量を表す。
また、酵素処理条件についても、特に制限されないが、一例として、下記酵素処理条件が例示される：
酵素濃度：例えば、collagenase type 2（Worthington社製；205U/mg）を使用する場合であれば、通常0.2〜0.6重量％、好ましくは0.4重量％程度；或いは骨格筋組織２ｇ当たり、通常3075〜9225Ｕ、好ましくは6150Ｕ程度となる濃度が挙げられる。
処理温度：通常37℃程度となる温度が挙げられる。
処理時間：通常30〜60分、好ましくは45分程度となる時間が挙げられる。
斯くして酵素処理することにより、骨格筋組織から骨格筋組織由来細胞が遊離するので、酵素処理後に、遠心分離等の公知の手段により骨格筋組織由来細胞を分離することによって、骨格筋組織由来細胞を取得することができる。斯くして得られた骨格筋組織由来細胞には、該細胞の生育に適した培地を添加しておくことが望ましい。このような培地としては、例えば10容量％び牛胎児血清（ＦＢＳ）及び1容量％のペニシリン−ストレプトマイシン（5000U/ml penicillin及び5000μg/ml streptomycin sulfateの混合物）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地が例示される。
なお、斯くして得られる骨格筋組織由来細胞は、必要に応じて濾過処理等に供されて、細胞以外の成分が除去されていてもよい。
２．骨格筋組織由来細胞の培養
次いで上記で得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；epidermal growth factor）及び繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ；fibroblast growth factor)を含む培地において培養する（工程(ii)）。
上記工程(i)で得られた骨格筋組織由来細胞同士が結合や付着している場合には、当該培養に先立って、該骨格筋組織由来細胞を更に酵素処理に供して、細胞同士の結合や付着を解消しておいてもよい。かかる酵素処理の具体的方法については、特に制限されず、プロテアーゼ等を使用した公知の方法により行うことができる。該酵素処理の一例として、骨格筋組織由来細胞群を0.05重量％のトリプシン及び0.53mMのＥＤＴＡを含有する溶液で、37℃で10分間程度処理する方法が例示される。また、当該酵素処理後にはプロテアーゼ阻害剤を添加し、プロテアーゼ活性を失活させた後に本工程(iii)に供することが望ましい。
本工程で使用される培地は、通常の細胞培養（浮遊培養）に使用される培地に、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子が添加されていればよい。該培地の好適なものとして、例えば、2容量％程度のB27サプリメント（GIBCO社製）を含む培地（例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等）に、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子が添加されている培地が例示される。また、本工程で使用される培地は、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；グルタミン等のアミノ酸等を含有していてもよい。
本工程で使用される培地において、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子の配合割合については、例えば、上皮細胞増殖因子が20ng/ml程度であり、繊維芽細胞成長因子が40ng/ml程度が例示される。
本工程において、培養開始時の細胞濃度が1×104〜4×104cells/ml、好ましくは2×104cells/ml程度となるように設定して、培養を行うことが望ましい。
なお、制限されないが、本工程において、上記工程(i)で得られた骨格筋組織由来細胞をまず非コーティング培養ディッシュで培養した後に、得られた培養液をフィブロネクチン等でコーティングされた培養ディッシュに移し替えて更に培養することが望ましい。
本工程における培養は、通常37℃、5％ＣＯ２下で、通常7〜21日間、好ましくは10〜14日間行う。
３．骨格筋組織由来多能性幹細胞の単離
上記工程(ii)により得られた培養液中には、骨格筋組織由来多能性幹細胞が増殖することにより形成したコロニーが浮遊した状態で存在しており、骨格筋組織由来の繊維芽細胞や骨格筋芽細胞は、培養容器の基底に付着した状態で存在する。従って、上記工程(ii)により得られた培養液から、細胞増殖により形成されたコロニーを選択し分離することにより、高純度の骨格筋組織由来多能性幹細胞を単離することができる（工程(iii)）。ここで、他の細胞が混在しないように、上記工程(ii)により得られた培養液に浮遊した状態にある「単一細胞が増殖することにより形成したコロニー」を選択し、該コロニーが単独で存在する状態に分離することにより、単一の上記多能性幹細胞に由来する細胞塊を単離することができる。
本工程において、細胞増殖により形成されたコロニーを選択し分離する方法としては、特に制限されないが、例えば、顕微鏡下でマイクロピペットを用いて採取する方法等が例示される。
なお、本工程において、細胞増殖により形成されたコロニーと、単に骨格筋組織由来細胞同士が付着した細胞塊とを区別して、正確に目的のコロニーを選択分離することが望ましい。本工程において、正確に目的のコロニーを選択分離する手法の具体例として、以下の手法が例示される：まず、上記工程(ii)において、骨格筋組織由来細胞と共に、色素発現細胞（例えば緑色蛍光色素タンパク(GFP)発現細胞）を共存させて培養しておく。本工程(iii)において、培養液中から色素発現細胞が含まれていない細胞塊を目的のコロニーとして選択し分離する。かかる手法において、浮遊している細胞塊の内、色素発現細胞が含まれる細胞塊は単なる細胞同士の付着により形成されたものであり、色素発現細胞が含まれない細胞塊は多能性幹細胞が増殖により形成されたコロニーであると判定することができる。
また、本工程で取得したコロニーが本発明の多能性幹細胞により構成されていることは、必要に応じて後述する培養によって増殖させた後、該幹細胞マーカーの発現を測定することにより確認できる。
Ｂ．本発明の多能性幹細胞の培養（増殖）
上記で単離された単一の多能性幹細胞から形成されたコロニーを、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含有する培地で培養して、該多能性幹細胞を増殖させることによって、単一の多能性幹細胞に由来する高純度の該多能性幹細胞群（細胞集団）を得ることができる。本発明の多能性幹細胞を増殖させるために使用される培地としては、通常の細胞培養（浮遊培養）に使用される培地に、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞成長因子及び白血病抑制因子（LIF: leukemia inhibitory factor）が添加されているものが挙げられる。また、本工程で使用される培地は、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；グルタミン等のアミノ酸等を含有していてもよい。該培地として、より具体的には、2容量％程度のウシ胎児血清と1容量％程度のL-glutamine−(20mM)−penicillin(10000 units/mL)−streptomycin(10mg/mL)を含む培地［例えば、Advanced DMEM/F12(GIBCO社製)等］に、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞成長因子及び白血病抑制因子が添加されている培地が例示される。
本工程で使用される培地において、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞成長因子及び白血病抑制因子の配合割合については、例えば、上皮細胞増殖因子が20ng/ml程度、繊維芽細胞成長因子が10ng/ml程度、及び白血病抑制因子が10ng/ml程度が例示される。
上記の培地に、更にフォリスタチン（follistatin）が添加されていると、本発明の多能性幹細胞の増殖速度を選択適時速めることが可能になる。フォリスタチンの培地中への添加量としては、特に制限されるものではないが、例えば652 ng/mL程度の濃度が望ましい。
フォリスタチンを含む培地を用いた上記多能性幹細胞の培養では、例えば、培養開始時の細胞濃度を20cells/μl程度として、37℃、5％ＣＯ２下で、通常10〜14日間程度培養を行うことにより、該多能性幹細胞を選択的に増殖させることができる。
上記多能性幹細胞は、長期間未分化の状態を維持して継代培養可能であるという利点があり、フォリスタチンの添加の有無に拘わらず、必要に応じて、培養期間を400日以上の長期に設定することも可能である。
Ｃ．本発明の幹細胞の目的細胞への分化誘導
上記多能性幹細胞を、心筋細胞を初めとする各種細胞に分化誘導させる方法としては、例えば、増殖させた上記多能性幹細胞を、目的細胞に分化誘導するためのインデューサーを含有する培地で培養する方法が挙げられる。
特に、上記多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導させるには、インデューサーとしてデキサメタゾンが好適に使用される。以下、心筋細胞に分化誘導させる場合を例に挙げて説明する。
心筋細胞への分化誘導に使用される培地において、添加されるデキサメサゾンの割合については、心筋細胞への分化誘導が可能である限り特に制限されないが、通常、培地中にデキサメサゾンが1×10-8モル/l程度の割合で含まれていればよい。
心筋細胞への分化誘導に使用される培地の種類については特に制限されないが、好適な培地としてＭＥＭ培地（minimum essential medium、GIBCO社製）に、デキサメサゾンが添加されている培地が例示される。また、該培地は、多能性幹細胞の増殖に使用する培地と同様に、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；インスリン、トランスフェリン、セレニウム-X等のその他の成分等を含有していてもよい。
上記培地を用いて、通常37℃で、5％ＣＯ２下で、通常7〜21日間、好ましくは14日間程度、上記多能性幹細胞を培養することにより、一定の割合で上記多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導することができる。
また、上記多能性幹細胞を心筋細胞以外の各種細胞に分化誘導する場合、インデューサー及びその培地中濃度として、例えば、血管平滑筋細胞に分化誘導する場合、10ng/ml程度の血小板由来成長因子（PDGF-BB）；内皮細胞に分化誘導する場合、10ng/ml程度の血管内皮成長因子（VEGF）；グリア細胞に分化誘導する場合、5mM程度のβ−メルカプトエタノール；神経細胞に分化誘導する場合、脳由来神経因子（BDNF）を10ng/ml程度；脂肪細胞に分化誘導する場合、1×ITS-A（Insulin transferin-selenite）、1×10-8M程度のデキサメタゾン、及び0.5mM程度のIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)；及び骨細胞に分化誘導する場合、10ng/ml程度のTGF(Transforming growth factor)及び50nM程度のアスコルビン酸-2-リン酸が例示される。これらの細胞への分化誘導において、その他の培地成分や培養条件等については、上記心筋細胞への分化誘導の場合と同様である。
Ｄ．疾患の治療方法
本発明の多能性幹細胞は、各種組織又は臓器の再生や修復に使用することができる。具体的には、組織又は臓器に疾患がある患者に、上記多能性幹細胞の治療有効量を組織又は臓器の疾患部位に移植することにより、該疾患を治療することができる。ここで、治療有効量については、対象となる疾患やその重篤度、患者の年齢や性別等に応じて適宜設定されるが、例えば1.0×107〜1.0×109 cells程度が例示される。
また、上記多能性幹細胞を目的の細胞に分化させた後に、該分化細胞を組織又は臓器の疾患部位に移植することによっても、該疾患を治療することができる。
本発明の多能性幹細胞を用いた治療において、対象となる疾患として、好ましくは、心疾患が挙げられる。本発明の多能性幹細胞は拍動性心筋細胞への分化能に優れているので、上記疾患の中でも心疾患の治療に好適に使用される。
対象となる心臓疾患としては、心筋若しくは冠動脈に障害を来し、収縮力が低下するような心臓疾患が挙げられ、具体的には、心筋梗塞、拡張型心筋症、虚血性心疾患、うっ血性心不全等が例示される。
多能性幹細胞を移植する方法として、例えば、治療目的の組織又は臓器の疾患部位にカテーテルを利用して上記多能性幹細胞を注入する方法、或いは切開して治療目的の組織又は臓器の疾患部位に上記多能性幹細胞を直接注入する方法等が挙げられる。
また、上記多能性幹細胞から分化させた細胞を移植する方法としては、例えば、シート状等の目的に応じた形態の生体吸収材料に該分化細胞を担持させて、これを治療目的の組織又は臓器の疾患部位に貼付する方法を例示することができる。
本発明の治療方法では、疾患を有する患者以外の者から採取した多能性幹細胞、又は該多能性幹細胞から分化させた細胞を使用してもよいが、拒絶反応を抑制する観点から、患者自身の心臓組織由来の多能性幹細胞、又は該多能性幹細胞から分化させた細胞を使用することが望ましい。
なお、本発明の治療方法には、心疾患の治療方法として、下記（I）及び(II)の態様の方法が挙げられる：
(I) 下記工程(i)〜(v)を含有する疾患の治療方法：
(i)ヒトから骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で培養する工程、
(iii)上記工程(ii)で得られた培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程
(iv)上記工程(iii)で分離したコロニーを形成している細胞を増殖させる工程、及び
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞を心疾患の患者の心臓に移植する工程。
(II) 下記工程(i)〜(v)を含有する疾患の治療方法：
(i)ヒトから骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
(ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で培養する工程、
(iii)上記工程(ii)で得られた培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程(iv)上記工程(iii)で分離したコロニーを形成している細胞を増殖させる工程、
(v)上記工程(iv)で増殖させた細胞を、デキサメサゾンを含有する培地で培養して、心筋細胞に分化誘導させる工程、及び
(vi)分化した心筋細胞を、心疾患を有する患者の心臓に移植する工程。
Ｅ．医薬組成物
前述するように、上記骨格筋組織由来多能性幹細胞は、各種組織又は臓器の再生や修復に使用でき、各種疾患の治療に有用である。故に、本発明は、更に、上記骨格筋組織由来多能性幹細胞を含有する医薬組成物を提供する。当該医薬組成物には、上記骨格筋組織由来多能性幹細胞の他に、医学上又は薬学上許容される担体、その他薬理成分等が含まれていてもよい。
当該医薬組成物は、組織又は細胞の再生薬として使用でき、特に臓器不全の治療薬として有用である。中でも、心疾患は好適な治療対象であり、その具体例については、上記「Ｄ．疾患の治療方法」の欄に記載の通りである。
当該医薬組成物において、上記骨格筋組織由来多能性幹細胞の配合量や投与量については、対象となる疾患の治療有効量に基づいて適宜設定することができる。
Ｆ．スクリーニング方法
上記骨格筋組織由来多能性幹細胞を使用して、該多能性幹細胞を各種細胞へ分化誘導させる物質や該多能性幹細胞を増幅させる物質をスクリーニングすることができる。即ち、本発明は、更に、下記態様(III)の多能性幹細胞を各種細胞へ分化誘導させる物質をスクリーニングする方法、及び下記態様（IV）の多能性幹細胞を増幅させる物質をスクリーニングする方法を提供する。
(III) 上記骨格筋組織由来多能性幹細胞を各種細胞へ分化誘導させる物質をスクリーニングする方法であって、
(a)該多能性幹細胞に被験物質を接触させて培養する工程、及び
(b)該多能性幹細胞の分化誘導の有無を観察し、その結果に基づいて、被験物質を選別する工程、を含む方法。
(IV)上記骨格筋組織由来多能性幹細胞を増幅させる物質をスクリーニングする方法であって、
(a)該多能性幹細胞に被験物質を接触させて培養する工程、及び
(b)該多能性幹細胞の増幅の有無を観察し、その結果に基づいて、被験物質を選別する工
程、を含む方法。
なお、本スクリーニング方法において、被験物質としては、特に制限されず、生体由来物質、天然物質、合成物質のいずれであってもよい。
また、本スリーニング方法において、多能性幹細胞の使用時の濃度、被験物質の添加濃度（多能性幹細胞との接触時の被験物質濃度）、培養条件等については、被験物質の種類やスクリーニング目的に応じて適宜設定することができる。
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１ マウス骨格筋組織由来幹細胞の取得
（１）マウス骨格筋組織由来細胞の取得
6〜8週齢の雌C57Bl/6Jマウス（清水実験材料株式会社製）（以下、野生型マウスと表記することもある）又は同マウスに緑色蛍光色素タンパク(GFP)発現能を付与したマウス（以下、GFP発現マウスと表記することもある）をジエチルエーテル麻酔下に用手的に頸椎脱臼にて安楽死させ、70容量%エチルアルコール水溶液に浸して全身を消毒した。前もって高圧蒸気滅菌を施した尖鋭のピンセット及びはさみを用い、腰部以下両下肢の皮膚を剥離した。極力出血による血球成分の混入を避けるため、鼠径部に露出する大腿動脈を把持鉗子にて結紮後、可視範囲内で結紮部以下の動脈を剥離した。その他の血管、神経、腱、靱帯、骨組織が混入しないよう注意深く筋肉のみを切離し、切離した筋組織は、2mM ｌ−グルタミン (ICN Biomedicals社製)及び1容量%ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO社製)を含有するHanks’ Balanced Salt Solution(GIBCO社製)（以下、緩衝液１と記す）内で血液成分が十分除去されるまですすいだ後、新鮮な緩衝液１内に保存した。さらに先鋭のピンセットにて緩衝液１内の組織を破砕しながら、筋肉以外の組織を極力除去していく。滅菌済みのはさみを用いて破砕した筋肉断片を泥砂状になるまで、約1mm3以下の断片にまで細切した。緩衝液１と共に筋肉断片を容量50mlの円錐状チューブに回収し、一旦遠心して上清を除去した。次いで、予め37℃に保温しておいた0.4% collagenase type2 (Worthington社製)を筋組織約2gに対して15ml 加え、37℃恒温漕内で45分間震盪して酵素処理を行った。酵素処理後、緩衝液１を1チューブ当たり20ml加え、よく撹拌後遠心により上清を除去し、次いで、１チューブ当たり、10mlの10容量%FBS(牛胎仔血清)(Hyclone社製)及び1容量%ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するDMEM(GIBCO社製)培地を加えて十分に細胞を懸濁し、100μm cell strainer(FALCON社製)で濾過した後、更に40μm cell strainer(FALCON社製)で濾過して、マウス骨格筋組織由来細胞を取得した。
（２）マウス骨格筋組織由来幹細胞取得のための培養
上記(1)で得られた、野生型マウス又はGFP発現マウス由来の骨格筋組織由来細胞をserum free medium[DMEM/F12(GIBCO社製)、2容量%B27 supplement(GIBCO社製)、1容量%L-glutamine(200mM)-penicillin(10000 units/ml)-streptomycin(10mg/ml) solution (SIGMA社製)、20ng/ml recombinant human basic FGF (Promega社製)、40ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有]（以下、培地Ａと記す）に懸濁して細胞数を計測した。培地Ａを用いて、non-coating 10cm cell culture dish (Corning Inc社製)で、培養開始時の細胞濃度を2×104cells / mlとして、37℃、5%CO2下で14日間培養した。かかる培養により、培養液中に浮遊している状態の幹細胞のコロニー（図１のＡ及びＢ）が認められると共に、培養ディッシュの基底に付着した細胞として、核が小さく細長く伸展した線維芽細胞（図１のＣ）及び球状に集団を形成した骨格筋芽細胞（図１のＤ）が認められた。
（３）マウス骨格筋組織由来幹細胞のコロニーの単離、及び該幹細胞の培養
上記(2)で得られた培養液中に浮遊して増殖する細胞群（コロニー）をマイクロピペットで採取した。fibronectin coating 24-well plate (Becton Dickinson)の各wellに、上記で得られた１つの細胞群（コロニー）が入るように加えて、再度、low-serum expansion medium [advanced DMEM/F12(GIBCO社製)、2容量%FBS、1容量%L-glutamine(200mM)-penicillin(10000 units/ml)-streptomycin(10mg/ml) solution (SIGMA社製)、10ng/ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)、10ng/ml mouse LIF(CHEMICON社製)含有]（以下、培地Ｂと記す）で培養することによって単クローン性の幹細胞群を得た。
また、比較検討のために、上記(2)において、培養後に10cm fibronectin coating dishに付着している細胞（以下、「付着細胞」と表記する）についても酵素処理することにより採取した。
（４）マウス骨格筋組織由来幹細胞取得のための培養、及び該幹細胞のコロニーの単離
上記(1)で得られた野生型マウス骨格筋組織由来細胞と、上記(1)で得られたGFP発現マウス骨格筋組織骨格筋組織由来細胞とを１：１の比率で混合して、上記(2)と同様の条件で、non-coating 10cm cell culture dishによる培養を行った。培養前後に浮遊する細胞又はコロニーを観察した結果を図２に示す。図２において、左上図は、non-coating 10cm cell culture dishによる培養開始時に、細胞が浮遊している状態を位相差顕微鏡にて撮影した写真；左下図は左上図と同一視野を蛍光顕微鏡にて撮影した写真；右上図は、non-coating dish上で14日間培養した後に浮遊しているコロニーを位相差顕微鏡にて撮影した写真；及び右下図は左上図と同一視野を蛍光顕微鏡にて撮影した写真を示す。図２の左上図の矢印が示す部分に観察されたコロニーは、左下図では観察されなかったことから、当該コロニーは野生型マウス骨格筋組織由来細胞が増殖することにより形成されたコロニーであることが分かる。一方、図２の左上図の矢印が示す部分に以外で観察されたコロニーは、左下図でもは観察されていることから、当該コロニーはGFP発現マウス由来細胞が増殖することにより形成されたコロニー、又は野生型マウス由来細胞とGFP発現マウス由来細胞が凝集することにより形成された細胞塊であることが分かる。従って、図２の左上図の矢印が示すコロニーを採取することにより、細胞凝集塊による偽性幹細胞コロニーを誤って採取することを回避でき、単一細胞から形成されたコロニーを正確に単離することができる。
（５）マウス骨格筋組織由来幹細胞の特徴の確認
＜BrdUの発現＞
上記(3)で単離した幹細胞に対してブロモデオキシウリジン（BrdU）染色を行い、該細胞のBrdUの取込の有無を確認した。更に、上記(3)で単離した幹細胞を培地Ｂを用いて３７℃で５日間培養増殖させた周辺細胞についても、同様にBrdUの取込の有無を確認した。この結果を図３に示す。図３において、左下図は上記(3)で単離した幹細胞のBrdUの発現を観察した結果（蛍光顕微鏡写真）；左上図は、左下図の同一視野における位相差像；右下図は、上記(3)で単離した幹細胞を５日間培養増殖させた周辺細胞のBrdUの発現を観察した結果（蛍光顕微鏡写真）；及び右上図は、右下図の同一視野における位相差像を示す。図３から分かるように、上記(3)で単離した幹細胞はBrdU陽性を示し、細胞分裂を盛んに行っていることが確認された。また、上記(3)で単離した幹細胞を５日間培養増殖させた周辺細胞もBrdU陽性を示すことが確認された。
＜増殖特性＞
上記(3)で単離した幹細胞を、上記培地Ｂを用いて、10cm fibronectin coating dish (Becton Dickinson社製)で、37℃、5%CO2下で7日間培養したところ、経時的に増殖することが確認された（図４のＡ及びＢ参照）。図４において、Ａは培養３日目の細胞の顕微鏡写真；Ｂは培養７日目の細胞の顕微鏡写真をそれぞれ示す。上記(3)で単離した幹細胞を、上記培地Ｂを用いて培養することによって、他種細胞が混入することのない高純度の該幹細胞の細胞集団を得ることができた。
また、上記(3)で単離した幹細胞を6日おきに継代して培養したところ、３回目の継代培養後でも、その増殖能は保持されていた（図４のＣ参照）。図４において、Ｃは３回目の継代培養後の細胞の顕微鏡写真を示す。
一方、上記(3)で採取した付着細胞を上記培地Ｂを用いて、10cm fibronectin coating dishで、37℃、5%CO2下で7〜10日間培養したところ、培養時間の経過と共に、dishに付着した状態で増殖して、myotubeを形成し、骨格筋細胞に分化することが確認された（図４のＤ〜Ｆ参照）。図４中、Ｄは増殖した付着細胞；Ｅは該付着細胞がmyotubeを形成している状態；及びＦは該付着細胞が骨格筋細胞に分化した状態を示す。このことから、上記付着細胞は、骨格筋組織中に存在する骨格筋芽細胞であることが確認された。
＜細胞表面抗原及びマーカー＞
上記(3)で単離した幹細胞について、胚性幹細胞のマーカー（Bcrp、Bmi-1、Cripto、UTF-1、Nanog、Oct-4、HNF-3β、Brachyury、Sox 2及びβ-actin）の発現をPCRにより分析した。得られた結果を図５に示す。この結果、上記(3)で単離した幹細胞は、Bcrp、Bmi-1、Cripto、Nanog、Oct-4及びSox 2が、胚性幹細胞と同様に強く発現していることが分かった。
また、上記(3)で単離した幹細胞の各種細胞表面抗原（CD34、Sca-1、CD45、CD90、CD105、CD117、CD13、CD31及びCD38）についてFACS分析した。得られた結果を図６に示す。この結果から、CD90及びCD105が強陽性；CD34、Sca-1、CD13及びCD38が弱陽性；CD45、CD117及びCD31は陰性を示すことが確認された。
更に、上記(3)で単離した幹細胞について、筋芽細胞C2C12や骨格筋芽細胞のマーカー（Pax-7、Myf-5、c-met、M-cadherin、MyoD、及びMyogenin）の発現をPCRにより分析した。得られた結果を図７に示す。この結果から、上記(3)で単離した幹細胞は、筋芽細胞C2C12や骨格筋芽細胞に認められるマーカーを発現していないことが確認された。
また、上記(3)で単離した幹細胞について、CD34をAlex Fluor 555（Molecular Probes社製）により赤色；Myf-5をAlex Fluor 488（Molecular Probes社製）により緑色；細胞内の核をDAPI（4'6-diamino-2-pheny1indo1e）により青色に染色した。また、上記(3)で採取した付着細胞についても、同様に染色を行った。得られた結果を図８に示す。図８中、Ａ〜Ｄには付着細胞を染色した結果を示し、Ｅ〜Ｆには上記(3)で単離した幹細胞を染色した結果を示す。この結果からも、上記(3)で単離した幹細胞は、CD34陽性であって、骨格筋細胞の転写因子であるMyf-5を発現していないことが確認された。また、付着細胞の一部は、CD34陽性且つMyf-5陽性であり、サテライト細胞の特徴を示すことも確認された。
実施例２ マウス骨格筋組織由来幹細胞の局在部位の検討
6〜8週齢の雌C57Bl/6Jマウス（清水実験材料株式会社製）から、常法に従って骨格筋片を採取し、この骨格筋片を検体として、ラミニンをAlex Fluor 488（Molecular Probes社製）により緑色；細胞内の核をDAPIにより青色；及びCD34をAlex Fluor 555（Molecular Probes社製）により赤色に染色した。斯くして染色した検体を顕微鏡観察し、細胞基底膜及び間質における細胞の染色の有無を確認した。得られた結果を図９Ａ及びＢに示す。図９のＡには細胞基底膜の顕微鏡写真を示し、Ｂには間質の顕微鏡写真を示す。この結果から、骨格筋芽細胞は細胞基底膜下に存在しており（図９のＡ参照）、幹細胞は間質に局在していること（図９のＢ参照）が確認された。
また、同様に、この骨格筋片を検体として、ラミニンをAlex Fluor 555（Molecular Probes社製）により赤色；細胞内の核をDAPIにより青色；及びMyf-5をAlex Fluor 488（Molecular Probes社製）により緑色に染色して検体を顕微鏡観察し、細胞基底膜及び間質における細胞の染色の有無を確認した。得られた結果を図９Ｃに示す。この結果から、Myf-5陽性の骨格筋芽細胞は基底膜下に存在しており（図９のＣの黄色矢印部参照）、またMyf-5陰性である幹細胞は間質に存在していることが分かった（図９のＣの白矢印部参照）。
実施例３ マウス骨格筋組織由来幹細胞の心筋細胞への分化誘導
＜形態観察及びＧＦＰの発現の確認による心筋細胞への分化の確認＞
上記(3)で得られた幹細胞を上記培地Ｂで培養し、サブコンフルエントになった時点で、培地を、分化誘導用培地［MEM培地（GIBCO社製）；10容量％FBS、1容量％penicillin(10000 units/ml)-streptomycin(10mg/ml)、1容量％Insulin-transferrin-serenium-X (GIBCO社製)、及び1×10-8Ｍのデキサメサゾン(SIGMA社製)］に交換し、更に37℃、5%CO2下で2〜3週間培養を行った。培地交換後5日目頃から自発収縮する細胞の存在が観察された。また、培養後の細胞について形態的特徴を観察し、DAPI及び心筋特異的トロポニン−Iで細胞を染色した結果から、心筋細胞に分化していることが確認された（図１０のＡ参照）。また、prometaphaseからlate telophaseまでの心筋細胞が確認されたこと（図１０のＡ参照）から、上記幹細胞が分化した心筋細胞は、細胞分裂を行い、増殖する能力を有していることが確認された。
更に、上記(3)で増殖させた幹細胞を上記分化誘導用培地で、37℃、5%CO2下で2〜3週間培養を行った。分化誘導開始5日後頃から自発収縮する細胞の存在が観察された。分化誘導開始10日後にalpha-心筋重鎖プロモーターで制御されているGFP遺伝子を常法に従って導入し、その3日後に細胞の状態を顕微鏡観察した結果を図１０のＢに示す。図１０のＢにおいて、左上図は位相差顕微鏡により観察した像；右上図は左上図と同一視野を蛍光顕微鏡により観察した像；及び右下図は右上図に示す丸で囲んだ部分を拡大した像を示す。この結果、GFPが発現したことを示す緑色が観察されたことから、上記幹細胞が心筋細胞に分化したことが裏付けられた。
＜マーカーの確認による心筋細胞への分化の確認＞
上記(3)で得られた幹細胞と、該幹細胞を上記分化誘導用培地で、37℃、5％ＣＯ２下で14日間培養することにより分化誘導した細胞について、心筋細胞に認められる各種マーカー（図１１に示す各種心筋転写因子、構造タンパク、心筋結合タンパク、及びカルシウムイオンチャンネル）の発現をPCRにより分析した。得られた結果を図１１に示す。なお、陽性コントロールとして全心臓（positive control）を用いた。この結果からも、分化誘導１４日後に、上記幹細胞は心筋細胞に分化したことが確認された。
＜形態的特徴に基づく心筋細胞への分化の確認＞
骨格筋芽細胞を、常法に従って分化誘導すると、シート状に増殖分化した拍動性のmyotubeが形成される（図１２のＡ参照）。また、骨格筋芽細胞が未分化の状態のまま、多核の細胞形態を形成し、律動的拍動を呈することがある（図１２のＢ参照）。このように、心筋細胞に分化していない細胞であっても、拍動性を示し、心筋細胞に類似した特性を示すことがある。
これに対して、上記(3)で得られた幹細胞を前述する条件で分化誘導すると、単一または二核の形態を呈する拍動性心筋細胞（図１２のＣ参照）、特に骨格筋芽細胞より拍動数が少なく、規則性の拍動を示す単核の心筋細胞（図１２のＤ参照）への分化が認められる。このことからも、上記の幹細胞は、真に、心筋細胞に分化していることが確認された。
＜電気生理学的検討による心筋細胞への分化の確認＞
上記(3)で取得られた幹細胞を前述する条件で分化誘導させて得られた心筋細胞の拍動について、以下の方法で試験を行い、電気生理学的検討を行った。また、比較のため、骨格筋細胞についても、同様に電気生理学的検討を行った。
具体的には、上記(3)で取得られた幹細胞をコラーゲンコーティングしたカバーガラス（3mm×7mm、厚さ0.17〜0.25mm；MATSUNAMI社製）上で、上記分化誘導用培地を用いて、37℃、5％ＣＯ２下で培養し、分化誘導開始7〜10日後の時点で膜電位の測定を行った。膜電位の測定条件は次の通りである：Tyrode溶液（140mM NaCl、0.33mM NaHPO4、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、5.5mM glucose、及び5mM HEPES含有；NaOHにてpH7.4に調整）で灌流した記録チャンバー内に、上記培養後の細胞が付着したカバーガラスを入れて、2〜3MΩの抵抗に調整されたBorosilicate Glass CapillariesをPipette溶液（120mM KCl、1mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES、及び3mM MgATP含有；KOHにてpH7.2に調整）で満たして、増幅器（Axopatch 200A、AxonInstruments社製）を用いて活動電位を記録（whole cell recording）する。
得られた結果を図１３に示す。図１３中、Ａには骨格筋細胞の活動電位の振幅パターン；Ｂには骨格筋細胞におけるイソプロテレノール付加前後の活動電位の振幅パターン；Ｃには上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞の活動電位の振幅パターン；Ｄには上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞におけるイソプロテレノール付加前後の活動電位の振幅パターンを示す。図１３のＡ及びＣから分かるように、上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞では、骨格筋細胞に比してnotchを伴う幅の広い活動電位が観察された。また、図１３のＢ及びＤから明らかなように、上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞では、イソプロテレノール付加によって有意に拍動数が増加したが、骨格筋細胞ではイソプロテレノール付加前後で拍動数に変化は生じなかった。この結果からも、上記幹細胞から分化誘導した心筋細胞は、心筋細胞本来の拍動挙動を示し、骨格筋が呈する拍動挙動とは異なるものであることが確認された。
実施例４ マウス骨格筋組織由来幹細胞の他の細胞への分化誘導
上記(3)で得られた幹細胞を上記培地Ｂで培養し、サブコンフルエントになった時点で、培地を、各種インデューサーを添加したMEM培地に交換して、37℃、5%CO2下で更に２〜３週間培養して、各種細胞への分化誘導を行った。ここで、各種細胞の分化誘導の為に使用したインデューサー及びその濃度は表１の通りである。
Figure 2007010858
各種培地で培養した後に細胞を観察したところ、上記(3)で得られた幹細胞は、血管平滑筋細胞（図１４のＡ）、内皮細胞（図１４のＢ）、グリア細胞（図１４のＣ）、神経細胞（図１４のＤ）、脂肪細胞（図１４のＥ）、上皮細胞（図１４のＦ）、骨細胞（図１４のＧ）、及び骨格筋細胞（図１４のＨ）に分化していることが確認された。これらの細胞への分化は、細胞の形態的特徴と各種細胞染色の結果に基づいて確認された。なお、血管平滑筋細胞はα-SMCによる染色；内皮細胞はCD31による染色；グリア細胞はGAFPによる染色；神経細胞はNF2000による染色；脂肪細胞はoil-red染色；骨細胞はAlizarin red染色；骨格筋細胞はfast skeletal-MHCによる染色によって判定した。この結果から、上記(3)で得られた幹細胞は、多臓器に分化し得る多能性幹細胞であることが分かった。
実施例５ マウス由来幹細胞の移植
上記実施例１と同様の方法によって、全身の細胞がLacZを発現するLacZ過剰発現マウスから骨格筋組織由来幹細胞を取得し、これを培養して増殖させた。斯くして得られたLacZ発現幹細胞（約1×106cells）を、15μlのPBS(-)(GIBCO社製)に懸濁し、これを、BD Ultra Fine IIランセット(Becton Dickinson社製)を用いて、10〜12週齢のC57Bl/6Jマウス（清水実験材料株式会社製）に作成した梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植２１日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、LacZを緑色に染色すると共に、細胞内の核をDAPIにより青色に染色し、更に心筋細胞を心筋特異的トロポニンIを用いて赤色に、内皮細胞をCD31を用いて赤色に、また血管平滑筋細胞をα-smooth muscle-MHCを用いて赤色に染色した。
得られた結果を図１５に示す。図１５中、Ａ、Ｃ及びＥはLacZを染色した結果；Ｂは、Ａと同一視野において心筋特異的トロポニンIを用いて染色した結果；Ｄは、Ｃと同一視野においてCD31を用いて染色した結果；ＦはＥと同一視野においてα-smooth muscle-MHCを用いて染色した結果を示す。この結果から、移植した骨格筋由来の幹細胞が、ホスト心筋に生着して、心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞に分化しており、心臓の修復に寄与していることが明らかになった。
実施例６ ヒト由来幹細胞の取得
ヒトから採取した骨格筋組織片を用いて、上記実施例１に記載の「(1)マウス骨格筋組織由来細胞の取得」及び「(2)マウス骨格筋組織由来幹細胞取得のための培養」の方法に従って、ヒト骨格筋組織由来細胞を培養すると、dishに付着して増殖した細胞と共に、培養液中に浮遊して増殖能を示す細胞群（コロニー）が認められた（図１６のＡ及びＢ参照）。
更に、上記実施例１に記載の「(3)マウス骨格筋組織由来幹細胞のコロニーの単離、及び該幹細胞の培養」の方法に従って、単一の幹細胞から形成されたコロニーを機械的に単離し、培養を行うことによって、ヒト骨格筋組織由来の幹細胞を単離培養することに成功した。このとき単離した直後の幹細胞コロニーの顕微鏡写真を図１６のＣに、また培養５日後において同円心状増殖した幹細胞コロニーの顕微鏡写真を図１６のＤに示す。
上記で得られたヒト骨格筋組織由来の幹細胞について、胚性幹細胞のマーカー（Nanog、Oct-4、Rex1、Brachyury及びSox 2）の発現をRT-PCRにより分析した。得られた結果を図１７に示す。この結果、上記で単離した幹細胞は、Nanog、Oct-4、Rex1及びSox 2を、胚性幹細胞と同様に発現していることが確認された。
また、上記で得られたヒト骨格筋組織由来の幹細胞の各種細胞表面抗原（CD56、CD34、CD45、CD117、CD90、CD105、CD31及びCD38）についてFACS分析した。得られた結果を図１８に示す。CD56はヒト骨格筋芽細胞を100%認識する表面抗原である。ヒト骨格筋組織由来の幹細胞はCD56はほぼ陰性であった。ここでヒト骨格筋組織由来の幹細胞に関する結果は、マウスの場合と比べ、CD34陰性とCD38が弱陽性であることが大きな違いであった。一方、CD105陽性、CD90陽性は、ヒト及びマウスの何れの場合でも一致していた。なお、Sca-1についてはヒト由来細胞では存在しないため検討しなかった。
上記で得られた幹細胞のマーカーの発現を測定すると、c-met陰性、Pax-7陰性、Myf-5陰性、MyoD陰性、Myogenin陰性、及びM-cadherin陰性を示すことが確認された。
実施例７ ヒト骨格筋組織由来幹細胞の各種細胞への分化誘導
上記実施例６で得られたヒト骨格筋組織由来幹細胞を、上記実施例４と同様の方法で、各種細胞への分化誘導を行った。これによって、上記幹細胞が、心筋細胞（図１９のＡ参照）、骨格筋細胞（図１９のＢ参照）、平滑筋細胞（図１８のＣ参照）及び内皮細胞（図１８のＤ参照）に分化したことが確認された。これらの細胞への分化は、細胞の形態的特徴と各種細胞染色の結果に基づいて確認された。細胞染色は、DAPIによる細胞内の核の染色に加えて、心筋細胞は心筋性トポニンIによる染色；骨格筋細胞は速筋型骨格筋ミオシン重鎖による染色；平滑筋細胞は平滑筋ミオシン重鎖による染色；及び内皮細胞はCD31による染色を採用した。この結果から、上記実施例６で得られたヒト骨格筋組織由来幹細胞は、多臓器に分化し得る多能性幹細胞であること確認された。
実施例８ ヒト骨格筋組織由来幹細胞の移植
上記実施例６で得られたヒト骨格筋組織由来幹細胞（約1×106cells）を、15μlのPBS(-)(GIBCO社製)に懸濁し、これを、BD Ultra Fine IIランセット(Becton Dickinson社製)を用いて、10〜12週齢のN0D/SCIDマウス（Jackson Laboratoryより購入）に作成した梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植２１日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、細胞内の核をDAPI（4'6-diamino-2-pheny1indo1e）を用いて染色すると共に、心筋細胞を心筋特異的トロポニンIを用いて赤色；平滑筋細胞をalpha型smooth muscleミオシン重鎖を用いて赤色；内皮細胞をCD31を用いて赤色；及びヒト由来の核をmouse anti-human nuclei monoclonal antibodyを用いて緑色に染色した。
得られた結果を図２０に示す。図２０中、Ａには心筋型トロポニン-I陽性心筋細胞を赤色、及びヒト由来の核を緑色に染色した結果を示し；ＢにはＡと同一視野において心筋型トロポニン-I陽性心筋細胞を赤色、及び全ての核をDAPIにより白色に染色した結果を示し；Ｃにはalpha型smooth muscleミオシン重鎖陽性平滑筋細胞を赤色、及びヒト由来の核を緑色に染色した結果を示し；ＤにはCD31陽性内皮細胞を赤色、及びヒト由来の核を緑色に染色した結果を示す。この結果から、ヒト骨格筋組織由来幹細胞がホスト心筋に生着して心筋細胞に分化したことが確認された（図２０のＡの白矢印部参照）。また、ヒト骨格筋組織由来幹細胞がホスト心筋に生着して、平滑筋細胞や内皮細胞に分化したことも確認された（図２０のＣ及びＤ参照）。以上の結果から、移植した骨格筋組織由来の幹細胞が、ホスト心筋に生着して心筋各種細胞に分化して、心臓を修復していることが明らかになった。
実施例９ マウス骨格筋由来幹細胞の長期培養の検討
6、12及び24週齢の雌C57Bl/6Jマウス（清水実験材料株式会社製）を用いて、上記実施例１の(1)〜(3)と同様の方法で、マウス骨格筋由来幹細胞の取得を行った。取得できたマウス骨格筋由来幹細胞のコロニーの数と、fibronectin coating dishに付着したサテライト細胞の数を計測した。結果を図２１のＡに示す。この結果、Myf5陽性を示すサテライト細胞（図２１Ａ中、白丸）はマウスの週令の増加に伴い減少した。一方、骨格筋由来幹細胞の組織含有量（図２１Ａ中、黒丸）はマウスの週令の増加によっても変化せず一定量を保っていた。
また、上記培地Ｂを用いて、6週齢の雌C57Bl/6Jマウスから得られた上記骨格筋由来幹細胞の継代培養を行ったところ、120回の継代によって400日間培養可能であることも確認された（図２１のＢ参照）。斯くして継代培養した際に観察した細胞の形態を図２２に示す。図２２のＡにおいて、左の写真には初期形成した幹細胞コロニー（継代０回）の形態；中の写真には付着培養で120回継代した細胞の時点の細胞の形態；右の写真には120回継代後もserum free mediumに交換することでコロニーを形成しながら増幅していく幹細胞の形態を示す。
また、120回継代した上記骨格筋由来幹細胞コロニーについて、細胞染色により幹細胞のマーカーであるSca-1、CD34、及びnestinの発現の有無を確認した。その結果、120回継代した幹細胞コロニーは、上記幹細胞のマーカーのいずれをも提示しており、未分化維持されていることが確認できた（図２２のB参照）。更に、120回継代した幹細胞コロニーについて、胚性幹細胞のマーカーであるNanog及びOct-4の発現をPCRにより分析した。この結果から、120回継代した幹細胞コロニーは、Nanog及びOct-4を発現していることも確認できた（図２２のC参照）。
実施例１０ 骨格筋由来幹細胞の培養にマイオスタチンが与える影響の検討
ES細胞、実施例９で得られた初期（継代０回）骨格筋由来幹細胞、実施例９で得られた３回継代した骨格筋由来幹細胞、マウス筋芽細胞（C2C12細胞）、実施例９におけるマウス骨格筋由来幹細胞取得過程でfibronectin coating dishに付着したサテライト細胞、成人の筋肉由来の成熟細胞、及び成人の心筋由来の成熟細胞について、フォリスタチンとその拮抗するリガンドであるマイオスタチン（myostatin）の発現をPCRにより分析した。結果を図２３のＡに示す。この結果から、初期骨格筋由来幹細胞コロニー及び3回継代した骨格筋由来幹細胞コロニーに強く発現しており、分化した成熟細胞には発現が少ないことが明らかとなった。一方、マイオスタチンは、フォリスタチンとは逆の発現パターンを示し、未分化の細胞にその発現が少ないことが確認された。
また、実施例９で得られた初期（継代０回）骨格筋由来幹細胞を、マイオスタチン0.5μg/mL又は1.0μg/mLを含む培地Ｂで37℃、5%CO2下で1日間培養した。得られた骨格筋由来幹細胞について、p21、Cdk2、Rbの発現をウエスタンブロティング解析により分析した。結果を図２３のＢに示す。この結果から、マイオスタチンを含む培地で培養することによって、細胞増殖抑制系因子である細胞周期抑制因子p21の発現が増加し、逆に、細胞増殖促進因子であるCdk2の発現が低下していた。また、Rbの脱リン酸化も認められた。
実施例１１ マイオスタチン及びフォリスタチンが骨格筋幹細胞の増殖に及ぼす影響の検討
上記実施例１の(1)に記載の方法に従って、マイオスタチン欠損マウス(mstn-/-)及びGFP発現マウス(GFP-Tg)から骨格筋組織由来細胞を取得した。次いで、マイオスタチン欠損マウス由来の細胞とGFP発現マウス由来の細胞を培地Ｂを用いて、37℃、5%CO2下で14日間共培養した。培養後、浮遊している幹細胞コロニーと付着している衛星細胞の形態を観察した結果を図２４に示す。マイオスタチン欠損マウス由来の幹細胞コロニーはGFP発現マウス由来のものとサイズに変化がないものの、マイオスタチン欠損マウス由来の衛星細胞ではGFP発現マウス由来のものと比べ、細胞融合現象が顕著に認められた。
また、実施例１で得られた骨格筋由来幹細胞を、フォリスタチン625ng/mLを含む培地Ａ又はフォリスタチン未添加の培地Ａで37℃、5%CO2下で14日間培養した。その結果、フォリスタチンを含む培地での培養によって、骨格筋由来幹細胞コロニーの増幅速度が速くなりコロニー径が拡大する一方、サテライト細胞の細胞間融合も顕著に認められた（図２５のA参照）。また、実施例１で得られた骨格筋由来幹細胞を、フォリスタチン625ng/mLを含む培地Ｂで、37℃、5%CO2下で培養し、経時的にタンパク質の抽出を行い、p-smad2/3、smad2/3、p- smad1/5/8、smad1/5/8、p21、Cdk2及びRbの発現をウエスタンブロッティング解析により分析した。その結果、フォリスタチンは、骨格筋由来幹細胞におけるsmad2/3の非活性化とsmad1/5/8の活性化を促すと共に、細胞周期抑制因子であるp21の発現低下、増殖促進因子であるCdk2の発現上昇とRbのリン酸化に寄与しており、幹細胞コロニーの増殖を促進していることが確認できた。
更に、実施例９で得られた初期（継代０回）骨格筋由来幹細胞についてNodal, Activin及びGDF11の発現をPCRにより分析した。この結果から、フォリスタチンが直接抑制しているリガンドはActivinとGDF11である可能性が示唆された（図２６のＡ参照）。また、骨格筋由来幹細胞において、activin受容体及びALK2,3,4,5,7の発現も、PCR分析により確認された。
実施例１２ 骨格筋由来幹細胞移植後の心筋細胞分化形態の検討
6〜8週齢のLacZリポーターマウス（大阪大学医学部 宮崎博士より供給）を用いて、実施例１の(1)〜(3)と同様の方法で、骨格筋由来幹細胞を取得した。得られた骨格筋由来幹細胞（約1×106cells）を、15μlのPBS(-)(GIBCO社製)に懸濁して、骨格筋由来幹細胞懸濁液を得た。また、別途、10〜12週齢のGFP発現能を有するCAG-EGFPマウス（大阪大学医学部 岡部博士より供給）に（以下、GFP発現マウスと表記することもある）に梗塞心筋を作成した。上記の骨格筋由来幹細胞懸濁液15μlを、BD Ultra Fine IIランセット(Becton Dickinson社製)を用いて、GFP発現マウスの梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植28日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋について、心筋特異的構造蛋白トロポニン-I（cTnI）染色（赤色として認識される）及びLacZ染色（青色として認識される）を行った。
その結果、GFP陽性、LacZ陽性且つcTnI陽性を示す心筋細胞が確認されたことから、移植した骨格筋由来幹細胞がホスト心筋との細胞融合をして心筋細胞に分化していることが確認された（図２７の上段参照）。また、GFP陰性、LacZ陽性且つcTnI陽性を示す心筋細胞の存在も確認されたことから、移植した骨格筋由来幹細胞が細胞間融合を介さずに能動的心筋細胞にも分化していることが明らかになった（図２７の中段参照）。更に、GFP陰性、トロポニン-I陰性、且つLacZ陽性を示す細胞も一部に観察され、非心筋細胞に分化した細胞の存在も示唆された（図２７の下段参照）。なお、移植後のマウスの新機能を解析したところ、その改善が認められ、骨格筋由来幹細胞の移植が有効であることが確認された。
実施例１３ 骨格筋由来幹細胞が移植された梗塞心筋における心機能の解析
実施例１で得られた骨格筋由来幹細胞（約1×106cells）を、15μlのPBS(-)(GIBCO社製)に懸濁して、骨格筋由来幹細胞懸濁液を得た。また、別途、10〜12週齢の雌C57Bl/6Jマウス（清水実験材料株式会社製）に梗塞心筋を作成した。上記の骨格筋由来幹細胞懸濁液15μlを、BD Ultra Fine IIランセット(Becton Dickinson社製)を用いて、C57Bl/6Jマウスの梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植14及び28日後に、心エコー法により心機能解析を行った。更に、左室拡張末期径、内径短縮率、及び左室拡張能を測定した。なお、比較のために、梗塞心筋を作成した雌C57Bl/6JマウスにPBS15μlを投与した群（MI＋PBS群）、並びに梗塞心筋を作成しなかったC57Bl/6Jマウス群（sham群）に対して、心エコー法による心機能解析及び心機能パラメーターの測定を同様に実施した。
心エコー法により心機能解析の結果、骨格筋由来幹細胞の移植によって、虚血の前壁領域の壁運動に改善が認められた（図２８のA参照）。また、左室拡張末期径、内径短縮率、及び左室拡張能の測定結果から、骨格筋由来幹細胞を移植したマウスでは、MI＋PBS群のマウスに比べ、移植後４週までに各種機能に有意な改善が認められた（図２８のＢ参照）。

Claims (23)

  1. c-met陰性、Pax-7陰性、Myf-5陰性、MyoD陰性、Myogenin陰性、及びM-cadherin陰性を示す、ほ乳動物の骨格筋組織由来の単離された多能性幹細胞。
  2. CD105及びCD90が陽性を示し、c-kit及びCD45が陰性を示す、請求項１に記載の多能性幹細胞。
  3. Sox-2陽性、Cripto陽性、Nanog陽性、Oct-4陽性、Bmi-1陽性、及びBrcp陽性を示す、請求項２に記載の多能性幹細胞。
  4. 骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、血液細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、及び神経系細胞よりなる群から選択される１種又は２種以上の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、請求項１に記載の多能性幹細胞。
  5. 少なくとも拍動性心筋細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、請求項１に記載の多能性幹細胞。
  6. ほ乳動物が、ヒト、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、イヌ、及びサルよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の多能性幹細胞。
  7. 下記工程を経て得られる、請求項１に記載の多能性幹細胞：
    (i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
    (ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、及び
    (iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程。
  8. 下記工程を含有する、請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を単離する方法：
    (i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨格筋組織由来細胞を得る工程、
    (ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、及び
    (iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程。
  9. 請求項１に記載の多能性幹細胞で構成され、単一細胞から増殖して得られることを特徴とする、多能性幹細胞群。
  10. 下記工程を経て得られる、請求項９に記載の多能性幹細胞群：
    (i)ほ乳動物から骨格筋組織を採取し、得られた骨格筋組織を酵素処理することにより骨
    格筋組織由来細胞を得る工程、
    (ii)得られた骨格筋組織由来細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含む培地において培養する工程、
    (iii)培養液中に浮遊しているコロニーを選択し、分離する工程、及び
    (iv)上記工程(iii)で分離したコロニーを形成している細胞を増殖させる工程。
  11. 上記工程(iii)が、培養液中に浮遊しているコロニーの内、単一の細胞が増殖して形成したコロニーを選択し、該コロニーが１つだけ存在する状態に分離する工程である、請求項１０に記載の多能性幹細胞群
  12. 請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を、フォリスタチンを含む培地で培養することを特徴とする、該多能性幹細胞の増殖方法。
  13. フォリスタチンの、請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を増殖させるための使用。
  14. 請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞、又は該幹細胞から分化した細胞を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。
  15. 治療対象疾患が心疾患である、請求項１４に記載の治療方法。
  16. 請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を含有する、医薬組成物。
  17. 組織又は細胞の再生薬である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 臓器不全の治療薬である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  19. 請求項１乃至８のいずれかに記載の多能性幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用医薬組成物の製造のための使用。
  20. 医薬組成物が組織又は細胞の再生薬である、請求項１９に記載の使用。
  21. 医薬組成物が心疾患治療用である、請求項１９に記載の使用。
  22. 請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を各種細胞へ分化誘導させる物質をスクリーニングする方法であって、
    (a)該多能性幹細胞に被験物質を接触させて培養する工程、及び
    (b)該多能性幹細胞の分化誘導の有無を観察し、その結果に基づいて、被験物質を選別す
    る工程
    を含む、方法。
  23. 請求項１乃至７のいずれかに記載の多能性幹細胞を増幅させる物質をスクリーニングする方法であって、
    (a)該多能性幹細胞に被験物質を接触させて培養する工程、及び
    (b)該多能性幹細胞の増幅の有無を観察し、その結果に基づいて、被験物質を選別する工
    程
    を含む、方法。
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