JPWO2001083705A1

JPWO2001083705A1 - Cardiomyocyte proliferation-related genes

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Publication number: JPWO2001083705A1
Application number: JP2001-580314A
Authority: JP
Inventors: 陽史山田; 進関根; 泰弘菊池; 一洋桜田
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2003-07-29

Abstract

(57)【要約】胎児心臓と成体心臓とで発現量が変化する遺伝子群を取得し、心筋壊死によって障害を受けた組織を修復するための治療薬の探索に有用な蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡおよび該蛋白質を認識する抗体、ならびにこれらの利用法を提供する。 (57) [Abstract] We have obtained a group of genes whose expression levels change between the fetal heart and the adult heart, and provide proteins useful in the search for therapeutic agents to repair tissue damaged by myocardial necrosis, DNA encoding the proteins, antibodies that recognize the proteins, and methods for using them.

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動するｍＲＮＡを基にして、サ
ブトラクション法およびディファレンシャルハイブリダイゼーション法を用いて
取得した該ｍＲＮＡに相補するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、および該ＤＮＡがコードす
る蛋白質に関する。また、該蛋白質に対する抗体、該蛋白質および該ＤＮＡの検
出方法、ならびに該ＤＮＡ、蛋白質、抗体などを含む、心筋壊死を原因とする種
々の心疾患、例えば心肥大、心不全などの疾患の診断薬および治療薬に関する。背景技術心臓は個体発生の極めて早期に、臓器としては最も早く分化し、分化後すぐに
自律拍動を開始する。心筋細胞は分化後も分裂能を維持し、胎生期の間は活発に
分裂増殖を続ける。つまり、この時期の心筋細胞の特徴は、細胞質に多数の収縮
フィラメントの束を含んでいるにもかかわらず、有糸分裂を有することである。他の多くの体細胞は、それぞれ分化を遂げて特殊な細胞質構造ができあがると
、分裂能が失われるが、心筋細胞の場合、この一般法則から逸脱している。出生後、心筋細胞の増殖能は急速に低下する。このため、心臓の成長は個々の
心筋細胞の大きさが増すという生理的肥大によっておこなわれ、出生後の心筋細
胞には再生能力がないと考えられている。心筋梗塞、心筋炎、老化等により心筋細胞が壊死すると、残存心筋細胞は細胞
分裂ではなく、細胞肥大により適応する。出生直後の心肥大は生理的適応である
が、この場合は、共存する心線維芽細胞の増生、間質の線維化と相まって心臓自
体の拡張機能の低下、さらには収縮機能の低下へと結びつき、心不全を呈してく
る。心筋梗塞等による心不全のこれまでの治療では、心収縮力の増強薬や血管拡
張薬による圧負荷や容量負荷の軽減、利尿薬による体積量の減少等の対処療法が
主に行われてきた。重篤な心不全は予後が不良であり、抜本的治療法としては心
臓移植しかないが、臓器提供者の不足、脳死判定の難しさ、拒絶反応、医療費の
高騰等の問題から心臓移植が一般的な治療法となってはいない。もし、成体心筋細胞に増殖能が付与されれば、心不全を治療、予防できると考
えられる。現在、心筋細胞が出生後増殖能を喪失する分子機構については不明で
ある。しかし、胎児および成体における心筋細胞の性質の違いから、胎児心臓で
高発現している分子、または成体心臓で高発現している分子が心筋細胞の増殖抑
制に関与している、ことが考えられる。現在までに、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する蛋白質として、以下の
ようなものが知られている。成体心臓に比べて胎児心臓で高発現している蛋白質として、ＰＣＮＡ（ｐｒｏ
ｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ）、Ｒｂ（
ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、Ｃｙｃ（ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１、ＣｙｃＤ３、
Ｃｄｋ（ＣｙｃｌｉｎＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ）４等、ＤＮＡ
複製や細胞周期に関与するものが知られている〔Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，
２７１，Ｈ２１８３−Ｈ２１８９（１９９６）〕。一方、胎児心臓に比べて成体
心臓で高発現している蛋白質として、Ｇａｘ（Ｇｒｏｗｔｈａｒｒｅｓｔ−ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｅｏｂｏｘ）が知られている〔Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，２７１，Ｈ２１８３−Ｈ２１８９（１９９６）〕。しかし、例えば、心筋細胞特異的にＣｙｃｌｉｎＤ１を強制発現させたトラン
スジェニックマウスにおいて、成体心筋細胞での多核は観察されたものの、成体
型収縮蛋白質が発現するのみで細胞数の顕著な増加は観察されていない〔Ｊ．Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９９，２６４４−２６５４（１
９９７）〕等、これらの蛋白質のみで成体心筋細胞に増殖能を与えることには成
功していない。従って、心筋細胞の増殖に関与すると考えられる、胎児心臓と成体心臓とで発
現量が変動する新たな因子の同定が求められている。発明の開示胎児期には増殖能を有していた心筋細胞が、出生後、増殖能を喪失する分子メ
カニズムを解明できれば、心筋壊死を原因とする種々の心疾患の発症機構ならび
に治療のターゲットを知ることができ、心筋細胞の再生方法を開発することがで
きる。本発明の目的は、胎児心臓と成体臓とで発現量が変化する遺伝子を取得し
、心筋壊死によって障害を受けた組織を修復するような治療薬の探索に有用な蛋
白質、該蛋白質をコードするＤＮＡおよび該蛋白質を認識する抗体、並びにこれ
らの利用法を提供することにある。本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究し以下の結果を得た。すなわち、
胎生１６日目のラット心臓由来のｍＲＮＡを鋳型として作製したｃＤＮＡライブ
ラリーを、生後８週齢のラット心臓より抽出したｍＲＮＡで差し引くことにより
、胎児心臓で発現が高い遺伝子が濃縮されたサブトラクションライブラリーを構
築した。該サブトラクションライブラリーでは、発現量の低い遺伝子が均一化す
る現象ならびに挿入断片のない空のベクターが増加することから、サブトラクシ
ョンライブラリーの各ｃＤＮＡクローンについてディファレンシャルハイブリダ
イゼーションを行うことにより、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動するよう
な遺伝子のクローンを多数取得した。該クローンの中には既に胎児心臓と成体心
臓とで発現量が変動することが知られている遺伝子に加えて、その変動が今まで
知られていなかった遺伝子、および新規遺伝子が含まれていた。また、ノーザン
ハイブリダイゼーションを行って、それら遺伝子の発現変動を確認した。さらに
該遺伝子がコードするペプチドを見出すことにより、本発明を完成させるに至っ
た。以下、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子を心筋細胞増殖関連遺
伝子とも言う。本願は、以下の（１）〜（５９）に記載の発明を提供する。（１）配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表される塩基配列からなる
群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。（２）配列番号２１または２７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動
する遺伝子のＤＮＡ。（３）配列番号２３、２５または３０で表される塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズしかつ該ＤＮＡと９０％以上の相同性を
有し、かつ胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子のＤＮＡ。（４）配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表わされる塩基配列からな
る群より選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡ
。（５）上記（４）記載のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ。（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて、胎児心臓と
成体心臓とで発現量が変動する遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法。（７）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、心筋壊死
を原因とする心疾患の診断薬。（８）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて、心筋壊死を
原因とする心疾患の原因遺伝子を検出する方法。（９）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて、胎児心臓と
成体心臓とで発現量が変動する遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促進する
物質をスクリーニングする方法。（１０）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて心筋壊死を
原因とする心疾患の治療薬をスクリーニングする方法。（１１）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、心筋壊
死を原因とする心疾患の治療薬。（１２）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えウイル
スベクター。（１３）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のＤＮＡのセンス鎖と相同な
配列からなるＲＮＡを含む組換えウイルスベクター。（１４）配列番号１９、３２および３７で表される塩基配列からなる群より選ば
れる塩基配列を有するＤＮＡ。（１５）上記（１４）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする、胎児心臓と成体心臓とで発現が変動する遺伝子のＤＮＡ。（１６）配列番号１９、３２および３７で表される塩基配列からなる群より選ば
れる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡ。（１７）上記（１６）記載のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ。（１８）上記（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、心
筋壊死を原因とする心疾患の診断薬。（１９）上記（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いる、心筋
壊死を原因とする心疾患の原因遺伝子を検出する方法。（２０）上記（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて、胎児
心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促
進する物質をスクリーニングする方法。（２１）上記（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて心筋壊
死を原因とする心疾患の治療薬をスクリーニングする方法。（２２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡを用いて
、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法。（２３）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡを含有す
る、心筋壊死を原因とする心疾患の診断薬。（２４）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡを用いて
、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制ま
たは促進する物質をスクリーニングする方法。（２５）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡを用いて
、心筋壊死を原因とする心疾患の治療薬をスクリーニングする方法。（２６）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡを含有す
る、心筋壊死を原因とする心疾患の治療薬。（２７）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡを含む組
換えウイルスベクター。（２８）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、３３および３
５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡのセンス
鎖と相同な配列からなるＲＮＡを含む組換えウイルスベクター。（２９）配列番号２２、２４、２６、２８および３１で表されるアミノ酸配列か
らなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質。（３０）配列番号２２、２４、２６および２８で表されるアミノ酸配列からなる
群より選ばれるアミノ酸配列とは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または
付加したアミノ酸配列からなり、かつ心筋壊死を原因とする心疾患の修復に関与
する活性を有する蛋白質。（３１）上記（２９）または（３０）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。（３２）上記（１）〜（４）および（３１）のいずれか１項記載のＤＮＡをベク
ターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。（３３）上記（３２）記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質
転換体。（３４）上記（３３）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（２９
）または（３０）記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取す
ることを特徴とする蛋白質の製造方法。（３５）上記（２９）または（３０）記載の蛋白質を含有する、心筋壊死を原因
とする心疾患の治療薬。（３６）上記（３３）記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物を用い
て心筋壊死を原因とする心疾患の治療薬をスクリーニングする方法。（３７）上記（２９）または（３０）記載の蛋白質を用いて、心筋壊死を原因と
する心疾患の治療薬をスクリーニングする方法。（３８）上記（２９）または（３０）記載の蛋白質の生産に関与する組換えウイ
ルスベクター。（３９）上記（３８）記載の組換えウイルスベクターを含有する、心筋壊死を原
因とする心疾患の治療薬。（４０）上記（２９）または（３０）記載の蛋白質を認識する抗体。（４１）上記（４０）記載の抗体を用いる上記（２９）または（３０）記載の蛋
白質の免疫学的検出方法。（４２）上記（４０）記載の抗体を用いて、心筋壊死を原因とする心疾患の治療
薬をスクリーニングする方法。（４３）上記（４０）記載の抗体を用いて、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変
動する遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促進する物質をスクリーニングす
る方法。（４４）上記（４０）記載の抗体を含有する、心筋壊死を原因とする心疾患の診
断薬。（４５）上記（４０）記載の抗体を含有する、心筋壊死を原因とする心疾患の治
療薬。（４６）上記（４０）記載の抗体と放射性同位元素、蛋白質および低分子化合物
から選ばれる薬剤とを結合させた融合抗体を心臓病巣へ誘導するドラッグデリバ
リー方法。（４７）配列番号２０または３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を認識
する抗体。（４８）上記（４７）記載の抗体を用いて、心筋壊死を原因とする心疾患の治療
薬をスクリーニングする方法。（４９）上記（４７）記載の抗体を用いて、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変
動する遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制する物質をスクリーニングする方法。（５０）上記（４７）記載の抗体を含有する、心筋壊死を原因とする心疾患の診
断薬。（５１）上記（４７）記載の抗体を含有する、心筋壊死を原因とする心疾患の治
療薬。（５２）上記（４７）記載の抗体と放射性同位元素、蛋白質および低分子化合物
から選ばれる薬剤とを結合させた融合抗体を心臓病巣へ誘導するドラッグデリバ
リー方法。（５３）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、３４および
３６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白
質の生産に関与する組換えウイルスベクター。（５４）上記（５３）記載の組換えウイルスベクターを含有する、心筋壊死を原
因とする心疾患の治療薬。（５５）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、３４および
３６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白
質を認識する抗体を用いて、心筋壊死を原因とする心疾患の治療薬をスクリーニ
ングする方法。（５６）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、３４および
３６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白
質を認識する抗体を用いて、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子の
転写もしくは翻訳を抑制または促進する物質をスクリーニングする方法。（５７）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、３４および
３６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白
質を認識する抗体を含有する、心筋壊死を原因とする心疾患の診断薬。（５８）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、３４および
３６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白
質を認識する抗体を含有する、心筋壊死を原因とする心疾患の治療薬。（５９）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、３４および
３６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白
質を認識する抗体と放射性同位元素、蛋白質および低分子化合物より選ばれる薬
剤とを結合させた融合抗体を心臓病巣へ誘導するドラッグデリバリー方法。以下に本発明を詳細に説明する。本発明のＤＮＡは胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子のＤＮＡで
あり、例えば、配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表される塩基配列
から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、および該ＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつ胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動するＤＮＡ
をあげることができる。上記の配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表される塩基配列から選
ばれる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、
配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表される塩基配列から選ばれる塩
基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法
、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼ
ーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、細菌の
コロニーあるいはファージのプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用
いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃で標識したＤＮＡプローブと
のハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍
濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナト
リウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定
できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）
（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略記する）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略記する）、ＤＮＡＣｌｏｎｉ
ｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐ
ｒｏａｃｈ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリ
ダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２１、２３、２５、２７および
３０で表される塩基配列から選ばれる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性
を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましく
は９０％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。さらに、本発明のＤＮＡとして、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するオリゴ
ヌクレオチドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドも含まれる。該オリゴヌ
クレオチドとして、例えば、配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表さ
れる塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０残基、好ましくは１０
〜４０残基の塩基配列と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることがで
き、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとして、例えば、該オリゴヌクレオチド
のアンチセンス・オリゴヌクレオチドをあげることができる。本発明の蛋白質として、心筋壊死を原因とする心疾患に関連する活性を有する
蛋白質をあげることができ、具体的には、配列番号２２、２４、２６、２８およ
び３１で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、また
は配列番号２２、２４、２６および２８で表されるアミノ酸配列から選ばれるア
ミノ酸配列とは１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸
配列からなり、かつ心筋壊死を原因とする心疾患の修復に関与する活性を有する
蛋白質をあげることができる。配列番号２２、２４、２６および２８で表されるアミノ酸配列から選ばれるア
ミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列とは１もしくは数個のアミノ酸が欠失
、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ心筋壊死を原因とする心疾患
の修復に関与する活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版
、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅ
ｎｅ，３４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒ
ｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することがで
きる。１心筋細胞増殖関連遺伝子の調製（１）ラット心臓差分化ｃＤＮＡライブラリーの調製とディファレンシャルハイ
ブリダイゼーションによるライブラリーからのｃＤＮＡの選択心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡを以下のようにして調製する。まず、生後８週齢ラット心臓ｍＲＮＡを用いて差分化を行った胎生１６日ラッ
ト心臓ｃＤＮＡライブラリーを作製し、その差分化ｃＤＮＡライブラリー中のｃ
ＤＮＡクローンについて、さらに胎生１６日ラット心臓ＲＮＡと生後８週齢ラッ
ト心臓ＲＮＡをそれぞれプローブとしたデファレンシャルハイブリダイゼーショ
ンを行って胎生１６日心臓と生後８週齢心臓とで発現量が異なるｃＤＮＡクロー
ンを選択することによって心筋細胞増殖関連遺伝子を得ることができる。差分化とは、ある条件の組織や細胞から抽出したｍＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡ
を作製して対照群の細胞のｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡとハイブリ
ダイズしたｃＤＮＡだけを除くことによって、対照群と比較して発現量が異なる
遺伝子のｃＤＮＡを選択する方法である。（１）−１差分化ｃＤＮＡライブラリーの作製差分化ｃＤＮＡライブラリーの作製法にはいくつかの方法があるが、本発明で
は、まず通常の方法で胎生１６日ラット心臓ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ヘ
ルパーファージを用いて１本鎖ＤＮＡに転換した後、差分化を行う方法〔Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８２５（１９９１）〕をとる
。差分化は、ビオチン化した８週齢ラット心臓ｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、
ハイブリダイズしたビオチン化ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体にさらにストレプトア
ビジンを結合させた後、フェノール抽出により分離する方法を用いる。（１）−１−Ａ胎生１６日ラット心臓ｃＤＮＡライブラリーの作製ラット心臓からの全ＲＮＡの調製方法としては、チオシアン酸グアニジン−ト
リフルオロ酢酸セシウム法〔ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）〕等をあげることができる。ｍＲＮＡは一般に３’末端にポリ（Ａ）が付加しているので、オリゴ（ｄＴ）
固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等により、
全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製することができる。さらに、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ・アイソレーション・キット（Ｆａ
ｓｔＴｒａｃｋｍＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社製）、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション・キット（
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ：Ａｍｅ
ｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）等のキットを用いてｍ
ＲＮＡを調製することもできる。ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーの作製法としては、モレキュラー・クロー
ニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒ
ａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏ
ｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あ
るいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォ
ー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング（ＳｕｐｅｒＳ
ｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅ
ｓｉｓａｎｄＰｌａｓｍｉｄＣｌｏｎｉｎｇ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ社製）やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ
ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等が
あげられる。クローニングベクターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中で
高いコピー数で複製可能で、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子
等の形質転換用のマーカー遺伝子、ｃＤＮＡを挿入できるマルチクローニングサ
イト等を有しており、かつ一本鎖ＤＮＡへの変換が簡単にできるクローニングベ
クターがあげられる。クローニングベクターとしては、Ｍ１３ファージの複製シ
グナルＩＧ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｐａｃｅ）を含みヘルパーファージの感
染により一本鎖ＤＮＡファージに変換可能なプラスミドであるファージミドベク
ターがあげられる。具体的には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）、ｐＢＳ（−）、ｐＢＣ（＋）〔以上いずれも
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）
等があげられる。ヘルパーファージを利用したイン・ビボ・エクシジョン（ｉｎ
ｖｉｖｏｅｘｃｉｓｉｏｎ）により、ファージミドに変換が可能なλファー
ジベクターがあげられる。具体的には、λＺＡＰＩＩ、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ（
両者ともストラタジーン社製）等があげられる。上述したイン・ビボ・エクシジ
ョン、一本鎖ＤＮＡファージへの変換方法、および培養上清中のファージからの
一本鎖ＤＮＡの精製方法はそれぞれ市販のベクターに添付されたマニュアルに従
って行うことができる。ｃＤＮＡを組み込んだベクターを導入する大腸菌としては、導入した遺伝子を
発現できるものならいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＣ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＹ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８
（１９８３）〕、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＹ１０９０〔Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮ
Ｍ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１
９６６）〕、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８
，２７５（１９８５）〕等を用いることができる。差分化にはｃＤＮＡと生後８週齢ラット心臓のｍＲＮＡとのハイブリダイゼー
ションを用いることと、ファージミドからできる一本鎖ＤＮＡは、ファージミド
の種類により二本鎖のうちのどちらの鎖ができるか決まっていることから、ｃＤ
ＮＡライブラリー作製に際しては、どのｃＤＮＡクローンからも一本鎖ＤＮＡと
してアンチセンス鎖（実際のｍＲＮＡとは相補的な塩基配列をもつ鎖）ができる
ようにｃＤＮＡの作製とベクターへの挿入方向を工夫する。例えば、ストラタジーン社のＺＡＰｃＤＮＡ合成キットのマニュアルに記載
のように、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成には５’末端にＸｈｏＩサイトをもつ
オリゴｄＴプライマーと、基質としてｄＣＴＰの代わりに５−メチルｄＣＴＰ（
合成後のｃＤＮＡの内部でＸｈｏＩ切断できないようになる。）を含むｄＮＴＰ
とを用いて行う。合成されたｃＤＮＡの両端にＥｃｏＲＩアダプターを付加した
後に、ＸｈｏＩで切断する。切断されたｃＤＮＡをベクターλＺＡＰＩＩのＥｃ
ｏＲＩ／ＸｈｏＩサイト間に挿入すると、常にｃＤＮＡのＥｃｏＲＩサイト側が
５’末端でＸｈｏＩサイト側が３’末端になり、ベクターへの挿入方向が一定に
なる。上述の方法で得られたｃＤＮＡライブラリーは、インビボエクシジョンにより
ファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）に変換した後、ヘル
パーファージを感染させることにより、ｃＤＮＡ部分がアンチセンス鎖の１本鎖
ＤＮＡを取得することができる。（１）−１−Ｂ生後８週齢ラット心臓ｍＲＮＡを用いた差分化（１）−１−Ａで調製したファージミドベクターのｃＤＮＡライブラリーにつ
いて、ヘルパーファージを感染させることにより、培養液中に一本鎖ＤＮＡファ
ージを放出させる。該培養液から一本鎖ｃＤＮＡを精製回収する。λファージベ
クターを用いる場合には、インビボエクシジョンを行ってベクターをファージミ
ドに変換した後に上記と同様の操作を行う（モレキュラー・クローニング第２版
）。一本鎖ＤＮＡの精製方法はモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法
に基づいて行うことができる。差分化の具体的操作および試薬の組成や反応条件はＧｅｎｅｓｔｏＣｅｌ
ｌｓ，３，４５９（１９９８）に記載された方法で行うことができる。（１）−
１−Ａで示した方法で調製した生後８週齢ラット心臓ｍＲＮＡを、フォトプロー
ブビオチン〔ベクター・ラボラトリーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）社製〕等を用いてビオチン化を行った後、上記の一本鎖胎生１６日ラット
心臓ｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後の溶液にビオチンと強
固に結合するストレプトアビジンを反応させることにより、ビオチン化ｍＲＮＡ
とハイブリダイズしたｃＤＮＡに、さらにストレプトアビジンを結合させ、疎水
性を上昇させた後、フェノールを加えて抽出操作を行う。ハイブリダイズしない
ｃＤＮＡを水層から分取することができる。なおフェノール層にはビオチン化ｍＲＮＡとハイブリダイズしたｃＤＮＡが抽出
される。（１）−１−Ｃ差分化後のｃＤＮＡライブラリー化（１）−１−Ｂの差分化ｃＤＮＡについて、ベクター部分の塩基配列と相補的
な塩基配列をもつ適当なプライマーおよびＢｃａＢＥＳＴ（宝酒造社製）、Ｋｌ
ｅｎｏｗ断片等のＤＮＡポリメラーゼを利用して二本鎖にした後、大腸菌に導入
することにより、再度ｃＤＮＡライブラリーとすることができる。大腸菌への導
入方法は形質転換効率が高いエレクトロポレーション法が好ましい。（１）−２ディファレンシャルハイブリダイゼーション（１）−１で作製した差分化ｃＤＮＡライブラリーには、胎生１６日ラット心
臓で発現量が増加する遺伝子のｃＤＮＡが濃縮されているが、該ライブラリーの
中の全てのｃＤＮＡクローンが心筋細胞増殖関連遺伝子であるとは限らない。こ
れらの中から心筋細胞増殖関連遺伝子のｃＤＮＡを選択するには、それぞれのｃ
ＤＮＡクローンをプローブにしたノーザン・ハイブリダイゼーション（モレキュ
ラー・クローニング第２版）やｃＤＮＡクローンの塩基配列に基づいたプライマ
ーを用いたＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）−ＰＣＲ法〔ＰＣ
ＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９０）〕により
胎生１６日ラット心臓または生後８週齢ラット心臓のｍＲＮＡの発現量を比較す
ることにより、どちらかでｍＲＮＡの発現量の高い心筋細胞増殖関連遺伝子のｃ
ＤＮＡを選択する。また、以下に示すディファレンシャルハイブリダイゼーショ
ンを行うことにより、発現量の増加しているｃＤＮＡクローンを包括的かつ効率
的に選択することもできる。まず、（１）−１の方法で得られた差分化ｃＤＮＡライブラリーを、個々のコ
ロニーが分離できる程度の濃度に希釈して寒天培地上に広げて培養し、分離した
コロニーをそれぞれ同一条件で液体培地中で培養する。該培養液中の大腸菌に含
まれるｃＤＮＡを鋳型として、クローニングベクター特異的なオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅させる。その後、反応溶液
を同一量２枚のナイロンメンブレンにスポットさせる。モレキュラー・クローニ
ング第２版に記載の方法でナイロンメンブレン上のＤＮＡの変性と中和を行った
後、紫外線照射によりナイロンメンブレンにＤＮＡを固定する。該メンブレンに
ついて１枚は胎生１６日ラット心臓の全ｍＲＮＡ、もう１枚は生後８週齢ラット
心臓の全ｍＲＮＡをそれぞれプローブにしてハイブリダイゼーションを行い、そ
のハイブリダイズシグナルの強弱を比較することにより、生後８週齢ラット心臓
と胎生１６日ラット心臓とで発現量が異なるクローンを選択する。選んだクロー
ンの各コロニーを９６穴プレートに分離して培養し、Ｈｙｄｒａ９６（Ｒｏｂｂ
ｉｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の９６穴プレートに対応した自動微量分
注装置を使用して反応溶液を分注した後ＰＣＲ反応を行う。この操作により多数
のクローンについて同じ量のＤＮＡがブロットされた２枚の同一のメンブレンを
容易に素早く調製でき、しかも元のクローンとの対応も明瞭である。プローブとしては、通常のＤＮＡプローブと同様にｍＲＮＡ全体に対し逆転写
酵素とランダムプライマーを用いて作製した標識ｃＤＮＡを用いることも可能だ
が、ＲＮＡプローブの方が、メンブレン上のＤＮＡに対しＤＮＡプローブより強
固にハイブリダイズして強いシグナルを与えるため、望ましい。プローブの標識
には、^３２Ｐ、^３５Ｓなどの放射性同位体またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉ
ｇｅｎｉｎ；ＤＩＧ）、ビオチン等の非放射性物質が用いられるが、安全性から
非放射性物質がより好ましい。胎生１６日ラット心臓、および生後８週齢ラット心臓それぞれのＲＮＡプロー
ブと上記で作製したメンブレンをハイブリダイズさせた後、各コロニーＤＮＡと
ハイブリダイズしたプローブを検出する。ハイブリダイズしたプローブの検出に
は標識物質によりそれぞれ適した方法が用いられる。例えば、放射性同位元素の
場合は直接Ｘ線フィルムあるいはイメージングプレートを感光させるオートラジ
オグラフィーにより、ＤＩＧの場合はＤＩＧシステムユーザーガイド（ロシュ社
製）に従いアルカリフォスファターゼ標識した抗ＤＩＧ抗体を結合させた後、ア
ルカリフォスファターゼにより発光するＣＳＰＤ等の基質を反応させてＸ線フィ
ルムを感光させる方法などが感度よくまた定量的に検出する方法として用いられ
る。例えば、胎生１６日ラットの心臓と生後８週齢ラットの心臓と比較して、どち
らかで多く発現している遺伝子は、プローブ中に存在するその遺伝子のｍＲＮＡ
分子数の割合も高くなる。したがって、メンブレン上に等量のＤＮＡがブロッテ
ィングされていれば、その遺伝子に対応するｃＤＮＡのスポットにはより多くの
プローブが結合することになる。すなわち、同じｃＤＮＡクローンのＤＮＡがブ
ロットされている２枚のメンブレン上のハイブリダイズシグナルの強度を比較す
ることにより、胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とで発現量が異な
る遺伝子のｃＤＮＡを選択することができる。このようにして得られたラットｃＤＮＡとして、配列番号１、３、５、７、９
、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３２、３３
、３５および３７に示す塩基配列を有するラットｃＤＮＡをあげることができる
。（２）ＤＮＡ塩基配列の解析上記の方法で選択された、胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とで
発現量が異なる遺伝子のｃＤＮＡについて、通常用いられる塩基配列解析方法、
例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・Ｄ
ＮＡシークエンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）等の塩基配列分離装置を
用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。上記方法で決定された塩基配列の新規性は、Ｂｌａｓｔ等の相同性検索プログ
ラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データ
ベースを検索することにより確認できる。（３）全長ｃＤＮＡの調製上述の方法で得られたＤＮＡが、ｃＤＮＡの部分ＤＮＡである場合には、例え
ば、ｃＤＮＡクローンの塩基配列に基づいたプライマーでＰＣＲを行う５’−Ｒ
ＡＣＥ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５，８９９８
（１９８８）〕により、元のｃＤＮＡよりも５’末端側のｃＤＮＡ断片を得るこ
とができ、このｃＤＮＡ断片と元のｃＤＮＡを繋ぎあわせることにより、全長の
ｃＤＮＡを取得することができる。このようにして得られる、心筋細胞増殖関連遺伝子の全長ｃＤＮＡとして、例
えば、配列番号２１、２３、２５、２７および３０で表される塩基配列を有する
ＤＮＡ等をあげることができる。また、以上のようにして全長ｃＤＮＡの塩基配列が明らかになった後は、塩基
配列に基づいたプライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃ
ＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的とするＤＮＡを取得する
ことができる。また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で
化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成
機としては、フォスフォアミダイト法を利用したＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製
のＤＮＡ合成機モデル３９２等をあげることができる。（４）ヒトにおける相当遺伝子の取得以上のようにして得られた、ラット胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する
遺伝子に対応する遺伝子は、ヒトにも存在すると考えられる。一般に同じ機能を
有する蛋白質は動物種が異なってもアミノ酸配列に高い相同性があり、該蛋白質
をコードしている遺伝子の塩基配列にも高い相同性がある傾向がある。したがっ
て、ラットのｃＤＮＡをプローブにして、ヒトの心臓のｃＤＮＡライブラリーか
らややストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うことによってヒ
トｃＤＮＡを取得することが可能である。ややストリンジェントな条件は、以下
の方法で決定する。ヒトｃＤＮＡとラットｃＤＮＡの相同性の程度によって異なるが、制限酵素で
切断したヒト染色体ＤＮＡに、ラットｃＤＮＡをプローブとして、度合いが異な
るいくつかのハイブリダイズ条件でサザンブロットを行い、明確なバンドが見え
る条件のうち最もストリンジェントな条件をややストリンジェントな条件として
決定する。具体的には、ホルムアミドを含まないハイブリダイズ液の場合、ハイ
ブリダイズ液の組成は塩濃度を１Ｍに固定し、ハイブリダイズ温度を６８℃〜４
２℃の間で段階的に変えてハイブリダイズを行う。メンブレンの洗浄は、ハイブ
リダイズ時と同じ温度で、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用いて行う。ホル
ムアミドを含むハイブリダイズ液の場合、温度（４２℃）と塩濃度（６×ＳＳＣ
）を固定して、ホルムアミド濃度を５０％〜０％で段階的に変えてハイブリダイ
ズを行う。メンブレンの洗浄は、５０℃で０．５％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣを用
いて行う。また、（１）または（３）で得られたラットｃＤＮＡの塩基配列に対して、（
２）と同様にして塩基配列の新規性と相同性の検索を行い、ラットｃＤＮＡの中
の塩基配列のうち、蛋白質をコードしている領域全体において６０％、好ましく
は８０％以上の相同性を示すヒトのｃＤＮＡの塩基配列を検索する。高い相同性
を示すヒトｃＤＮＡは、（１）または（３）で得られたラット遺伝子に相当する
ヒト遺伝子のｃＤＮＡと推定される。したがって、このヒトｃＤＮＡの５’末端
および３’末端の塩基配列に対応するプライマーを用いて、ヒトの細胞や組織、
好ましくは心臓組織あるいは心臓由来の細胞から抽出したＲＮＡを鋳型にしてＲ
Ｔ−ＰＣＲを行うことにより、このヒトｃＤＮＡを増幅することができる。なお
、ここでデータベース中で見出されるヒトｃＤＮＡが全長のものでなかったりＥ
ＳＴの塩基配列だけの場合もあるが、このような場合も、ラットｃＤＮＡについ
て（３）に記載したのと同様な方法により全長のヒトｃＤＮＡを得ることができ
る。また、このようにして得られたヒトｃＤＮＡは（２）と同様にして塩基配列を
解析し、そのｃＤＮＡがコードするヒト蛋白質のアミノ酸配列を明らかにするこ
とができる。（５）ゲノム遺伝子の取得モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法により、ラットあるいはヒト
の細胞や組織から単離した染色体ＤＮＡを用いて作製したゲノムＤＮＡライブラ
リーに対して、（１）あるいは（４）で得られたラットあるいはヒトｃＤＮＡを
プローブにして、プラークハイブリダイゼーション等の方法でスクリーニングす
ることにより、本発明の遺伝子のラットあるいはヒトのゲノムＤＮＡを得ること
ができる。ゲノムＤＮＡの塩基配列とｃＤＮＡの塩基配列を比較することにより
該遺伝子のエキソン／イントロン構造を明らかにすることができる。また、特に
ｃＤＮＡの５’末端の部分をプローブにすることにより、本発明の遺伝子のプロ
モーターなど転写を制御するゲノム遺伝子領域の塩基配列を明らかにすることが
できる。この配列は本発明の遺伝子の転写の制御機構を解析するのに役立つ。ま
た、相同性組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，３４−３８（１９８
７）、Ｃｅｌｌ，５１，５０３−５１２（１９８７）等〕により、染色体上の本
発明の遺伝子を不活化または任意の配列と置換したクローンを作製することもで
きる。（６）オリゴヌクレオチドの調製本発明のＤＮＡの塩基配列情報を用いて、常法あるいはＤＮＡ合成機により、
本発明のＤＮＡの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス・
オリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして、例え
ば、検出したいｍＲＮＡの一部の塩基配列において、５’末端側の塩基配列に相
当するセンスプライマー、３’末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライ
マー等をあげることができる。ただし、ｍＲＮＡにおいてウラシルに相当する塩
基は、オリゴヌクレオチドプライマーにおいてはチミジンとなる。センスプライ
マーおよびアンチセンスプライマーとしては、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩
基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドで、５〜６０塩基数のものが
好ましい。さらに、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導
体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエス
テル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、
オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’スフォアミデー
ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボー
スとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド
誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換さ
れたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チア
ゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中
のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体
、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏ
ｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌク
レオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボー
スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリ
ボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導
体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。２心筋細胞増殖関連蛋白質の生産完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適
当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡを発現ベクター内のプロモーターの下
流に挿入することにより、該蛋白質の組換発現ベクターを造成する。該組換発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞内に導入する。宿主細胞としては、目的とするＤＮＡを発現できるものは全て用いることがで
き、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブ
レビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロバクテリウ
ム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等に属する細菌、クルイベロミセス（Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、
トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａ
ｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等を用いることが
できる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への
組込みが可能で、心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡを転写できる位置にプロモータ
ーを含有しているものが用いられる。細菌を宿主細胞として用いる場合は、心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡ組換発現
ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム
結合配列、心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組
換発現ベクターであることが好ましい。ベクターにはプロモーターを制御する遺
伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２
（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８
（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０〔特開昭５８−１１０６００〕、ｐＫＹＰ
２００〔ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ
社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳＰ４６８６１９１、ＵＳＰ４９３９０９４、ＵＳＰ
５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥ
Ｇ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕等を例
示することができる。発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜
１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるもので
もよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌ
ａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌や
ファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモー
ター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列
させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモー
ター〔Ｇｅｎｅ，４４，２９（１９８６）〕、ｌａｃＴ７プロモーターのよう
に人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡの蛋白質をコードする部分の塩基配列
を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように置換することにより、目的と
する蛋白質の生産率を向上させることができる。本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも
必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ま
しい。宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等
に属する微生物、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉＤＨ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＣ１０００
、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫＹ３２７６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ１４８５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉＮｏ．４９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＷ３１１０、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＹ４９、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍ
ｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１４０６８、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１３８７０
、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１５
３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる
。組換発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法
であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）
〕、プロトプラスト法〔特開昭６３−２４８３９４〕、またはＧｅｎｅ，１７，
１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ
１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０
（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよ
く、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター
、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、
ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモ
ーター等をあげることができる。宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒ
ｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス
（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ）等をあげることができる
。組換発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば
いずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０〕、スフェロプラスト
法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５，１９２９（１９
７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９
８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（
１９７８）に記載の方法等をあげることができる。動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐ
ｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐｃＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐ
ＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ
ｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐ
ＡＧＥ２１０等を例示することができる。プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる
ことができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄ
ｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、
レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショッ
ク蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒ
トＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サル
の細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、
ＨＢＴ５６３７〔特開昭６３−２９９〕等をあげることができる。組換発現ベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる
方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２
−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６
（１９７３）〕等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開
平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されて
いる方法に準じて行なうことができる。昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクス
プレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジ
ーサプルメント１−３８（１９８７−１９９７）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現するこ
とができる。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入
して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆
虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。遺伝子導入用ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、
ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることが
できる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスである
アウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａ
ｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅ
ｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞
であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶ
ｅｃｔｏｒｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍ
ａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９２）］、Ｔｒｉｃ
ｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製）等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクタ
ーと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法
〔特開平２−２２７０７５〕、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができ
る。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第
２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うこと
ができる。酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が
付加された蛋白質を得ることができる。心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体を培地に培養し、培養物中に心筋細胞増殖関連蛋白質を生成蓄積させ、該
培養物より該蛋白質を採取することにより、心筋細胞増殖関連蛋白質を製造する
ことができる。本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質を製造するための形質転換体を培地に培養す
る方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母等の真核生物を宿主細胞とす
る場合、これら形質転換体を培養する培地は、該宿主細胞が資化し得る炭素源、
窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天
然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの宿主細胞が資化し得るものであればよく、グルコ
ース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデ
ンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、
プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
チープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵
菌体およびその消化物等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅
、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温
度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐ
Ｈは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培
地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質
転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、ｌａｃプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培
養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等
を、ｔｒｐプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養すると
きにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般
に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈ
ｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５
１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０
１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６
（１９５９）〕、１９９培地〔ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉ
ｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１
（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いること
ができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜
７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に
添加してもよい。昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般
に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９０
０ＩＩＳＦＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅ
ｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社
製）、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ〔Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ
．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。形質転換体の培養物から、心筋細胞増殖関連蛋白質を単離精製するには、通常
の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。例えば、蛋白質が、細胞内に溶解状態で産生した場合には、培養終了後、細胞
を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス
、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞
抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通
常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有
機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ））−セファロース、Ｄ
ＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロ
マトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａ
ｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマト
グラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた
疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロ
マトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法
等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、蛋白質の精製標品を得ることができ
る。また、蛋白質が細胞内に不溶体を形成して産生した場合は、細胞を回収後破砕
し、遠心分離することにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。可溶化液を希釈あるいは透析して、可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げる
ことにより、蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製
法により蛋白質の精製標品を得る。蛋白質あるいはその糖修飾体等が細胞外に分泌された場合には、培養上清から
、該蛋白質あるいはその糖修飾体等を回収することができる。即ち、培養物から
遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離
精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号２２、２４、２６
、２８および３１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質等をあげることができ
る。また、本発明の蛋白質を、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル
法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても
製造することができる。また、米国ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ社製、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉ
ｏｔｅｃｈ社製、米国ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ社製、米国Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社製、米国ＰｅｒＳｅｐｔｉ
ｖｅ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。３心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体の調製本発明蛋白質の全長または部分断片精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部
のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを抗原として５０〜１００μｇ／匹程、ウ
サギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスターなどの非ヒトほ乳動物の皮下、静脈内
または腹腔内に、適当なアジュバント［例えば、フロイントの完全アジュバント
（ＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓＡｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニ
ウムゲル、百日咳菌ワクチンなど］とともに投与する。ペプチドを抗原とする場
合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈ
ａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させ
たものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合
成することができる。抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後
、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、血清が免疫に用いた抗原と反応するか否
かを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊１９７６
年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕などで調
べる。免疫に用いた抗原に対し、血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物を、血
清または抗体産生細胞の供給源とする。ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することがで
きる。モノクローナル抗体は、抗体産生細胞と非ヒトほ乳動物由来の骨髄腫細胞とを
融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投
与して該動物を腹水癌化させ、培養液または腹水から分離、精製することにより
調製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞、特に脾臓
の抗体産生細胞が好適に用いられる。骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫
細胞株であるＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔ＣｕｒｒｅｎｔＴｏ
ｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
１８，１（１９７８）〕、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）〔Ｅｕｒｏ
ｐｅａｎＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０
−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３
−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５
４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等、マウス由来の株化細胞が好適に用いられる。ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン
、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地）に懸濁したのち、７〜１４日間
培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反
応し、抗原を含まない蛋白質には反応しないものを選択する。ついで、限界希釈
法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認め
られたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては
、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム
、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム
等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて用いる方法があげ
られる。４心筋細胞増殖関連蛋白質を生産する組換えウイルスベクターの調製以下に、本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質を特定のヒト組織内で生産するため
の組換えウイルスベクターの調製法について述べる。心筋細胞増殖関連遺伝子の完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質
をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡをウイルスベクター内のプロモーター
の下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。ＲＮＡウィルスベクターの場合には、心筋増殖関連遺伝子の完全長ｃＤＮＡに
相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウィルスベクター内のプロモーターの下流
に挿入することにより、組換えウィルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほ
か、ウィルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどち
らか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウィルスベクターの場合は、センス鎖
に相同なＲＮＡを、センスウィルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同
なＲＮＡを選択する。該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導
入する。パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコ
ードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠
損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎
臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることが
できる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクタ
ーの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、レンチウイル
スベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖ
ｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、アデノウイルスベクターの場合はアデ
ノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂが、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５
，ｐ１９，ｐ４０），Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげられる。ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルス
が生産でき、標的細胞で心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡを転写できる位置にプロ
モーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７
（１９９５）］、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
，１８，３５８７−３５９６（１９９０）］、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−
ＣＧ、ＣＬＧ［ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，７２，８１５０−８
１５７（１９９８）］、ｐＡｄｅｘ１［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
，２３，３８１６−３８２１（１９９５）］等が用いられる。プロモーターとし
ては、ヒト組織中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば
、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌ
ｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモータ
ー、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝
子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、
リン酸カルシウム法〔特開平２−２２７０７５号公報〕、リポフェクション法〔
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）
〕等をあげることができる。５心筋細胞増殖関連遺伝子ｍＲＮＡの検出以下に本発明の心筋増殖関連遺伝子のＤＮＡを用いて、心筋細胞増殖関連遺伝
子ｍＲＮＡを検出する方法について述べる。当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号１、３、５、７、９、
１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、
３５および３７で表される塩基配列を有するＤＮＡもしくはそれらから得られる
ＤＮＡ断片等があげられる。心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの発現量や構造変化を検出する方法として
は、例えば（１）ノーザンブロット法（２）ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼイシ
ョン法、（３）定量的ＰＣＲ法、（４）デファレンシャル・ハイブリダイゼイシ
ョン法、（５）ＤＮＡチップ法、（６）ＲＮＡｓｅ保護アッセイ法などの方法等
があげられる。上記方法による分析に供する検体としては、心疾患患者ならびに健常者より取
得した心臓組織、血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞を取得
して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞試料から取得したｍＲＮＡ
あるいは全ＲＮＡが用いられる（以後、該ｍＲＮＡおよび全ＲＮＡを検体由来Ｒ
ＮＡと称する）。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリ
オスタット切片として単離したものを用いることもできる。ノーザンブロット法では、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロン
フィルター等の支持体に転写し、本発明のＤＮＡより調製した標識プローブを用
いて、ハイブリダイゼイションならびに洗浄を行うことで、心筋細胞増殖関連遺
伝子ｍＲＮＡに特異的に結合したバンドを検出することにより、心筋細胞増殖関
連遺伝子ｍＲＮＡの発現量ならびに構造の変化を検出することができる。ハイブ
リダイゼイションを行う際には、プローブと検体由来ＲＮＡ中の心筋細胞増殖関
連遺伝子ｍＲＮＡが安定なハイブリッドを形成する条件でインキュベーションす
る。偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼイションならびに洗浄工程は高スト
リンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩
基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定さ
れる。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載さ
れている。ノーザンブロット法に用いる標識プローブは、例えば、公知の方法（ニック・
トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナージング）により放射
性同位体、ビオチン、蛍光基、化学発光基等を、本発明のＤＮＡあるいは該ＤＮ
Ａの配列から設計したオリゴヌクレオチドに取り込ませることで調製することが
できる。標識プローブの結合量は心筋細胞増殖関連遺伝子ｍＲＮＡの発現量を反
映することから、結合した標識プローブの量を定量することで心筋細胞増殖関連
遺伝子ｍＲＮＡの発現量を定量することができる。また、標識プローブ結合部位
を分析することで、心筋細胞増殖関連遺伝子ｍＲＮＡの構造変化を知ることがで
きる。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼイション法は、上記標識プローブと、生体から
取得した組織をパラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用
いてハイブリダイゼイションおよび洗浄の工程を行うことにより、心筋細胞増殖
関連遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法である。ｉｎｓｉｔｕハイブリ
ダイゼイション法で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼイションならびに
洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度
、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の
因子により決定される。これらの因子は、例えばカレント・プロトコールズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている。定量的ＰＣＲ法、デファレンシャル・ハイブリダイゼイション法またはＤＮＡ
チップ法等の心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの検出法は、検体由来ＲＮＡに
、オリゴｄＴプライマーあるいはランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いて
ｃＤＮＡを合成することに基づいた方法で行うことができる（以後、該ｃＤＮＡ
を検体由来ｃＤＮＡと称する）。検体由来ＲＮＡがｍＲＮＡの場合は、上記いず
れのプライマーも用いることができるが、該検体由来ＲＮＡが全ＲＮＡである場
合は、オリゴｄＴプライマーを用いる。定量的ＰＣＲ法では、検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとし、本発明のＤＮＡ
が有する塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、心
筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片が増幅する方法である。増幅
ＤＮＡ断片の量は心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの発現量を反映することか
ら、アクチンやＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）等をコードするＤＮＡを内部コントロー
ルとして置くことで心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの量を定量することが可
能である。また、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離することで、心筋細
胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの構造の変化を知ることもできる。本検出法では、
標的配列を特異的にかつ効率的に増幅する適当なプライマーを用いることが望ま
しい。適当なプライマーは、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさ
ず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合して、変性条件で標的ｃＤ
ＮＡからはずれる等の条件に基づき設計することができる。増幅ＤＮＡ断片の定
量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ反応の内に行うことが必要であ
る。このようなＰＣＲ反応は、各反応ごとに生産される該増幅ＤＮＡ断片を回収
してゲル電気泳動で定量分析することで知ることができる。デファレンシャル・ハイブリダイゼイション法〔ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ，７，３１４−３１７（１９９１）〕やＤＮＡチップ法〔Ｇｅｎｏｍ
ｅＲｅｓｅａｒｃｈ，６，６３９−６４５（１９９６）〕は、検体由来ｃＤＮ
Ａをプローブとして、本発明のＤＮＡを固定化させたフィルターまたはスライド
ガラスあるいはシリコンなどの基盤に対して、ハイブリダイゼイションならびに
洗浄を行うことにより、心筋細胞増殖関連遺伝子ｍＲＮＡの発現量の変動を検出
する方法である。いずれの方法もフィルターまたは基盤上に、アクチンやＧ３Ｐ
ＤＨなどの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での
心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの発現の違いを正確に検出することができる
。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡを基にそれぞれ異なる標識ｄＮＴＰを用
いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、フィルターまたは基盤に二つの標識ｃＤＮＡプロ
ーブを同時にハイブリダイズさせることにより正確な心筋細胞増殖関連遺伝子の
ｍＲＮＡの発現量の定量を行うことができる。ＲＮＡｓｅ保護アッセイ法は、以下の方法により行う。まず、本発明のＤＮＡ
の３’末端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を
結合し、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎｖｉｔｒｏの転写系により標識した
ｒＮＴＰを用いて、標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセン
スＲＮＡを検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成さ
せた後、ＲＮＡｓｅで消化し、消化から保護されたＲＮＡ断片をゲル電気泳動に
よりバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量することで、心筋細胞増
殖関連遺伝子ｍＲＮＡの発現量を定量することができる。６心疾患原因遺伝子の検出以下に本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを用いて心筋壊死を原因とす
る心疾患の原因遺伝子を検出する方法について述べる。当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号１、３、５、７、９、
１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、
３５および３７で表される塩基配列を有するＤＮＡもしくはそれらから得られる
ＤＮＡ断片等があげられる。心筋細胞増殖関連遺伝子座中に存在する心疾患の原因となる変異の存在の有無
を評価するための最も明確な試験は、対照集団からの遺伝子と心疾患患者からの
遺伝子とを直接比較することである。具体的には心疾患患者ならび健常人から、心臓組織、血清、唾液等のヒト生体
試料あるいは、該生体試料から樹立した初代培養細胞由来の試料を集め、該生体
試料ならびに該初代培養細胞由来試料中からＤＮＡを抽出する（以後、該ＤＮＡ
を検体由来ＤＮＡと称する）。該検体由来ＤＮＡは直接あるいは、本発明のＤＮ
Ａが有する塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて増殖した心筋細胞増殖
関連遺伝子ＤＮＡを試料ＤＮＡとして用いることができる。別法として、該検体
由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、本発明のＤＮＡが有する塩基配列に基づき
設計したプライマーによりＰＣＲを行うことで増殖した心筋細胞増殖関連遺伝子
のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を試料ＤＮＡとして用いることができる。心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡに心疾患の原因となる変異があるかどうかを
検出する方法として、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有
するＤＮＡ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法
を用いることができる。ヘテロ二本鎖を検出する方法には、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よるヘテロ二本鎖検出法〔ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．，７，５（１９９１）〕
、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，３２
５−３３２（１９９３）〕、（３）ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ，ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｃｌｅａｖａｇｅｏｆｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）［Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６），ＴｏｍＳｔｒａｃｈａｎａｎｄＡｎｄｒ
ｅｗＰ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
Ｌｉｍｉｔｅｄ］、（４）ミスマッチの酵素的切断法〔ＮａｔｕｒｅＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ，９，１０３−１０４（１９９６）〕、（５）変性ゲル電気泳動法〔
Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２８８，１０３−１１２（１９９３）〕等の方法があげ
られる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法は、検体由来ＤＮ
Ａあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮ
Ａを配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３
、２５、２７、３０、３２、３３、３５および３７に記載の塩基配列に基づき設
計したプライマーにより、２００ｂｐよりも小さい断片として増幅する。該ＤＮ
Ａ断片を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。心筋細胞増殖関連遺伝子の
ＤＮＡの変異によりヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本
鎖よりもゲルの移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができ
る。特製のゲル（Ｈｙｄｒｏ−ｌｉｎｋ，ＭＤＥなど）を用いた方が分離度はよ
い。２００ｂｐよりも小さいＤＮＡ断片の検索ならば、挿入、欠失、ほとんどの
１塩基置換を検出可能である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォ
メーション多型解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ解析；ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａ
ｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉ
ｓ）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、本発明のＤ
ＮＡが有する塩基配列に基づき設計したプライマーにより、２００ｂｐよりも小
さい断片として増幅した心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを変性後、未変性ポリ
アクリルアミドゲル中で泳動する。ＤＮＡ増幅を行う際にプライマーを放射性同
位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色すること
により、増幅した心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡをバンドとして検出すること
ができる。野生型の泳動パターンとの相違を明らかにするために、コントロール
の検体も同時に電気泳動すると、塩基配列に変異を持った断片を移動度の違いか
ら検出することができる。ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法）は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来
ｃＤＮＡをテンプレートに、心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを配列番号１、３
、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３０
、３２、３３、３５および３７に記載の塩基配列に基づき設計したプライマーで
ＤＮＡ断片を増幅する。本発明のＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をとり
込ませた標識ＤＮＡと増幅ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、四酸化オスミウ
ムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ塩基
配列の変異を検出することができる。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つで
あり、キロベースの長さの検体にも適応できる。上記、四酸化オスミウムの代わりにＴ４ファージリゾルベースとエンドヌクレ
アーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮＡｓｅＡ
と組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。変性ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由
来ｃＤＮＡをテンプレートとして、心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを配列番号
１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７
、３０、３２、３３、３５および３７に記載の塩基配列に基づき設計したプライ
マーで増幅したＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを
用いて電気泳動する。増幅したＤＮＡ断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで
移動し、変性後は移動しなくなる。心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡに変異があ
る場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル内での移動度が異なることから、変
異の存在を検出することが可能である。検出感度を上げるにはそれぞれのプライ
マーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けるとよい。心疾患の原因遺伝子を検出する別の方法として、蛋白質短縮試験（ｐｒｏｔｅ
ｉｎｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｔｅｓｔ：ＰＴＴ法）〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０，１−４（１９９４）〕がある。該試験により蛋白質の欠損を生み出すフレーム
シフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出
することができる。ＰＴＴ法は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１
５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３０、３３および３５に記載の塩基
配列を有するＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列
をつないだ特殊なプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来ＲＮＡよ
り逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法でｃＤＮＡを作製する。該ｃＤＮＡを用い、
ｉｎｖｉｔｒｏ転写、翻訳を行うと蛋白質が生産される。該蛋白質をゲルに泳
動して、該蛋白質の泳動位置が完全長蛋白質に相当する位置にあれば欠損を生み
出す変異は存在せず、該蛋白質に欠損がある場合は、完全長蛋白質より短い位置
に該蛋白質は泳動され、該位置より欠損の程度を知ることができる。検体由来ＤＮＡおよび検体由来ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために本発明の
ＤＮＡが有する塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いることが可能であ
る。決定された塩基配列を解析することにより、検体由来ＤＮＡまたは検体由来
ｃＤＮＡに心疾患の原因となる変異があるか否かを判別することができる。心筋細胞増殖関連遺伝子のコード領域以外の変異は、該遺伝子の付近またはそ
の中のイントロンおよび調節配列などの、非コード領域を検査することによって
検出し得る。非コード領域中の変異に起因する心疾患は、上記に記載した方法と
同様の方法により検出することができる。このようにして非コード領域における変異の存在が示唆された該遺伝子につい
ては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２
３、２５、２７、３０、３２、３３、３５および３７に記載の塩基配列を有する
ＤＮＡをハイブリダイゼイションのプローブとして用いることにより、クローン
化することができる。非コード領域における変異は上述のいずれかの方法に準じ
て探索することができる。見出された変異は、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ
Ｌｉｎｋａｇｅ．ＴｈｅＪｏｈｎＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）に記載された方法に従い統計処
理を行うことで、心疾患との連鎖があるＳＮＰｓ（シングル・ヌクレオチド・ポ
リモルフィズム）として同定することができる。また、心疾患の病歴を持つ家族
から、先に示した方法に従いＤＮＡを取得し、変異を検出することで、心疾患の
原因遺伝子を同定することができる。７心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを用いて心疾患の発生の可能性および予後
を診断する方法当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号１、３、５、７、９、
１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、
３５および３７で表される塩基配列を有するＤＮＡもしくはそれらから得られる
ＤＮＡ断片等があげられる。心疾患の原因は、ヒトのいずれかの組織における遺伝子の変異を検出すること
によって確認することができる。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変
異を遺伝した個人は、心疾患を発症し易い傾向である可能性がある。当該変異は
、該個人の体のいずれかの組織からのＤＮＡを試験することによって検出し得る
。例えば、ヒトから採血した血液の細胞からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて
、遺伝子の変異を検出することにより、心疾患を診断することができる。また、
胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を採取してＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用い
て、遺伝子の変異を検出することにより、出生前の心疾患診断を行うことができ
る。また心疾患を発症した患者の、病巣部位の生体組織からＤＮＡを取得し、遺伝
子の変化を検出することにより、心疾患の種類を診断し、投与する薬物の選択な
どに利用することができる。生体組織からのＤＮＡは、周囲の正常組織から遊離
した病巣部位の組織を単離してトリプシンなどで処理し、得られた細胞を適当な
培地で培養し、培養した細胞から染色体ＤＮＡならびにｍＲＮＡを抽出すること
により取得することができる。以後、診断を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＤＮＡを
診断検体由来ＤＮＡと称する。また、診断を目的としてヒト検体から上記いずれ
かの方法で取得したＲＮＡより合成したｃＤＮＡを診断検体由来ｃＤＮＡと称す
る。心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡおよび診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体
由来ｃＤＮＡを用い、上記心疾患の原因遺伝子を検出する方法に準じた方法によ
り、心疾患の診断を行うことができる。また、心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡおよび診断検体由来ＤＮＡあるいは診
断検体由来ｃＤＮＡを利用した心疾患の診断方法としては、（１）制限酵素部位
の検出、（２）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法
（ＡＳＯ：ａｌｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、（３）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチ
ドを用いたＰＣＲ（ＡＲＭＳ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｆｒａｃｔｏ
ｒｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）、（４）オリゴヌクレオチドライゲー
ションアッセイ（ＯＬＡ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉｇａｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ）、（５）ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（ＰＣＲ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａ
ｌｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎａｓｓａｙ）、（６）オリゴ
ＤＮＡアレイを用いる方法〔蛋白質核酸酵素、４３，２００４−２０１１（１９
９８）〕等の方法があげられる。制限酵素部位の検出は、以下の方法に従う。すなわち、単一塩基の変化により
制限酵素部位が消失または発生する場合は、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検
体由来ｃＤＮＡを、本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡが有する塩基配列
に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲで増幅したのち、制限酵素で消化し
、得られた制限酵素切断ＤＮＡ断片を正常人の場合と比較することで簡便に変異
を検出することができる。しかし単一塩基変化が起こることはまれであり、診断
目的には、本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡが有する配列情報ならびに
別途同定された変異の情報を組合せることでオリゴヌクレオチドプローブを設計
し、該オリゴヌクレオチドプローブをフィルターに結合させてハイブリダイズを
行うリバースドットブロット法で変異を検出する。対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）を利用する方法は
、短い合成ＤＮＡプローブが、完全に対合する塩基配列とのみハイブリダイズす
る特徴を利用した方法で、１塩基の変異を容易に検出することができる。具体的
には、本発明のＤＮＡが有する塩基配列と同定された塩基の変異に基づき設計し
たオリゴヌクレオチドをフィルターに結合させ、診断検体由来ＤＮＡあるいは診
断検体由来ｃＤＮＡから本発明のＤＮＡが有する配列を用いて設計したプライマ
ーと標識したｄＮＴＰを用いたＰＣＲで作成したプローブを用いてハイブリダイ
ズを行うリバースドットブロットが用いられることが多い。リバースドットブロットとは、スライドガラスまたはシリコンなどの基盤に直
接、本発明のＤＮＡが有する塩基配列と該変異に基づき設計したオリゴヌクレオ
チドを合成して、高密度のアレイであるＤＮＡチップを用いて、少量の診断検体
由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを反応させて多様な変異をより簡便に
検出する方法である。本方法は、大規模な診断目的に適した変異検出法である。塩基の変異は、以下のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
法によっても検出できる。ＯＬＡ法を、以下に具体的に述べる。変異部位を挟んで５’末端側および３’末端側でそれぞれハイブリダイズする
本発明のＤＮＡが有する塩基配列をもとに設計した２０塩基配列程度のオリゴヌ
クレオチドを作成する。診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテ
ンプレートとして用いて、本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡが有する塩
基配列から設計したプライマーを用い、ＰＣＲにより心筋細胞増殖関連遺伝子の
ＤＮＡ断片を増幅する。該ＤＮＡ増幅断片と上記２本のオリゴヌクレオチドとを
ハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、ＤＮＡリガーゼで２本のオリゴヌク
レオチドを連結させる。例えば、２本のうちの一方のオリゴヌクレオチドにはビ
オチンを、他方のオリゴヌクレオチドにはジゴケシゲニンなどの異なる標識体を
付加し、連結反応が起こったかどうかを速やかに検出することが可能である。Ｏ
ＬＡは電気泳動や遠心分離操作が不要なために、多数のサンプルを効果的に短期
間で診断するのに適した変異検出法である。また、以下のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法により微量な変異遺伝子を定量的かつ容易に
検出することができる。ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）、非常に高い特異性を示す液
相でのハイブリダイゼイション、およびＥＬＩＳＡと同様の操作でＰＣＲ産物を
検出するＥＤ−ＰＣＲ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰＣ
Ｒｐｒｏｄｕｃｔ）の３つを組み合わせた方法である。ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＤＮＰ）標識およびビオチン標識したプライマ
ーセットを用いて、本発明のＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ増幅を行い、両末端
標識増幅物を調製する。これに対して、未標識で標識プライマーと同じ塩基配列
を有するプライマーセットを用いて、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来
ｃＤＮＡをテンプレートに増幅して得た非標識増幅物を２０〜１００倍の大過剰
量混合する。そして混合物を熱変性処理後、１℃／５分〜１０分間程度の緩やか
な温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を優先的に形成させる。こうして再形成され
た標識ＤＮＡはビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウエルに捕獲吸着し
、ＤＮＰを介して酵素標識抗ＤＮＰ抗体を結合させて酵素による発色反応により
検出する。検体中に標識ＤＮＡと同じ配列の遺伝子が存在しない場合は、元の２
本鎖の標識ＤＮＡが優先的に再形成されて発色を示す。これに対し、同じ塩基配
列の遺伝子が存在する場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成され
る標識ＤＮＡは減少するので、発色は著しく低下する。これにより、既知の変異
・多型遺伝子の検出・定量が可能となる。８心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて心筋細胞増殖関連
蛋白質を免疫学的に検出または定量する方法本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体（ポリクローナル抗
体、あるいはモノクローナル抗体）を用いて、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内
あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織を、免
疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬ
ＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞
染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッ
ティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法
〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）
、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕など
があげられる。蛍光抗体法とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した
微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さ
らにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルし
た抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイ
トメーターで測定する方法である。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内ある
いは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明
の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施
した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度
計で測定する方法である。放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内
あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本
発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは
その断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法であ
る。免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免疫組織化学染色法とは、心筋細胞増
殖関連蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫
細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、
ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるい
はその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。ウェスタンブロッティング法とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内あるいは
細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニト
ロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらにＦ
ＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗
マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、確認する方法である。ドットブロッティング法とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内あるいは細胞
外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をニトロセ
ルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴ
Ｃなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウ
スＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。免疫沈降法とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した
微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を本発明の抗体と反応さ
せた後、プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有
する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する
抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体をプ
レートに吸着させ、もう一方の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダー
ゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、本発明の蛋白質
を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組
織の抽出液を反応させた後、標識した抗体を反応させ、結合した標識物質により
検出を行う方法である。９心筋増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体を用いる心疾患の診断ヒト生体試料ならびヒト初代培養細胞での、心筋細胞増殖関連蛋白質の発現量
の変化ならびに発現している蛋白質の構造変化を同定することは、将来心疾患を
発症する危険性や既に発症した心疾患の原因を知る上で有用である。心筋細胞増殖関連蛋白質の発現量や構造変化を検出して診断する方法としては
、上記した、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免
疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色
法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティ
ング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などがあげられる。上記方法による診断に供する検体としては、患者より取得した心臓病巣部位の
組織、血液、血清、尿、便、唾液などの生体試料そのものあるいは、該生体試料
から取得した細胞ならびに細胞抽出液が用いられる。また、生体試料から取得し
た組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いる
こともできる。１０心筋細胞増殖関連蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡまたは該蛋白質を
認識する抗体を用いる心疾患治療薬のスクリーニング当該スクリーニング方法において用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号
１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７
、３０、３２、３３、３５および３７で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげ
られ、蛋白質としては、例えば配列番号２２、２４、２６、２８および３１で表
されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは、配列
番号２２、２４、２６および２８で表されるアミノ酸とは１もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ心筋壊死を原因と
する心疾患の修復に関与する活性を有する蛋白質があげられ、抗体としては、該
蛋白質を認識する抗体があげられる。本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを導入して本発明の心筋細胞増殖関
連蛋白質あるいは心筋細胞増殖関連蛋白質の一部を構成するポリペプチドを生産
するように形質転換した微生物、動物細胞、または昆虫細胞ならびに、精製した
心筋細胞増殖関連蛋白質あるいは心筋細胞増殖関連ポリペプチドは、心筋細胞増
殖関連蛋白質に特異的に作用する薬剤をスクリーニングするために有用である。スクリーニングにより得られた薬剤は、心疾患の治療に有用である。上記スクリーニングの１つの方法は、本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質あるい
は心筋細胞増殖関連蛋白質の一部を構成するポリペプチドを生産するように形質
転換した微生物、動物細胞、または昆虫細胞（以後、探索用形質転換体と称する
）に特異的に結合する標的化合物を選択することである。形質転換していない微
生物、動物細胞、または昆虫細胞との結合状態を対照として比較することで、特
異的な標的化合物を検出することができる。また、探索用形質転換体に特異的に
結合する化合物あるいは蛋白質の探索用形質転換体に対する結合を阻害すること
を指標に、標的化合物を競合スクリーニングすることができる。精製した本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質または心筋細胞増殖関連蛋白質の一
部を構成するポリペプチドは、心筋細胞増殖関連蛋白質に特異的に結合する標的
化合物を選択するのに用いることができる。標的化合物を定量するには、本発明
の心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて上記の免疫学的方法
により行うことができる。また、心筋細胞増殖関連蛋白質あるいは心筋細胞増殖
関連ポリペプチドに結合する標的化合物の該蛋白質あるいは心筋細胞増殖関連ポ
リペプチドに対する結合を阻害することを指標に、標的化合物を競合スクリーニ
ングすることができる。上記スクリーニングのもう１つの方法としては、心筋細胞増殖関連蛋白質の一
部を構成するペプチドを多数、プラスチックピンまたはある種の固体支持体上で
高密度に合成し、該ペプチドに選択的に結合する化合物あるいは蛋白質を効率的
にスクリーニングする方法がある（ＷＯ８４／０３５６４）。心臓由来の細胞株で、心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡあるいは心筋細胞増
殖関連蛋白質の発現を促進あるいは抑制する発現調節用薬剤も、心疾患の治療に
有効である。心臓由来の細胞株に種々の被検化合物を添加し、本発明の心筋細胞増殖関連遺
伝子のＤＮＡを用いて、心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの発現の増減を測定
することで心筋細胞増殖関連遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促進する物
質をスクリーニングすることができる。心筋細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡの発
現の増減は、上記したＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ
法により検出できる。心臓由来の細胞株に種々の被検化合物を添加し、本発明の心筋細胞増殖関連蛋
白質を特異的に認識する抗体を用いて、心筋細胞増殖関連蛋白質の発現の増減を
測定することで心筋細胞増殖関連遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促進す
る物質をスクリーニングすることができる。心筋細胞増殖関連蛋白質の発現の増
減は、上記した蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識
免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染
色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッテ
ィング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出できる。上述の方法により取得した化合物は、心筋梗塞モデルラットなどの心疾患モデ
ル動物に薬剤として投与し、該動物の心臓活動電位ならびに心拍数の測定等を行
うことにより、該化合物のその心疾患への治療効果を評価することが可能である
。１１心筋増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて心臓に特異的に薬物
を輸送する方法（ドラッグデリバリー方法）当該ドラッグデリバリー方法に用いられる抗体は、本発明の心筋細胞増殖関連
蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれでも良いが、特にヒト化抗体を用
いることが望ましい。ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＲｅｇｉｏｎ；相補性決定領域；以下、Ｃ
ＤＲと記す）移植抗体などがあげられる。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖
として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変
領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常
領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常
領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物として
は、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。本発明のヒト型キメラ抗体は、心筋細胞増殖関連蛋白質に結合し、本発明の蛋
白質の作用を中和するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨ
およびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬを
コードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キ
メラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ製造す
ることができる。ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表
記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であ
り、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇ
Ｇ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗
体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいは
λクラスのものを用いることができる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲの
アミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味す
る。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質に反応し
、本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質に結合し、本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質
の作用を中和する、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列で任意
のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードす
るｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子
を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現
ベクターを構築し、宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することがで
きる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよ
いが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇ
Ｇ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用い
ることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すれ
ばいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができ
る。ヒト抗体は、元来、ヒトの体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺
伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体フ
ァージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗
体等も含まれる。ヒトの体内に存在する抗体は、例えば、以下の方法により取得することができ
る。ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化させた後、ク
ローニングする。得られた目的とする抗体を産生するリンパ球を培養し、培養物
中より該抗体を取得することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファ
ージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ
表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した
基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現
しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手
法により、完全型ヒト抗体へ変換することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれ
た動物を意味する。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該
ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生ト
ランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニッ
ク動物からのヒト抗体の作製方法としては、通常のヒト以外の哺乳動物で行われ
ているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養す
ることで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させる方法があげられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体、ジスル
フィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる
。Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（
Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖
全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断
片である。本発明のＦａｂは、本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素
パパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮ
Ａを宿主細胞発現ベクターに挿入後、該ベクターを宿主細胞へ導入し、該ＤＮＡ
を発現させることによりＦａｂを取得することができる。Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片
のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域
のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の
抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦ（ａｂ’）_２は、本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質
分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、該抗体のＦ（ａｂ’）_２
をコードするＤＮＡを宿主細胞用発現ベクターに挿入後、該ベクターを宿主細胞
へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、Ｆ（ａｂ’）_２を取得することが
できる。Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した
分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体を還元剤ジチオ
スレイトール処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコード
するＤＮＡを宿主細胞用発現ベクターに挿入後、該ベクターを宿主細胞へ導入し
、該ＤＮＡを発現させることにより、Ｆａｂ’を取得することができる。一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖとも称す）は、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当
なペプチドリンカー（以下、Ｐと称す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬない
しはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれ
るＶＨおよびＶＬは、本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化
抗体またはヒト抗体から由来したものを用いることができる。本発明の一本鎖抗体は、以下の方法により取得できる。本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮ
Ａを取得後、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを宿主細胞用
ベクターに挿入後、該発現ベクターを宿主細胞へ導入し、該ＤＮＡを発現させる
ことにより、一本鎖抗体を取得することができる。ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも称す）は、ＶＨおよびＶ
Ｌ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該シ
ステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン
残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立
体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明の蛋白質に特
異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用
いることができる。本発明のジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）は、以下の方法により取
得することができる。本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮ
Ａを取得後、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを宿主細胞用発
現ベクターに挿入後、該発現ベクターを宿主細胞へ導入し、該ＤＮＡを発現させ
ることにより、ｄｓＦｖを取得することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、ｔＢｏｃ法等の化学合成法によって製
造することができる。本発明の抗体により調製された以下に述べる融合抗体は、心臓の病巣へ特異的
に薬剤や蛋白質を運ぶ、ドラッグデリバリーに用いることができる。融合抗体は、本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、
ヒト抗体およびそれらの抗体断片に放射性同位元素、蛋白質、低分子化合物等の
薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体をいう。本発明の融合抗体は、本発明の蛋白質に特異的に反応する抗体および抗体断片
のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体および抗体断片中の適当な置
換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、蛋
白質、低分子化合物等の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させるこ
とにより製造することができる。放射性同位元素としては、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ等があげられ、例えば、クロラ
ミンＴ法等により、抗体または抗体断片に結合させることができる。低分子化合物としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミ
ドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮
抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、
ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン
のような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤
等の抗癌剤［臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編１９９６年癌と化学療法社
）］、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリ
ン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなど
の免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マ
レイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症
剤［炎症と抗炎症療法昭和５７年医歯薬出版株式会社］などがあげられる。常法により上記抗体に低分子の薬剤を結合させることができるが、例えば、ダ
ウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介して
ダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを
介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等が
あげられる。蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカインや血管内皮、血管平
滑筋等の増殖制御因子が好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆
粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因
子、ヒトインターロイキン１２、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２），血小
板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等があげられる。蛋白質との融合抗体は、以下の方法により取得できる。抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連
結させて、融合抗体をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物あるい
は真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生
物などの宿主細胞へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、融合抗体を取得
することができる。１２心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを含有する遺伝子治療剤本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを含有するウイルスベクターを用い
た遺伝子治療剤は４項で作製した組換えウイルスベクターと遺伝子治療剤に用い
る基剤を調合することにより製造することができる［ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ
．，８，４２（１９９４）］。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのよ
うなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混
合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の糖
溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコ
ース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧
調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオ
ン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注
射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用
時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の遺伝子治療剤は、液体の場
合はそのままで、個体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に遺伝子治
療の直前に溶解して治療に使用することができる。本発明の遺伝子治療剤の投与
方法としては、患者の冠動脈より心臓に吸収されるように、局所的に投与する方
法をあげることができる。ウイルスベクターを用いる遺伝子移入は、リポソームデリバリーを用いる直接
的イン・ビボ（ｉｎｖｉｖｏ）遺伝子移入と組み合わせることにより、心臓病
巣にウイルスベクターを指向させることができる。適当なサイズの本発明の心筋細胞増殖関連遺伝子のＤＮＡを、アデノウイルス
・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコ
ンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結
合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベ
クターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細
胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。心筋細胞増殖関連遺伝子ＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に
輸送することができる。当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法［Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）］、マイクロインジェクション法［Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０
）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８
４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ
，２９４，９２−９４（１９８１）］、リポソームを介した膜融合−介在移入法
［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７
（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８
９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９
）；Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３，２６７−２７５，（１９９２）；Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）］あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよ
び受容体−媒介ＤＮＡ移入法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（
１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１
９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−
３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６
９８７（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１
９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−
３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅＴｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）］等をあげることができる。リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組
織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現
が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている［Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅＴｈｅｒ．，３，３９９−４１０（１９９２）］。したがって同様の効果が
心臓病巣でも期待される。ＤＮＡを心臓病巣に直接標的化するには、直接ＤＮＡ
取り込み技術が好ましい。受容体−媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介
して、蛋白質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラ
スミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標
的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択
する。受容体とリガンドの組み合わせとしては、例えばエンドセリン（ＥＴ）−
１受容体とＥＴ−１の組み合わせが包含される。当該リガンド−ＤＮＡコンジュ
ゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮ
Ａ−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細
胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機
能を崩壊させることもできる。１３心筋細胞増殖関連蛋白質を含有する心疾患治療薬本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質は心筋壊死を原因とする種々の心疾患におい
て、心臓の構造ならびに機能を再構築するのに用いることができる。本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質を含有する心疾患治療薬は、有効成分として
該蛋白質のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあ
るいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる
任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投
与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与
をあげることができ、蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることが
できる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、
座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤
、顆粒剤等があげられる。例えば、乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は
、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピ
レングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミ
ント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、
散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプ
ン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の
滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の
結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤とし
て用いて製造できる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注
射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて
調製される。または、本発明の蛋白質を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナ
トリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカ
オ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は本発明の蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘
膜を刺激せず、かつ本発明の蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさ
せる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。本発明の蛋白質およ
び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である
。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加
することもできる。投与量または投与回数は、対象疾病の種類、投与方法、治療期間、年齢、体重
等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。１４心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体を含有する心疾患治療薬本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体は、心疾患などの治
療に直接利用することができる。本発明の心筋細胞増殖関連蛋白質を特異的に認識する抗体を含有する治療薬は
、有効成分として該抗体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許
容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野におい
てよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい
。該治療薬の調製、投与は前記１３の心筋細胞増殖関連蛋白質を含有する治療薬
に準じて行うことができる。以下に実施例をあげて、本発明を具体的に示す。発明を実施するための最良の形態実施例１胎生１６日ラット心臓ｃＤＮＡライブラリーの作製Ｗｉｓｔａｒ系妊娠１６日ラット（日本ＳＬＣ社）から胎児心臓を摘出し、チ
オシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）〕により、全ＲＮＡを調製した
。この全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に通過させることにより、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍ
ＲＮＡを取得した後、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ＺＡＰ−_ＣＤＮＡＳｙｎ
ｔｈｅｓｉｓＫｉｔ、ストラタジーン社）を用いて、独立プラーク総数１．０
×１０^６のｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法
の詳細は、キットのマニュアルに従った。このｃＤＮＡライブラリーは、λファ
ージベクターλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）をベクターとして、ベクター
のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩサイト間にｃＤＮＡの５’末端がＥｃｏＲＩサイト側に
なるように挿入されている。実施例２差分化ライブラリーの作製（１）一本鎖ＤＮＡの調製実施例１で調製した胎生１６日ラット心臓ｃＤＮＡライブラリー（λファージ
の状態）を、ヘルパーファージＥｘＡｓｓｉｓｔ（ストラタジーン社製）ととも
に宿主細胞、ＥｓｃｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’（
ストラタジーン社製）に感染させ、イン・ビボ・エクシジョン（ｉｎｖｉｖｏｅｘｃｉｓｉｏｎ）を行うことにより、ベクターからｃＤＮＡを含むファージ
ミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）部分を一本鎖ＤＮＡファージとして
切り出し、培養上清中に放出させた。イン・ビボ・エクシジョンの方法は、スト
ラタジーン社のマニュアルに従った。この培養上清（タイター：１．８×１０^５
ｃｆｕ／μｌ）７００μｌを、ＥｘＡｓｓｉｓｔが感染しない宿主細胞であるＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＳＯＲＬ（ストラタジーン社）１．８×１０
^１０個を含む１０ｍＭＭｇＳＯ_４７ｍｌに添加し３７℃で１５分間保温した後
、全量を２×ＹＴ培地（１．６％バクトトリプトン、１％イーストエキス）２０
０ｍｌに添加して３７℃で４５分間振とう培養し、ｃＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡ
ファージを感染させた。これに、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ濃度になるよう
添加し、さらに３７℃で１時間振とう培養し、ファージ感染大腸菌のみを増殖さ
せた。６００ｎｍの吸光度で細胞数を測定したところ８．０×１０^１０だったの
で、ヘルパーファージＲ４０８（ストラタジーン社）を感染多重度（ｍｏｉ）＝
１０（７．７×１０^１１ｐｆｕ）で添加して３７℃で７時間振とう培養し、再度
一本鎖ＤＮＡを上清に放出させた。培養液を滅菌チューブに移し、４℃で１００
００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、ファージを含む上清のみを新しい滅菌チュー
ブに移して回収した。この上清を同条件で再度遠心分離した後、孔径０．２２ｍ
ｍの滅菌フィルター（ミリポア社製）に通し、菌体を完全に除いた。１０×緩衝
液［１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＭｇＣｌ_２］
２０ｍｌ、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ニッポンジーン社）１４０単位を添加
し、３７℃で３０分間反応させた。これに１／４容の２０％ポリエチレングリコ
ール（分子量６０００）−２．５ＭＮａＣｌを加えてよく混合して室温に２０
分間静置した後、４℃で１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、ファージを沈
殿させた。上清を完全に除き、得られたファージの沈殿を、４００μｌのＴＥ［
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
］に溶解し、１０％ＳＤＳを４μｌ、プロテイナーゼＫ６２５μｇ（２５μｌ
）を添加して、４２℃で１時間反応させた。フェノール抽出、フェノール−クロ
ロホルム抽出、クロロホルム抽出の後、水層をエタノール沈殿し、胎生１６日ラ
ット心臓ｃＤＮＡライブラリーの一本鎖ＤＮＡ（ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ（−））７５．０μｇを得た。（２）ＲＮＡのビオチン化実施例１と同様の方法により、生後８週齢ラット心臓からポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
を調製した。このＲＮＡ１０μｇと蒸留水を試験管に加えて２０μｌとし、こ
れに１μｇ／μｌのＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥｂｉｏｔｉｎ（ＶｅｃｔｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３０μｌを暗所で加えた。試験管の蓋を開けて氷上
に置き、約１０ｃｍの高さから水銀ランプを２０分間照射してビオチン化した。反応液に５０μｌの１００ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．５）と１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液を加えた。これに１００μｌの水飽和ブタノール
を加え、激しく攪拌した。４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上層
のブタノール層を除いた。この操作をあと２回繰り返した。水層に１００μｌの
クロロホルムを加えて激しく攪拌し、４℃で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分
離後、水層を新しい試験管に移した。この操作を再度繰り返した後、エタノール
沈殿を行った。回収されたＲＮＡの沈殿を２０μｌの蒸留水に溶解させ、ビオチ
ン化の操作を繰り返した。ビオチン化したＲＮＡは、ハイブリダイゼーションま
でエタノール沈殿の状態で−８０℃に保存した。（３）差分化（１）で調製した胎生１６日ラット心臓ｃＤＮＡライブラリーの一本鎖ＤＮＡ
０．５μｇ（１μｌ）に、２×反応用緩衝液［８０％ホルムアミド、１００ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２％ＳＤ
Ｓ］１２．５μｌ、２．５ＭＮａＣｌ２．５μｌおよびポリ（Ａ）（アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテク社製）０．５μｇ（１μｌ）を添加し、さらに
（２）で調製したビオチン化ＲＮＡ（ＲＮＡ１０μｇ分）を５μｌの蒸留水に溶
解して添加した。混合液を６５℃で１０分間加熱した後、２晩、４２℃保温して
、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション反応後の液に緩衝液［５００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］４００μｌ
を加え、これにストレプトアビジン（ライフ・テクノロジーズ社製）１０μｇ（
５μｌ）を添加し、室温で５分間反応させた。フェノール−クロロホルム抽出を
行い、ストレプトアビジン−ビオチン化ＲＮＡ−ハイブリダイズしたｃＤＮＡか
らなる複合体を水層から除去した。水層に再度ストレプトアビジン１０μｇを添
加し室温で５分間反応させ、フェノール−クロロホルム抽出を２回行った後、ク
ロロホルム抽出を行い水層を回収した。水層をユニットフィルターウルトラフリ
ーＣ３プラスＴＫ（ミリポア社製）に通してフィルターにｃＤＮＡを吸着・洗浄
後、１／１０ＴＥ［１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）］３０μｌに回収することによりｃＤＮＡの濃縮と脱塩を
行った。このフィルターを用いた操作はミリポア社のマニュアルに従った。（４）２本鎖ＤＮＡの合成、大腸菌への導入上記のように差分化を行って得られた１本鎖ＤＮＡ３０μｌのうち１５μｌに
、蒸留水１４μｌ、２μｇ／μｌの配列番号４２記載の塩基配列を有するプライ
マー伸長用プライマー１μｌを加え、６５℃で１０分間加熱した。室温に５分間
置いてプライマーを１本鎖ＤＮＡにアニーリングさせた後、１０×反応緩衝液（
ＢｃａＢＥＳＴＤｉｄｅｏｘｙＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔに添付のもの
、宝酒造社製）５μｌ、１ｍＭｄＮＴＰ混合液１０μｌ、３μｇ／μｌの１本
鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＳＢ社製）０．５μｌ、２単位／μｌのＢｃａＢＥ
ＳＴＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）２μｌ、蒸留水２．５μｌ
を加えた。６５℃で１時間反応させ、２本鎖ＤＮＡを合成した。該反応液に６０
μｌの蒸留水を加え、フェノール・クロロホルム処理、クロロホルム処理を行っ
た。（３）と同様にユニットフィルターウルトラフリーＣ３プラスＴＫを用いて
溶液を濃縮し、最終的に２０μｌのＴＥで２本鎖ＤＮＡを溶解した。このうち１
／５量を用い、大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’にエレクトロポレーション法
により該２本鎖ＤＮＡを導入し、ｃＤＮＡライブラリー（差分化ｃＤＮＡライブ
ラリー）を作製した。実施例３ディファレンシャルハイブリダイゼーション（１）アレイフィルターの作製実施例２の（４）で作製した差分化ｃＤＮＡライブラリーを用いて、ＬＢ−Ａ
ｐ寒天培地上にコロニーを形成させ、その内の９６００コロニーをＬＢ−Ａｐ培
地１００μｌを入れた９６穴プレート１０３枚に１コロニー／１穴になるよう植
菌した。各コロニーは９６穴プレート中で３７℃で培養後、５０％グリセロール
７５μｌを添加して−８０℃にて保存した（この保存培養液をグリセロールスト
ックとよぶ）。ＬＢ−Ａｐ培地１００μｌを分注した９６穴プレートに、再度グリセロールス
トックから９６ピンレプリケーターを使用して植菌し、３７℃で一晩静置培養し
た。予め、９６穴ＰＣＲプレートに、以下のような反応液を自動分注装置Ｈｙｄ
ｒａ９６を用いて２０μｌ分注しておき、そこへ大腸菌を含んだ一晩培養液を痕
跡量付けた。ＰＣＲ反応溶液は、１０×反応用緩衝液（ＥｘＴａｑに添付）２μ
ｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ２μｌ、１０μＭＴ３ＨＴプライマー（配列
番号３９）１μｌ、１０μＭＴ７プライマー（配列番号４０）１μｌ、蒸留
水１３．８μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）０．２
μｌで行った。また反応条件は、ＰＣＲ用装置を用いて、９４℃で５分間加熱後
、９４℃１分間（変性）／６４℃１分間（アニール）／７２℃１分間（伸長反応
）からなる反応サイクルを３０回行い、４℃で保存した。なお、Ｔ３ＨＴプ
ライマー、Ｔ７プライマーはｃＤＮＡ部分が増幅されるよう、ベクターのｃＤ
ＮＡ挿入部の両側にあたる特異的な配列をもとに設計してある。この反応液を０．５μｌずつＮＹＬＯＮＴＲＡＮＳＦＥＲＭＥＭＢＲＡＮ
ＥＨｙｂｏｎｄＮ^＋（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）上に９
６穴プレートと同じ格子状（縦８×横１２）にスポットした。１枚のナイロンメ
ンブレンには９６穴プレート４枚分に相当する３８４コロニー分を格子状（縦１
６×横２４）にスポットし、また１つのコロニー由来のＰＣＲ反応液について２
枚のメンブレンの同じ位置にスポットし、同じメンブレンが２枚ずつできるよう
にした。反応液をスポットしたメンブレンを室温で風乾させた後、変性溶液（０
．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ）を染み込ませたろ紙上にのせ、室温で
１０分間放置し、ＤＮＡを変性させた後、中和溶液（１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌｐＨ７．５、１．５ＭＮａＣｌ）を染み込ませたろ紙上にメンブレンを移
し、室温で１０分間放置した。バットに十分量用意した０．５％ＳＤＳを含む２
×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）中で、メン
ブレン（アレイフィルター）を洗浄した。（２）プローブのラベル化実施例１および実施例２（２）で調製した胎生１６日ラット心臓および生後８
週齢ラット心臓のポリ（Ａ）ＲＮＡからＬａｂｅｌＩＴＤｉｇｏｘｉｎＮ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（以下「ＬａｂｅｌＩＴ
Ｋｉｔ」と呼ぶ）（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標
識プローブを作製した。方法はキットに添付のマニュアルに従った。（３）ハイブリダイゼーションハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズしたスポットの検出の方法と試
薬は全てロシュ社のＤＩＧシステムユーザーズガイドに従った。（１）で作製したメンブレンをハイブリバッグに入れ、５０℃に加温したハイ
ブリダイゼーション緩衝液［５×ＳＳＣ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、
０．０２％ＳＤＳ、２％ブロッキング試薬（ロシュ社製）、５０％ホルムアミド
］２０ｍｌを加え、５０℃で４時間プレハイブリダイゼーションを行った。（２
）で調製したプローブ量の１０分の１容量のＤｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ緩衝液（
ＬａｂｅｌＩＴｋｉｔに添付；Ｍｉｒｕｓ社製）を加え室温で５分間反応さ
せた後、同じくプローブの１０分の１容量のＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ緩衝
液（ＬａｂｅｌＩＴｋｉｔに添付；Ｍｉｒｕｓ社製）を加え、変性させた。
これをハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、プレハイブリダイゼーションの
終了したメンブレンに加えた。５０℃で１晩保温し、バッグ内でフィルターが動
く程度（約１２ｒｐｍ）に振とうさせながらハイブリダイゼーションを行った。
なお、（１）で同一のＤＮＡをスポットした２枚のメンブレンを作製しているの
で、１枚は胎生１６日ラット心臓のプローブ、１枚は生後８週齢ラット心臓のプ
ローブとハイブリダイゼーションさせた。（４）スポットの検出メンブレンをハイブリバッグから取り出し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６
８℃で１０分間洗浄した後、洗浄液を新しくして、再度同じ条件で洗浄した。さ
らに０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６８℃で１５分間洗浄する操作を２回繰
り返した。その後、アルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体、化学発光基質
ＣＳＰＤからなるＤＩＧ発光検出キット（ロシュ社製）で処理し、Ｘ線フィルム
ハイパーフィルムＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を感
光させ、現像した。感光時間は、胎生１６日ラット心臓のプローブ、生後８週齢
ラット心臓のプローブとハイブリダイズしたものでバックグラウンドが同程度の
濃度になるように調整した。生後８週齢ラット心臓のプローブと比較して胎生１
６日ラット心臓のプローブと強くハイブリダイズしたクローン、および、胎生１
６日ラット心臓のプローブと比較して生後８週齢ラット心臓のプローブと強くハ
イブリダイズしたクローン、合計３１６クローンを選択した。アレイの位置から
クローンを特定し、各クローンをそれぞれ実施例３の（１）で調製したグリセロ
ールストックから培養して、プラスミドＤＮＡを調製した。実施例４各クローンの解析（１）塩基配列の決定実施例３のディファレンシャルハイブリダイゼーションによって選択された３
１６クローンのｃＤＮＡの塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーを用いて解析した
。この塩基配列について、解析プログラムＢｌａｓｔＮを用いて、塩基配列デー
タベースＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＧｅｎｅＳｅｑ〔ダーウェント（Ｄｅ
ｒｗｅｎｔ）社製〕中の配列に対する相同性を調べた。この解析の結果、成体心
臓に比べ胎児心臓で強く発現していることが公知の遺伝子、ｓｌｏｗ−ｆｉｂｅ
ｒｔｒｏｐｏｎｉｎＩ、ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅｍｙｏｓｉｎａｌｋａｌ
ｉｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ１α
をコードする遺伝子が含まれていた。その後、（２）に示すノーザンハイブリダイゼーション法によっても、生後８
週齢ラットの心臓と比較して胎生１６日ラットの心臓で発現量が上昇しているこ
とが確認された遺伝子、および、胎生１６日ラットの心臓と比較して生後８週齢
ラットの心臓で発現量が上昇している遺伝子については、ｃＤＮＡ全体の塩基配
列を決定し、得られたｃＤＮＡの塩基配列から、遺伝子がコードする蛋白質のア
ミノ酸配列を推定した。さらに、このアミノ酸配列についても、解析プログラム
Ｂｌａｓｔを用いて、アミノ酸配列データベースＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、
ＧｅｎＰｅｐｔ、ＴＲＥＭＢＬ、ＧｅｎｅＳｅｑ中の配列に対する相同性を調べ
た。（２）ノーザンハイブリダイゼーションによる発現変動解析（１）で選択した３１６クローンから、新規な塩基配列のものを中心に興味深
いクローンを選択し、それぞれの遺伝子の胎生１６日心臓と生後８週齢心臓での
発現量を比較して調べるため、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。（２）−１ＲＮＡのメンブレンへの転写胎生１６日ラット心臓、あるいは生後８週齢ラット心臓から実施例１と同様の
方法により得られた全ＲＮＡ１２μｇに、それぞれ蒸留水を加え３．５μｌとし
た。ここに１０×ＭＯＰＳ緩衝液［８０ｍＭ酢酸ナトリウム、１９７ｍＭＭ
ＯＰＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］１．５μｌ、３５％ホルムアルデ
ヒド溶液（ナカライテスク社製）２μｌ、脱イオン化ホルムアミド５μｌを加え
た。６５℃で５分間加熱した後、氷上に置いて急冷し、全量を１×ＭＯＰＳ／２
％ホルムアルデヒド／１％アガロースゲルで電気泳動した。泳動終了後、ゲルを
２０×ＳＳＣ［３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム］を用いたキャ
ピラリートランスファー法により、ゲル中のＲＮＡをＮＹＬＯＮＴＲＡＮＳＦ
ＥＲＭＥＭＢＲＡＮＥＨｙｂｏｎｄＮ^＋（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテク社製）に転写した。転写終了後、クロスリンカーオプティマルリンク（
フナコシ社製）を用いて紫外線照射により、ＲＮＡをメンブレンに固定した。（２）−２プローブのラベル化選択したクローンについて、プラスミドをＡｐａＩとＰｓｔＩで切断し、挿入
ＤＮＡ断片を切り出した。断片の精製にはＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、方法はキットに添付のマニ
ュアルに従った。精製したＤＮＡ断片を鋳型とし、ＤＩＧ−ＨｉｇｈＰｒｉｍ
ｅ（ロシュ社製）を用いて該ＤＮＡ断片をラベルし、プローブとして用いた。方
法はキットに添付のマニュアルに従った。（２）−３ハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィーハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズしたスポットの検出の方法と試
薬は全てロシュ社のＤＩＧシステムユーザーズガイドに従った。（１）で作製したメンブレンをハイブリバッグに入れ、５０℃に加温した高Ｓ
ＤＳハイブリダイゼーション緩衝液［５×ＳＳＣ、０．１％ラウロイルサルコシ
ル、７％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５０％フォ
ルマミド、２％ブロッキング試薬（ロシュ社）］を加えた。５０℃で数時間以上
保温し、プレハイブリダイゼーションを行った。（２）で調製したプローブを９
５℃で５分間加熱後、急冷し、変性させた。これをハイブリダイゼーション緩衝
液と混合し、プレハイブリダイゼーションの終了したメンブレンに加えた。５０
℃で一晩保温し、ハイブリダイゼーションを行った。メンブランをハイブリバッ
グから取り出し、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６８℃で１０分間洗浄した後、
洗浄液を新しくして、再度同じ条件で洗浄した。さらに０．１×ＳＳＣ−０．１
％ＳＤＳで６８℃で１５分間洗浄する操作を２回繰り返した。その後、アルカリ
フォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体、化学発光基質ＣＳＰＤからなるＤＩＧ発光
検出キット（ロシュ社製）で処理し、Ｘ線フィルムハイパーフィルムＥＣＬ（
アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を感光させ、オートラジオグラフ
ィーを行った。その結果、生後８週齢ラット心臓と比べて胎生１６日ラット心臓で発現量が高
いクローン１６個［ＲＨＤＨ−００９、ＲＨＤＨ−０６３、ＲＨＤＨ−０６８、
ＲＨＤＨ−０９８、ＲＨＤＨ−０９９、ＲＨＤＨ−２３１、ＲＨＤＨ−２４９、
ＲＨＤＨ−２７４、ＲＨＤＨ−２８６、ＲＨＤＨ−０５７、ＲＨＤＨ−１８５、
ＲＨＤＨ−２２６、ＲＨＤＨ−２３５、ＲＨＤＨ−２３９、ＲＨＤＨ−２７９、
ＲＨＤＨ−３０９］および胎生１６日ラット心臓と比べて生後８週齢ラット心臓
で発現量が高いクローン３個［ＲＨＤＨ−１００、ＲＨＤＨ−１４０、ＲＨＤＨ
−０９３］を得た。以下、これらのクローンについて記載する。（３）生後８週齢ラット心臓と比較して胎生１６日ラット心臓で発現量が高い既
知遺伝子ＲＨＤＨ−００９の塩基配列はｒａｔｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗ
ｔｈｆａｃｔｏｒＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ
１３１０１〕（配列番号１）と一致した。この遺伝子がコードするアミノ酸配列
を配列番号２に示した。ＩＧＦ−ＩＩは、細胞増殖因子の一つとして知られてい
るが、生理的な意義は不明な点が多い。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラッ
ト心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル１に示した。ＲＨＤＨ−０６３の塩基配列（配列番号３）は推定ヒト分泌蛋白質の遺伝子〔
ＰＣＴ出願：ＷＯ９９／３１２６〕と７６％と高い相同性を示した。従って、こ
の遺伝子はラットにおけるオーソログであると推定された。配列番号３に示した
塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号４に示した。この遺伝子がコード
するタンパク質は、他の既知のタンパク質と顕著な相同性を示さず、機能も未知
である。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロ
ットを、第１図のパネル２に示した。ＲＨＤＨ−０６８の塩基配列はｒａｔｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｅｎｅ１（ｍｓｇ１）の配列〔Ａｃｃｅｓｓ
ｉｏｎ：ＡＦ１０４３９９〕（配列番号５）と一致した。この遺伝子がコード
するアミノ酸配列を配列番号６に示した。ｍｓｇ１遺伝子は細胞の色素沈着と関
連があると考えられている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９３，１２２９８−１２３０３（１９９６）〕が、心臓での機能は全くわかって
いない。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロ
ットを、第１図のパネル３に示した。ＲＨＤＨ−０９８の塩基配列はｍｏｕｓｅｃ−ａｂｌの配列〔Ａｃｃｅｓｓ
ｉｏｎ：Ｌ１０６５６〕（配列番号７）と高い相同性を示した。この遺伝子が
コードするアミノ酸配列を配列番号８に示した。ｃ−ａｂｌ遺伝子産物はチロシ
ンキナーゼ活性を有している。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓と
に対するノーザンブロットを、第１図のパネル４に示した。ＲＨＤＨ−０９９の塩基配列はｒａｔｎｏｎ−ｎｅｕｒｏｎａｌｅｎｏｌ
ａｓｅの配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｘ０２６１０〕（配列番号９）と一致し
た。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１０に示した。ｎｏｎ−ｎ
ｅｕｒｏｎａｌｅｎｏｌａｓｅ遺伝子は解糖系の酵素であるが、胎児心臓と成
体心臓での発現量の変動は知られていない。心臓胎生１６日ラット心臓と生後８
週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル５に示した。ＲＨＤＨ−２３１の塩基配列はｒａｔｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｎｋｅｄｔ
ｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＰＴＰ−Ｐ１）の配列〔Ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ：Ｌ１９１８０〕（配列番号１１）と一致した。この遺伝子がコード
するアミノ酸配列を配列番号１２に示した。この遺伝子産物はチロシンフォスフ
ァターゼ活性を有する。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対す
るノーザンブロットを、第１図のパネル６に示した。ＲＨＤＨ−２４９の塩基配列はｒａｔＴＳＣ−２２の配列〔Ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ：Ｌ２５７８５〕（配列番号１３）と一致した。この遺伝子がコードする
アミノ酸配列を配列番号１４に示した。ｒａｔＴＳＣ−２２遺伝子はＴＧＦ−
βにより発現が誘導される遺伝子として報告されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７，１０２１９（１９９２）〕が、その機能は明らかになっていない
。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを
、第１図のパネル７に示した。ＲＨＤＨ−２７４の塩基配列はｒａｔＳＨ３ｐ８の配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏ
ｎ：ＡＢ００８１６１〕（配列番号１５）と一致した。この遺伝子がコードす
るアミノ酸配列を配列番号１６に示した。ＳＨ３ｐ８の遺伝子産物はＳｒｃｈ
ｏｍｏｌｏｇｙ３（ＳＨ３）ドメインを有しｓｙｎａｐｔｏｊａｎｉｎあるい
はｄｙｎａｍｉｎＩと結合する活性を持つ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，８５６９−８５７４（１９９７）〕。胎生１６日ラット
心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル８
に示した。ＲＨＤＨ−２８６の塩基配列（配列番号１７）はｍｏｕｓｅｒｅｔｉｎｏｉ
ｃａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＫ）の配列〔Ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ：Ｍ３５８３〕と９１％と高い相同性を示した。従って、この遺伝子
はラットにおけるオーソログであると推定された。配列番号１７で示された塩基
配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１８に示した。ＭＫ遺伝子産物は、レ
チノイン酸による胚性腫瘍細胞の分化過程で早期に発現が誘導される遺伝子産物
として知られている〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．，１５１，１３１２−１３１８（１９８８）〕。胎生１６日ラット心臓と生後
８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル９に示した。（４）生後８週齢ラット心臓と比較して胎生１６日ラット心臓で発現量が高い新
規遺伝子ＲＨＤＨ−０５７の塩基配列を配列番号１９に示した。相同性解析の結果、既
知遺伝子中の配列で一致するものはなく新規な塩基配列であった。ＵｎｉＧｅｎ
ｅＲｎ．７７９０に含まれるＥＳＴ群と一致したが、ＲＨＤＨ−０５７の塩基
配列と全て重複するものは存在しなかった。ＲＨＤＨ−０５７がコードするアミ
ノ酸配列を配列番号２０に示した。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心
臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル１０に示した。ＲＨＤＨ−１８５の塩基配列を配列番号２１に示した。相同性解析の結果、既
知遺伝子中の配列で一致するものはなく新規な塩基配列であった。ＵｎｉＧｅｎ
ｅＲｎ．１２５９１に含まれるＥＳＴ群と一致したが、ＲＨＤＨ−１８５の塩
基配列と全て重複するものは存在しなかった。ＲＨＤＨ−１８５のｃＤＮＡを含
有するプラスミドｐＲＨＤＨ−１８５を保有する大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ
Ｆ’／ｐＲＨＤＨ１８５株はブダペスト条件に基づいて独立行政法人産業技術
総合研究所特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中
央第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号）に平成１２年３月１０日付けで受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０８１
として国際寄託されている。ＲＨＤＨ−１８５の塩基配列中には１０９アミノ酸
からなるＯＲＦが観察され、配列番号２２にそのアミノ酸配列をに示した。胎生
１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１
図のパネル１１に示した。ＲＨＤＨ−２２６の塩基配列を配列番号２３に示した。相同性解析の結果、既
知遺伝子中の配列で一致するものはなく新規な塩基配列であった。ＵｎｉＧｅｎ
ｅＲｎ．７２７０に含まれるＥＳＴ群と一致したが、ＲＨＤＨ−２２６の塩基
配列と全て重複するものは存在しなかった。ＲＨＤＨ−２２６のｃＤＮＡを含有
するプラスミドｐＲＨＤＨ−２２６を保有する大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ
’／ｐＲＨＤＨ２２６はブダペスト条件に基づいて独立行政法人産業技術総合
研究所特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第
６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に平成１２年３月１０日付けで受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０８２とし
て国際寄託されている。ＲＨＤＨ−２２６の塩基配列中には３７６アミノ酸からなるＯＲＦが観察され
、配列番号２４にそのアミノ酸配列を示した。このアミノ酸配列とデータベース
中の配列との相同性を調べたところ、ＷＯ９９／０６４２３公報で推定ヒト分泌
蛋白質として公開されているアミノ酸配列と、配列番号２４の１〜２７３番目の
アミノ酸配列の部分で８８％の高い相同性を示したが、配列番号２４の２７４〜
３７６番目のアミノ酸と対応する、ＷＯ９９／０６４２３公報に示される蛋白質
のアミノ酸配列は存在しなかった。従って、ＷＯ９９／０６４２３公報で示され
る蛋白質は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のヒトオーソ
ログではないと推定できる。なお、ＷＯ９９／０６４２３公報に示される蛋白質
の機能は分泌因子であること以外は明らかになっていない。胎生１６日ラット心
臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル１２
に示した。ＲＨＤＨ−２３５の塩基配列を配列番号２５に示した。相同性解析の結果、ｈ
ｕｍａｎｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅ１（ｍｔ
ａ１）の配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｕ３５１１３〕と６５％の相同性を、ま
た、そのラットオーソログであるｒａｔｍｔａ１の配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
：Ｕ０２５２２〕とは６４％の相同性を示した。ＲＨＤＨ−２３５の塩基配列
中には５１３アミノ酸からなるＯＲＦが観察され、配列番号２６にそのアミノ酸
配列を示した。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、ｈｕｍａｎｍｔａ１
遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列とは７４％、ｒａｔｍｔａ１遺伝子
がコードする蛋白質のアミノ酸配列とは７３％の相同性を示した。ｈｕｍａｎ
ｍｔａ１およびｒａｔｍｔａ１のアミノ酸配列とは一致しないことから、ＲＨ
ＤＨ−２３５は、新規遺伝子と考えられる。ＲＨＤＨ−２３５のｃＤＮＡを含有
するプラスミドｐＲＨＤＨ−２３５を保有する大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ
’／ｐＲＨＤＨ２３５はブダペスト条件に基づいて独立行政法人産業技術総合
研究所特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第
６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に平成１２年３月１０日付けで受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０８３とし
て国際寄託されている。胎生１６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対す
るノーザンブロットを、第１図のパネル１３に示した。ＲＨＤＨ−２３９の塩基配列を配列番号２７に示した。相同性解析の結果、既
知遺伝子中の配列で一致するものはなく新規な塩基配列であった。ＵｎｉＧｅｎ
ｅＲｎ．２３８９０に含まれるＥＳＴ群と一致したが、ＲＨＤＨ−２３９の塩
基配列と全て重複するものは存在しなかった。ＲＨＤＨ−２３９のｃＤＮＡを含
有するプラスミドｐＲＨＤＨ−２３９を保有する大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ
Ｆ’／ｐＲＨＤＨ２３９はブダペスト条件に基づいて独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央
第６（旧：工業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号）に平成１２年３月１０日付けで受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０８４と
して国際寄託されている。ＲＨＤＨ−２３９の塩基配列中には１５８アミノ酸か
らなるＯＲＦが観察され、配列番号２８にそのアミノ酸配列を示した。胎生１６
日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図の
パネル１４に示した。ＲＨＤＨ−２７９の塩基配列を配列番号２９に示した。相同性解析の結果、マ
ウスｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ３（ｍｉｒ
ｆ３）の配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｕ７５８４０〕と９２％と高い相同性を
示した。配列番号２９で示した塩基配列とｍｉｒｆ３遺伝子の塩基配列を比較す
ると、このクローンは全長ｃＤＮＡの５’末端が欠けているものと考えられた。
そこで実施例１でλＺＡＰＩＩをベクターにして作製した胎生１６日ラット心臓
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、ベクター特異的配列を基にした配列番号３
９に示すプライマーとＲＨＤＨ−２７９特異的な配列を基にした配列番号４１に
示すプライマーを用いてＰＣＲをおこなうことにより、クローンのｃＤＮＡより
もさらに５酎、のｃＤＮＡ断片を増幅し単離した。このｃＤＮＡ断片とＲＨＤＨ−２７９のｃＤＮＡとをつなぎあわせることにより
ＲＨＤＨ−２７９−１クローンを得た。ＲＨＤＨ−２７９−１の塩基配列を配列
番号３０に示した。ＲＨＤＨ−２７９−１のｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＲ
ＨＤＨ−２７９−１を保有する大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’／ｐＲＨＤＨ
２７９−１はブダペスト条件に基づいて独立行政法人産業技術総合研究所特
許生物寄託センター：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（旧：工
業技術院生命工学工業技術研究所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に
平成１２年３月１０日付けで受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０８５として国際寄託
されている。配列番号３０で示される塩基配列の３０番目以降は、ｍｉｒｆ３の
配列と９２％と高い相同性を示す一方、配列番号３０で示される塩基配列の１〜
２９番目は、ｍｉｒｆ３の配列とは大きく異なっている。従って配列番号３０で示される塩基配列は単なるｍｉｆｒ３のラットオーソロ
グではないと推定される。配列番号３０で示される塩基配列中には９４アミノ酸
からなるＯＲＦが観察され、配列番号３１にそのアミノ酸配列を示した。胎生１
６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図
のパネル１５に示した。ＲＨＤＨ−３０９の塩基配列を配列番号３２に示した。相同性解析の結果、既
知遺伝子中の配列で一致するものはなく新規な塩基配列であった。ＵｎｉＧｅｎ
ｅＲｎ．１７７９に含まれるＥＳＴ群と一致したが、ＲＨＤＨ−３０９の塩基
配列と全て重複するものは存在しなかった。この配列中には１００アミノ酸以上
から成るＯＲＦが存在せず、非翻訳領域と考えられる。胎生１６日ラット心臓と
生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル１６に示
した。（５）胎生１６日ラット心臓と比較して生後８週齢ラット心臓で発現量が高い既
知遺伝子ＲＨＤＨ−１００の塩基配列はｒａｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ
ｒｅｃｅｐｔｏｒの配列〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｕ０３３９０〕（配列番号３
３）と一致した。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号３４に示した。胎生１６日ラ
ット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネ
ル１７に示した。ＲＨＤＨ−１４０の塩基配列（配列番号３５）はｍｏｕｓｅｐｉｇｍｅｎｔ
ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ（ＰＥＤＦ）の配列〔
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＦ０１７０５７〕と９２％と高い相同性を示した。従
って、この遺伝子はラットにおけるオーソログであると推定された。配列番号３
５に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号３６に示した。胎生１
６日ラット心臓と生後８週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図
のパネル１８に示した。（６）胎生１６日ラット心臓と比較して生後８週齢ラット心臓で発現量が高い新
規遺伝子ＲＨＤＨ−０９３の塩基配列を配列番号３７に示した。相同性解析の結果、既
知遺伝子中の配列で一致するものはなく新規な塩基配列であった。ＵｎｉＧｅｎ
ｅＲｎ．１６５４２に含まれるＥＳＴ群と一致したが、ＲＨＤＨ−０９３の塩
基配列と全て重複するものは存在しなかった。ＲＨＤＨ−０９３の塩基配列がコ
ードするアミノ酸配列を配列番号３８に示した。胎生１６日ラット心臓と生後８
週齢ラット心臓とに対するノーザンブロットを、第１図のパネル１９に示した。産業上の利用可能性心筋壊死を原因とする種々の心疾患、例えば心肥大、心不全などの疾患の診断
薬および治療薬を提供することができる。「配列表フリーテキスト」配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡDetailed Description of the InventionTechnical Field The present invention is based on mRNA whose expression level changes between fetal and adult hearts.
Using the extraction method and differential hybridization method
The DNA (cDNA) complementary to the obtained mRNA and the DNA encoded by the mRNA
The present invention also relates to an antibody against the protein, a method for detecting the protein and the DNA.
and a method for detecting the DNA, protein, antibody, etc., which cause myocardial necrosis.
The present invention relates to diagnostic and therapeutic agents for various heart diseases, such as cardiac hypertrophy and heart failure.Background technologyThe heart differentiates very early in development, becoming the earliest organ, and immediately after differentiation
Cardiomyocytes maintain their ability to divide even after differentiation and are active during the fetal period.
The cardiomyocytes continue to divide and proliferate. In other words, the characteristic of cardiomyocytes at this stage is that they contain many contractile cells in the cytoplasm.
Despite containing bundles of filaments, they undergo mitosis. Many other somatic cells undergo differentiation and develop specialized cytoplasmic structures.
However, cardiomyocytes deviate from this general rule. After birth, the proliferation ability of cardiomyocytes declines rapidly. Therefore, cardiac growth is dependent on the individual
This is caused by physiological hypertrophy, which is an increase in the size of cardiac muscle cells, and
It is believed that myocardial cells do not have the ability to regenerate. When myocardial cells die due to myocardial infarction, myocarditis, aging, etc., the remaining myocardial cells
Cardiac hypertrophy is a physiological adaptation immediately after birth.
However, in this case, the proliferation of coexisting cardiac fibroblasts and interstitial fibrosis combined with cardiac autoimmunity
This leads to a decrease in the body's diastolic function and even a decrease in contractile function, resulting in heart failure.
Conventional treatments for heart failure due to myocardial infarction, etc., have involved drugs that enhance cardiac contractility and vasodilators.
Symptomatic treatments include reducing pressure and volume overload with tonics and reducing volume with diuretics.
Severe heart failure has a poor prognosis, and cardiac surgery has been the only radical treatment.
The only option is organ transplantation, but there are problems such as a shortage of organ donors, difficulty in determining brain death, rejection reactions, and high medical costs.
Heart transplants are not a common treatment due to issues such as rising costs. If adult cardiomyocytes could be given the ability to proliferate, it would be possible to treat and prevent heart failure.
Currently, the molecular mechanism by which cardiomyocytes lose their proliferation ability after birth is unknown.
However, due to differences in the properties of fetal and adult cardiomyocytes,
Highly expressed molecules, or molecules highly expressed in the adult heart, inhibit cardiomyocyte proliferation.
It is thought that these proteins are involved in the regulation of the expression of the fetal heart and adult heart. To date, the following proteins have been identified as having different expression levels between the fetal and adult hearts:
It is known that PCNA (pro
living cell nuclear antigen), Rb(
retinoblastoma), Cyc (cyclin) D1, CycD3,
Cdk (Cyclin D-dependent kinase) 4 etc., DNA
Some are known to be involved in replication and the cell cycle [Am. J. Physiol.,
271On the other hand, compared with fetal hearts, adult hearts
Gax (Growth arrest-stimulating factor) is a protein highly expressed in the heart.
specific homeobox) is known [Am. J. Phys.
l.,271, H2183-H2189 (1996)]. However, for example, transgenic mice in which CyclinD1 was forcibly expressed specifically in cardiomyocytes
In transgenic mice, multinucleation was observed in adult cardiomyocytes, but
Only the expression of type 2 contractile proteins was observed, and no significant increase in cell number was observed [J.C.
linical investigation,99, 2644-2654 (1
997)], these proteins alone are not able to confer proliferation ability to adult cardiomyocytes.
Therefore, the mechanism of action of the ATPase inhibitors, which are thought to be involved in the proliferation of cardiomyocytes, in both fetal and adult hearts is unclear.
There is a need to identify new factors that cause fluctuations in abundance.Disclosure of the InventionCardiomyocytes, which have the ability to proliferate during fetal development, lose their ability to proliferate after birth due to a molecular mechanism known as
If we can elucidate the mechanism of myocardial necrosis, we will be able to understand the mechanisms of myocardial necrosis and the pathogenesis of various heart diseases.
This will allow us to identify therapeutic targets and develop methods for regenerating cardiomyocytes.
The object of the present invention is to obtain genes whose expression levels change between the fetal heart and the adult heart.
This protein is useful for the search for therapeutic agents that repair tissues damaged by myocardial necrosis.
a protein, DNA encoding the protein, and an antibody that recognizes the protein;
The present inventors have conducted extensive research to solve the above problems and have obtained the following results:
cDNA library prepared using mRNA derived from the heart of a 16-day-old rat embryo.
By subtracting the mRNA extracted from the heart of 8-week-old rats,
We constructed a subtraction library enriched for genes highly expressed in the fetal heart.
In this subtraction library, genes with low expression levels were homogenized.
The phenomenon of the insertion of vectors into the chromosome and the increase in empty vectors without insert fragments are
Differential hybridization was performed on each cDNA clone in the library.
By performing this amplification, the expression levels of the proteins differ between fetal and adult hearts.
We have obtained many clones of genes that are suitable for the development of fetal and adult hearts.
In addition to genes whose expression levels are known to vary between the liver and the brain,
These included unknown and novel genes.
Hybridization was performed to confirm the changes in the expression of these genes.
The present invention was accomplished by discovering the peptide encoded by the gene.
Below, genes whose expression levels change between fetal and adult hearts are referred to as cardiomyocyte proliferation-related genes.
This application provides the following inventions (1) to (59): (1) A gene comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, and 30.
(2) DNA having a base sequence selected from the group consisting of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 or 27 and stringency
hybridized under circumstantial conditions, and the expression levels varied between fetal and adult hearts.
(3) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, 25, or 30.
hybridizes under irradiant conditions and has 90% or more homology with the DNA
(4) DNA of a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, and 30, the expression level of which varies between the fetal heart and the adult heart.
DNA having the same sequence as 5 to 60 consecutive bases in a base sequence selected from the group
(5) DNA having a sequence complementary to the DNA described in (4) above. (6) A method for producing a fetal heart using the DNA described in any one of (1) to (5) above.
(7) A method for detecting mRNA of a gene whose expression level changes between the adult heart and the myocardial necrosis heart, comprising the DNA described in any one of (1) to (5) above.
(8) A diagnostic agent for cardiac disease caused by myocardial necrosis using the DNA described in any one of (1) to (5) above.
(9) A method for detecting a causative gene of a cardiac disease using the DNA described in any one of (1) to (5) above.
Suppress or enhance the transcription or translation of genes whose expression levels differ between the adult and adult hearts
(10) A method for screening a substance, comprising: inducing myocardial necrosis using the DNA described in any one of (1) to (5) above;
(11) A method for screening therapeutic agents for cardiac diseases caused by myocardial infarction, comprising the DNA described in any one of (1) to (5) above.
(12) A recombinant virus containing the DNA described in any one of (1) to (5) above.
(13) A vector homologous to the sense strand of the DNA described in any one of (1) to (5) above.
(14) A recombinant viral vector comprising RNA consisting of a sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 19, 32, and 37.
(15) A DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the DNA described in (14) above.
(16) DNA of a gene whose expression varies between the fetal heart and the adult heart. (17) A DNA selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 19, 32, and 37.
(17) DNA having a sequence complementary to the DNA described in (16) above. (18) A cardiac cell comprising the DNA described in any one of (14) to (16) above.
(19) A diagnostic agent for cardiac disease caused by myonecrosis. (19) A diagnostic agent for cardiac disease caused by myonecrosis, using the DNA described in any one of (14) to (16) above.
(20) A method for detecting a gene causing a heart disease caused by necrosis, using the DNA described in any one of (14) to (16) above.
Suppress or promote transcription or translation of genes whose expression levels differ between the adult and adult hearts
(21) A method for screening a substance that promotes myocardial injury using the DNA described in any one of (14) to (16) above.
A method for screening therapeutic agents for cardiac diseases that cause death. (22) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33, and 3
Using DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 5
A method for detecting mRNA of a gene whose expression level changes between the fetal heart and the adult heart. (23) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33, and 3
5. A DNA containing a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by
A diagnostic agent for heart disease caused by myocardial necrosis. (24) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33 and 3
Using DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 5
suppress the transcription or translation of genes whose expression levels differ between fetal and adult hearts
A method for screening for a substance that promotes or inhibits the growth of a target gene. (25) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33, and 3
Using DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 5
and a method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis. (26) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33, and 3
5. A DNA containing a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by
A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis. (27) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33 and 3
A composition containing DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 5.
Recombinant viral vector. (28) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33, and 3
Sense DNA having a base sequence selected from the group consisting of base sequences represented by 5.
(29) A recombinant viral vector comprising RNA having a sequence homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, and 31.
(30) A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of:
The amino acid sequence selected from the group is a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or
It consists of an additional amino acid sequence and is involved in repairing heart disease caused by myocardial necrosis.
(31) DNA encoding the protein described in (29) or (30) above. (32) A vector encoding the DNA described in any one of (1) to (4) and (31) above.
(33) A trait obtained by introducing the recombinant DNA described in (32) above into a host cell.
Transformant. (34) The transformant described in (33) above is cultured in a medium, and the transformant described in (29) above is added to the culture.
(30) or (31), and collecting the protein from the culture.
(35) A method for producing a protein that causes myocardial necrosis, comprising the protein according to (29) or (30).
(36) A therapeutic drug for heart disease, comprising culturing the transformant described in (33) above in a medium and using the resulting culture.
(37) A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis using the protein described in (29) or (30) above.
(38) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (39) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (40) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (41) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (42) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (43) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (44) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (45) A method for screening therapeutic agents for heart disease. (46) A method for
(39) A virus vector for inducing myocardial necrosis, comprising the recombinant virus vector described in (38) above.
(40) An antibody that recognizes the protein described in (29) or (30) above. (41) A method for treating heart disease caused by the protein described in (29) or (30) above using the antibody described in (40) above.
A method for immunologically detecting white matter. (42) Treatment of heart disease caused by myocardial necrosis using the antibody described in (40) above.
A method for screening drugs. (43) Using the antibody described in (40) above, a method for detecting differences in expression levels between fetal heart and adult heart.
Screening for substances that suppress or promote the transcription or translation of genes that regulate the transcription or translation of genes
(44) A method for diagnosing a heart disease caused by myocardial necrosis, comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of the antibody described in (40) above.
(45) A method for treating heart disease caused by myocardial necrosis, comprising administering to a patient an antibody according to (40) above.
(46) The antibody, radioisotope, protein, and low-molecular-weight compound according to (40) above.
A drug delivery system that guides a fusion antibody bound to a drug selected from the group consisting of:
Lee method. (47) Recognizing a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or 38
(48) Treatment of heart disease caused by myocardial necrosis using the antibody described in (47) above.
A method for screening drugs. (49) Using the antibody described in (47) above, a method for detecting differences in expression levels between fetal heart and adult heart.
(50) A method for screening for a substance that inhibits the transcription or translation of a gene that is involved in myocardial necrosis. (51) A method for screening for a substance that inhibits the transcription or translation of a gene that is involved in myocardial necrosis, comprising the antibody described in (47) above.
(51) A method for treating heart disease caused by myocardial necrosis, comprising administering to a patient an antibody according to (47) above.
(52) The antibody according to (47) above, a radioisotope, a protein, and a low-molecular-weight compound.
A drug delivery system that guides a fusion antibody bound to a drug selected from the group consisting of:
Lee method. (53) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34, and
A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 36.
(54) A recombinant viral vector involved in the production of a protein that induces myocardial necrosis, comprising the recombinant viral vector described in (53) above.
A therapeutic drug for heart disease caused by the action of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34, and
A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 36.
Using antibodies that recognize proteins, we screen for therapeutic drugs for heart diseases that cause myocardial necrosis.
(56) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34, and
A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 36.
Using antibodies that recognize the proteins, we identified genes whose expression levels change between fetal and adult hearts.
A method for screening for a substance that inhibits or promotes transcription or translation. (57) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34, and
A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 36.
A diagnostic agent for a heart disease caused by myocardial necrosis, comprising an antibody that recognizes the protein. (58) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34, and
A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 36.
A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising an antibody that recognizes the target protein. (59) SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34 and
A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 36.
Antibodies that recognize the target substance and drugs selected from radioisotopes, proteins, and small molecule compounds
A drug delivery method for guiding a fusion antibody bound to a drug to cardiac lesions. The present invention is described in detail below. The DNA of the present invention is DNA of a gene whose expression level varies between the fetal heart and the adult heart.
For example, the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, and 30
and a DNA having a base sequence selected from the group consisting of:
DNA that hybridizes under these conditions and whose expression level varies between fetal heart and adult heart
Examples include the base sequences selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27 and 30.
The DNA that hybridizes with the base sequence under stringent conditions is
A salt selected from the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27 and 30.
Colony hybridization method using DNA consisting of the base sequence as a probe
, plaque hybridization or Southern blot hybridization
Specifically, it refers to the DNA obtained by using the DNA isolation method, etc.
A filter on which DNA derived from colonies or phage plaques is immobilized is used.
In the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, the labeled DNA probe was incubated at 65°C.
After hybridization, 0.1 to 2 times SSC solution (1 times
The composition of the SSC solution was 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate,
The filter was washed at 65°C using a cellulose acetate solution containing sodium.
Examples of DNA that can be hybridized include: Hybridization is described in Molecular Cloning, A.L.A.
Laboratory Manual, Second Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)
(hereinafter referred to as "Molecular Cloning, 2nd Edition"), Current
Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons (1987-1997) (hereafter referred to as Current Protocol)
(abbreviated as "Rules in Molecular Biology"), DNA Cloni
ng 1: Core Techniques, A Practical App
reach, Second Edition, Oxford University
This can be carried out in accordance with the method described in, for example, [Yoshinobu] ty (1995).
Specific examples of soybean-compatible DNA include SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, and
At least 60% homology with a base sequence selected from the base sequences represented by 30
DNA having the following structure, preferably a DNA having 80% or more homology therewith, more preferably
Examples of the DNA of the present invention include DNA having a homology of 90% or more. Furthermore, the DNA of the present invention includes an oligonucleotide having a partial sequence of the DNA of the present invention.
Also included are oligonucleotides and antisense oligonucleotides.
As nucleotides, for example, those represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27 and 30
A sequence of 5 to 60 consecutive residues, preferably 10 consecutive residues, in a base sequence selected from the base sequences
Examples of oligonucleotides include those having the same sequence as the base sequence of 1 to 40 residues.
As an antisense oligonucleotide, for example, the oligonucleotide
Examples of the protein of the present invention include antisense oligonucleotides having activity related to heart disease caused by myocardial necrosis.
Proteins of SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28 and
a protein having an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by 31 and 32;
is an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 22, 24, 26 and 28.
An amino acid sequence is an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added.
and has activity involved in repair of cardiac diseases caused by myocardial necrosis.
Examples of such proteins include those selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 22, 24, 26, and 28.
The amino acid sequence of a protein is one in which one or several amino acids are deleted.
, a substituted or added amino acid sequence, and a heart disease caused by myocardial necrosis.
Proteins with activity involved in repair of
, Current Protocols in Molecular Biology, Nucle
ic Acids Research,10, 6487 (1982), Proc.
．． Natl. Acad. Sci. ,USA,79, 6409 (1982), Ge
ne,34, 315 (1985), Nucleic Acids Research
ch,13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.
,USA,82, 488 (1985) and the like.
1. Preparation of cardiomyocyte proliferation-related genes (1) Preparation of a rat heart differential cDNA library and differential high-throughput analysis
Selection of cDNA from a library by hybridization Cardiomyocyte proliferation-related gene DNA was prepared as follows. First, we used 16-day-old rat embryonic day (E16) rat heart mRNA, which was differentiated using 8-week-old rat heart mRNA.
A rat heart cDNA library was prepared, and the cDNA fragments in the subtracted cDNA library were
The DNA clones were further analyzed using heart RNA from 16-day-old embryonic rats and 8-week-old rats.
Differential hybridization was performed using rat heart RNA as a probe.
The cDNA clones with different expression levels between the 16-day fetal heart and the 8-week-old heart were identified by the analysis.
By selecting the gene, cardiac muscle cell proliferation-related genes can be obtained. Differentiation is the process of generating single-stranded cDNA from mRNA extracted from tissues or cells under certain conditions.
The hybridization was performed with the mRNA of the control cells.
By excluding only soybean cDNA, the expression level differs compared to the control group.
This is a method for selecting cDNAs of genes. (1)-1 Construction of a differential cDNA library There are several methods for constructing a differential cDNA library, but the present invention
First, a cDNA library was prepared from the heart of a 16-day-old rat by conventional methods.
A method of converting the DNA into single-stranded DNA using a phage and then performing differential synthesis [Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA,88, 825 (1991)
Subtraction was performed by hybridizing with biotinylated 8-week-old rat heart mRNA.
The hybridized biotinylated mRNA-cDNA complex was further treated with streptavidin.
After binding to guanidin, the RNA is separated by phenol extraction. (1)-1-A. Preparation of a 16-day embryonic rat heart cDNA library Total RNA from rat heart was prepared using guanidinium thiocyanate-thiocyanate.
Cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol.,154, 3 (1987)]. Since mRNA generally has poly(A) added to the 3' end, oligo(dT)
Using the immobilized cellulose column method (Molecular Cloning, 2nd Edition), etc.
Poly(A)+ RNA can be prepared from total RNA. Furthermore, the Fast Track mRNA Isolation Kit (Fa
st Track mRNA Isolation Kit: Invitrog
en), Quick Prep mRNA Purification Kit (
Quick Prep mRNA Purification Kit: Ame
(manufactured by Barsham Pharmacia Biotech) or other kits.
RNA can also be prepared. A method for creating a cDNA library from mRNA is molecular cloning.
Learning 2nd Edition and Current Protocols in Molecular Biology
-, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Pr
Actical Approach, Second Edition, Oxford
University Press (1995), and
or commercially available kits, such as the SuperScript Plasmid System for
- cDNA synthesis and plasmid cloning (SuperS
crypt Plasmid System for cDNA Synthe
sis and Plasmid Cloning; Life Technology
ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by Sigma-Aldrich) and ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by Sigma-Aldrich)
A method using a DNA synthesis kit (Stratagene) is also available.
Examples include: Cloning vectors are used in E. coli (Escherichia coli) in
It can replicate at high copy number and contains ampicillin resistance genes and kanamycin resistance genes.
A multicloning site that can insert marker genes and cDNA for transformation such as
It is a cloning vector that has a DNA fragment containing a nucleotide sequence and can be easily converted into single-stranded DNA.
Examples of cloning vectors include the replication sequence of M13 phage.
It contains signal IG (intergenic space) and is used for the induction of helper phage.
A phage midvector is a plasmid that can be converted into a single-stranded DNA phage by transfection.
Specifically, pBluescript SK(-), pBlue
ScriptII KS(+), pBS(-), pBC(+)
Stratagene], pUC118 (Takara Shuzo)
In vivo excision using helper phage
λ phage that can be converted into phagemid by in vivo excision
Specifically, λZAPII, ZAPExpress (
(Both manufactured by Stratagene)
method for converting single-stranded DNA phages into single-stranded DNA phages, and
The single-stranded DNA was purified according to the manual attached to each commercially available vector.
The E. coli into which the vector incorporating the cDNA is introduced is
Any gene that can be expressed can be used.Escher
ichia coliXL1-Blue MRF' [Stratagene
Manufactured by Strategies,5, 81 (1992)],Escherichia coli C600 [Genetics,39, 440 (1954)],Es Cherichia coli Y1088 [Science,222, 778
(1983)],Escherichia coli Y1090 [Scien
ce,222, 778 (1983)],Escherichia coliN
M522 [J. Mol. Biol. ，166, 1 (1983)],Escher
ichia coli K802 [J. Mol. Biol. ，16, 118 (1
966)Escherichia coli JM105 [Gene,38
,275 (1985)] can be used. For subtraction, hybridization of cDNA with mRNA from the hearts of 8-week-old rats was performed.
The single-stranded DNA produced from the phagemid is
The type of DNA determines which of the two strands will be formed.
When constructing the NA library, single-stranded DNA was obtained from each cDNA clone.
This creates an antisense strand (a strand with a base sequence complementary to the actual mRNA).
Therefore, the cDNA should be prepared and the direction of insertion into the vector should be devised. For example, as described in the manual for Stratagene's ZAP cDNA synthesis kit,
As shown above, cDNA synthesis by reverse transcriptase requires the addition of a 5' end.XhoHas an I-site
The oligo-dT primer and 5-methyl-dCTP (
Inside the synthesized cDNAXhoI) into which dNTPs containing
The synthesized cDNA is then inserted at both ends.EcoRI adapter added
Later,XhoThe digested cDNA was inserted into the vector λZAPII.Ec
oRI/XhoWhen inserted between the I sites, the cDNAEcoRI Site side
At the 5' endXhoThe I site side becomes the 3' end, and the insertion direction into the vector is constant.
The cDNA library obtained by the above method is then subjected to in vivo excision.
After converting it into the phagemid vector pBluescript SK(-),
By infecting the phage, the cDNA portion becomes a single strand of the antisense strand.
DNA can be obtained. (1)-1-B Differentiation using 8-week-old rat heart mRNA Regarding the cDNA library of the phagemid vector prepared in (1)-1-A,
By infecting the cells with helper phage, single-stranded DNA fragments are introduced into the culture medium.
The single-stranded cDNA is purified and recovered from the culture medium.
When using vectors, in vivo excision is performed to convert the vectors into phage mimetics.
After converting it to the nucleotide sequence, the same procedure as above is carried out (Molecular Cloning, 2nd Edition).
The single-stranded DNA was purified according to the method described in Molecular Cloning, 2nd Edition.
The specific procedures for differentiation, the composition of reagents, and the reaction conditions are described in Genes to Cell.
ls,3This can be carried out by the method described in (1998).
The mRNA from the heart of an 8-week-old rat prepared by the method shown in 1-A was photoprobe-
Bubiotin (Vector Laboratories)
After biotinylation using a biotin-containing antibody, the single stranded antibody was
Hybridization with heart cDNA. After hybridization, biotin and strong
By reacting with streptavidin, which binds to biotinylated mRNA
Streptavidin is further bound to the hybridized cDNA, and hydrophobic
After increasing the concentration, phenol is added and extraction is performed.
The cDNA can be separated from the aqueous layer. The phenol layer contains cDNA that has hybridized with biotinylated mRNA.
(1)-1-C. Creating a cDNA library after differentiation (1)-1-B. The differentiated cDNA is then cloned into a library with a base sequence complementary to that of the vector.
Suitable primers having the desired base sequence, BcaBEST (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), Kl
After making it double-stranded using DNA polymerase such as the enow fragment, it is introduced into E. coli.
By introducing the cDNA into E. coli, it is possible to create a cDNA library again.
Electroporation is the preferred method for transformation, as it has high transformation efficiency. (1)-2 Differential Hybridization The differential cDNA library prepared in (1)-1 contains cDNA from embryonic day 16 rat hearts.
The cDNAs of genes whose expression levels are increased in the liver are enriched, but
Not all of the cDNA clones in this study are necessarily cardiomyocyte proliferation-related genes.
To select the cDNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene from these,
Northern hybridization using DNA clones as probes (molecular
primers based on the base sequence of the cDNA clones (Larsen cloning, 2nd edition)
RT (reverse-transcribed)-PCR method using
R Protocols, Academic Press (1990)]
The mRNA expression levels in the hearts of 16-day-old embryonic rats and 8-week-old rats were compared.
By doing so, the c of cardiomyocyte proliferation-related genes with high mRNA expression levels in either
Select DNA. Also, use the differential hybridization method described below.
By performing this screening, we were able to comprehensively and efficiently identify cDNA clones with increased expression levels.
First, the subtracted cDNA library obtained by method (1)-1 is divided into individual
The sample was diluted to a concentration sufficient to isolate Ronnie, spread on an agar medium, and cultured.
The colonies are cultured in liquid media under the same conditions.
The cDNA contained in the cloning vector is used as a template to generate a cloning vector-specific oligonucleotide.
The cDNA is amplified by PCR using the primers.
Spot the same amount onto two nylon membranes.
The DNA on the nylon membrane was denatured and neutralized according to the method described in [Illegible Text].
Afterwards, the DNA is fixed to the nylon membrane by ultraviolet irradiation.
One is total mRNA from the heart of a 16-day-old rat, and the other is from an 8-week-old rat.
Hybridization was performed using all the mRNAs from the heart as probes.
By comparing the strength of the hybridization signal, we were able to identify the 8-week-old rat heart
Select clones that have different expression levels between the 16-day-old rat heart and the 16-day-old rat heart.
Each colony was isolated and cultured in a 96-well plate.
Automatic microanalysis compatible with 96-well plates such as those manufactured by Ins Scientific
After dispensing the reaction solution using a dispenser, the PCR reaction is carried out.
Two identical membranes were prepared on which the same amount of DNA was blotted for each clone.
It can be prepared easily and quickly, and its correspondence with the original clone is clear. As a probe, it is reverse transcribed against the entire mRNA, just like a regular DNA probe.
It is also possible to use labeled cDNA made using enzymes and random primers.
However, the RNA probe binds more strongly to the DNA on the membrane than the DNA probe.
This is desirable because it hybridizes tightly and gives a strong signal.
for,³²P.³⁵Radioisotopes such as S or digoxigenin (digoxi
Non-radioactive substances such as dihydrogenin (DIG) and biotin are used, but for safety reasons
Non-radioactive materials are more preferable. RNA probes from 16-day-old embryonic rat hearts and 8-week-old rat hearts, respectively.
After hybridizing the DNA of each colony with the membrane prepared above,
Detect the hybridized probe.
For example, the method for labeling radioisotopes is
In this case, use an autoradiograph that directly exposes X-ray film or an imaging plate.
For DIG, refer to the DIG System User Guide (Roche)
After binding with alkaline phosphatase-labeled anti-DIG antibody according to the procedure described above,
X-ray filters are reacted with a substrate such as CSPD, which emits light due to alkaline phosphatase.
A method of exposing film to light is used as a sensitive and quantitative detection method.
For example, comparing the hearts of 16-day-old embryonic rats with those of 8-week-old rats,
A gene that is highly expressed in a particular region is identified by the mRNA of that gene present in the probe.
Therefore, the ratio of the number of molecules on the membrane is higher.
If the gene is matched, the cDNA spot corresponding to the gene will contain more
The probes will bind to the same cDNA clone.
Compare the hybridization signal intensity on two membranes in a batch.
As a result, the expression levels differed between the hearts of 16-day-old rats and 8-week-old rats.
The rat cDNAs obtained in this manner are shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9.
, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 32, 33
Examples of the rat cDNAs include those having the base sequences shown in 35 and 37.
(2) DNA sequence analysis The 16-day-old embryonic rat hearts and 8-week-old rat hearts selected by the above method were analyzed.
A commonly used base sequence analysis method for cDNA of genes with different expression levels,
For example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proc. Natl. Ac.
ad. Sci. ,USA,74, 5463 (1977)] or 373A.D.
A base sequence separation device such as an NA sequencer (manufactured by Perkin Elmer)
The base sequence of the DNA is determined by analyzing it using the above method. The novelty of the base sequence determined by the above method can be confirmed by using a homology search program such as Blast.
Using the program, we can access base sequence data from Genbank, EMBL, DDBJ, etc.
This can be confirmed by searching for the base. (3) Preparation of full-length cDNA If the DNA obtained by the above method is a partial cDNA, for example,
For example, PCR is performed using primers based on the base sequence of the cDNA clone.
ACE method [Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA,85, 8998
(1988)] to obtain a cDNA fragment closer to the 5' end than the original cDNA.
By joining this cDNA fragment with the original cDNA, the full-length cDNA can be obtained.
cDNA can be obtained. As the full-length cDNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene obtained in this way, for example,
For example, the nucleic acids having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27 and 30
DNA, etc. After the base sequence of the full-length cDNA has been determined in this way,
Primers based on the sequence were prepared, and cDNA or cDNA synthesized from mRNA was
Using the DNA library as a template, the target DNA is obtained by PCR.
Furthermore, based on the determined DNA base sequence, it is possible to synthesize the DNA in a DNA synthesizer.
The desired DNA can also be prepared by chemical synthesis.
The machine used was a Perkin Elmer HPLC system using the phosphoramidite method.
Examples include the DNA synthesizer model 392. (4) Obtaining the human equivalent gene The resulting gene, which shows differences in expression levels between fetal and adult rat hearts, was used.
It is thought that genes corresponding to these genes also exist in humans.
Proteins possessing the same amino acid sequence have high homology even among different animal species, and the proteins
The sequences of the genes encoding them also tend to be highly homologous.
Using rat cDNA as a probe, a cDNA library from a human heart was
Hybridization under slightly more stringent conditions
It is possible to obtain the target cDNA.
This is determined by the following method. Depending on the degree of homology between human cDNA and rat cDNA,
The rat cDNA was used as a probe for the digested human chromosomal DNA.
Southern blot analysis was performed under several hybridization conditions, and clear bands were observed.
The most stringent conditions are considered to be semi-stringent conditions.
Specifically, in the case of a hybridization solution that does not contain formamide,
The hybridization solution had a fixed salt concentration of 1M and a hybridization temperature of 68°C to 4°C.
Hybridization is carried out at temperatures gradually changed between 2°C and 3°C.
The procedure is carried out at the same temperature as that used for redistribution, using 2xSSC containing 0.5% SDS.
In the case of a hybridization solution containing amide, the temperature (42°C) and salt concentration (6x SSC
) and hybridized in a stepwise manner from 50% to 0% formamide.
Wash the membrane with 6x SSC containing 0.5% SDS at 50°C.
In addition, for the base sequence of rat cDNA obtained in (1) or (3), (
Similar to 2), a search for novelty and homology of the base sequence was carried out.
60% of the base sequence in the entire protein-coding region, preferably
Searches for human cDNA sequences that show 80% or more homology.
The human cDNA showing the following corresponds to the rat gene obtained in (1) or (3)
It is presumed to be a cDNA of a human gene. Therefore, the 5' end of this human cDNA
and 3'-terminal primers were used to identify human cells and tissues.
Preferably, RNA extracted from cardiac tissue or cells derived from the heart is used as a template.
This human cDNA can be amplified by T-PCR.
However, the human cDNAs found in the database are not full-length or
In some cases, only the ST base sequence is available, but even in such cases, the rat cDNA
The full-length human cDNA can be obtained by the same method as described in (3).
The human cDNA obtained in this way was sequenced in the same manner as in (2).
The amino acid sequence of the human protein encoded by the cDNA will be revealed.
(5) Obtaining genomic genes Rat or human genomic genes can be obtained using the method described in Molecular Cloning, 2nd Edition.
Genomic DNA library constructed using chromosomal DNA isolated from cells and tissues
For Lee, rat or human cDNA obtained in (1) or (4) was used.
Use it as a probe and screen it using methods such as plaque hybridization.
By doing so, it is possible to obtain rat or human genomic DNA of the gene of the present invention.
By comparing the base sequence of genomic DNA with the base sequence of cDNA,
The exon/intron structure of the gene can be elucidated.
The 5' end of the cDNA was used as a probe to identify the gene of the present invention.
It is important to clarify the base sequences of the genomic gene regions that control transcription, such as motors.
This sequence is useful for analyzing the transcriptional control mechanism of the gene of the present invention.
In addition, the technique of homologous recombination [for example, Nature,324, 34-38 (198
7), Cell,51, 503-512 (1987), etc.,
It is also possible to create clones in which the gene of the invention is inactivated or replaced with any sequence.
(6) Preparation of oligonucleotides Using the base sequence information of the DNA of the present invention, oligonucleotides can be prepared by conventional methods or a DNA synthesizer.
The oligonucleotides and antisense oligonucleotides having a partial sequence of the DNA of the present invention
Oligonucleotides can be prepared. The oligonucleotides or antisense oligonucleotides can be, for example,
For example, in the base sequence of a part of the mRNA to be detected,
a sense primer corresponding to the nucleotide sequence at the 3' end, and an antisense primer corresponding to the nucleotide sequence at the 3' end.
However, the salt corresponding to uracil in mRNA can be
The base becomes thymidine in the oligonucleotide primer.
The melting temperature (Tm) and salt concentration of the primers are
Oligonucleotides with 5 to 60 bases that do not change radically in base number.
Furthermore, derivatives of these oligonucleotides (hereinafter referred to as oligonucleotide derivatives)
The oligonucleotide derivatives of the present invention can also be used as oligonucleotides. The oligonucleotide derivatives include phosphate diesters in oligonucleotides.
an oligonucleotide derivative in which a tert-butyl bond has been converted to a phosphorothioate bond;
The phosphodiester bond in the oligonucleotide is N3'-P5' phosphoamide.
oligonucleotide derivatives converted to ribonucleotide bonds,
and oligonucleotides in which the phosphodiester bond was converted to a peptide nucleic acid bond.
Derivatives, uracil in oligonucleotides replaced with C-5 propynyluracil
The oligonucleotide derivatives, wherein uracil in the oligonucleotide is C-5 thiamin
azole-uracil substituted oligonucleotide derivatives, in oligonucleotides
An oligonucleotide derivative in which the cytosine is replaced with C-5 propynylcytosine
, the cytosine in the oligonucleotide is a phenoxazine-modified cytosine (phenoxazine-modified cytosine).
cytosine-modified cytosine-substituted oligonucleotides
ribose in oligonucleotide is 2'-O-propyl ribose
oligonucleotide derivatives substituted with hydroxyl groups or hydroxyl groups in oligonucleotides
Oligonucleotide derivatives in which the ribose is replaced with 2'-methoxyethoxyribose
Examples of such things include cell engineering,16, 1463 (1997)]. 2. Production of cardiomyocyte proliferation-associated protein Based on the full-length cDNA, an appropriate fragment containing the portion encoding the protein may be produced, if necessary.
Prepare a DNA fragment of the appropriate length. The DNA fragment or full-length cDNA is inserted under the promoter in an expression vector.
A recombinant expression vector for the protein is created by inserting the DNA into a vector. The recombinant expression vector is then introduced into a host cell that is compatible with the expression vector. Any host cell that can express the target DNA can be used.
For example, Escherichia genus, Serratia genus,
tia genus, Corynebacterium genus,
Brevibacterium genus, Pseudomonas (Ps
eudomonas, Bacillus, Microbacteria
Bacteria belonging to the genus Microbacterium, etc., Kluyveromyces
Genus luyveromyces, Saccharomyces
s), the genus Schizosaccharomyces,
Genus Trichosporon, Schwa
Yeast belonging to the genus Niomyces, animal cells, insect cells, etc. can be used.
As an expression vector, it can be replicated autonomously in the host cell or integrated into the chromosome.
A promoter is inserted at a position where integration is possible and cardiomyocyte proliferation-related gene DNA can be transcribed.
When bacteria are used as host cells, recombinant expression of cardiomyocyte proliferation-related gene DNA is required.
The vector is capable of autonomous replication in the bacterium and contains a promoter, ribosome
A combination consisting of a binding sequence, cardiomyocyte proliferation-related gene DNA and a transcription termination sequence.
Preferably, the vector is a recombinant expression vector.
The gene may be included. Expression vectors include, for example, pBTrp2, pBTac1, and pBTac2.
(both commercially available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Amer
Sham Pharmacia Biotech), pSE280 (Inv
pGEMEX-1 (Promega), pQE-8
(QIAGEN), pKYP10 [JP Patent Publication No. 58-110600], pKYP
200 [Agricultural Biological Chemistry]
y,48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Che
m.,53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA,82, 4306 (1985)], pBluescript
II SK(-) (Stratagene), pGEX (Amersham)
pET-3 (Novagen)
pTerm2 (USP 4686191, USP 4939094, USP
5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pE
G400 [J. Bacteriol. ，172, 2392 (1990) for example.
The expression vector can be used to express the Shine-Dalgarno (Sh) ribosome binding sequence.
A suitable distance (e.g., 6 to 100 s) is provided between the ribosomal (I)-Dalgarno) sequence and the initiation codon.
It is preferable to use a promoter that is adjusted to a length of 18 bases. Any promoter can be used as long as it can be expressed in the host cell.
For example, the trp promoter (Ptrp), the lac promoter (Pl
ac), P_LPromoter, P_RE. coli promoters, T7 promoters, etc.
Promoters derived from phages, etc., SPO1 promoter, SPO2 promoter
Examples of promoters include the penP promoter and the penP promoter.
promoter (Ptrpx2), tac promoter, letI promoter
Tar [Gene,44, 29 (1986)], like the lacT7 promoter
Artificially designed and modified promoters can also be used. The base sequence of the protein-encoding portion of the cardiomyocyte proliferation-related gene DNA of the present invention
By substituting the codons for those that are optimal for expression in the host cell, the desired
This can improve the production rate of the protein. The transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene of the present invention.
Although not necessary, it is preferable to place a transcription termination sequence immediately downstream of the structural gene.
Host cells include Escherichia, Serratia, Corynebacterium, and Bacillus subtilis.
Levibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Microbacterium, etc.
Microorganisms belonging to, e.g.Escherichia coliXL1-Blu
e.Escherichia coliXL2-Blue,Escheric
hia coliDH1,Escherichia coliMC1000
,Escherichia coliKY3276,Escherichia coliW1485,Escherichia coliJM109,E
scherichia coliHB101,Escherichia co
liNo. 49,Escherichia coliW3110,Esch
erichia coliNY49,Bacillus subtilis,
Bacillus amyloliquefaciens,Brevibact
erium ammoniagenes,Brevibacterium im
mariophilum ATCC14068,Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066,Corynebaec
terium glutamicum ATCC13032,Coryneba
cterium glutamicum ATCC14067,Coryneb
Acterium glutamicum ATCC13869,Coryne
bacterium acetoacidophilumATCC 13870
,Microbacterium ammoniaphilumATCC15
354,PseudomonasExamples include sp. D-0110.
. The method for introducing a recombinant expression vector includes the method of introducing DNA into the host cell.
Any method can be used, for example, a method using calcium ions [
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)
], the protoplast method [Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394], or Gene,17,
107 (1982) and Molecular & General Genet.
cs,168, 111 (1979). When yeast is used as the host cell, the expression vector can be, for example, YEp
13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50
(ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. Any promoter may be used as long as it can be expressed in yeast.
For example, the PHO5 promoter, the PGK promoter, and the GAP promoter
, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter,
Heat shock protein promoter, MFα1 promoter, CUP 1 promoter
Examples of host cells include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyce
s cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe (Schizosa
ccharomyces pombe), Kluyveromyces lactis (Kl
uyveromyces lactis), Trichosporon pullulans (Tr
icosporon pullulans), Schwanniomyces albius
(Schwanniomyces alluvius) etc.
. The recombinant expression vector can be introduced into yeast using the following methods:
Any of these methods can be used. For example, electroporation [Method
s. in Enzymol. ，194, 182 (1990), Spheroplast
Law [Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA,75, 1929 (19
78)], lithium acetate method [J. Bacteriol.,153, 163 (19
83)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (
1978). When animal cells are used as host cells, the expression vector can be, for example, p
cDNAI (Invitrogen), pcDM8 (Invitrogen
Co., Ltd.), pAGE107 [JP Patent Publication No. 3-22979; Cytotechnolog
y,3, 133 (1990)], pAS3-3 (JP 2-227075), p
CDM8 [Nature,329, 840 (1987)], pcDNAI/Am
p (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen),
pAGE103 [J. Biochem. ，101, 1307 (1987)], p.
Examples include AGE210. Any promoter that can be expressed in animal cells can be used.
For example, immediate endothelial cell death (IE) of cytomegalovirus (human CMV) can be
the promoter of the early gene, the early promoter of SV40,
Retroviral promoter, metallothionein promoter, heat shock
Examples of promoters include the SRα promoter and the SRα promoter.
The enhancer of the IE gene of human CMV may also be used together with the promoter. Host cells include human Namalwa cells, monkey
COS cells, which are cells of the human body, CHO cells, which are cells of the Chinese hamster,
Examples include HBT5637 [JP Patent Publication No. 63-299]. The recombinant expression vector can be introduced using any method that can introduce DNA into animal cells.
For example, electroporation method [Cytote
technology,3, 133 (1990)], calcium phosphate method (Patent Publication No. 2002-2006)
-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA,84, 7413 (1987), Virology,52, 456
(1973)] can be used. The acquisition and cultivation of transformants can be carried out by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-244994.
The method is described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
This can be done according to the method currently used. When insect cells are used as host cells, for example, baculovirus exon
Pressure Vectors, A Laboratory Manual (Baculovi
rus Expression Vectors, A Laboratory
Manual), Current Protocols in Molecular Biology
- Supplement 1-38 (1987-1997), Bio/Technology
g.y.,6, 47 (1988) and other methods.
That is, a recombinant gene transfer vector and a baculovirus can be co-transfected into insect cells.
After obtaining the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, the recombinant virus was further
It can be used to infect insect cells and express proteins. Examples of gene transfer vectors include pVL1392, pVL1393,
pBlueBacIII (both manufactured by Invitrogen) and the like.
An example of a baculovirus is a virus that infects insects in the family Mythodidae.
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (A
autographa californica nuclear polyhe
drossis virus), etc. can be used. Insect cells include:Spodoptera frugiperdaovarian cells
Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression V
ectors, A Laboratory Manual, W. H. Free
and Company, New York, (1992)],Trick
hoplusia niHigh 5 (Invitrogen) ovarian cells
(manufactured by the Company) can be used. The above-mentioned recombinant gene transfer vector can be used to introduce the recombinant gene into insect cells to prepare a recombinant virus.
Examples of methods for co-transfection of the vector and the baculovirus include the calcium phosphate method.
[JP-A-2-227075], lipofection method [Proc. Natl. Ac
ad. Sci. ,USA,84, 7413 (1987) and others can be cited.
In addition to direct expression, molecular cloning is another method for gene expression.
Perform secretory production, fusion protein expression, etc. in accordance with the methods described in the 2nd edition.
When expressed in yeast, animal cells, or insect cells, sugars or sugar chains
The added protein can be obtained. A trait that carries recombinant DNA incorporating the DNA of a cardiomyocyte proliferation-related gene.
The transformant is cultured in a medium to produce and accumulate a cardiomyocyte proliferation-associated protein in the culture.
The cardiomyocyte proliferation-associated protein is produced by collecting the protein from the culture.
The transformant for producing the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention is cultured in a medium.
The method for culturing the transformant of the present invention can be carried out according to a conventional method used for culturing host cells. The transformant of the present invention can be produced using prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast as host cells.
In this case, the medium for culturing these transformants contains a carbon source that can be utilized by the host cells,
Any medium that contains a nitrogen source, inorganic substances, etc. and can efficiently cultivate transformants is suitable.
Either a natural medium or a synthetic medium may be used. The carbon source may be any that can be utilized by the host cells, and glucose may be used.
sugar, fructose, sucrose, molasses containing these, starch or
Carbohydrates such as starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol,
Alcohols such as propanol can be used. Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium acetate.
Ammonium of various inorganic or organic acids such as ammonium, ammonium phosphate, etc.
Salt, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn starch
Cheap liquor, casein hydrolysate, soybean meal and soybean meal hydrolysate, various fermented
Bacterial bodies and their digested products are used. Inorganic substances include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, etc.
ammonium sulfate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate
, calcium carbonate, etc. can be used. Cultivation is carried out under aerobic conditions such as shaking culture or submerged aeration and stirring culture.
The temperature is preferably 15 to 40°C, and the incubation time is usually 16 hours to 7 days.
The pH is adjusted by adding inorganic or organic acids, alkalis, or ammonium hydroxide.
Potassium solution, urea, calcium carbonate, ammonia, etc. are used. If necessary, antibiotics such as ampicillin or tetracycline may be used during cultivation.
It may also be added to the soil. Transformation using an expression vector with an inducible promoter
When culturing the transformant, an inducer may be added to the medium as needed.
For example, a transformant using an expression vector having a lac promoter is cultured.
When culturing, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like is used.
When a transformant using an expression vector having a trp promoter was cultured,
In some cases, indoleacrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium. Generally, media for culturing transformants obtained using animal cells as host cells are
The RPMI 1640 medium used in
e American Medical Association,199, 5
19 (1967)], Eagle's MEM medium [Science,122, 50
1 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology,8, 396
(1959)], 199 medium [Proceedings of the Society
ety for the Biological Medicine,73, 1
(1950)] or a medium containing fetal bovine serum or the like.
Culture is usually carried out at pH 6-8, 30-40°C, and 5% CO₂Under conditions such as in the presence of 1 to
The culture period is 7 days. If necessary, antibiotics such as kanamycin or penicillin may be added to the culture medium.
As a medium for culturing transformants obtained using insect cells as host cells,
TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-90
0 II SFM medium (Life Technologies), ExCe
11400, ExCell 405 (both JRH Biosciences)
), Grace's Insect Medium [Grace, T. C. C
. , Nature,195, 788 (1962)] can be used. Cultivation is usually carried out for 1 to 5 days under conditions such as pH 6 to 7 and 25 to 30°C. If necessary, antibiotics such as gentamicin can be added to the medium during cultivation.
To isolate and purify cardiomyocyte proliferation-associated proteins from the culture of the transformant,
For example, if the protein is produced in a dissolved state within the cells, after the culture is completed,
The mixture was collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then crushed using an ultrasonic crusher or a French press.
The cells were disrupted using a Manton-Gaulin homogenizer, a Dynomill, or the like, and the cell-free extract was obtained.
The cell-free extract is centrifuged to obtain a supernatant, from which the
Conventional protein isolation and purification methods, such as solvent extraction, salting out with ammonium sulfate, desalting,
Organic precipitation method, diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, D
Anion exchange chromatography using resin such as IAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation)
chromatography, S-Sepharose FF (Amersham Pha
Cation exchange chromatography using resins such as those manufactured by Pharmacia Biotech
chromatographic method, using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose
Hydrophobic chromatography, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography
Electrophoretic methods such as chromatography, chromatofocusing, and isoelectric focusing
These techniques can be used alone or in combination to obtain purified protein samples.
If the protein is produced as an insoluble body within the cells, the cells are collected and then disrupted.
The insoluble protein is collected as a precipitate fraction by centrifugation. The collected insoluble protein is solubilized with a protein denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed to reduce the concentration of the protein denaturant in the solubilized solution.
This allows the protein structure to return to its normal three-dimensional structure, and then the protein is isolated and purified in the same manner as above.
A purified protein preparation is obtained by this method. If the protein or its glycosylated form is secreted outside the cells, it is extracted from the culture supernatant.
The protein or its glycosylated form can be recovered from the culture.
The culture supernatant is collected by a method such as centrifugation, and the same isolation as above is carried out from the culture supernatant.
By using this purification method, a purified preparation can be obtained. Proteins obtained in this manner include, for example, those represented by SEQ ID NOs: 22, 24, and 26.
, 28, and 31.
The protein of the present invention can also be synthesized using the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl
It can also be synthesized by chemical synthesis methods such as the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method)
It can also be manufactured by Advanced ChemTech, Inc., USA.
Perkin-Elmer, Amersham Pharmacia Bio
Manufactured by Otech, Protein Technology Institute, USA
ent, USA; Synthecell-Vega, USA; PerSepti
It can also be synthesized using a peptide synthesizer manufactured by VE, Shimadzu Corporation, or other companies. 3. Preparation of antibodies that specifically recognize cardiomyocyte proliferation-associated proteins A purified preparation of the full-length or partial fragment of the protein of the present invention, or a portion of the protein of the present invention
A synthetic peptide having the amino acid sequence of
Subcutaneous or intravenous administration to non-human mammals such as herons, goats, rats, mice, and hamsters
Alternatively, the vaccine may be administered intraperitoneally with an appropriate adjuvant [e.g., Freund's complete adjuvant].
(Complete Freund's Adjuvant), Aluminum Hydroxide
When peptides are used as antigens,
In this case, the peptide was synthesized using keyhole limpet hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin).
covalently bound to a carrier protein such as aemocyanin or bovine thyroglobulin
It is desirable to use a peptide synthesized using a peptide synthesizer as an antigen.
After the first administration, the antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks.
On the 3rd to 7th day, blood was collected from the venous plexus at the back of the eye, and the serum was examined to see if it reacted with the antigen used for immunization.
Enzyme immunoassay (ELISA): Igaku Shoin Publishing, 1976
Year, Antibodies-A Laboratory Manual, Col.
Spring Harbor Laboratory, 1988)
Non-human mammals whose serum showed sufficient antibody titers against the antigen used for immunization were selected as blood samples.
The serum is used as a source of serum or antibody-producing cells. Polyclonal antibodies can be prepared by isolating and purifying the serum.
Monoclonal antibodies are produced by combining antibody-producing cells with myeloma cells derived from non-human mammals.
The hybridomas are then fused to form hybridomas, which are then cultured or injected into animals.
The animal is given the drug to induce ascites tumorigenesis, and the drug is then isolated and purified from the culture medium or ascites.
Antibody-producing cells can be prepared from the spleen, lymph nodes, and peripheral blood, particularly from the spleen.
Antibody-producing cells of the above are preferably used. As myeloma cells, 8-azaguanine-resistant mouse (BALB/c-derived) myeloma is preferred.
The cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current To
pics in Microbiology and Immunology,
18, 1 (1978)], P3-NS1/1-Ag41 (NS-1) [Euro
pean J. Immunology,6, 511 (1976)], SP2/0
-Ag14 (SP-2) [Nature,276, 269 (1978)], P3
-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology,123, 15
48 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature,256Established mouse cell lines, such as those described in [Chem., 495 (1975)], are preferably used. Hybridoma cells can be produced by the following method: Antibody-producing cells and myeloma cells are mixed and cultured in HAT medium (normal medium supplemented with hypoxanthine
After suspending the cells in a medium containing thymidine and aminopterin, the cells were incubated for 7 to 14 days.
After culturing, a portion of the culture supernatant is taken and tested for antigen-reactive properties using enzyme immunoassay or other methods.
Then, limiting dilution is performed to select those that react with the antigen and do not react with proteins that do not contain the antigen.
Cloning was performed using the method, and stable high antibody titers were confirmed by enzyme immunoassay.
The resulting hybridoma cells are selected as monoclonal antibody-producing hybridoma cells. Methods for isolating and purifying polyclonal or monoclonal antibodies include:
, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, caprylic acid precipitation, or DEAE-Sepharose column
, anion exchange column, protein A or G column or gel filtration column
Examples of methods include chromatography using the above methods, either alone or in combination.
4. Preparation of a recombinant viral vector producing a cardiomyocyte proliferation-associated protein The following describes a method for producing the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention in specific human tissue.
This paper describes a method for preparing a recombinant viral vector for the cardiomyocyte proliferation-related gene. Based on the full-length cDNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene, the protein
A DNA fragment of an appropriate length containing the portion encoding the above is prepared. The DNA fragment or the full-length cDNA is inserted into a promoter in a viral vector.
A recombinant viral vector is constructed by inserting the gene downstream of the target gene. In the case of an RNA viral vector, the full-length cDNA of the cardiac growth-related gene is inserted.
Homologous RNA fragments are prepared and inserted downstream of a promoter in a viral vector.
The RNA fragment is inserted into the
Depending on the type of viral vector, either the sense strand or the antisense strand may be used.
For example, in the case of retroviral vectors, the sense strand is selected.
In the case of a sense viral vector, an RNA homologous to the antisense strand is used.
Select suitable RNA. The recombinant viral vector is then introduced into packaging cells compatible with the vector.
Packaging cells contain the proteins necessary for viral packaging.
A recombinant viral vector lacking at least one of the genes encoding the vector is
Any cells that can replenish lost proteins are acceptable. For example, human kidney cells
Hepatic HEK293 cells, mouse fibroblast cells NIH3T3, etc. can be used.
The proteins supplied to the packaging cells are the retroviral vector proteins.
In the case of -, gag, pol, env derived from mouse retrovirus, lentivirus
In the case of vectors, gag, pol, env, vpr, and v
pu, vif, tat, rev, nef, and adenovirus vectors.
E1A and E1B derived from adenoviruses are expressed as Rep (p5
, p19, p40), Vp (Cap), etc. As for viral vectors, recombinant viruses produced in the above packaging cells are
The protein can be produced and inserted into the target cell at a position where it can transcribe the cardiomyocyte proliferation-related gene DNA.
The vector used contains a motor.
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 6733-6737
(1995)], pBabePuro [Nucleic Acids Res.
,18, 3587-3596 (1990)], LL-CG, CL-CG, CS-
CG, CLG [Journal of Virology,72, 8150-8
157 (1998)], pAdex1 [Nucleic Acids Res.
,23, 3816-3821 (1995)].
Any gene that can be expressed in human tissues can be used.
, cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate ear)
y) Gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter
promoter, metallothionein promoter, heat shock protein promoter
The IE gene of human CMV and the SRα promoter are also examples of the promoter.
A recombinant enhancer may be used together with the promoter. Methods for introducing a recombinant viral vector into packaging cells include, for example,
Calcium phosphate method [Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2-227075], lipofection method [
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413 (1987)
] etc. 5. Detection of cardiomyocyte proliferation-associated gene mRNA Below, the DNA of the cardiomyocyte proliferation-associated gene of the present invention can be used to detect cardiomyocyte proliferation-associated gene mRNA.
This section describes a method for detecting mRNA. DNAs used in this method include those represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 30, 32, 33,
DNA having the base sequences represented by 35 and 37 or derived therefrom
Examples include DNA fragments. As a method for detecting mRNA expression levels and structural changes of cardiomyocyte proliferation-related genes
For example, (1) Northern blotting (2)in situationHybridization
(3) quantitative PCR; (4) differential hybridization
(5) DNA chip method, (6) RNAse protection assay method, etc.
The samples to be analyzed by the above method are collected from patients with heart disease and healthy individuals.
Obtaining biological samples such as cardiac tissue, serum, saliva, etc., or cells from the biological samples
mRNA obtained from a primary culture cell sample cultured in a suitable medium in a test tube.
Alternatively, total RNA is used (hereinafter, the mRNA and total RNA are referred to as sample-derived RNA).
In addition, tissues obtained from biological samples are stored in paraffin or
Alternatively, RNA isolated as a phage section can be used. In the Northern blot method, RNA from a sample is separated by gel electrophoresis and then immersed in nylon 1000.
The DNA is transferred onto a support such as a filter, and a labeled probe prepared from the DNA of the present invention is used.
By performing hybridization and washing, cardiomyocyte proliferation-related genes were identified.
By detecting bands specifically bound to gene mRNA, we were able to identify the role of cardiomyocyte proliferation.
Changes in the expression level and structure of the mRNA of the associated gene can be detected.
When performing reduction, the cardiomyocyte proliferation-related activity in the probe and sample-derived RNA must be analyzed.
Incubate under conditions that allow the linked gene mRNA to form a stable hybrid.
To prevent false positives, hybridization and washing steps should be performed at high strain.
It is desirable to carry out the procedure under gentle conditions. These conditions include temperature, ionic strength, salt
It is determined by many factors, such as base composition, probe length, and formamide concentration.
These factors are described, for example, in Molecular Cloning, 2nd Edition.
The labeled probes used in the Northern blotting method can be prepared by known methods (nicking,
translation, random priming, or kinesing)
A chiral isotope, biotin, a fluorescent group, a chemiluminescent group, etc., may be attached to the DNA of the present invention or the DNA.
It can be prepared by incorporating the sequence of A into an oligonucleotide designed from the sequence of A.
The amount of binding of the labeled probe can be used to measure the expression level of the cardiomyocyte proliferation-related gene mRNA.
By quantifying the amount of bound labeled probe, cardiomyocyte proliferation-related
The amount of gene mRNA expression can be quantified.
By analyzing this, we can understand the structural changes in the mRNA of cardiomyocyte proliferation-related genes.
Cut. in situationThe hybridization method involves the use of the labeled probe and a
The tissues were isolated as paraffin or cryostat sections and used.
By performing hybridization and washing steps using the
This is a method for detecting the expression level of mRNA of related genes.in situationHybrid
In the hybridization method, to prevent false positives, hybridization and
It is desirable to perform the washing step under highly stringent conditions. These conditions include temperature,
Many variables, such as ionic strength, base composition, probe length, and formamide concentration, are considered.
These factors are determined by, for example, Current Protocols Int.
This is described in "Molecular Biology." Quantitative PCR, differential hybridization, or DNA
The detection method of mRNA of cardiomyocyte proliferation-related genes, such as the chip method, is based on RNA derived from the specimen.
, using oligo-dT primers or random primers and reverse transcriptase
This can be done by a method based on synthesizing cDNA (hereinafter, the cDNA
(These are referred to as sample-derived cDNA.) When the sample-derived RNA is mRNA,
However, when the sample-derived RNA is total RNA,
In this case, an oligo-dT primer is used. In quantitative PCR, the cDNA derived from the sample is used as a template, and the DNA of the present invention is
PCR was performed using primers designed based on the base sequence of
This method amplifies DNA fragments derived from mRNA of muscle cell proliferation-related genes.
The amount of DNA fragments reflects the mRNA expression level of cardiomyocyte proliferation-related genes.
actin and G3PDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)
DNA encoding ATPase (ATPase dehydrogenase) etc. is used as an internal control.
By placing the cells as a matrix, it is possible to quantify the amount of mRNA of cardiomyocyte proliferation-related genes.
Furthermore, the amplified DNA fragments were separated by gel electrophoresis, and the DNA fragments were analyzed for myocardial cell
This detection method can also reveal changes in the structure of mRNA of cells proliferation-related genes.
It is desirable to use appropriate primers that specifically and efficiently amplify the target sequence.
Suitable primers should be those that do not cause inter-primer or intra-primer binding.
First, it specifically binds to the target cDNA at the annealing temperature and then denatures the target cDNA under denaturing conditions.
The design can be based on conditions such as the deviation from the NA.
The amount must be increased within the PCR reaction period when the amplification product is exponentially increasing.
In such a PCR reaction, the amplified DNA fragments produced in each reaction are collected.
This can be determined by quantitative analysis using gel electrophoresis. Differential hybridization method [Trends in Gen
etics,7, 314-317 (1991)] and DNA chip method [Genome
e Research,6, 639-645 (1996)] is a cDNA derived from a sample.
A is used as a probe, and a filter or slide on which the DNA of the present invention is immobilized is used.
Hybridization and
By washing, changes in the expression level of cardiomyocyte proliferation-related gene mRNA were detected.
In both methods, actin and G3P are deposited on a filter or substrate.
Immobilization of an internal control such as DH allows for a high degree of accuracy between the control and target samples.
It is possible to accurately detect differences in mRNA expression of cardiomyocyte proliferation-related genes
In addition, different labeled dNTPs were used based on the RNA from the control sample and the target sample.
Labeled cDNA synthesis was performed using a filter or substrate, and two labeled cDNA probes were attached to the filter or substrate.
By simultaneously hybridizing the probes, accurate identification of cardiomyocyte proliferation-related genes was possible.
The amount of mRNA expression can be quantified. The RNAse protection assay is performed as follows. First,
A promoter sequence such as a T7 promoter or an SP6 promoter is attached to the 3' end of the
Binding and RNA polymerasein vitroLabeled by the transcription system
Labeled antisense RNA is synthesized using rNTPs.
The RNA is then allowed to bind to the sample-derived RNA to form an RNA-RNA hybrid.
After incubation, the mixture was digested with RNAse, and the RNA fragments protected from digestion were subjected to gel electrophoresis.
The bands formed by the ATPase are then detected. The bands obtained are then quantified to determine the proliferation of cardiomyocytes.
The expression level of proliferation-related gene mRNA can be quantified. 6. Detection of cardiac disease-causing genes Below, we will describe how to detect cardiac disease-causing genes using the DNA of the cardiomyocyte proliferation-related genes of the present invention.
This article describes a method for detecting genes that cause heart disease. DNAs that can be used in this method include those of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 30, 32, 33,
DNA having the base sequences represented by 35 and 37 or derived therefrom
Examples include DNA fragments. Presence or absence of mutations that cause heart disease in gene loci related to cardiomyocyte proliferation
The most definitive studies to assess the genetic makeup of heart disease patients are
Specifically, we will compare human biological samples such as cardiac tissue, serum, and saliva from patients with heart disease and healthy individuals.
A sample or a sample derived from primary cultured cells established from the biological sample is collected, and the biological sample is then analyzed.
DNA is extracted from the sample and the sample derived from the primary cultured cells (hereinafter referred to as the DNA
The sample-derived DNA may be directly or indirectly extracted from the DNA of the present invention.
Cardiomyocyte proliferation using primers designed based on the base sequence of A
The relevant gene DNA can be used as the sample DNA.
Using the derived cDNA as a template,
Cardiomyocyte proliferation-related genes amplified by PCR using designed primers
A DNA fragment containing the DNA sequence can be used as the sample DNA. It can be used to determine whether the DNA of a cardiomyocyte proliferation-related gene has a mutation that causes heart disease.
As a method of detection, a DNA strand having a wild-type allele and a DNA strand having a mutant allele are separated.
Method for detecting heteroduplexes formed by hybridization with corresponding DNA strands - Patents.com
Methods for detecting heteroduplexes include (1) polyacrylamide gel electrophoresis.
Heteroduplex detection method [Trends Genet.,7, 5 (1991)]
(2) Single-strand conformation polymorphism analysis [Genomics,16, 32
5-332 (1993)], (3) Chemical cleavage of mismatches (CCM, chem
(mical cleavage of mismatches) [Human
Genetics (1996), Tom Strachan and Andr
ew P. Read, BIOS Scientific Publishers
Limited], (4) Enzymatic cleavage of mismatches [Nature Gen
etics,9, 103-104 (1996)], (5) Denaturing gel electrophoresis [
Mutat. Res. ，288, 103-112 (1993)].
Heteroduplex detection using polyacrylamide gel electrophoresis is
A or sample-derived cDNA is used as a template to generate DNA for cardiomyocyte proliferation-related genes.
A is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23
, 25, 27, 30, 32, 33, 35 and 37
The DNA is amplified as a fragment smaller than 200 bp using the designed primers.
The A fragment is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis.
When a heteroduplex is formed due to a DNA mutation, a homoduplex without the mutation is formed.
They migrate slower in the gel than the strands and can be detected as extra bands.
The degree of separation is better when special gels (Hydro-link, MDE, etc.) are used.
If you are searching for DNA fragments smaller than 200 bp, you can find insertions, deletions, and most
It is possible to detect single base substitutions.
It is desirable to perform this analysis on a single gel in combination with single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP analysis).
nd conformation polymorphism analysis
s) is a method for carrying out the DNA or cDNA synthesis of the present invention using a sample-derived DNA or a sample-derived cDNA as a template.
The primers were designed based on the base sequence of the NA, and fragments smaller than 200 bp were generated.
The DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene amplified as a small fragment was denatured, and then the undenatured polynucleotide was added.
The primers used for DNA amplification are radioactively isolated from the DNA.
Labeling with fluorophores or fluorescent dyes, or silver staining of unlabeled amplification products
The amplified DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene is detected as a band.
To clarify the difference from the wild-type migration pattern, a control
When the sample is electrophoresed at the same time, fragments with mutations in the base sequence are identified due to differences in mobility.
The chemical cleavage of mismatches (CCM) can be performed using sample-derived DNA or
Using the cDNA as a template, DNA of cardiomyocyte proliferation-related genes was cloned from SEQ ID NOs: 1 and 3.
, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 30
, 32, 33, 35 and 37.
The DNA fragment is amplified. The DNA of the present invention is treated with a radioisotope or a fluorescent dye.
The labeled DNA was hybridized with the amplified DNA fragments, and then osmium tetroxide was added.
By treating with methionine, one strand of DNA is cut at the mismatched site, and the base is
The CCM method is one of the most sensitive detection methods.
It can be used for samples up to kilobases in length. Instead of osmium tetroxide, T4 phage resolvase and endonuclease are used.
enzymes involved in mismatch repair in cells, such as RNAse VII, and RNAse A
By combining this with denaturing gradient gel electrophoresis, mismatches can be enzymatically cleaved.
DNA elution (DGGE) is a method for analyzing DNA derived from specimens or specimens.
Using the cDNA as a template, the DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene was cloned according to the sequence number
1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27
, 30, 32, 33, 35 and 37.
DNA fragments amplified with mers are then passed through a gel with a concentration gradient of a chemical denaturant or a temperature gradient.
The amplified DNA fragments are electrophoresed in the gel until they are denatured into single strands.
They migrate, but after degeneration they stop migrating. There is a mutation in the DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene.
The mobility of the amplified DNA in the gel differs depending on whether or not it is present.
To increase the detection sensitivity,
It is recommended to add a poly(G:C) tail to the mer. Another method for detecting genes that cause heart disease is the protein truncation test.
in truncation test: PTT method) [Genomics,20 , 1-4 (1994)]. The framework for producing protein deficiency by this test
Specific detection of shift mutations, splice site mutations, and nonsense mutations
The PTT method can be performed using SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 1
5, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 30, 33 and 35
A T7 promoter sequence and a eukaryotic translation initiation sequence at the 5' end of the DNA having the sequence
A special primer is designed that connects the two, and the primer is used to detect the RNA from the sample.
cDNA is then prepared by reverse transcription PCR (RT-PCR).
in vitroAfter transcription and translation, proteins are produced.
If the migration position of the protein is the position corresponding to the full-length protein, a deletion is generated.
If there is a deletion in the protein, the deletion is at a position shorter than the full-length protein.
The protein is electrophoresed, and the degree of deletion can be determined from the position. The method of the present invention is used to determine the base sequences of sample-derived DNA and sample-derived cDNA.
It is possible to use primers designed based on the base sequence of the DNA.
By analyzing the determined base sequence, the DNA derived from the specimen or the
It is possible to determine whether or not the cDNA contains mutations that cause heart disease. Mutations outside the coding region of cardiomyocyte proliferation-related genes can be detected near or within the gene.
By examining non-coding regions, such as introns and regulatory sequences in
Cardiac diseases caused by mutations in non-coding regions can be detected by the methods described above.
The same method can be used to detect mutations in the non-coding region of the gene.
SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 2
3, 25, 27, 30, 32, 33, 35 and 37
DNA was used as a hybridization probe to identify clones.
Mutations in non-coding regions can be made according to any of the methods described above.
The mutations found can be analyzed using the Handbook of Human Genetics.
Linkage. The John Hopkins University
Statistical processing was performed according to the method described in [Press, Baltimore (1994)].
By conducting this analysis, it is possible to identify SNPs (single nucleotide polymorphisms) that are linked to heart disease.
It can also be identified as a family history of heart disease.
By extracting DNA from the samples using the method described above and detecting mutations, we can identify the risk of heart disease.
The causative gene can be identified. 7. The possibility of developing heart disease and its prognosis can be predicted using DNA from cardiomyocyte proliferation-related genes.
Method for diagnosing DNAs used in this method include, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 30, 32, 33,
DNA having the base sequences represented by 35 and 37 or derived therefrom
Examples include DNA fragments. The cause of heart disease can be determined by detecting genetic mutations in any human tissue.
For example, if there is a germline mutation, the mutation can be confirmed by
Individuals who inherit the mutation may be predisposed to developing heart disease.
can be detected by testing DNA from any tissue in the individual's body.
For example, DNA is extracted from blood cells collected from a human, and the DNA is used to
By detecting gene mutations, heart disease can be diagnosed.
Fetal cells, placental cells, or amniotic cells are collected, DNA is extracted, and the DNA is used to
By detecting gene mutations, it is possible to diagnose heart disease before birth.
In addition, DNA is extracted from the tissue of the affected area of patients who have developed heart disease, and genetic
By detecting changes in the blood pressure, it is possible to diagnose the type of heart disease and select the appropriate medication.
DNA from living tissues is released from surrounding normal tissues.
The tissue from the affected area is isolated and treated with trypsin, etc., and the obtained cells are then cultured in a suitable
Cultivating the cells in a medium and extracting chromosomal DNA and mRNA from the cultured cells
Hereafter, DNA obtained from a human specimen by any of the above methods for diagnostic purposes will be referred to as
DNA derived from a diagnostic specimen is also called DNA derived from a human specimen for diagnostic purposes.
The cDNA synthesized from the RNA obtained by this method is called diagnostic sample-derived cDNA.
DNA of cardiomyocyte proliferation-related genes and DNA derived from diagnostic specimens or diagnostic specimens
Using the derived cDNA, a method similar to the method for detecting the causative gene of the above-mentioned heart disease was performed.
This allows for the diagnosis of heart disease. In addition, DNA from cardiac muscle cell proliferation-related genes and DNA from diagnostic specimens or diagnostic samples can be used.
The method for diagnosing heart disease using cDNA derived from a tissue specimen includes: (1) determining the restriction enzyme site;
(2) detection using allele-specific oligonucleotide probes
(ASO: allele specific oligonucleotide
(3) allele-specific oligonucleotide hybridization
PCR (ARMS: amplification refractory
(4) oligonucleotide ligation system
Oligonucleotide ligation assay (OLA)
assay), (5) PCR-PHFA method (PCR-preferentia
(1) homoduplex formation assay), (6) oligo
Methods using DNA arrays [protein nucleic acid enzymes,43, 2004-2011 (19
98) and other methods are available. Restriction enzyme sites are detected by the following method:
If restriction enzyme sites are lost or created, the DNA from the diagnostic specimen or the diagnostic test
The cDNA derived from the body is a cDNA having a base sequence of the DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene of the present invention.
The DNA was amplified by PCR using primers designed based on the above, and then digested with restriction enzymes.
The resulting restriction enzyme digested DNA fragments can be easily compared with those of normal individuals to identify mutations.
However, single base changes are rare and are not diagnostic.
The purpose of the present invention is to provide a method for identifying the sequence information of the DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene of the present invention and
Design oligonucleotide probes by combining information from separately identified mutations
The oligonucleotide probe is then bound to a filter and hybridized.
Mutations are detected using a reverse dot blot method. Methods that use allele-specific oligonucleotide probes (ASOs)
A short synthetic DNA probe hybridizes only with a perfectly matched base sequence.
This method utilizes the characteristics of the DNA, making it possible to easily detect single base mutations.
The DNA of the present invention is designed based on the base sequence of the DNA and the identified base mutations.
The oligonucleotides are bound to a filter, and the DNA from the diagnostic sample or the diagnostic sample is then
Primers designed using the sequence of the DNA of the present invention from the cDNA derived from the specimen
Hybridization was performed using a probe prepared by PCR using dNTPs labeled with .
Reverse dot blots, which perform the same procedure as above, are often used. Reverse dot blots are performed by directly placing the blot on a glass slide or a substrate such as silicon.
The base sequence of the DNA of the present invention and the oligonucleotides designed based on the mutations are
The DNA is synthesized and then analyzed using a high-density array DNA chip.
DNA or cDNA derived from diagnostic samples can be easily used to detect various mutations.
This method is suitable for large-scale diagnostic purposes. Base mutations can be detected using the following oligonucleotide ligation assay (OLA):
The OLA method can also be used to detect the mutation. The OLA method is described in detail below. The mutation site is hybridized at both the 5' and 3' ends.
An oligonucleotide with a sequence of about 20 bases designed based on the base sequence of the DNA of the present invention
DNA or cDNA derived from diagnostic specimens is used to prepare the nucleotides.
The DNA of the cardiomyocyte proliferation-associated gene of the present invention is used as a template.
Using primers designed from the base sequence, PCR was performed to identify the gene involved in cardiomyocyte proliferation.
The DNA fragment is amplified. The amplified DNA fragment and the two oligonucleotides are then used.
After hybridization, the two oligonucleotides are ligated with DNA ligase.
For example, one of the two oligonucleotides has a
The other oligonucleotide was labeled with a different label such as digoctethin.
It is possible to quickly detect whether or not a ligation reaction has occurred.
LA does not require electrophoresis or centrifugation, allowing for efficient short-term analysis of multiple samples.
This mutation detection method is suitable for diagnosing between the ages of 10 and 20. Furthermore, the following PCR-PHFA method can quantitatively and easily detect minute amounts of mutated genes.
The PCR-PHFA method uses a gene amplification method (PCR), a liquid ion beam that exhibits extremely high specificity.
The PCR product was then subjected to hybridization in a phase similar to that of ELISA.
ED-PCR (enzymatic detection of PCR)
This method combines three primers: dinitrophenyl (DNP)-labeled and biotin-labeled primers,
PCR amplification was performed using the DNA of the present invention as a template using the set of
A labeled amplification product is prepared. In contrast, an unlabeled amplification product with the same base sequence as the labeled primer is prepared.
The diagnostic specimen-derived DNA or the diagnostic specimen-derived DNA was analyzed using a primer set having the following structure:
A 20- to 100-fold excess of unlabeled amplified product obtained by amplifying cDNA as a template
The mixture is then heat-denatured and then gently heated at 1°C for 5 to 10 minutes.
The reaction mixture is cooled in a temperature gradient to allow the complete complementary strand to form preferentially.
The labeled DNA is captured and adsorbed to the streptavidin-immobilized well via biotin.
By binding enzyme-labeled anti-DNP antibody via DNP, a color reaction occurs due to the enzyme.
If the sample does not contain a gene with the same sequence as the labeled DNA, the original 2
The labeled DNA strands are preferentially reformed and produce color.
If a gene with a complementary strand is present, it will be re-formed due to random displacement of the complementary strand.
The amount of labeled DNA decreases, and the color development decreases significantly.
- It becomes possible to detect and quantify polymorphic genes. 8. Cardiomyocyte proliferation-related proteins can be detected using antibodies that specifically recognize them.
Immunological detection or quantification method for a protein An antibody (polyclonal antibody) that specifically recognizes the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention
Using antibodies (antibodies or monoclonal antibodies), we detect cardiomyocyte growth-related proteins intracellularly.
Or, the extracellularly expressed microorganism, animal cell, or insect cell or tissue is used as an immunogen.
Epidemiological detection and quantification methods include the fluorescent antibody method and enzyme immunoassay (EL
ISA method), radioactive immunoassay (RIA), immunohistochemical staining and immune cell
Immunohistochemical staining methods such as staining methods (ABC method, CSA method, etc.), Western blot
dot blotting, immunoprecipitation, sandwich ELISA
[Monoclonal Antibody Experiment Manual (Kodansha Scientific) (1987)
, Continued Biochemistry Experiment Course 5: Immunobiochemistry Research Methods (Tokyo Kagaku Dojin) (1986)
Fluorescent antibody testing is used to detect myocardial cell proliferation-related proteins expressed intracellularly or extracellularly.
The antibody of the present invention is reacted with a microorganism, an animal cell, or an insect cell or tissue, and
Furthermore, they are labeled with fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC).
After reacting with anti-mouse IgG antibody or its fragment, a fluorescent dye was added to the
This is a method of measuring cardiomyocyte proliferation using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
The present invention is applied to microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues that are expressed extracellularly or extracellularly.
The antibody is reacted with the antibody, and then enzyme labeling such as peroxidase and biotin is performed.
After reacting with the anti-mouse IgG antibody or binding fragment, the color-developing dye was measured by absorbance spectrophotometry.
Radioactive immunoassay (RIA) is a method of measuring cardiomyocyte proliferation-related proteins intracellularly.
or in microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues where the present invention is expressed extracellularly.
Anti-mouse IgG antibody reacted with the antibody of the present invention and further radiolabeled, or
After reacting the fragments, measurements are made using a scintillation counter or the like.
Immunohistochemical staining methods such as immunocytochemistry and immunohistochemistry are used to detect myocardial cell proliferation.
Microorganisms, animal cells, or insects expressing growth-related proteins intracellularly or extracellularly
The antibody of the present invention is reacted with cells or tissues, and then a fluorescent substance such as FITC is added.
Anti-mouse IgG antibody labeled with enzymes such as peroxidase and biotin
Western blotting is a method of detecting cardiomyocyte proliferation-related proteins in cells or tissues after reacting the fragments with the cells and observing them under a microscope.
Extracts of extracellularly expressed microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues are used for SD.
S-Polyacrylamide gel electrophoresis [Antibodies-A Laboratories
Atory Manual, Cold Spring Harbor Labo
After fractionation using a PVDF membrane or a nitrite membrane, the gel was
The antibody of the present invention was reacted with the membrane, and then F
Antibodies labeled with fluorescent substances such as ITC, or enzymes such as peroxidase and biotin
This is a method of confirming the presence of a mouse IgG antibody or its fragment after reaction. The dot blotting method is a method of detecting cardiomyocyte proliferation-related proteins within or outside the cells.
Extracts of extraneously expressed microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues are nitrose
The antibody of the present invention was reacted with the membrane, and the antibody was further reacted with FIT.
Anti-mouse antibodies labeled with fluorescent substances such as C, or enzymes such as peroxidase and biotin.
This is a method of confirming the presence of cardiomyocyte proliferation-related proteins after reacting them with IgG antibodies or binding fragments. Immunoprecipitation is a method of detecting cardiomyocyte proliferation-related proteins expressed intracellularly or extracellularly.
Extracts of microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues are reacted with the antibodies of the present invention.
After that, a material having specific binding ability to immunoglobulin, such as protein G-Sepharose, is used.
This method involves adding a carrier that specifically recognizes cardiomyocyte proliferation-related proteins to precipitate the antigen-antibody complex. The sandwich ELISA method uses a carrier that specifically recognizes cardiomyocyte proliferation-related proteins to precipitate the antigen-antibody complex.
Of the two types of antibodies with different antigen recognition sites, one antibody is pre-primed.
The other antibody is adsorbed onto a plate, and the other antibody is adsorbed onto a fluorescent substance such as FITC or peroxidase.
The protein of the present invention is labeled with an enzyme such as ATP or biotin, and then applied to an antibody adsorption plate.
Microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues expressing the
After reacting with the tissue extract, the labeled antibody is reacted and the bound labeled substance
This is a method for detecting myocardial proliferation-related proteins. 9. Diagnosis of heart disease using antibodies that specifically recognize myocardial proliferation-related proteins Expression levels of myocardial proliferation-related proteins in human biological samples and human primary cultured cells
Identifying changes in the expression of proteins and structural changes in proteins will be important for preventing heart disease in the future.
It is useful for understanding the risk of developing heart disease and the causes of existing heart disease. A diagnostic method for detecting the expression levels and structural changes of cardiomyocyte proliferation-related proteins is
The above-mentioned fluorescent antibody method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioactive substance-labeled immunosorbent assay,
Immunohistochemical staining such as immunoassay (RIA), immunohistochemical staining, and immunocytochemical staining
methods (ABC method, CSA method, etc.), Western blotting, dot blotting
Examples of methods for diagnosis using the above methods include immunoprecipitation, immunoprecipitation, and sandwich ELISA. Samples used for diagnosis using the above methods include samples from cardiac lesions obtained from patients.
Biological samples such as tissue, blood, serum, urine, feces, saliva, etc., or the biological samples themselves
Cells and cell extracts obtained from biological samples are used.
The tissues were isolated as paraffin or cryostat sections.
10. Cardiomyocyte proliferation-associated protein, DNA encoding said protein, or said protein
Screening for cardiac disease therapeutic drugs using antibodies that recognize the DNA The DNA used in this screening method is, for example,
1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27
, 30, 32, 33, 35 and 37.
Examples of proteins include those represented by SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, and 31.
a protein having an amino acid sequence selected from the amino acid sequences of
The amino acids represented by numbers 22, 24, 26 and 28 are one or several amino acids.
It consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and is known to cause myocardial necrosis.
Examples of antibodies include proteins that have activity involved in repairing heart disease.
Examples include antibodies that recognize proteins. The DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene of the present invention is introduced to generate the cardiomyocyte proliferation-related protein of the present invention.
It produces polypeptides that constitute part of related proteins or cardiomyocyte growth-associated proteins.
Microorganisms, animal cells, or insect cells transformed to produce the
Cardiomyocyte proliferation-associated proteins or cardiomyocyte proliferation-associated polypeptides are involved in cardiomyocyte proliferation.
This method is useful for screening for drugs that act specifically on cardiomyocyte proliferation-associated proteins. Drugs obtained by screening are useful for treating heart diseases. One of the screening methods is to use a cardiomyocyte proliferation-associated protein or
are transformed to produce a polypeptide that constitutes part of the cardiomyocyte growth-associated protein.
Transformed microorganisms, animal cells, or insect cells (hereafter referred to as research transformants)
The aim is to select target compounds that specifically bind to the target.
By comparing the binding state with living organisms, animal cells, or insect cells as a control,
It is possible to detect target compounds specific to the transformant under investigation.
Inhibiting the binding of binding compounds or proteins to the target transformant
Target compounds can be competitively screened using this as an index. The purified cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention or one of the cardiomyocyte proliferation-associated proteins
The polypeptide constituting the portion specifically binds to a target associated with cardiomyocyte proliferation.
The present invention can be used to select compounds.
The above immunological method is carried out using an antibody that specifically recognizes the cardiomyocyte proliferation-associated protein.
Furthermore, the cardiomyocyte proliferation-associated protein or cardiomyocyte proliferation
A target compound that binds to the protein or the cardiomyocyte proliferation-associated polypeptide
Target compounds were screened in a competitive screen using the inhibition of binding to the polypeptide as an index.
Another screening method for the above is to detect one of the cardiomyocyte proliferation-related proteins.
The peptides that make up the nucleotide sequence are then attached to plastic pins or some other solid support.
Compounds or proteins that selectively bind to the peptides can be efficiently synthesized at high density.
There is a screening method for cardiac cell proliferation (WO84/03564). In cardiac cell lines, mRNA of cardiomyocyte proliferation-related genes or cardiomyocyte proliferation-related genes are detected.
Drugs that promote or suppress the expression of growth-related proteins are also being used to treat heart disease.
Various test compounds were added to a cardiac cell line, and the cardiomyocyte proliferation-related genes of the present invention were detected.
Using gene DNA, the increase or decrease in mRNA expression of cardiomyocyte proliferation-related genes was measured.
By doing so, the transcription or translation of cardiomyocyte proliferation-related genes is suppressed or promoted.
The quality of the cardiomyocyte proliferation-related gene mRNA can be screened.
The increase or decrease in the expression level was measured by PCR, Northern blot analysis, and RNAse protection assay.
Various test compounds are added to a cardiac cell line, and the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention is detected.
Using antibodies that specifically recognize white matter, we investigated the increase or decrease in the expression of cardiomyocyte proliferation-related proteins.
By measuring the transcription or translation of cardiomyocyte proliferation-related genes,
It is possible to screen for substances that increase the expression of cardiomyocyte proliferation-related proteins.
The reduction is achieved by the above-mentioned fluorescent antibody method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and radioactive labeling.
Immunohistochemical staining such as immunoassay (RIA), immunohistochemical staining, and immunocytochemical staining
Colorimetric methods (ABC method, CSA method, etc.), Western blotting, dot blot
The compounds obtained by the above methods can be detected in cardiac disease models such as myocardial infarction model rats.
It is administered as a drug to animals, and the cardiac action potential and heart rate of the animals are measured.
By doing so, it is possible to evaluate the therapeutic effect of the compound on heart disease.
11. Drug delivery specifically to the heart using antibodies that specifically recognize myocardial proliferation-related proteins
Method for transporting (drug delivery method) The antibody used in the drug delivery method is a cardiomyocyte proliferation-related antibody of the present invention.
Any antibody that specifically recognizes a protein may be used, but a humanized antibody is particularly preferred.
It is desirable that the humanized antibody is a human chimeric antibody, a human CDR (Complement
Complementarity Determining Region; hereinafter, C
Examples include human chimeric antibodies, which are derived from the heavy chain variable region of an antibody from an animal other than a human.
The variable region is also called HV or VH as a V region) and the antibody light chain variable
The light chain is also referred to as the L chain and as the heavy chain constant region of a human antibody (hereinafter referred to as LV or VL).
region (hereinafter, the constant region is also referred to as C region, or CH) and the light chain constant region of a human antibody
The term "antibody" refers to an antibody consisting of a region (hereinafter also referred to as CL).
Monoclonal antibody-producing hybrids such as mice, rats, hamsters, and rabbits are used.
Any antibody can be used as long as it is possible to produce a chimeric antibody. The human chimeric antibody of the present invention binds to a cardiomyocyte proliferation-associated protein and binds to the protein of the present invention.
A hybridoma producing a monoclonal antibody that neutralizes the action of VH
and VL, and human antibody CH and human antibody CL were generated.
The humanized protein is then inserted into an expression vector for host cells carrying a gene encoding the protein.
An antibody expression vector is constructed and introduced into host cells to express and produce the antibody.
The CH of a human chimeric antibody can be human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg).
Any antibody belonging to the class (described below) may be used, but those of the hIgG class are preferred.
Furthermore, hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG belong to the hIgG class.
Any of the subclasses, such as G4, can be used.
The CL of the body may be any one that belongs to the hIg class, such as κ class or
Those of the λ class can be used. Human CDR-grafted antibodies are antibodies in which the CDRs of the VH and VL of a non-human animal antibody are grafted.
It refers to an antibody in which an amino acid sequence has been transplanted into appropriate positions in the VH and VL of a human antibody.
The human CDR-grafted antibody of the present invention reacts with the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention.
, which binds to the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention,
Any CDR sequence of VH and VL of a non-human animal antibody that neutralizes the activity of
The V region encoding the VH and VL CDR sequences of the human antibody
cDNAs encoding the CH and CL genes of human antibodies were constructed.
and expressing a human CDR-grafted antibody by inserting the vector into a host cell expression vector having the compound
It can be produced by constructing a vector, introducing it into a host cell, and expressing it.
Any CH of a human CDR-grafted antibody can be used as long as it belongs to the hIg group.
However, those of the hIgG class are preferred, and hIg belonging to the hIgG class is also preferred.
Any of the subclasses, such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG4, can be used.
In addition, the CL of a human CDR-grafted antibody can be a human CDR-grafted antibody belonging to the hIg group.
Any type may be used, and those of the κ class or λ class may be used.
Human antibodies originally meant antibodies that exist naturally in the human body, but in recent
Human antibodies produced through advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering.
Antibodies obtained from phage libraries and human antibody-producing transgenic animals
This also includes antibodies present in the human body. Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by the following methods:
Human peripheral blood lymphocytes are isolated, infected with EB virus or other viruses to immortalize them, and then cloned.
The resulting lymphocytes that produce the desired antibody are cultured, and the culture
The antibody can be obtained from the phage library. The human antibody phage library is a library of antibodies prepared from human B cells.
By inserting the fragment into the phage gene, antibody fragments such as Fab and single-chain antibodies can be expressed on the phage.
The library is expressed on the surface of the antibody.
Using the binding activity to the substrate as an indicator, antibody fragments with the desired antigen-binding activity are expressed.
The antibody fragments can be further purified by genetic engineering techniques.
By this method, it is possible to convert them into fully human antibodies. Human antibody-producing transgenic animals are animals in which human antibody genes have been incorporated into their cells.
Specifically, a human antibody gene is introduced into mouse ES cells, and the resulting
By transplanting ES cells into the early embryos of other mice and then allowing them to develop, human antibody production
Transgenic animals can be produced.
The method for producing human antibodies from mammals is generally performed in mammals other than humans.
Human antibody-producing hybridomas are obtained and cultured by the hybridoma production method described in the present application.
Examples of antibody fragments include Fab, Fab', and F(ab').₂, single-chain antibody, disulfide
peptides containing CDRs, etc.
Fab is a fragment obtained by treating IgG with the protease papain (
The N-terminal half of the H chain and the L chain are cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain.
An antibody fragment with a molecular weight of approximately 50,000, which is entirely bound by disulfide bonds and has antigen-binding activity.
The Fab of the present invention is a fragment of a protein produced by binding an antibody that specifically reacts with the protein of the present invention to a protease.
The DNA encoding the Fab fragment of the antibody can be obtained by treating it with papain.
A is inserted into a host cell expression vector, and the vector is then introduced into a host cell, whereby the DNA
Fab can be obtained by expressing F(ab').₂is a fragment obtained by treating IgG with the protease pepsin
(cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), Fab is
The molecular weight of the molecule is about 100,000, which is slightly larger than that of the molecule linked via disulfide bonds.
The F(ab') of the present invention is an antibody fragment that has antigen-binding activity.₂The present invention provides a method for detecting a protein by using an antibody that specifically reacts with the protein of the present invention.
The antibody can be obtained by treating it with the decomposing enzyme pepsin.₂
After inserting the DNA encoding the above into an expression vector for a host cell, the vector is transformed into a host cell.
The DNA is then introduced into the IgG1 vector and expressed to produce F(ab')₂to get
Fab' can be obtained by the above F(ab')₂The disulfide bond in the hinge region of
It is an antibody fragment with a molecular weight of approximately 50,000 and antigen-binding activity. The Fab' of the present invention is an antibody that specifically reacts with the protein of the present invention, which is produced by treating the antibody with a reducing agent, dithiothiazolinone.
The antibody can be obtained by treating it with threitol.
The DNA is inserted into an expression vector for a host cell, and then the vector is introduced into the host cell.
Fab' can be obtained by expressing this DNA. Single-chain antibodies (hereinafter also referred to as scFv) are made by appropriately combining one VH and one VL.
VH-P-VL linked using a suitable peptide linker (hereinafter referred to as P)
The symbol indicates a VL-P-VH polypeptide.
The VH and VL are used to generate antibodies that specifically react with the protein of the present invention, for example, humanized antibodies.
Single-chain antibodies of the present invention can be obtained by the following method: cDNA encoding the VH and VL of an antibody that specifically reacts with the protein of the present invention.
After obtaining A, DNA encoding the single-chain antibody is constructed.
After insertion into a vector, the expression vector is introduced into a host cell to express the DNA.
By this method, a single-chain antibody can be obtained. Disulfide-stabilized V region fragments (hereinafter also referred to as dsFv) consist of VH and V
A polypeptide in which each amino acid residue in L is substituted with a cysteine residue is called a cysteine polypeptide.
Cysteine refers to a compound bound via a disulfide bond between cysteine residues.
The amino acid residues to be substituted for the residues were determined according to the method shown by Reiter et al. [Protein
In Engineering,7, 697 (1994)],
The VH and VL contained in the dsFv used in the present invention are specific to the protein of the present invention.
Use of heterologous antibodies, e.g., humanized or derived from human antibodies.
The disulfide-stabilized V domain fragment (dsFv) of the present invention can be obtained by the following method.
cDNA encoding the VH and VL of an antibody that specifically reacts with the protein of the present invention can be obtained.
After obtaining A, DNA encoding dsFv is constructed.
After insertion into an expression vector, the expression vector is introduced into a host cell to express the DNA.
By doing so, dsFv can be obtained. Peptides containing CDRs can be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method and the tBoc method.
The fusion antibody described below, prepared using the antibody of the present invention, can be specifically targeted to cardiac lesions.
The fusion antibody can be used for drug delivery, carrying drugs or proteins to cells. Fusion antibodies are antibodies that specifically react with the proteins of the present invention, such as humanized antibodies,
Human antibodies and their antibody fragments are treated with radioisotopes, proteins, low molecular weight compounds, etc.
An antibody to which a drug or other substance has been chemically or genetically bound. The fusion antibody of the present invention is an antibody or antibody fragment that specifically reacts with the protein of the present invention.
the N-terminal or C-terminal side of the H chain or L chain of the antibody, or an appropriate position in the antibody or antibody fragment.
Radioisotopes, protein
The binding of proteins, low molecular weight compounds, and other drugs chemically or genetically
It can be produced by the following: Radioactive isotopes include:¹³¹I,¹²⁵I, etc., for example, Chlorella
They can be bound to antibodies or antibody fragments using the MinT method, etc. Low molecular weight compounds include nitrogen mustard, cyclophosphamide,
alkylating agents such as benzodiazepine, 5-fluorouracil, methotrexate, and other antimetabolites
Antibiotics, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin,
Antibiotics such as doxorubicin, vincristine, vinblastine, and vindesine
plant alkaloids, hormonal agents such as tamoxifen and dexamethasone
Anticancer drugs such as [Clinical Oncology (Japanese Society of Clinical Oncology, 1996, Cancer and Chemotherapy Co., Ltd.]
) or steroids such as hydrocortisone, prednisone, or aspirin
nonsteroidal drugs such as indomethacin, gold thiomalate, penicillamine, etc.
immunomodulators, immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine,
Anti-inflammatory drugs such as antihistamines like chlorpheniramine leate and clemacitin
Examples include drugs [Inflammation and Anti-inflammatory Therapy, 1982, Ishiyaku Publishing Co., Ltd.]. Low-molecular-weight drugs can be bound to the above antibodies using standard methods.
The method of binding unonomycin to antibody is via glutaraldehyde.
A method for binding daunomycin to the amino group of an antibody using a water-soluble carbodiimide
The amino group of daunomycin is linked to the carboxyl group of the antibody via a
Examples of proteins include cytokines that activate immune cells, vascular endothelium, and vascular endothelial cells.
Growth regulators of smooth muscle and the like are preferred, for example, human interleukin 2, human condylar
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, human macrophage colony-stimulating factor
Human interleukin 12, fibroblast growth factor-2 (FGF-2), blood
Examples include platelet-derived growth factor (PDGF). Antibodies fused with proteins can be obtained by the following method: A cDNA encoding a protein is linked to a cDNA encoding an antibody or antibody fragment.
The DNA encoding the fusion antibody is then constructed by ligating the DNA to a prokaryote or
After inserting the vector into an expression vector for eukaryotes, the expression vector is transformed into a prokaryotic or eukaryotic
The DNA is introduced into a host cell such as a mammalian cell, and the DNA is expressed to obtain a fusion antibody.
12. Gene Therapy Agents Containing DNA of Cardiomyocyte Proliferation-Associated Genes A viral vector containing DNA of the cardiomyocyte proliferation-associated gene of the present invention can be used to treat
The gene therapy agent was prepared using the recombinant virus vector prepared in Section 4.
It can be produced by mixing the above bases [Nature Genet
．8, 42 (1994)]. As a base for gene therapy agents, any base normally used for injections can be used.
It may be any of the following: distilled water, sodium chloride, or a mixture of sodium chloride and an inorganic salt.
salt solutions such as mannitol, lactose, dextran, glucose, etc.
solution, amino acid solution such as glycine, arginine, etc., organic acid solution or salt solution and glucose
In addition, in accordance with the usual method, these bases may be mixed with osmotic
pH adjuster, vegetable oil such as sesame oil or soybean oil, or lecithin or non-ionic surfactants
It is injected as a solution, suspension, or dispersion using auxiliary agents such as surfactants, etc.
These injections may be prepared for use by powdering, freeze-drying, etc.
The gene therapy agent of the present invention can also be prepared as a preparation for dissolution at the time of administration.
In the case of an individual, the gene therapy agent is placed in the above-mentioned base, which has been sterilized as necessary.
The agent for gene therapy of the present invention can be dissolved and used immediately before the treatment.
The method is to administer it locally so that it can be absorbed into the heart through the patient's coronary artery.
Gene transfer using viral vectors and direct delivery using liposomes are some of the methods.
In vivo (in vivo) Combined with gene transfer, heart disease
A viral vector can be directed to the foci. The DNA of the cardiomyocyte proliferation-related gene of the present invention of an appropriate size can be introduced into the adenovirus.
In combination with a polylysine-conjugated antibody specific to the hexon protein
A complex is prepared, and the resulting complex is ligated to an adenovirus vector.
By combining the above-mentioned vectors, a viral vector can be prepared.
The vector stably reaches the target cell, is taken up into the cell by endosomes, and is then transported to the cell membrane.
It is degraded within the cells, allowing efficient gene expression. Cardiomyocyte proliferation-related gene DNA can also be introduced into the lesion using non-viral gene transfer methods.
Non-viral gene transfer methods known in the art include calcium phosphate co-precipitation [V
irology,52, 456-467 (1973); Science,209 , 1414-1422 (1980)], microinjection method [Proc
．． Natl. Acad. Sci. USA,77, 5399-5403 (1980
); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 7380-738
4 (1980); Cell,27, 223-231 (1981); Nature
,294, 92-94 (1981)], liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413-7417
(1987);Biochemistry,28, 9508-9514 (198
9);J. Biol. Chem. ，264, 12126-12129 (1989
);Hum. Gene Ther. ，3, 267-275, (1992); Sc
ience,249, 1285-1288 (1990); Circulation
n,83, 2007-2011 (1992)] or direct DNA uptake and
and receptor-mediated DNA transfer [Science,247, 1465-1468 (
1990); J. Biol. Chem. ，266, 14338-14342 (1
991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 3655-
3659 (1991); J. Biol. Chem. ，264, 16985-16
987 (1989); BioTechniques,11, 474-485 (1
991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 3410-
3414 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 , 4255-4259 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci.
USA,87, 4033-4037 (1990); Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA,88, 8850-8854 (1991); Hum. Gen
e Ther.,3, 147-154 (1991)]. In the liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer method, liposome preparations are used to target cells.
By administering the gene directly to the tissue, local uptake and expression of the gene in the tissue can be achieved.
It has been reported in tumor studies that this is possible [Hum. Gen.
e Ther.,3, 399-410 (1992)]. Therefore, a similar effect
It is also expected to be used in cardiac lesions. To directly target DNA to cardiac lesions,
Uptake techniques are preferred. Receptor-mediated DNA transfer, e.g., via polylysine
The protein ligand is then coupled to DNA (usually a covalently closed supercoiled polymer).
This is done by conjugating a target ligand (in the form of a sulphide).
Selection based on the presence of the corresponding ligand receptor on the cell surface of the target cell or tissue.
As a combination of receptor and ligand, for example, endothelin (ET)-
The combination of the ET-1 receptor with ET-1 is also included.
Gates can be injected directly into the blood vessels if desired, and receptor binding and DNA
The A-protein complex can be directed to target tissues where internalization occurs.
To prevent intracellular destruction, adenovirus is co-infected to disrupt the endosomal machinery.
It can also disrupt the function of the cardiomyocyte proliferation-associated protein. 13. Cardiac Disease Therapeutic Drug Containing Cardiomyocyte Proliferation-Associated Protein The cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention is effective in treating various cardiac diseases caused by myocardial necrosis.
and can be used to reconstruct the structure and function of the heart. The therapeutic drug for cardiac disease containing the cardiomyocyte proliferation-associated protein of the present invention contains as an active ingredient
Although it may contain only the protein, it is usually a pharmacologically acceptable one.
and the like, and the mixture is mixed with one or more carriers, and the mixture is then ...
It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation manufactured by any method. The most effective route of administration for treatment is preferably used, and oral administration is recommended.
or parenterally, including oral, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular, and intravenous administration
In the case of protein formulations, intravenous administration is preferable.
Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions,
Examples include suppositories, injections, ointments, and tapes. Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, and powders.
For example, liquid preparations such as emulsions and syrups are
, water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, polyethylene glycol, propylene glycol
glycols such as ethylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-
Preservatives such as hydroxybenzoates, strawberry flavor, peppermint
It can be produced using flavors such as cinnamon and other flavorings as additives.
Powders and granules contain excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol, and starch.
disintegrants such as cellulose, sodium alginate, magnesium stearate, talc, etc.
Lubricants, polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, etc.
Additives include binders, surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as glycerin.
Preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays, etc.
The propellant is a carrier consisting of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
Alternatively, the protein of the present invention may be freeze-dried in a conventional manner, and sodium chloride may be added to the freeze-dried protein.
Powdered injections can also be prepared by adding thorium.
The spray is prepared using a carrier such as corn fat, hydrogenated fat, or carboxylic acid. The spray may contain the protein of the present invention itself or a spray containing the protein of the present invention in the recipient's oral cavity and airway mucosa.
It does not stimulate the membrane and disperses the protein of the present invention as fine particles, making it easy to absorb.
The protein of the present invention is prepared using a carrier or the like that allows the protein to be easily absorbed. Specific examples of carriers include lactose and glycerin.
Depending on the properties of the carrier used, aerosols, dry powders, etc. can be prepared.
In addition, these parenteral preparations may also contain the ingredients listed as additives for oral preparations.
The dosage or frequency of administration can be determined based on the type of target disease, administration method, treatment period, age, and body weight.
The dose varies depending on the patient's condition, but is typically 10 μg/kg to 8 mg/kg per day for adults. 14. Heart Disease Therapeutic Drug Containing an Antibody That Specifically Recognizes Cardiomyocyte Proliferation-Associated Protein The antibody of the present invention that specifically recognizes cardiomyocyte proliferation-associated protein can be used to treat heart disease, etc.
Therapeutic agents containing antibodies that specifically recognize the cardiomyocyte proliferation-associated proteins of the present invention can be directly used in therapeutic treatment.
Although the antibody may contain only the antibody as an active ingredient, it is usually pharmacologically acceptable.
and mixing with one or more carriers acceptable in the art of pharmaceutical formulation.
Preferably, the compound is provided as a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the art.
The preparation and administration of the therapeutic agent are carried out by using the therapeutic agent containing the 13 cardiomyocyte proliferation-associated proteins.
The present invention can be specifically illustrated by the following examples.Best Mode for Carrying Out the InventionExample 1: Preparation of a 16-day fetal rat heart cDNA library Fetal hearts were isolated from 16-day pregnant Wistar rats (Japan SLC).
Guanidine ocyanate-cesium trifluoroacetate method
Enzymology,154Total RNA was prepared according to the method described in [J. Chem. Soc., 3 (1987)].
This total RNA was purified by oligo dT cellulose column (Collaborative
By passing the mixture through a filter (manufactured by Research Institute, Inc.), poly(A) + RNA was obtained.
After obtaining RNA, the DNA was synthesized using the ZAP-cDNA synthesis kit (ZAP-_CDNA Syn
The total number of independent plaques was 1.0 using the CT Thesis Kit (Stratagene).
x10⁶A cDNA library was constructed.
The details of the procedure were as described in the kit manual.
The vector λZAPII (Stratagene) was used as a vector.
The 5' end of the cDNA is located on the EcoRI site side between the XhoI/EcoRI sites.
The insertion is performed so that the cDNA fragments are inserted as follows. Example 2: Preparation of a Differential Library (1) Preparation of Single-Stranded DNA The 16-day-old embryonic rat heart cDNA library (λ phage) prepared in Example 1 was used.
The cells were incubated with helper phage ExAssist (Stratagene).
to the host cell,Escerichia coli XL1-Blue MRF'(
Stratagene) and then in vivo excision (in vivo By performing excision, phages containing cDNA are isolated from the vector.
The pBluescript SK(-) portion was used as a single-stranded DNA phage.
The cells were excised and released into the culture supernatant.
The culture supernatant (titer: 1.8 × 10⁵
cfu/μl) was added to host cells that ExAssist does not infect.E
scherichia coliSORL (Stratagene) 1.8 x 10
¹⁰Contains 10 mM MgSO₄After adding 7 ml and incubating at 37°C for 15 minutes
The total volume was adjusted to 20 ml of 2xYT medium (1.6% bactotryptone, 1% yeast extract).
The mixture was added to 100 ml of water and incubated at 37°C for 45 minutes with shaking.
The cells were infected with phages. Ampicillin was added to the cells to a concentration of 50 μg/ml.
The mixture was then shaken at 37°C for an additional hour to grow only the phage-infected E. coli.
The number of cells was measured by absorbance at 600 nm, and it was 8.0 × 10¹⁰It was
Then, helper phage R408 (Stratagene) was used at a multiplicity of infection (moi) of
10 (7.7 x 10¹¹pfu) and cultured at 37°C for 7 hours with shaking.
The single-stranded DNA was released into the supernatant. The culture medium was transferred to a sterile tube and incubated at 4°C for 100 min.
The mixture was centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, and the supernatant containing the phage was transferred to a new sterile tube.
The supernatant was centrifuged again under the same conditions and then transferred to a 0.22 mm pore size tube.
The mixture was passed through a 1000 ml sterilization filter (Millipore) to completely remove the bacterial cells.
solution [100mM Tris-HCl (pH 7.5), 100mM MgCl₂］
20 ml, add 140 units of deoxyribonuclease I (Nippon Gene Co., Ltd.)
The mixture was incubated at 37°C for 30 minutes.
Add 2.5M NaCl (molecular weight 6000) and mix well.
After leaving it to stand for 1 minute, it was centrifuged at 10,000 rpm at 4°C for 10 minutes to precipitate the phages.
The supernatant was completely removed, and the resulting phage precipitate was added to 400 μl of TE buffer [
10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA (pH 8.0)
], 4 μl of 10% SDS, 625 μg of proteinase K (25 μl
) was added and reacted at 42°C for 1 hour.
After extraction with methylform and chloroform, the aqueous layer was precipitated with ethanol.
Single-stranded DNA of the rat heart cDNA library (vector pBluescript
75.0 μg of tSK(-) was obtained. (2) Biotinylation of RNA Poly(A)+ RNA was extracted from the hearts of 8-week-old rats using the same method as in Example 1.
10 μg of this RNA was added to a test tube and distilled water to make 20 μl.
1 μg/μl of PHOTOPROBE biotin (Vector La
The test tube was opened and placed on ice.
The plates were then placed in a container and irradiated with a mercury lamp from a height of approximately 10 cm for 20 minutes to biotinylate them. The reaction mixture was diluted with 50 μl of 100 mM Tris·HCl (pH 9.5) and 1 mM
A solution of EDTA (pH 8.0) was added to the solution, to which 100 μl of water-saturated butanol was added.
After centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes at 4°C, the upper layer
The butanol layer was removed. This procedure was repeated two more times. 100 μl of
Chloroform was added, the mixture was stirred vigorously, and the mixture was centrifuged at 14,000 rpm at 4°C for 5 minutes.
After separation, the aqueous layer was transferred to a new test tube.
The recovered RNA precipitate was dissolved in 20 μl of distilled water and
The biotinylated RNA was then subjected to hybridization and repeated.
The DNA was then ethanol precipitated and stored at -80°C. (3) Subtraction Single-stranded DNA from the 16-day-old rat heart cDNA library prepared in (1)
0.5 μg (1 μl) was added to 2× reaction buffer [80% formamide, 100 mM
HEPES (pH 7.5), 2mM EDTA (pH 8.0), 0.2% SD
S] 12.5 μl, 2.5 μl of 2.5 M NaCl and poly(A) (Amasi
0.5 μg (1 μl) of PEG-100 (manufactured by Pharmacia Biotech) was added, and
Dissolve the biotinylated RNA (10 μg of RNA) prepared in (2) in 5 μl of distilled water.
The mixture was heated at 65°C for 10 minutes, and then kept at 42°C for two nights.
Hybridization was then carried out. After the hybridization reaction, a buffer solution [500 mM NaCl, 50 mM
M HEPES (pH 7.5), 2mM EDTA (pH 8.0)] 400 μl
10 μg (
5 μl) was added and reacted at room temperature for 5 minutes.
The streptavidin-biotinylated RNA-hybridized cDNA was then
The complex was removed from the aqueous layer. 10 μg of streptavidin was added to the aqueous layer again.
The mixture was added to the flask and reacted at room temperature for 5 minutes. After extraction with phenol-chloroform twice,
The aqueous layer was filtered through a unit filter, and the extract was collected.
- Pass through C3 Plus TK (Millipore) and adsorb and wash the cDNA onto the filter
After that, 1/10TE [1mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1mM E
The cDNA was concentrated and desalted by collecting it in 30 μl of PBS (pH 8.0).
The procedure using this filter was performed according to the Millipore manual. (4) Synthesis of double-stranded DNA and introduction into E. coli Of the 30 μl of single-stranded DNA obtained by subtraction as described above, 15 μl was
14 μl of distilled water, 2 μg/μl of a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 42
1 μl of primer for mer extension was added, and the mixture was heated at 65° C. for 10 minutes.
After annealing the primer to the single-stranded DNA, 10x reaction buffer (
Included in the BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit
(manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 5 μl, 10 μl of 1mM dNTP mixture, 1 bottle of 3 μg/μl
Strand DNA binding protein (USB) 0.5 μl, 2 units/μl BcaBE
ST DNA polymerase (Takara Shuzo) 2 μl, distilled water 2.5 μl
The reaction was carried out at 65°C for 1 hour to synthesize double-stranded DNA.
μl of distilled water was added, and the mixture was treated with phenol and chloroform, and then with chloroform.
As in (3), the unit filter Ultra Free C3 Plus TK was used.
The solution was concentrated, and finally, the double-stranded DNA was dissolved in 20 μl of TE.
1/5 of the total volume was used to electroporate E. coli XL1-Blue MRF'.
The double-stranded DNA was introduced into a cDNA library (differential cDNA library)
An array (LB-A) was prepared using the differential cDNA library prepared in Example 2 (4). Example 3: Differential Hybridization (1) Preparation of Array Filter The differential cDNA library prepared in Example 2 (4) was used to prepare LB-A.
Colonies were formed on the LB-A agar medium, and 9600 of these colonies were cultured on the LB-A agar medium.
The colonies were inoculated into 103 96-well plates containing 100 μl of the medium, with one colony per well.
Each colony was cultured in a 96-well plate at 37°C and then diluted with 50% glycerol
75 μl of the stock culture was added and stored at −80° C. (This stock culture was stocked with glycerol stock.)
(This is called a "batch"). 100 μl of LB-Ap medium was dispensed into a 96-well plate, and the glycerol
The cells were inoculated using a 96-pin replicator from the stock and incubated overnight at 37°C.
The following reaction mixture was poured into a 96-well PCR plate in advance using an automatic dispenser Hyd.
Using the RA96, 20 μl of the overnight culture solution containing E. coli was dispensed.
The PCR reaction solution consisted of 2 μL of 10× reaction buffer (included in ExTaq).
1 μl, 2.5 mM dNTP 2 μl, 10 μM T3 HT primer (sequence
No. 39) 1 μl, 10 μM T7 primer (SEQ ID NO: 40) 1 μl, distilled
Water 13.8 μl, Taq DNA polymerase ExTaq (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.2
The reaction was carried out using a PCR device at 94°C for 5 minutes.
, 94°C for 1 minute (denaturation) / 64°C for 1 minute (annealing) / 72°C for 1 minute (extension reaction)
) was repeated 30 times and stored at 4°C.
The primer, T7 primer, is inserted into the cDNA of the vector so that the cDNA portion can be amplified.
It is designed based on the specific sequences on both sides of the NA insertion site. 0.5 μl of this reaction mixture was placed in NYLON TRANSFER MEMBRANE.
E Hybond N⁺(Amersham Pharmacia Biotech) 9
The cells were spotted in the same grid pattern (8 vertical x 12 horizontal) as the 6-well plate.
The plate was arranged in a grid (1 vertical line) with 384 colonies, equivalent to four 96-well plates.
The PCR reaction mixture from one colony was spotted on a 24×6 matrix.
Spot the same spot on each membrane, so that two identical membranes are used.
The membrane on which the reaction solution was spotted was air-dried at room temperature, and then denaturing solution (0
Place the sample on a filter paper soaked in 1.5M NaOH and 1.5M NaCl at room temperature.
The mixture was left for 10 minutes to denature the DNA, and then neutralized with a neutralizing solution (1.0 M Tris-HCl
Transfer the membrane onto a filter paper soaked in 1.5M NaCl (pH 7.5).
The mixture was then left at room temperature for 10 minutes.
x SSC (0.3 M sodium chloride, 30 mM sodium citrate)
The array filter was washed. (2) Probe Labeling The 16-day-old embryonic rat hearts and 8-day-old embryonic rat hearts prepared in Examples 1 and 2(2) were used.
Label IT Digoxin N from poly(A) RNA of 1-week-old rat hearts
ucleic Acid Labeling Kit (hereinafter referred to as “Label IT”)
The digoxigenin (DIG) target was detected using a digoxigenin (DIG) targeting kit (Mirus).
Identification probes were prepared according to the instructions in the kit manual. (3) Hybridization Methods and experiments for hybridization and detection of hybridized spots
All drugs were administered in accordance with the Roche DIG system user's guide. The membrane prepared in (1) was placed in a hybribag and heated to 50°C.
Hybridization buffer [5xSSC, 0.1% N-lauroyl sarcosine,
0.02% SDS, 2% blocking reagent (Roche), 50% formamide
] 20 ml was added, and prehybridization was carried out at 50°C for 4 hours.
) and add 1/10 volume of Denaturation buffer (
The plate was then incubated at room temperature for 5 minutes.
After that, add 1/10 the volume of the probe of neutralization buffer.
The solution (attached to the Label IT kit; manufactured by Mirus) was added to the mixture to cause denaturation.
This is mixed with the hybridization buffer to form the prehybridization
The filter was then added to the membrane. It was then incubated at 50°C overnight to prevent the filter from moving inside the bag.
Hybridization was carried out while shaking gently (about 12 rpm).
In addition, since two membranes were prepared with the same DNA spotted in (1),
One is a probe from a 16-day-old rat heart, and the other is a probe from an 8-week-old rat heart.
The probe was hybridized with the probe. (4) Spot detection The membrane was removed from the hybribag and incubated for 6 h with 2x SSC-0.1% SDS.
After washing for 10 minutes at 8°C, the washing solution was renewed and the plate was washed again under the same conditions.
The procedure of washing with 0.1×SSC-0.1% SDS at 68° C. for 15 minutes was repeated twice.
Then, alkaline phosphatase-conjugated anti-DIG antibody and chemiluminescent substrate were added.
The samples were treated with a DIG luminescence detection kit (manufactured by Roche) consisting of CSPD, and then exposed to X-ray film.
Hyperfilm ECL (Amersham Pharmacia Biotech) was used for imaging.
The exposure time was 16-day embryonic rat heart probe, 8-week-old rat heart probe, and 16-day embryonic rat heart probe.
Hybridized with rat heart probe, the background was similar.
The concentration was adjusted to a value of 1.5.
Clones that hybridized strongly with the probe from day 6 rat hearts and embryonic day 1
Compared with the probes of 6-day-old rat hearts, the probes of 8-week-old rat hearts showed a strong halo effect.
A total of 316 hybridized clones were selected.
The clones were identified, and each clone was subjected to the glycerol treatment prepared in Example 3(1).
Plasmid DNA was prepared by culturing the whole stock. Example 4: Analysis of Each Clones (1) Determination of Nucleotide Sequence Three clones selected by differential hybridization in Example 3 were analyzed.
The cDNA sequences of the 16 clones were analyzed using a DNA sequencer.
The base sequence was analyzed using the analysis program BlastN.
The databases GenBank, EMBL, and GeneSeq (Derwent)
The homology to the sequences in the adult heart was examined.
slow-fiber, a gene known to be highly expressed in the fetal heart compared to the liver
r troponin I, non-muscle myosin alkal
i light chain, vimentin, elongation 1α
The gene encoding the gene was then identified by Northern hybridization (see (2)).
The expression level was higher in the hearts of embryonic day 16 rats compared to the hearts of week-old rats.
The genes identified as α- and β-glucan-containing genes were compared with the hearts of 16-day-old rats and 8-week-old rats.
For genes whose expression levels are elevated in the rat heart, the entire cDNA sequence
The sequence of the cDNA was determined, and the address of the protein encoded by the gene was determined from the base sequence of the obtained cDNA.
The amino acid sequence was estimated. Furthermore, this amino acid sequence was also analyzed using the analysis program
Blast was used to search the amino acid sequence databases SwissProt, PIR,
Check for homology to sequences in GenPept, TREMBL, and GeneSeq
(2) Expression analysis by Northern hybridization From the 316 clones selected in (1), interesting clones were identified, primarily those with novel base sequences.
The clones with the highest expression levels were selected, and the expression levels of each gene were measured in the 16-day embryonic heart and the 8-week-old heart.
Northern hybridization was performed to compare expression levels. (2)-1 RNA transfer to membrane RNA was transferred to membranes from the hearts of 16-day-old embryonic rats or 8-week-old rats in the same manner as in Example 1.
Distilled water was added to 12 μg of total RNA obtained by the method to make a total volume of 3.5 μl.
10x MOPS buffer [80 mM sodium acetate, 197 mM
OPS, 10 mM EDTA (pH 8.0)] 1.5 μl, 35% formaldehyde
Add 2 μl of hydride solution (Nacalai Tesque) and 5 μl of deionized formamide.
After heating at 65°C for 5 minutes, the mixture was quickly cooled on ice and the total volume was diluted with 1x MOPS/200ml.
% formaldehyde/1% agarose gel.
Calibration using 20xSSC [3M NaCl, 0.3M sodium citrate]
The RNA in the gel was transferred to NYLON TRANSFER by the column transfer method.
ER MEMBRANE Hybond N⁺(Amersham Pharmacia
After the transfer, the DNA was transferred onto a crosslinker Optimal Link (
The RNA was fixed to the membrane by UV irradiation using a fluorescent probe (Funakoshi). (2)-2 Probe Labeling The plasmids for the selected clones wereApaI andPstCut with I and insert
The DNA fragment was excised and purified using QIAEX II Gel Extract.
The method used was the Action Kit (manufactured by QIAGEN) and was performed according to the manual attached to the kit.
The purified DNA fragment was used as a template and PCR was carried out according to the instructions in the manufacturer's manual.
The DNA fragment was labeled with ELISA (manufactured by Roche) and used as a probe.
The method was performed according to the manual provided with the kit. (2)-3 Hybridization and Autoradiography Methods and Tests for Hybridization and Detection of Hybridized Spots
All drugs were administered in accordance with the Roche DIG System User's Guide. The membrane prepared in (1) was placed in a hybribag and incubated in a high-S
DS hybridization buffer [5xSSC, 0.1% lauroyl sarcosine
7% SDS, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 50% phosphate
lumamide, 2% blocking reagent (Roche) was added.
The probe prepared in (2) was incubated and prehybridized.
After heating at 5°C for 5 minutes, the mixture was cooled and denatured.
The mixture was mixed with the solution and added to the membrane after prehybridization.
The membrane was incubated at ℃ overnight for hybridization.
The membrane was removed from the bag, washed with 2x SSC-0.1% SDS at 68°C for 10 minutes, and then
The washing solution was replaced with a new one and washed again under the same conditions.
The procedure of washing with 100% SDS at 68°C for 15 minutes was repeated twice.
DIG luminescence consisting of phosphatase-conjugated anti-DIG antibody and chemiluminescent substrate CSPD
The samples were treated with a detection kit (Roche) and then analyzed on X-ray film Hyperfilm ECL (
Amersham Pharmacia Biotech) was exposed to light and autoradiographed.
As a result, the expression level was higher in the hearts of 16-day-old rats compared to the hearts of 8-week-old rats.
16 clones [RHDH-009, RHDH-063, RHDH-068,
RHDH-098, RHDH-099, RHDH-231, RHDH-249,
RHDH-274, RHDH-286, RHDH-057, RHDH-185,
RHDH-226, RHDH-235, RHDH-239, RHDH-279,
RHDH-309] and 8-week-old rat hearts compared with embryonic day 16 rat hearts.
Three clones with high expression levels [RHDH-100, RHDH-140, RHDH
These clones are described below. (3) We have previously obtained a gene that expresses a protein with higher expression levels in the hearts of embryonic day 16 rats compared to the hearts of 8-week-old rats.
The base sequence of the gene RHDH-009 is rat insulin-like growth factor.
The sequence of IGF-II [Accession: X
13101] (SEQ ID NO: 1). The amino acid sequence encoded by this gene
The sequence is shown in SEQ ID NO: 2. IGF-II is known as a cell growth factor.
However, the physiological significance of this phenomenon is unclear.
The Northern blot analysis of the RHDH-063 gene (SEQ ID NO: 3) is shown in Figure 1, Panel 1. The nucleotide sequence of RHDH-063 (SEQ ID NO: 3) is a putative human secretory protein gene [
PCT application WO99/3126] showed a high homology of 76%.
The gene shown in SEQ ID NO: 3 was predicted to be an orthologue in rats.
The amino acid sequence encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
The protein does not show significant homology to other known proteins and has unknown function.
The Northern blot analysis of the 16-day-old rat heart and the 8-week-old rat heart
The base sequence of RHDH-068 is shown in panel 2 of Figure 1. The base sequence of RHDH-068 is rat melanocyte-specific.
Sequence of ic expression gene 1 (msg1) [Access
ion: AF104399] (SEQ ID NO: 5).
The amino acid sequence of the msg1 gene is shown in SEQ ID NO: 6. The msg1 gene is involved in cell pigmentation.
It is believed that there is a connection [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93, 12298-12303 (1996)], but its function in the heart is not fully understood.
Northern blot analysis of 16-day-old rat hearts and 8-week-old rat hearts
The base sequence of RHDH-098 is shown in panel 3 of Figure 1. The base sequence of RHDH-098 is the same as that of mouse c-abl [Access
ion: L10656] (SEQ ID NO: 7).
The encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8. The c-abl gene product is a tyrosine
The heart of a 16-day-old embryonic rat and an 8-week-old rat were
The Northern blot for RHDH-099 is shown in panel 4 of Figure 1. The nucleotide sequence of RHDH-099 is rat non-neuronal enol
The sequence of the nucleotide ...
The amino acid sequence encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 10.
The euronal enolase gene is a glycolytic enzyme, but is not expressed in the fetal heart.
The expression level in the systemic heart is unknown.
Northern blots of 1-week-old rat hearts are shown in Figure 1, panel 5. The nucleotide sequence of RHDH-231 is rat receptor-linked t
The sequence of erythrosine phosphatase (PTP-P1) [Access
This gene was found to be identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 11.
The amino acid sequence of this gene product is shown in SEQ ID NO: 12.
The enzyme activity was observed in the hearts of 16-day-old embryonic rats and 8-week-old rats.
The Northern blot is shown in panel 6 of Figure 1. The nucleotide sequence of RHDH-249 is identical to the sequence of rat TSC-22 [Accession No.
on: L25785] (SEQ ID NO: 13).
The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14. The rat TSC-22 gene encodes TGF-
It has been reported as a gene whose expression is induced by β [J. Biol. Chem.
m.,267, 10219 (1992)], but its function is unknown.
Northern blot analysis of the hearts of 16-day-old embryonic rats and 8-week-old rats was performed.
, shown in panel 7 of Figure 1. The nucleotide sequence of RHDH-274 is identical to the sequence of rat SH3p8 [Accession
n: AB008161] (SEQ ID NO: 15).
The amino acid sequence of SH3p8 is shown in SEQ ID NO: 16. The gene product of SH3p8 is Src h
Synaptojanin or synaptojanin has a SH3 domain.
has the activity of binding to dynamin I [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA,94, 8569-8574 (1997)]. Embryonic day 16 rat
Northern blots of the heart and 8-week-old rat hearts are shown in panel 8 of FIG. 1.
The base sequence of RHDH-286 (SEQ ID NO: 17) is shown in
c acid-response protein (MK) sequence [Access
sion: M3583] showed a high homology of 91%.
was predicted to be an orthologue in rats.
The amino acid sequence encoded by the sequence is shown in SEQ ID NO: 18. The MK gene product is
A gene product whose expression is induced early during differentiation of embryonal tumor cells by thiamine mononitrate
Known as [Biochem. Biophys. Res. Commun.
．151, 1312-1318 (1988)]. Embryonic day 16 rat heart and postnatal
Northern blots of the 8-week-old rat hearts are shown in Panel 9 of Figure 1. (4) New proteins with higher expression levels in the hearts of embryonic day 16 rats compared to the hearts of 8-week-old rats.
The base sequence of the gene RHDH-057 is shown in SEQ ID NO: 19.
There was no match with any known gene sequence, making it a novel base sequence.
e) Matched with the EST group included in Rn. 7790, but the base of RHDH-057
There was no sequence that completely overlapped with the amino acid sequence encoded by RHDH-057.
The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20. Embryonic day 16 rat heart and 8-week-old rat heart
The Northern blot analysis of RHDH-185 and the rhesus mammary gland is shown in panel 10 of Figure 1. The nucleotide sequence of RHDH-185 is shown in SEQ ID NO: 21. As a result of homology analysis,
There was no match with any known gene sequence, making it a novel base sequence.
e) Matched with the EST group included in Rn. 12591, but was a salt of RHDH-185.
There was no sequence that completely overlapped with the original sequence.
E. coli XL1-Blue MR harboring the plasmid pRHDH-185
The F'/pRHDH185 strain was developed under the Budapest conditions by the National Institute of Industrial Science and Technology.
Research Institute Patent Organism Deposit Center: 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan
Central 6 (formerly the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology: Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan)
1-3) on March 10, 2000 under the accession number FERM BP-7081.
The base sequence of RHDH-185 contains 109 amino acids.
An ORF consisting of the following was observed, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 22.
Northern blots of 16-day-old rat hearts and 8-week-old rat hearts were performed as follows:
The base sequence of RHDH-226 is shown in SEQ ID NO: 23.
There was no match with any known gene sequence, making it a novel base sequence.
e) Matched with the EST group included in Rn. 7270, but the base of RHDH-226
There was no sequence that completely overlapped with the cDNA of RHDH-226.
E. coli XL1-Blue MRF harboring the plasmid pRHDH-226
'/pRHDH226 is a product of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) based on the Budapest conditions.
Research Institute Patent Organism Deposit Center: Central 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan
6 (formerly: Agency of Industrial Science and Technology, Institute of Bioscience and Human-Technology: 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan)
No. 3) on March 10, 2000, under the accession number FERM BP-7082.
It has been deposited internationally. An ORF consisting of 376 amino acids was observed in the nucleotide sequence of RHDH-226.
The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24. This amino acid sequence and the database
When the homology with the sequence in WO99/06423 was examined, it was found to be a putative human secretory protein.
The amino acid sequence published as a protein and the amino acid sequence of positions 1 to 273 of SEQ ID NO: 24
The amino acid sequence showed a high homology of 88%, with the amino acid sequence from 274 to 275 of SEQ ID NO: 24
The protein shown in WO99/06423, which corresponds to the 376th amino acid
Therefore, the amino acid sequence shown in WO99/06423 was not found.
The protein is a human ortholog of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:24.
It can be assumed that the protein is not a log.
The function of α-amyloid is not clear except that it is a secretory factor.
Northern blots of the liver and the heart of 8-week-old rats are shown in panel 12 of FIG.
The base sequence of RHDH-235 is shown in SEQ ID NO: 25. As a result of homology analysis,
uman metastasis-associated gene 1 (mt
a1) [Accession: U35113] and 65% homology.
In addition, the sequence of its rat orthologue, rat mta1 [Accession
The base sequence of RHDH-235 showed 64% homology with the nucleotide sequence of RHDH-235.
An ORF consisting of 513 amino acids was observed, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO:26.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is a sequence of human mta1
The amino acid sequence of the protein encoded by the gene is 74%, rat mta1 gene
The amino acid sequence of the protein encoded by human showed 73% homology.
Since the amino acid sequences of mta1 and rat mta1 do not match,
RHDH-235 is thought to be a novel gene.
E. coli XL1-Blue MRF harboring the plasmid pRHDH-235
’/pRHDH235 is a product of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) based on the Budapest conditions.
Research Institute Patent Organism Deposit Center: Central 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan
6 (formerly: Agency of Industrial Science and Technology, Institute of Bioscience and Human-Technology: 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan)
No. 3) on March 10, 2000, under the accession number FERM BP-7083.
The hearts of 16-day-old embryonic rats and 8-week-old rats were deposited internationally.
The Northern blot obtained is shown in panel 13 of Figure 1. The nucleotide sequence of RHDH-239 is shown in SEQ ID NO: 27. As a result of homology analysis,
There was no match with any known gene sequence, making it a novel base sequence.
e) Matched with the EST group included in Rn. 23890, but was a salt of RHDH-239
There was no sequence that completely overlapped with the original sequence.
E. coli XL1-Blue MR harboring the plasmid pRHDH-239
F'/pRHDH239 was approved by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Budapest conditions.
Patent Organism Deposit Center, Institute of Biological Sciences: 1-1-1 Chuo, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan
No. 6 (formerly: Agency of Industrial Science and Technology, Institute of Bioscience and Human-Technology: Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan
1-3) on March 10, 2000, under the accession number FERM BP-7084.
The base sequence of RHDH-239 contains 158 amino acids.
An ORF consisting of the following was observed, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
Northern blots of the hearts of day-old and 8-week-old rats were performed as shown in FIG.
The base sequence of RHDH-279 is shown in SEQ ID NO: 29.
UsInterferon regulatory factor 3 (mir
f3) sequence [Accession: U75840], which has a high homology of 92%.
The base sequence shown in SEQ ID NO: 29 was compared with the base sequence of the mirf3 gene.
This indicated that this clone lacked the 5' end of the full-length cDNA.
Therefore, in Example 1, the 16-day-old rat heart was prepared using λZAPII as a vector.
Using the cDNA library as a template, a vector-specific sequence was generated using SEQ ID NO: 3
9 and SEQ ID NO: 41 based on the RHDH-279 specific sequence.
PCR was performed using the primers shown to generate the cDNA fragment of the clone.
Furthermore, five cDNA fragments were amplified and isolated. By linking these cDNA fragments with the cDNA of RHDH-279,
The RHDH-279-1 clone was obtained. The nucleotide sequence of RHDH-279-1 was determined.
The plasmid pR containing the cDNA of RHDH-279-1 is shown in number 30.
E. coli XL1-Blue MRF'/pRHDH carrying HDH-279-1
279-1 is a patent application issued by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the Budapest conditions.
Biorepository Center: Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (formerly: Ko
National Institute of Bioscience and Human Technology, Japan (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan)
International deposit under accession number FERM BP-7085 on March 10, 2000.
The 30th and subsequent bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 are the same as those of mirf3.
While showing a high homology of 92% with the sequence shown in SEQ ID NO: 30,
The 29th position is significantly different from the sequence of mirf3. Therefore, the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 is simply the rat orthologue of mifr3.
The base sequence shown in SEQ ID NO: 30 contains 94 amino acids.
An ORF consisting of the following was observed, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 31.
Northern blots of 6-day-old rat hearts and 8-week-old rat hearts are shown in FIG.
The base sequence of RHDH-309 is shown in SEQ ID NO: 32.
There was no match with any known gene sequence, making it a novel base sequence.
e) Matched with the EST group included in Rn. 1779, but the base of RHDH-309
There was no sequence that completely overlapped with this sequence.
There is no ORF consisting of this, and it is thought to be a non-translated region.
Northern blots of 8-week-old rat hearts are shown in panel 16 of FIG.
(5) The expression level of a previously identified protein was higher in the hearts of 8-week-old rats than in the hearts of 16-day-old rats.
The base sequence of the known gene RHDH-100 is rat protein kinase C.
Receptor sequence [Accession: U03390] (SEQ ID NO: 3
3). The amino acid sequence encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 34.
Northern blots of the hearts of 8-week-old rats and 10-week-old rats were performed as shown in the panel of FIG.
The base sequence of RHDH-140 (SEQ ID NO: 35) is shown in Table 17.
The sequence of epithelium-derived factor (PEDF) [
It showed a high homology of 92% with the [Accession: AF017057].
Therefore, this gene was predicted to be the orthologue in rat.
The amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 is shown in SEQ ID NO: 36.
Northern blots of 6-day-old rat hearts and 8-week-old rat hearts are shown in FIG.
The expression levels of these proteins are shown in Panel 18. (6) New proteins expressed at higher levels in the hearts of 8-week-old rats compared to the hearts of 16-day-old rats.
The base sequence of the gene RHDH-093 is shown in SEQ ID NO: 37.
There was no match with any known gene sequence, making it a novel base sequence.
e) Matched with the EST group included in Rn. 16542, but was a salt of RHDH-093
There was no sequence that completely overlapped with the base sequence.
The amino acid sequence of the target gene is shown in SEQ ID NO: 38.
Northern blots of 1-week-old rat hearts are shown in panel 19 of FIG.Industrial ApplicabilityDiagnosis of various heart diseases caused by myocardial necrosis, such as cardiac hypertrophy and heart failure
Drugs and therapeutic agents can be provided. "Sequence Listing Free Text" SEQ ID NO: 39 - Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 40 - Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 41 - Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 42 - Description of artificial sequence: Synthetic DNA

【配列表】 [Sequence List]

[Brief explanation of the drawings]

第１図は、胎児心臓と成体心臓とで発現量が変動する遺伝子のノーザン解析の
結果である。パネル１〜１９はそれぞれ、ＲＨＤＨ−００９、−０６３、−０６
８、−０９８、−０９９、−２３１、−２４９、−２７４、−２８６、−０５７
、−１８５、−２２６、−２３５、−２３９、−２７９−１、−３０９、−１０
０、−１４０、−０９３についての胎児心臓と成体心臓とにおける発現量の変動
を示す。それぞれのブロットにおいて、左側のレーンにはラット胎生１６日心臓
由来の全ＲＮＡ１２μｇ、右側のレーンにはラット生後８週齢心臓由来の全ＲＮ
Ａ１２μｇを泳動した。 Figure 1 shows the results of Northern analysis of genes whose expression levels change between fetal and adult hearts. Panels 1 to 19 represent RHDH-009, -063, and -06, respectively.
8, -098, -099, -231, -249, -274, -286, -057
, -185, -226, -235, -239, -279-1, -309, -10
The left lane in each blot shows 12 μg of total RNA from the 16-day-old rat embryonic heart, and the right lane shows 12 μg of total RNA from the 8-week-old rat heart.
12 μg of A was electrophoresed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 51/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｐ 9/10 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 43/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者桜田一洋東京都町田市旭町３丁目６番６号協和▲ 醗▼酵工業株式会社東京研究所内（注）この公表は、国際事務局（ＷＩＰＯ）により国際公開された公報を基に作成したものである。なおこの公表に係る日本語特許出願（日本語実用新案登録出願）の国際公開の効果は、特許法第１８４条の１０第１項（実用新案法第４８条の１３第２項）により生ずるものであり、本掲載とは関係ありません。───────────────────────────────────────────────────────── Continued from the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification Symbol FI A61K 39/395 A61K 45/00 45/00 48/00 48/00 A61P 9/10 51/00 C07K 14/52 A61P 9/10 16/24 C07K 14/52 C12N 1/15 16/24 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/02 5/10 1/68 A C12P 21/02 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z 1/68 C12N 5/00 A G01N 33/15 A61K 37/02 33/50 43/00 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE, TR), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, G M, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ , UG, ZW), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, B Z, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE , DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, R O, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor: Sakurada Kazuhiro, 3-6-6 Asahi-cho, Machida-shi, Tokyo, Japan Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo Research Laboratory (Note) This publication is based on the publication published internationally by the International Bureau of Patents (WIPO). The effect of the international publication of the Japanese patent application (Japanese utility model registration application) related to this publication is caused by Article 184-10, Paragraph 1 of the Patent Act (Article 48-13, Paragraph 2 of the Utility Model Act) and is not related to this publication.

Claims

[Claims]

[Claim 1] DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27 and 30.

[Claim 2] DNA of a gene which hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 or 27 and whose expression level varies between fetal heart and adult heart.

3. A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, 25 or 30.
A DNA of a gene that hybridizes with A under stringent conditions, has 90% or more homology with said DNA, and whose expression level varies between fetal heart and adult heart.

4. A DNA having the same sequence as 5 to 60 consecutive bases in a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27 and 30.

5. A DNA having a sequence complementary to the DNA of claim 4.

6. A method for detecting mRNA of a gene whose expression level varies between fetal heart and adult heart, using the DNA according to any one of claims 1 to 5.

7. A diagnostic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the DNA according to any one of claims 1 to 5.

8. A method for detecting a causative gene of a heart disease caused by myocardial necrosis, using the DNA according to any one of claims 1 to 5.

9. A method for screening for a substance that suppresses or promotes the transcription or translation of a gene whose expression level varies between the fetal heart and the adult heart, using the DNA according to any one of claims 1 to 5.

10. A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, using the DNA according to any one of claims 1 to 5.

11. A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the DNA according to any one of claims 1 to 5.

12. A recombinant viral vector comprising the DNA of any one of claims 1 to 5.

13. A recombinant viral vector comprising RNA having a sequence homologous to the sense strand of the DNA of any one of claims 1 to 5.

14. A DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 19, 32 and 37.

15. A DNA of a gene whose expression is altered between fetal heart and adult heart, which hybridizes under stringent conditions with the DNA of claim 14.

16. A DNA having the same sequence as 5 to 60 consecutive bases in a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 19, 32 and 37.

17. A DNA having a sequence complementary to the DNA of claim 16.

18. A method for producing a nucleic acid sequence comprising the DNA of any one of claims 14 to 16.
A diagnostic agent for heart disease caused by myocardial necrosis.

19. A method for detecting a gene responsible for a heart disease caused by myocardial necrosis, which uses the DNA according to any one of claims 14 to 16.

20. A method for screening for a substance that suppresses or promotes the transcription or translation of a gene whose expression level varies between the fetal heart and the adult heart, using the DNA according to any one of claims 14 to 16.

21. A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, using the DNA according to any one of claims 14 to 16.

22. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A method for detecting mRNA of a gene whose expression level varies between the fetal heart and the adult heart using the method.

23. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A diagnostic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, containing

24. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A method for screening for substances that suppress or promote the transcription or translation of genes whose expression levels vary between fetal and adult hearts, using the method.

25. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A method for screening therapeutic drugs for heart diseases caused by myocardial necrosis using the method.

26. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A therapeutic drug for heart disease caused by myocardial necrosis, containing

27. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A recombinant viral vector comprising:

28. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33
and DNA having a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by 35.
A recombinant viral vector comprising RNA having a sequence homologous to the sense strand of

29. A protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28 and 31.

[Claim 30] An amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 22, 24, 26 and 28 is an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is a protein having activity involved in the repair of heart disease caused by myocardial necrosis.

31. A DNA encoding the protein according to claim 29 or 30.

32. A recombinant DNA obtained by inserting the DNA according to any one of claims 1 to 4 and 31 into a vector.

33. A transformant obtained by introducing the recombinant DNA according to claim 32 into a host cell.

34. A method for producing a protein, comprising culturing the transformant according to claim 33 in a medium, producing and accumulating the protein according to claim 29 or 30 in the culture, and recovering the protein from the culture.

35. A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the protein according to claim 29 or 30.

36. A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, which comprises culturing the transformant according to claim 33 in a medium and using the resulting culture.

37. A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, using the protein according to claim 29 or 30.

38. A recombinant viral vector involved in the production of the protein according to claim 29 or 30.

39. A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the recombinant viral vector according to claim 38.

40. An antibody that recognizes the protein according to claim 29 or 30.

41. A method for immunologically detecting the protein according to claim 29 or 30, which uses the antibody according to claim 40.

42. A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, using the antibody according to claim 40.

43. A method for screening for a substance that suppresses or promotes the transcription or translation of a gene whose expression level varies between fetal heart and adult heart, using the antibody according to claim 40.

44. A diagnostic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the antibody according to claim 40.

45. A therapeutic agent for a heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the antibody according to claim 40.

46. A drug delivery method for guiding a fusion antibody, which is obtained by binding the antibody according to claim 40 to a drug selected from a radioisotope, a protein, and a low molecular weight compound, to a cardiac lesion.

47. An antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or 38.

48. A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, using the antibody according to claim 47.

49. A method for screening for a substance that suppresses the transcription or translation of a gene whose expression level varies between fetal heart and adult heart, using the antibody according to claim 47.

50. A diagnostic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the antibody according to claim 47.

51. A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the antibody according to claim 47.

52. A drug delivery method for guiding a fusion antibody, which is obtained by binding the antibody according to claim 47 to a drug selected from a radioisotope, a protein, and a low molecular weight compound, to a cardiac lesion.

53. SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 3
A recombinant viral vector involved in the production of a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 4 and 36.

54. A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising the recombinant viral vector according to claim 53.

Claim 55: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 3
A method for screening therapeutic agents for heart diseases caused by myocardial necrosis, using an antibody that recognizes a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 4 and 36.

Claim 56: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 3
A method for screening for substances that suppress or promote the transcription or translation of genes whose expression levels vary between the fetal heart and the adult heart, using an antibody that recognizes a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 4 and 36.

Claim 57: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 3
A diagnostic agent for heart diseases caused by myocardial necrosis, comprising an antibody that recognizes a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 4 and 36.

Claim 58: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 3
A therapeutic agent for heart disease caused by myocardial necrosis, comprising an antibody that recognizes a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 4 and 36.

Claim 59: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 3
A drug delivery method for guiding a fusion antibody, which is formed by binding an antibody that recognizes a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by 4 and 36, to a cardiac lesion, and which is coupled to a drug selected from a radioactive isotope, a protein, and a low molecular weight compound.