JP4086492B2

JP4086492B2 - Medicine for the treatment of diabetes

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Publication number: JP4086492B2
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Inventors: 邦博土田
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Publication date: 2008-05-14
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オーファン受容体ＡＬＫ７、該受容体のリガンド蛋白質であるアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、該受容体をコードするＤＮＡ、または該リガンド蛋白質コードするＤＮＡを含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬および診断薬に関する。また、該受容体、該リガンド蛋白質、該受容体をコードするＤＮＡ、または該リガンド蛋白質コードするＤＮＡを利用した糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は先進諸国において最も大きな問題となっている生活習慣病の一種である。
糖尿病は膵臓β細胞から分泌されるホルモンであるインスリンの絶対的不足（１型糖尿病）、あるいは相対的不足・作用不足（２型糖尿病）に起因する疾患である。２型糖尿病の病態は、β細胞からのインスリン分泌不全とインスリン標的細胞でのインスリン作用障害（インスリン抵抗性）の二者で構成され、複数の遺伝因子・環境因子が複雑に関与する他因子疾患であることが知られている。ヒト２型糖尿病では、健常人と比較して膵β細胞が約６０％に減少しているとの報告もあり〔Tohoku J. Exp. Med., 129, 273-283, (1979)〕、β細胞数の低下が１型のみならず２型糖尿病患者においても病態と関連することが示唆されている。
【０００３】
インスリン分泌能を根本的に回復させる一方法として膵移植が1960年代から行われているが、ドナー・移植材料の確保が困難であることに加え、膵移植は非常に高度な技術を必要とする移植であることが問題とされている〔Nature Med., 6, 250-251, 2000〕。
【０００４】
一方、近年、膵移植と比較すると技術的には容易な膵ランゲルハンス氏島移植が試みられるようになってきたが、１年正着率が２７％と低い点、および個体の膵臓から十分な数のランゲルハンス氏島を取得し難いことが問題とされている。
【０００５】
膵ランゲルハンス氏島はインスリンを分泌するβ細胞のみならずグルカゴンを産生するα細胞、PPを産生するPP細胞、ソマトスタチンを産生するδ細胞の４種から成る。これら膵内分泌細胞は高度に最終分化した細胞であり、成体における新生現象はほとんど観察されず細胞分裂能も極めて低い。しかし非常に特殊な状況下、特に膵破壊・ランゲルハンス氏島破壊を伴う状況においてはβ細胞の再生が観察されることが主に動物モデルで証明されている〔Diabetes, 45, 941-945 (1996)、Diabetes, 46, 1281-1290 (1997)、Endocrinology, 138, 1750-1762 (1997)、Development, 118, 33-46, (1993)〕。よって、少なくともげっ歯類においては成体の膵臓にも内分泌細胞を増殖・再生させる潜在能力が存在し、特に膵導管に成体膵幹細胞が存在すると考えられている。
【０００６】
ヒトにおいては、上述したげっ歯類で観察されるような成体β細胞の再生現象は観察されていないが、糖尿病でない死者の剖検で、膵導管付近に数個以内の細胞から成るインスリン陽性細胞（single beta cell unit）が高頻度で観察されると報告されている。このsingle beta cell unitはランゲルハンス氏島を形成するβ細胞と比較し形態が小さいことから、より未分化なβ細胞であると考えられ、ヒト成体においてもβ細胞の再生が起こる可能性が示唆されている〔Diabetologia, 41, 629-633 (1998)〕。
【０００７】
膵移植に替わるβ細胞補充法として、ある特定の物質を投与することでin vivoでβ細胞の増殖・新生を誘導する物質としては、ポリADPリボースシンテターゼインヒビターであるニコチンアミド〔Biomed. Res., 18, 171 (1997)、Diabetes Res. Clin. Pract., 41, 1 (1998)〕、Reg蛋白質〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3589 (1994)〕の報告がある。しかし、ニコチンアミドは、糖尿病発症後の経口投与については、インスリン分泌能がある程度保たれている症例に約1年間に限りインスリン分泌持続効果があるのみであり〔Molecular Medicine, 38, 62-67 (2001)〕、またRegを過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、β細胞数が減少し、インスリン含量が減少した。その結果、耐糖能障害がみられ３８％が糖尿病を発症した。その後１００週齢までに死亡したマウスの死因のほとんどは、膵導管、卵巣での悪性腫瘍、リンパ腫の形成であった〔2000年、日本糖尿病学会要旨集〕。reg遺伝子の発現が癌化に関連していることを示す報告もあり〔Brit. J. Cancer, 83, 188-1(2000)〕、ニコチンアミド、Reg蛋白質ともヒト糖尿病治療への利用は難しいと考えられる。
【０００８】
近年、成体のあらゆる組識において成体幹細胞の存在が明らかにされ、種々の臓器不全、疾患に対する再生療法の可能性が期待されている。上述したような成体の膵臓、主に膵導管に潜むと考えられる膵成体幹細胞を、インスリンを分泌するβ細胞へと効率的に分化誘導することができれば、１型のみならず２型糖尿病患者における膵β細胞数の低下および機能低下を補い、糖尿病の根治治療へ繋がると考えられが、そのような技術は確立していない。
【０００９】
一方、近年の膵臓発生初期過程の解析において、アクチビン受容体様キナーゼ 7（ＡＬＫ７）が特異的に膵臓細胞に発現されていることが明らかにされてきた〔Biochem. Biophys. Res. Comm., 254, 707-712 (1999)〕。ＡＬＫ７はＴＧＦ−β受容体ファミリーに属する分子で〔Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478 (1996); J. Biol. Chem., 271, 30603-30609 (1996)〕、Ｉ型受容体に分類されているがそのリガンドはこれまで明らかにされていない。
【００１０】
一般にＴＧＦ−β受容体ファミリーに属する受容体の機能は、Ｉ型、II型の異なる分子により担われていることが明らかにされており、リガンドはII型受容体にまず結合し、リガンドとII型受容体の複合体がＩ型受容体と複合体を形成し、Ｉ型受容体が活性化されることにより細胞内にシグナルが伝達される〔Endocrinol., 141, 2281-2284 (2000) 〕。
【００１１】
特表平10-510143には、ラット由来のＡＬＫ７が取得され、該ＡＬＫ７のアミノ酸およびｃＤＮＡの配列が示されており、また該ＡＬＫ７ｍＲＮＡのラットの各臓器における発現分布の解析により、該ＡＬＫ７は神経疾患の治療に有効と推定しているが、該ＡＬＫ７のリガンドについては、具体的に特定、取得したとの記載はない。
【００１２】
一方、アクチビン類はTGF-βスーパーファミリーに属するサイトカインであり、ＴＧＦ−β等と同様に二量体構造を有するが、それを構成するサブユニット（βサブユニットと呼ばれる）は５種類が知られており、哺乳類では、βＡ、βＢの他にβＣ、βＥが存在することが明らかにされている〔Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, 669-674 (1996); Biochim. Biophys. Acta., 1307, 145-148 (1996)〕。これまでに哺乳動物生体内で蛋白質として発現が確認されているアクチビン類は、アクチビンＡ（βＡ−βＡ）、アクチビンＡＢ（βＡ−βＢ）、アクチビンＢ（βＢ−βＢ）である。アクチビン類（アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ）の受容体構成は、上記したようにＴＧＦ−β受容体ファミリーの典型であり、II型受容体（ActRIIAあるいはActRIIB）に結合し、その複合体がＩ型受容体（ＡＬＫ４）を活性化することによりシグナルが伝達されるものと考えられている〔Endocrinol., 141, 2281-2284 (2000)〕。また、現在の知見ではアクチビンＡ、ＡＢ、Ｂの間に明確な活性の相異は認められていない。
【００１３】
酵素活性を欠損した変異型II型アクチビン受容体遺伝子や、構成活性型Ｉ型アクチビン受容体遺伝子導入マウスの解析から、アクチビン類が膵臓β細胞の機能分化に重要である点は指摘されているが〔J. Clin. Invest., 102, 294-301 (1998)〕、他のＴＧＦ−βファミリーに属する分子との機能の重複性の影響が判別されず、アクチビン類の機能の詳細は明らかにされておらず、また、アクチビン類の機能上の相異も示唆されていない。これまでに、βＢの発現は下垂体、卵巣などβＡに比較して比較的限局されていることが明らかにされてきた〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 247-251(1988)〕。その後、βＡ、βＢ共に膵臓で発現していることも報告されているが〔Endocrinology, 133, 624-630 (1993); FEBS Letters, 319, 217-220 (1993); J. Gastrointest. Surg., 4, 269-275 (2000)〕、これらの検討結果はｍＲＮＡ発現に関する検討を示すのみであり、アクチビンＡ、ＡＢ、Ｂに機能上の相異があるとは指摘されていない。
【００１４】
この様に、アクチビン類に関しては、膵臓機能等に何らかの作用を有することが示唆されてはいるが、各分子種間において機能上の差異を窺わせる知見は存在せず、アクチビンＡ、ＡＢ、Ｂの間に膵臓の発生・分化並びに機能制御等に異なる機能が担われているとは予想されていない。
以上の様に、膵臓再生因子の探索は新規膵臓機能改善作用を有する治療薬として注目されているが、実際の医療に応用可能な分子は特定されていない。また、ＡＬＫ７は膵臓β細胞で発現されていることが明かにされており、膵臓の機能制御等に何らかの役割を担うことが示唆されてはいるがその具体的機能、およびそのリガンドに関しては知られていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
成体の膵臓に存在すると考えられる成体膵幹細胞を、インスリンを分泌し機能的に成熟した膵β細胞へと分化誘導することができれば、１型および２型糖尿病患者における膵β細胞数の低下および機能低下を補い糖尿病の根治治療へと繋がる。こうした活性を有する分子の特定とそれを利用した膵臓機能を改善する薬剤の開発が望まれている。
【００１６】
即ち、本発明は、グルコース依存性のインシュリン分泌の促進作用を示す物質を糖尿病の治療および／または予防のための医薬として提供することを解決すべき課題とした。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究し、膵臓β細胞で特異的に発現していることが知られているＴＧＦ−β受容体ファミリーのタイプＩ型受容体に属するＡＬＫ７のリガンドが公知のアクチビンＡＢおよびＢであることを同定した。さらに、膵臓β細胞で発現するタイプＩ型受容体ＡＬＫ７とタイプII受容体ActRIIAを介して情報を伝達することを明らかにした。さらにアクチビンＡＢを膵臓β細胞様のモデル細胞に投与することでグルコース依存性のインシュリン分泌の促進作用を示すことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（３５）を提供するものである。
【００１８】
（１）アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（２）下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質；
［ｂ］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；
［ｃ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；または
［ｄ］配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質：
【００１９】
（３）下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質；
［ｂ］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質；または
［ｃ］配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される二量体蛋白質であって、ＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質：
【００２０】
（４）下記の何れかの蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコードされる蛋白質；または
［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機能を有する蛋白質：
【００２１】
（５）下記の何れかのポリペプチドを有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
［ｂ］配列番号１または２において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；
【００２２】
（６）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵臓機能改善作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。
（７）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。
（８）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有するものである上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬。
（９）アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する、インスリン分泌促進剤。
【００２３】
（１０）アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
（１１）下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
［ａ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ；または
［ｃ］配列番号３および４で表される塩基配列を含むＤＮＡ：
【００２４】
（１２）下記の何れかのＤＮＡを含有する、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤。
［ａ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質をコードするＤＮＡ；または
［ｂ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ：
【００２５】
（１３）糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵臓機能改善作用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（１４）糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（１５）糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤が、膵外分泌細胞および膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有するものである上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（１６）アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを含有する、インスリン分泌促進剤。
【００２６】
（１７）以下の［ａ］〜［ｃ］のいずれかに記載のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体を含有する糖尿病の診断薬。
［ａ］アクチビンβA鎖、アクチビンβB鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、またはそれらＤＮＡの部分断片であるＤＮＡより選ばれるＤＮＡ
［ｃ］配列番号３または４で表される塩基配列、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列において、連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体
【００２７】
（１８）アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＡＬＫ７からなる群より選ばれる蛋白質を認識する抗体を含有する糖尿病の診断薬。
（１９）上記（１７）に記載のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドの誘導体、または上記（１８）に記載の抗体を含有する、糖尿病の診断キット。
【００２８】
（２０）（i）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞での該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量と、（ii）該ポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の該ポリペプチドまたは蛋白質の発現量とを比較し、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質の発現量を増大させる化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法。
［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７より選ばれる蛋白質；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選ばれるポリペプチドまたは蛋白質；
［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；または
［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を有する蛋白質：
【００２９】
（２１）（i）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞の機能と、（ii）該ポリペプチドまたは蛋白質を発現する細胞と被験試料を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、被験試料より細胞の機能を制御する活性を有する化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法。
［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７より選ばれる蛋白質；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選ばれるポリペプチドまたは蛋白質；
［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；または
［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を有する蛋白質：
【００３０】
（２２）細胞が、II型アクチビン受容体を発現している細胞である、上記（２０）または（２１）に記載のスクリーニング方法。
（２３）細胞が、膵臓β細胞種細胞である上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２４）以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子の転写を制御する領域の下流にレポーター遺伝子が連結されたＤＮＡを含むＤＮＡで形質転換された形質転換体と被験試料を接触させ、被験試料より以下の［ａ］〜［ｄ］のいずれかに記載のポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝子の発現を増大させる化合物を選択することを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬のスクリーニング方法。
［ａ］アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７より選ばれる蛋白質；
［ｂ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質より選ばれるポリペプチドまたは蛋白質；
［ｃ］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつＡＬＫ７のリガンドとしての機能を有する蛋白質を構成するポリペプチド；または
［ｄ］配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつアクチビンＡＢまたはアクチビンＢの受容体蛋白質としての活性を有する蛋白質
【００３１】
（２５）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が膵臓機能改善作用を有する化合物である（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有する化合物である上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２７）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有する化合物である上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２８）上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の方法によって得られる化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【００３２】
（２９）上記（２８）に記載の化合物、またはその薬理学的に許容される塩を含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３０）ＡＬＫ７を認識する抗体と上記（２８）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩とを結合して得られる、糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３１）膵臓機能改善作用を有する医薬である、上記（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３２）膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用を有する医薬である上記（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
（３３）膵外分泌細胞または膵内分泌細胞の再生を促進する作用を有する医薬である上記（２９）または（３０）に記載の糖尿病の治療および／または予防のための医薬。
【００３３】
（３４）ＡＬＫ７を認識する抗体とＡＬＫ７に作用する糖尿病の治療および／または予防のための医薬とを結合して得られる融合抗体を膵臓へ選択的に蓄積させることを特徴とする、糖尿病の治療および／または予防のための医薬の輸送方法。
（３５）糖尿病の治療および／または予防のための医薬が、上記（２８）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記（３４）に記載の方法。
【００３４】
本発明のさらに別の側面によれば、治療および／または予防に有効量の上記（１）から（５）の何れかに記載の蛋白質またはポリペプチドを、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖尿病の治療および／または予防のための方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、糖尿病の治療および／または予防のための医薬の製造における、上記（１）から（５）の何れかに記載の蛋白質またはポリペプチドの使用が提供される。
【００３５】
本発明のさらに別の側面によれば、治療および／または予防に有効量の上記（１０）から（１２）の何れかに記載のＤＮＡを、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖尿病の治療および／または予防のための方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、糖尿病の治療および／または予防のための遺伝子治療剤の製造における、上記（１０）から（１２）の何れかに記載のＤＮＡの使用が提供される。
【００３６】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬に含有される蛋白質としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ＡＬＫ７を挙げることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質としての活性を有する蛋白質であれば、天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質を挙げることができる。
アクチビンＡＢの具体的例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドより構成される二量体蛋白質を挙げることができ、アクチビンＢの具体的例としては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質を挙げることができる。
ＡＬＫ７は、ＡＬＫ７としての活性、すなわちアクチビンＡＢまたはアクチビンＢで活性化され、細胞のインスリン分泌を促進する活性を有する蛋白質であれば天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７を挙げることができる。
ＡＬＫ７の具体的例としては、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
【００３７】
また、本発明の医薬に含有される蛋白質としては、
（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質でありかつＡＬＫ７リガンドとしての活性を有する蛋白質、
（ｅ）配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質でありかつＡＬＫ７の活性を有する蛋白質、も挙げられる。
【００３８】
また、本発明の医薬に含有されるポリペプチドとしては、アクチビンβＡ鎖、およびアクチビンβＢ鎖を挙げることができる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでありかつ、アクチビンＡＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでありかつ、アクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドも、本発明の医薬に含有されるポリペプチドとして挙げられる。
【００３９】
さらには、上記蛋白質またはポリペプチドに様々なポリペプチドを付加した上記蛋白質またはポリペプチドとの融合蛋白質も本発明の医薬に含有される蛋白質またはポリペプチドである。融合蛋白質の例としては、マルトース結合蛋白質、オリゴ・ヒスチジン、抗体ペプチドエピトープ、ヒト免疫グロブリン定常領域、プロテインＡなどを結合した融合蛋白質を挙げることができる。また、融合蛋白は公知の手法により特異的に切断可能な配列を有することもできる。
【００４０】
配列番号１または２で表されるアミノ酸配列、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７としての活性を有する蛋白質、またはアクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００４１】
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１以上であり上限は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００４２】
本発明の医薬に含有される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および／または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどが挙げられる。
【００４３】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００４４】
また、本発明の医薬に含有される蛋白質またはポリペプチドが、アクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質またはアクチビンＡＢまたはアクチビンＢとしての活性を有する蛋白質を構成するポリペプチドであるためには、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有していることが好ましい。また、本発明の医薬に含有される蛋白質がＡＬＫ７としての活性を有するためには、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有していることが好ましい。
【００４５】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST〔Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)〕やFASTA〔Methods Enzymol., 183, 63 (1990)〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００４６】
本発明の医薬に含有される蛋白質又はポリペプチドが、ＡＬＫ７のリガンドとしての活性を有しているか否を確認する方法としては、例えば、II型アクチビン受容体とＡＬＫ７とを発現する組換え細胞と該蛋白質とを接触させたときの細胞の応答を測定する方法、または膵臓β細胞の形質を保有する培養細胞と該ポリペプチドまたは蛋白質を接触させたときの該培養細胞からのインスリン分泌量を測定する方法などをあげることができる。
【００４７】
細胞の応答の例としては、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、またはレポーター遺伝子の発現量などをあげることができる。
【００４８】
本発明の医薬に含有される蛋白質が、ＡＬＫ７としての活性を有しているか否かを確認する方法としては、II型アクチビン受容体と該蛋白質とを発現させた組み換え細胞とアクチビンＡＢまたはアクチビンＢを接触させたときの該細胞の応答又は該細胞からのインスリン分泌量を測定する方法などを挙げることができる。細胞応答の例としては上記の応答をあげることができる。
【００４９】
１．アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７の取得方法
アクチビンＡＢおよびアクチビンＢのように、完全長ｃＤＮＡが公知である場合、該完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
【００５０】
ヒトＡＬＫ７のように、完全長ｃＤＮＡが公知でない場合、配列番号１０で表される塩基配列を有するラット由来のＡＬＫ７遺伝子、または公知のヒトＡＬＫ７のＥＳＴ（expressed sequnece tag）をプローブに用いて、例えばヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＡＬＫ７をコードするｃＤＮＡを単離することができる。得られたｃＤＮＡが全長ｃＤＮＡでない場合は、このクローンをプローブとしたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングや、ＲＡＣＥ法〔rapid amplification of cDNA ends; Frohman MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)〕により全長のｃＤＮＡを取得することができる。
【００５１】
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサー等を用いて決定し、その塩基配列について各フレームでアミノ酸配列に翻訳した後、公知のラット由来のＡＬＫ７のアミノ酸配列と比較することにより、取得されたｃＤＮＡがヒトＡＬＫ７をコードするＤＮＡであるかを確認することができる。取得されたヒトＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いて、上記したように必要に応じて適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
【００５２】
該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡを発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、該蛋白質の組換発現ベクターを作製する。具体的には、例えば、配列番号1または２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、あるいは配列番号５および６で表される塩基配列を含む完全長ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを作製する。あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡと配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡとが独立のプロモーターにより発現調節されるように配置された同一の発現ベクター内に挿入されていても良い。
【００５３】
該組換発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞内に導入する。
宿主細胞としては、目的とするＤＮＡを発現できるものは全て用いることができ、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属等に属する細菌、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオミセス（Schwanniomyces）属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
【００５４】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００５５】
細菌を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡ組換発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ポリペプチドのＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換発現ベクターであることが好ましい。ベクターにはプロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５６】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKK233-2（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pSE280（Invitrogen社製)、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10〔特開昭58-110600〕、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、pGEX（Amersham Pharmacia Biotech社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕等を例示することができる。
【００５７】
発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。
【００５８】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、P_Lプロモーター、P_Rプロモーター、T7プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター〔Gene, 44, 29(1986）〕、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５９】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、およびＡＬＫ７をコードする部分のＤＮＡの塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように置換することにより、目的とするポリペプチドまたは蛋白質の生産率を向上させることができる。
上記ポリペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００６０】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacte rium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができる。
【００６１】
組換発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法〔特開昭63-248394〕、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
【００６２】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
【００６３】
プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等を挙げることができる。
【００６４】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等を挙げることができる。
【００６５】
組換発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. in Enzymol., 194, 182 (1990)、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法等を挙げることができる。
【００６６】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡ１．１(Invitrogen社製)、ｐＣＤＭ８（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００６７】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００６８】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７〔特開昭63-299〕等をあげることができる。
【００６９】
組換発現ベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)、Virology, 52, 456(1973)〕等を用いることができる。
【００７０】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント１−３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ポリペプチドまたは蛋白質を発現することができる。
【００７１】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドまたは蛋白質を発現させることができる。
遺伝子導入用ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ともにInvitrogen社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００７２】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual、W.H.Freeman and Company，New York，(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Invitrogen社製）等を用いることができる。
【００７３】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔特開平2-227075〕、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84,7413 (1987)〕等をあげることができる。
【００７４】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドまたは蛋白質を得ることができる。
【００７５】
該蛋白質のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドまたは蛋白質を採取することにより、目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を製造することができる。
アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を製造するための形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００７６】
上記形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母等の真核生物を宿主細胞とする場合、これら形質転換体を培養する培地は、該宿主細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００７７】
炭素源としては、それぞれの宿主細胞が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。
【００７８】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００７９】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００８０】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００８２】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【００８３】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８４】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Pharmingen社製）、Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ培地（Life Technologies社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもJRH Biosciences社製）、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８５】
形質転換体の培養物から、目的ポリペプチドまたは目的蛋白質を単離精製するには、通常のポリペプチドまたは蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、ポリペプチドまたは蛋白質が、細胞内に溶解状態で産生した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のポリペプチドまたは蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ポリペプチドまたは蛋白質の精製標品を得ることができる。
【００８６】
また、ポリペプチドまたは蛋白質が細胞内に不溶体を形成して産生した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離することにより、沈殿画分としてポリペプチドまたは蛋白質の不溶体を回収する。
回収したポリペプチドまたは蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
可溶化液を希釈あるいは透析して、可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、ポリペプチドまたは蛋白質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドまたは蛋白質の精製標品を得る。
【００８７】
ポリペプチドまたは蛋白質あるいはその糖修飾体等が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、該ポリペプチドまたは蛋白質あるいはその糖修飾体等を回収することができる。即ち、培養物から遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００８８】
このようにして取得されるポリペプチドまたは蛋白質として、例えば、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成される二量体蛋白質、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成される二量体蛋白質および配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質等をあげることができる。
【００８９】
また、該ポリペプチドまたは蛋白質を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、米国Advanced ChemTech社製、Perkin-Elmer社製、Amersham Pharmacia Biotech社製、米国Protein Technology Instrument社製、米国Synthecell-Vega社製、米国PerSeptive社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００９０】
２．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的に認識する抗体の作製
上記１で取得されるポリペプチドまたは蛋白質の部分断片精製標品、あるいは配列番号１または２で表されるアミノ酸配列、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を用いて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を認識する抗体を作製することができる。
【００９１】
（１）ポリクローナル抗体の作製
アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７または該蛋白質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは該蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
【００９２】
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
【００９３】
該抗原の投与は、1 回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕等で確認する。
【００９４】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
【００９５】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた蛋白質の部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
【００９６】
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【００９７】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５mmol/l）、２−メルカプトエタノール（５×１０^-5mol/l）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０⁷個以上用いる。
【００９８】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
【００９９】
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０⁸抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
【０１００】
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０^-4mol/l）、チミジン（１．５×１０^-5mol/l）およびアミノプテリン（４×１０^-7 mol/l）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
【０１０１】
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０１０２】
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べられている酵素免疫測定法により、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
【０１０３】
酵素免疫測定法の具体例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いたアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７の部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
【０１０４】
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
【０１０５】
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０⁶細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
【０１０６】
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
【０１０７】
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１０８】
３．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いたアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの検出方法
該検出方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等が挙げられる。以下、これらを本発明に用いるＤＮＡとも称する。
該遺伝子のｍＲＮＡの発現量や構造変化を検出する方法としては、例えば（１）ノーザンブロット法（２）ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、（３）定量的ＰＣＲ法、（４）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、（５）ＤＮＡチップ法、（６）ＲＮａｓｅ保護アッセイ法などの方法等があげられる。
【０１０９】
上記方法による分析に供する検体としては、糖尿病患者ならびに健常者より取得した膵臓組織、血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞試料から取得したｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用いられる（以後、該ｍＲＮＡおよび全ＲＮＡを検体由来ＲＮＡと称する）。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。
【０１１０】
ノーザンブロット法では、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、本発明に用いるＤＮＡより調製した標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことで、該遺伝子ｍＲＮＡに特異的に結合したバンドを検出することにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量ならびに構造の変化を検出することができる。ハイブリダイゼーションを行う際には、プローブと検体由来ＲＮＡ中の該遺伝子ｍＲＮＡが安定なハイブリッドを形成する条件でインキュベーションする。偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている。
【０１１１】
ノーザンブロット法に用いる標識プローブは、例えば、公知の方法(ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナージング)により放射性同位体、ビオチン、蛍光基、化学発光基等を、本発明に用いるＤＮＡあるいは該ＤＮＡの配列から設計したオリゴヌクレオチドに取り込ませることで調製することができる。標識プローブの結合量は該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を定量することができる。また、標識プローブ結合部位を分析することで、該遺伝子ｍＲＮＡの構造変化を知ることができる。
【０１１２】
ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、上記標識プローブと、生体から取得した組織をパラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程を行うことにより、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法である。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーションならびに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている。
【０１１３】
定量的ＰＣＲ法、デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡチップ法等の該遺伝子のｍＲＮＡの検出法は、検体由来ＲＮＡに、オリゴｄＴプライマーあるいはランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することに基づいた方法で行うことができる（以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮＡと称する）。検体由来ＲＮＡがｍＲＮＡの場合は、上記いずれのプライマーも用いることができるが、該検体由来ＲＮＡが全ＲＮＡである場合は、オリゴｄＴプライマーを用いる。
【０１１４】
定量的ＰＣＲ法では、検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとし、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、該遺伝子のｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅する方法である。増幅ＤＮＡ断片の量は該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を反映することから、アクチンやG3PDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)等をコードするＤＮＡを内部コントロールとして置くことで該遺伝子のｍＲＮＡの量を定量することが可能である。また、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離することで、該遺伝子のｍＲＮＡの構造の変化を知ることもできる。本検出法では、標的配列を特異的にかつ効率的に増幅する適当なプライマーを用いることが望ましい。適当なプライマーは、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合して、変性条件で標的ｃＤＮＡからはずれる等の条件に基づき設計することができる。増幅ＤＮＡ断片の定量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ反応の内に行うことが必要である。このようなＰＣＲ反応は、各反応ごとに生産される該増幅ＤＮＡ断片を回収してゲル電気泳動で定量分析することで知ることができる。
【０１１５】
デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法〔Trends in Genetics, 7, 314-317(1991)〕やＤＮＡチップ法〔Genome Research, 6, 639-645(1996)〕は、検体由来ｃＤＮＡをプローブとして、本発明に用いるＤＮＡを固定化させたフィルターまたはスライドガラスあるいはシリコンなどの基板に対して、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を行うことにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量の変動を検出する方法である。いずれの方法もフィルターまたは基板上に、アクチンやＧ３ＰＤＨなどの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での該遺伝子のｍＲＮＡの発現の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡを基にそれぞれ異なる標識ｄＮＴＰを用いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、フィルターまたは基板に二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることにより正確な該遺伝子のｍＲＮＡの発現量の定量を行うことができる。
【０１１６】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ法は、以下の方法により行う。まず、本発明に用いるＤＮＡの３’末端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎｖｉｔｒｏの転写系により標識したｒＮＴＰを用いて、標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、ＲＮａｓｅで消化し、消化から保護されたＲＮＡ断片をゲル電気泳動によりバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量することで、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量することができる。
【０１１７】
４．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的検出または定量方法
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を用いて、微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の細胞内あるいは細胞外に発現したアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法〔単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）〕などが挙げられる。
【０１１８】
蛍光抗体法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにフルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光物質でラベルした抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。
【０１１９】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【０１２０】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
【０１２１】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免疫組織化学染色法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。
【０１２２】
ウェスタンブロッティング法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, （1988）〕で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、確認する方法である。
【０１２３】
ドットブロッティング法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜にアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。
【０１２４】
免疫沈降法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体をプレートに吸着させ、もう一方の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を反応させた後、標識した抗体を反応させ、結合した標識物質により検出を行う方法である。
【０１２５】
５．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異同定方法
当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげられる。
【０１２６】
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７遺伝子座中に存在する糖尿病の原因となる変異の存在の有無を評価するための最も明確な試験は、対照集団からの遺伝子と糖尿病患者からの遺伝子とを直接比較することである。
【０１２７】
具体的には糖尿病患者ならび健常人から、膵臓組織、血清、唾液等のヒト生体試料あるいは、該生体試料から樹立した初代培養細胞由来の試料を集め、該生体試料ならびに該初代培養細胞由来試料中からＤＮＡを抽出する（以後、該ＤＮＡを検体由来ＤＮＡと称する）。該検体由来ＤＮＡは、直接あるいは配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを試料ＤＮＡとして用いることができる。別法として、該検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーによりＰＣＲを行うことで増幅したＤＮＡ断片を試料ＤＮＡとして用いることができる。
【０１２８】
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡに糖尿病の原因となる変異があるかどうかを検出する方法として、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
【０１２９】
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法〔Trends Genet., 7, 5 (1991)〕、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法〔Genomics, 16, 325-332 (1993)〕、（３）ミスマッチの化学的切断法（CCM, chemical cleavage of mismatches）[Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited]、（４）ミスマッチの酵素的切断法〔Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)〕、（５）変性ゲル電気泳動法〔Mutat. Res., 288, 103-112 (1993)〕等の方法をあげることができる。
【０１３０】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、２００ｂｐよりも小さい断片としてアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの断片を増幅し、該増幅ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、変異を有さないホモ二本鎖と泳動度を比較する方法である。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異によりヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりもゲルの移動度が遅く、それらはホモ二本鎖と異なるバンドとして検出することができる。該電気泳動には、市販のゲル〔Ｈｙｄｒｏ−ｌｉｎｋ，ＭＤＥ（ＦＭＣ社製）など〕を用いることもできる。また、２００ｂｐよりも小さいＤＮＡ断片を用いたヘテロ二本鎖検出法では、１塩基の挿入、欠失および置換を検出可能である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション多型解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。
【０１３１】
一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ解析；single strand conformation polymorphism analysis）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、２００ｂｐよりも小さい断片として増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを変性後、未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動する方法である。ＤＮＡの増幅を行う際にプライマーを放射性同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡをバンドとして検出することができる。野生型の泳動パターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に電気泳動すると、塩基配列に変異を持った断片を移動度の違いから検出することができる。
【０１３２】
ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法）は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅ＤＮＡ断片と配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をとり込ませた標識ＤＮＡとをハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ塩基配列の変異を検出する方法である。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。
【０１３３】
上記、四酸化オスミウムの代わりにＴ４ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮａｓｅＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
【０１３４】
変性ゲル電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE法）は、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する方法である。増幅したＤＮＡ断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡに変異がある場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル内での移動度が異なることから、変異の存在を検出することが可能である。ＰＣＲに使用するそれぞれのプライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けて検出感度を上げることもできる。
【０１３５】
糖尿病の原因遺伝子を検出する別の方法として、蛋白質短縮試験（protein truncation test：ＰＴＴ法）〔Genomics, 20, 1-4 (1994)〕がある。該試験により蛋白質の欠損を生み出すフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出することができる。ＰＴＴ法は、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列をつないだプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来ＲＮＡより逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法でアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするｃＤＮＡを作製する。該ｃＤＮＡを用い、in vitro転写、翻訳を行うと蛋白質が生産される。該蛋白質をポリアクリルアミド電気泳動して、該蛋白質の泳動位置が完全長蛋白質に相当する位置にあれば欠損を生み出す変異は存在せず、該蛋白質に欠損がある場合は、完全長蛋白質より短い位置に該蛋白質は泳動され、該位置より欠損の程度を知ることができる。
【０１３６】
検体由来ＤＮＡおよび検体由来ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡに基づいて設計したプライマーを用いることが可能である。決定された塩基配列を解析することにより、検体由来ＤＮＡまたは検体由来ｃＤＮＡに糖尿病の原因となる変異があるか否かを判別することができる。
【０１３７】
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７遺伝子のコード領域以外の変異は、該遺伝子の付近またはその中のイントロンおよび調節配列などの、非コード領域を検査することによって検出することができる。非コード領域中の変異に起因する糖尿病は、上記に記載した方法と同様の方法により検出することができる。
【０１３８】
このようにして非コード領域における変異の存在が示唆された該遺伝子については、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡをハイブリダイゼーションのプローブとして用いることにより、クローン化することができる。非コード領域における変異は上述のいずれかの方法に準じて探索することができる。
【０１３９】
見出された変異は、Handbook of Human Genetics Linkage. The John Hopkins University Press, Baltimore(1994)に記載された方法に従い統計処理を行うことで、糖尿病との連鎖があるＳＮＰｓ(シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム）として同定することができる。また、糖尿病の病歴を持つ家族から、先に示した方法に従いＤＮＡを取得し、変異を検出することで、糖尿病の原因遺伝子を同定することができる。
【０１４０】
６．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを用いた糖尿病の診断方法
上記方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげられる。
糖尿病の原因は、ヒトのいずれかの組織における遺伝子の変異を検出することによって確認することができる。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変異を遺伝した個人は、糖尿病を発症し易い傾向である可能性がある。当該変異は、該個人の体のいずれかの組織から抽出したＤＮＡを試験することによって検出することができる。例えば、ヒトから採血した血液の細胞からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、糖尿病を診断することができる。また、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を採取してＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、出生前の糖尿病診断を行うことができる。
【０１４１】
また糖尿病を発症した患者の、病巣部位の生体組織からＤＮＡを取得し、遺伝子の変異を検出することにより、糖尿病の種類を診断し、投与する薬物の選択などに利用することができる。生体組織からのＤＮＡは、周囲の正常組織から遊離した病巣部位の組織を単離してトリプシンなどで処理し、得られた細胞を適当な培地で培養し、培養した細胞から染色体ＤＮＡならびにｍＲＮＡを抽出することにより取得することができる。
【０１４２】
以下、診断を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＤＮＡを診断検体由来ＤＮＡと称する。また、診断を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＲＮＡより合成したｃＤＮＡを診断検体由来ｃＤＮＡと称する。
配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、および診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを用い、上記５のアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異を検出する方法に準じた方法により糖尿病の診断を行うことができるが、上記５の方法により、糖尿病との因果関係が見出された変異を診断検体由来ＤＮＡまたは診断検体由来ｃＤＮＡが有しているか否かを診断する方法としては、（１）制限酵素部位の検出、（２）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法（ASO：allele specific oligonucleotide hybridization）、（３）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ（ARMS：amplification refractory mutation system）、（４）オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA：oligonucleotide ligation assay）、（５）PCR-PHFA法（PCR-preferential homoduplex formation assay）、（６）オリゴＤＮＡアレイを用いる方法〔蛋白質核酸酵素、43, 2004-2011 (1998)〕等の方法が挙げられる。
【０１４３】
制限酵素部位の検出は、以下に記載の方法に従い行うことができる。すなわち、単一塩基の変化により制限酵素部位が消失または発生する場合は、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてPCRで増幅したのち、制限酵素で消化し、得られた制限酵素切断ＤＮＡ断片を正常人の場合と比較することで簡便に変異を検出することができる。さらに詳細に塩基の変化を診断する方法としては、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列情報ならびに上記５の方法により同定された変異の情報を組合せることでオリゴヌクレオチドプロ−ブを設計し、該オリゴヌクレオチドプローブをフィルターに結合させてハイブリダイズを行うリバースドットブロット法で変異を検出する方法を挙げることができる。
【０１４４】
対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）を利用する方法は、短い合成ＤＮＡプローブが、完全に対合する塩基配列とのみハイブリダイズする特徴を利用した方法で、１塩基の変異を容易に検出することができる。具体的には、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列と、上記５で同定された塩基の変異に基づき設計したオリゴヌクレオチドをフィルターに結合させ、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列を用いて設計したプライマーと標識したｄＮＴＰを用いたＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイズを行うリバースドットブロット法をあげることができる。
【０１４５】
リバースドットブロットとは、スライドガラスまたはシリコンなどの基盤に直接、測定対象とするＤＮＡに対応する変異のないＤＮＡの塩基配列と別途同定された該ＤＮＡの変異に基づき設計したオリゴヌクレオチドを合成して、高密度のアレイであるＤＮＡチップを用いて、少量の診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡを反応させて多様な変異をより簡便に検出する方法である。本方法は、大規模な診断目的に適した変異検出法である。
【０１４６】
塩基の変異は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）法によって以下に示す方法によっても検出できる。
調べようとするアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの変異部位をその３’末端に有する２０塩基程度のオリゴヌクレオチド、および該変異部位に続く２０塩基程度のオリゴヌクレオチドを配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計、合成する。このとき、例えば前者のオリゴヌクレオチドの５’末端にはビオチンを、後者のオリゴヌクレオチドの３’末端にはジゴケシゲニンなどの異なる標識体を付加しておく。次に診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、ＰＣＲによりアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを増幅する。次に該増幅ＤＮＡ断片と上記２本のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、ＤＮＡリガーゼで２本のオリゴヌクレオチドを連結させる。連結反応後、2本鎖ＤＮＡを熱変性させて得られるビオチン標識一本鎖ＤＮＡを、例えばアビジンに結合するＤＮＡとして回収する。変位部位を有する増幅ＤＮＡ断片とハイブリダイズした上記２種類のオリゴヌクレオチドは上記連結反応により連結しているので、その３’末端にジゴケシゲニンを有するＤＮＡとして得られ、該結合ＤＮＡを簡単に検出することができる。よって、変位を有するアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを迅速、簡便に検出可能である。ＯＬＡは電気泳動や遠心分離操作が不要なために、多数のサンプルを効果的に短期間で診断するのに適した変異検出法である。
【０１４７】
また、以下のPCR-PHFA法により微量な変異遺伝子を定量的かつ容易に検出することができる。
PCR-PHFA法は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）、非常に高い特異性を示す液相でのハイブリダイゼーション、およびELISAと同様の操作でＰＣＲ産物を検出するED-PCR(enzymatic detection of PCR product)の３つを組み合わせた方法である。dinitrophenyl(DNP)標識およびビオチン標識したプライマーセットを用いて、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、両末端標識増幅ＤＮＡ断片を調製する。次に、標識プライマーと同じ塩基配列を有する未標識プライマーセットを用いて、診断検体由来ＤＮＡあるいは診断検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに増幅して得られる非標識増幅ＤＮＡ断片を、該標識増幅ＤＮＡ断片と混合する。このとき非標識増幅ＤＮＡ断片は標識増幅ＤＮＡ断片に対し、２０〜１００倍の大過剰量を用いる。そして該混合物を熱変性処理後、１℃／５分〜１０分間程度の緩やかな温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を優先的に形成させる。こうして再形成された標識ＤＮＡは、ビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウエルに捕獲吸着させ、ＤＮＰを介して酵素標識抗ＤＮＰ抗体を結合させて酵素による発色反応により検出する。検体中に標識ＤＮＡと同じ配列の遺伝子が存在しない場合は、元の２本鎖の標識ＤＮＡが優先的に再形成されて発色を示す。これに対し、同じ塩基配列の遺伝子が存在する場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成される標識ＤＮＡは減少するので、発色は著しく低下する。これにより、既知の変異・多型遺伝子の検出・定量が可能となる。
【０１４８】
７．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の診断方法
ヒト生体試料ならびヒト初代培養細胞での、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質の発現量の変化ならびに発現している蛋白質の構造変化を同定することは、糖尿病を発症する危険性や既に発症した膵臓機能低下の原因を知る上で有用である。
【０１４９】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質の発現量や構造変化を検出して診断する方法としては、上記４に記載した蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などがあげられる。
【０１５０】
上記方法による診断に供する検体としては、患者より取得した膵臓病巣部位の組織、血液、血清、尿、便、唾液などの生体試料そのものあるいは、該生体試料から取得した細胞ならびに細胞抽出液が用いられる。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。
【０１５１】
８．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のいずれかを認識する抗体を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７を挙げることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質としての活性を有する蛋白質であれば、天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質を挙げることができる。
アクチビンＡＢの具体的例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドより構成される二量体蛋白質を挙げることができ、アクチビンＢの具体的例としては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二量体蛋白質を挙げることができる。
ＡＬＫ７は、ＡＬＫ７としての活性、すなわちアクチビンＡＢまたはアクチビンＢで活性化され、細胞のインスリン分泌を促進する活性を有する蛋白質であれば天然物由来の蛋白質でも、遺伝子工学的手法により製造された蛋白質であってもよく、例えば天然由来の該蛋白質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７を挙げることができる。
ＡＬＫ７の具体的例としては、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡにコードされる蛋白質、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるＤＮＡとしては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＡＬＫ７をコードするＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、上記本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよい。
アクチビンＡＢ、またはアクチビンＢをコードするＤＮＡの具体的例としては、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。またＡＬＫ７をコードするＤＮＡの具体的例としては、配列番号５および６で表される塩基配列を含むｃＤＮＡ、配列番号１０で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる抗体としては、上記本発明のスクリーニング方法に用いられる蛋白質、またはそのポリペプチド断片を認識する抗体をあげることができる。
【０１５２】
（１）アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に特異的に作用する化合物のスクリーニング
ＡＬＫ７蛋白質をII型アクチビン受容体と共に発現するように形質転換した微生物、動物細胞、または昆虫細胞、および精製したアクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に特異的に作用する化合物をスクリーニングするために有用である。II型アクチビン受容体としては、II型アクチビン受容体としての活性を有する蛋白質であればいずれでもよく、例えばCell, 65, 973-982(1991)に記載されているActRIIA等を挙げることができる。スクリーニングにより得られた化合物は、糖尿病治療薬として有用である。
【０１５３】
上記スクリーニングの１つの方法は、ＡＬＫ７蛋白質とII型アクチビン受容体を生産するように形質転換した動物細胞（以後、探索用形質転換体と称する）において、ＡＬＫ７の活性化を特異的に誘導する化合物を選択することである。ＡＬＫ７の活性化を検出する方法としては、該探索用形質転換体の細胞応答を測定する方法を挙げることができる。
【０１５４】
具体的な細胞の応答としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、またはレポーター遺伝子の発現変動などをあげることができる〔J. Biol. Chem., 271, 1857 (1996)、Science, 268, 98 (1995) 、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 275, 1274 (1995)、J. Biol. Chem., 272, 1822 (1997)、 Journal of Receptor and Signal Transduction Research, 17, 57 (1997)、Endocrinology 138, 1400 (1997)、Endocrinology 138, 1471 (1997)、 Nat. Biotechnol., 16, 1334 (1998)、Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 471 (1998)、Brit. J. Pharmacol., 125, 1387 (1998)、Trends Biotechnol., 15, 487 (1997)、Anal. Biochem., 252, 115 (1997)、Nature, 358, 325 (1992)、Nature, 393, 272 (1998)、Cell, 92, 573 (1998)、J. Biol. Chem., 272,27497 (1997)、Trends Pharmacol. Sci., 18, 430 (1997)、Trends Pharmacol.Sci., 20, 370 (1999)、WO98/46995〕。
【０１５５】
レポーター遺伝子を用いて細胞の応答をモニターする場合は、例えば、該探索用形質転換体に、ＡＬＫ７の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを導入することにより、ＡＬＫ７の活性化をレポーター遺伝子の発現で測定することができる。該プロモーターとしては、例えばＩＣＡＭ−１遺伝子のプロモーター、ｃ−ｆｏｓのプロモーター、Ｋｒｏｘ−２４のプロモーター〔Biochem. J., 320, 145 (1996)〕、インスリン遺伝子のプロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター、チロシンハイドロキシラーゼ遺伝子のプロモーターなどが利用できる。また、該プロモーターは、適当な転写因子の結合配列と基本プロモーターからなる人工プロモーターでもよい。転写因子の結合配列としては、例えばＣＲＥ（CREB binding element）、ＴＲＥ（TPA responsive element）、ＳＲＥ（serum responsive element）、ＳＢＥ−ｌｕｘプロモーター〔J. Biol. Chem., 273, 21145-21152 (1998)〕などが利用できる。レポーター遺伝子としては、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子などが利用できる。
【０１５６】
また、精製したアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質、または該蛋白質の一部を構成するポリペプチドは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に特異的に結合する標的化合物を選択するのに用いることができる。例えば、該蛋白質を固相担体等に固定しておき、被験試料を接触させた後、十分に該プレートを洗浄し、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質に結合している化合物を該蛋白質から遊離させることにより、標的化合物を選択することができる。
【０１５７】
上記スクリーニングのもう１つの方法としては、アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の一部を構成するペプチドを多数、プラスチックピンまたはある種の固体支持体上で高密度に合成し、該ペプチドに選択的に結合する化合物あるいは蛋白質を効率的にスクリーニングする方法がある（ＷＯ84/03564）。
【０１５８】
（２）アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡの転写あるいは翻訳を調節する化合物のスクリーニング方法
膵臓由来の細胞株で、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡあるいはアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現を促進する活性を有する化合物も、糖尿病治療薬として有用である。膵臓由来の細胞株としては、マウス膵臓β細胞種ＭＩＮ６細胞［Endocrinology, 127, 126-132（1990）］、マウスインスリノーマ細胞ＮＩＴ−１細胞（ATCC CRL-2055）、マウス膵臓α細胞種αＴＣ１細胞（ATCC CRL-2350）、ラット膵管上皮細胞ＡＲＩＰ細胞（ATCC CRL-1674）などを挙げることができる。
【０１５９】
膵臓由来の細胞株と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞株におけるアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定、比較することでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子の転写を抑制または促進する物質をスクリーニングすることができる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、上記３のＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮase保護アッセイ法により検出することができる。
【０１６０】
また、膵臓由来の細胞株と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞株におけるアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現量を測定、比較することでアクチビンＡＢ、アクチビンＢならびにＡＬＫ７遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制または促進する物質をスクリーニングすることができる。アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質の発現量は、上記４のアクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定することができる。
【０１６１】
さらに、アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結した組換え体ＤＮＡで形質転換された動物細胞と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該動物細胞における該レポーター遺伝子の発現量を測定、比較することでアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子の発現を抑制または促進する物質をスクリーニングすることができる。アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖またはＡＬＫ７遺伝子のプロモーターは、該プロモーターの塩基配列が公知である場合は、該配列に従い設計、合成することができるオリゴヌクレオチドを用いて動物由来の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにて取得することができる。プロモーター配列が公知でない場合は、上記遺伝子のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することができる。
【０１６２】
細胞中のレポーター遺伝子の発現量は公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編, 新細胞工学実験プロトコール, 秀潤社 (1993)、Biotechniques, 20, 914 (1996)、J. Antibiotics, 49, 453 (1996) 、Trends in Biochemical Sciences, 20, 448 (1995)、細胞工学, 16, 581 (1997)〕を用いて測定することができる。
【０１６３】
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
【０１６４】
上記の方法により取得した化合物は、NOD(Non-Obese Diabetes)マウスなどの糖尿病モデル動物に薬剤として投与し、該動物のインスリン分泌量ならびに血糖値などを公知の方法に従って測定することにより、該化合物のその糖尿病への治療効果を評価することが可能である。
【０１６５】
９．アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質は、膵機能低下を原因とする種々の糖尿病において、膵臓の構造ならびに機能を再構築することならびに膵臓からのインスリン分泌を促進することに用いることができる。
【０１６６】
上記アクチビンＡＢ、アクチビンＢは、ＡＬＫ７のリガンド蛋白質であれば天然由来のものでも、遺伝子工学的手法によって製造された組み換え蛋白質であってもよい。天然由来のＡＬＫ７のリガンド蛋白質としては、例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のＡＬＫ７リガンド蛋白質をあげることができるが、ヒト糖尿病の治療および／または予防のための医薬、すなわち膵臓機能改善剤、膵臓再生促進剤として用いる場合は、ヒト由来のＡＬＫ７リガンド蛋白質とアミノ酸配列が一致する蛋白質を用いることが好ましい。
【０１６７】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬は、有効成分として該蛋白質のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
【０１６８】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１６９】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１７０】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該ポリペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該ポリペプチドを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該ポリペプチドおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１７１】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり10μｇ/kg〜８mg/kgである。
【０１７２】
１０．アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
アクチビンＡＢ、アクチビンＢまたはＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医薬製剤形態、および投与方法等は、上記９のとおりである。
【０１７３】
１１．上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬
上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する糖尿病の治療および／または予防のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医薬製剤形態等は、および投与方法等は、上記９のとおりである。
【０１７４】
１２．アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質をコードするＤＮＡを含有する糖尿病用遺伝子治療剤
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質をコードするＤＮＡを糖尿病の遺伝子治療薬とてして用いる方法としては、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記９に記載した常法に従って製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法をあげることができる。
【０１７５】
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。
アクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７蛋白質の完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
【０１７６】
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、アクチビンＡＢ、アクチビンＢの完全長ｃＤＮＡに相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。
【０１７７】
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。
パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげられる。
【０１７８】
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞でアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,6733-6737 (1995)]、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ[Nucleic Acids Res., 18, 3587-3596 (1990)]、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ[Journal of Virology, 72, 8150-8157(1998)]、ｐＡｄｅｘ１[Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821(1995)]等が用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔特開平2-227075号公報〕、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
【０１７９】
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記９の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ(in vivo)遺伝子移入と組み合わせることにより、膵臓病巣にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。
すなわち、適当なサイズのアクチビンβＡ鎖、アクチビンβＢ鎖、またはＡＬＫ７をコードするＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン-コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
【０１８０】
アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７遺伝子のＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法[Virology, 52, 456-467 (1973)；Science, 209, 1414-1422 (1980)]、マイクロインジェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 5399-5403 (1980)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 7380-7384 (1980)；Cell, 27, 223-231 (1981)；Nature, 294, 92-94 (1981)]、リポソームを介した膜融合-介在移入法[Proc. Natl.Acad. Sci. USA，84, 7413-7417 (1987)；Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989)；J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989)；Hum. Gene Ther., 3, 267-275,(1992)；Science, 249, 1285-1288 (1990)；Circulation, 83, 2007-2011 (1992)]あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体-媒介ＤＮＡ移入法[Science, 247,1465-1468 (1990)；J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3655-3659 (1991)；J. Biol. Chem., 264, 16985-16987 (1989)；BioTechniques, 11, 474-485 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3410-3414 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 4255-4259 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 4033-4037 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 8850-8854 (1991)；Hum. Gene Ther., 3, 147-154 (1991)]等をあげることができる。
【０１８１】
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている[Hum. Gene Ther.3, 399-410 (1992)]。したがって同様の効果が膵臓病巣でも期待される。ＤＮＡを膵臓病巣に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体-媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ(通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる)をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド-ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ-蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
【０１８２】
１３．ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて膵臓に特異的に薬物を輸送する方法（ドラッグデリバリー方法）
当該ドラッグデリバリー方法に用いられる抗体は、ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれでも良いが、特にヒト化抗体を用いることが望ましい。
【０１８３】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR（Complementary Determining Region;相補性決定領域；以下、CDRと記す）移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はH鎖として、可変領域はV領域としてHVまたはVHとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はL鎖としてLVまたはVLとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はC領域としてCHとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、CLとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０１８４】
ＡＬＫ７蛋白質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
【０１８５】
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【０１８６】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型CDR 移植抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に反応し、ＡＬＫ７蛋白質に結合する、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR 配列で任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR 配列をそれぞれ置換したV 領域をコードするcＤＮＡを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR 移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
【０１８７】
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【０１８８】
ヒト抗体は、元来、ヒトの体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
【０１８９】
ヒトの体内に存在する抗体は、例えば、以下の方法により取得することができる。
ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルス等を感染させ不死化させた後、クローニングする。得られた目的とする抗体を産生するリンパ球を培養し、培養物中より該抗体を取得することができる。
【０１９０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Fab、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、完全型ヒト抗体へ変換することができる。
【０１９１】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法としては、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させる方法があげられる。
【０１９２】
抗体断片としては、Fab、Fab'、F(ab')₂、一本鎖抗体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（dsFv）、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される）、H鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fabは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。また、該抗体のFabをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることによりFabを取得することができる。
【０１９３】
F(ab')₂は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（H鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
F(ab')₂は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、該抗体のF(ab')₂をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、F(ab')₂を取得することができる。
【０１９４】
Fab'は、上記F(ab')₂のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fab'は、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。また、該抗体のFab'断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、Fab'を取得することができる。
【０１９５】
一本鎖抗体（以下、scFvとも称す）は、一本のVHと一本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Pと称す）を用いて連結した、VH−P−VLないしはVL−P−VHポリペプチドを示す。本発明で使用されるscFvに含まれるVHおよびVLは、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、またはＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用いることができる。
【０１９６】
一本鎖抗体は、以下の方法により取得できる。
ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体のVHおよびVLをコードするｃＤＮＡを取得後、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、一本鎖抗体を取得することができる。
【０１９７】
ジスルフィド安定化V領域断片（以下、dsFvとも称す）は、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法［Protein Engineering, 7, 697 (1994)］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるdsFvに含まれるVHおよびVLはＡＬＫ７に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体から由来したものを用いることができる。
【０１９８】
ジスルフィド安定化V領域断片(dsFv)は、以下の方法により取得することができる。
ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体のVHおよびVLをコードするｃＤＮＡを取得後、dsFvをコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、dsFvを取得することができる。
CDRを含むペプチドは、Fmoc法、tBoc法等の化学合成法によって製造することができる。
【０１９９】
ＡＬＫ７蛋白質を特異的に認識する抗体から調製される融合抗体は、膵臓の病巣へ特異的に薬剤や蛋白質を運ぶ、ドラッグデリバリーに用いることができる。
融合抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片に、蛋白質、低分子化合物等の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体をいう。
該融合抗体は、ＡＬＫ７蛋白質に特異的に反応する抗体および抗体断片のH鎖或いはL鎖のN末端側或いはC末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖に、蛋白質、低分子化合物等の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる。
【０２００】
低分子化合物としては、上記８のスクリーニング方法によって得られた化合物をあげることができる。該化合物は化学的手法〔抗体入門（金光修著、１９９４年、地人書館）〕により上記抗体に結合させることができる。
蛋白質としては、膵臓の機能を亢進する活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトベーターセルリン、ヒトアクチビンＡＢ、ヒトアクチビンＢ、ヒトHGF(Hepatocyte Growth Factor)等があげられる。
【０２０１】
蛋白質との融合抗体は、以下の方法により取得できる。
抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させて、融合抗体をコードするＤＮＡを構築する。該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入後、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物などの宿主細胞へ導入し、該ＤＮＡを発現させることにより、融合抗体を取得することができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【０２０２】
【実施例】
実施例１：ＡＬＫ７過剰発現細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析
内因性にＡＬＫ７を発現していない、ヒト腎上皮細胞HEK293細胞（ATCC CRL-1573）を１０％ウシ胎児血清、２mmol/L グルタミン、1g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに6×10⁴細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で培養した。翌日、（１）ラットＡＬＫ７の全長ｃDNAを含むプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1996）］のＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片と動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ１（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ断片とをライゲーションすることにより作成されたプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1996）］1.5μg、（２）マウスのII型アクチビン受容体ActRIIAｃＤＮＡを含むプラスミド［Cell, 65, 973-982（1991）］を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し平滑末端化したＤＮＡ断片と、公知の動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＬＳＲ−α［Mol. Cell. Biol., 8, 466-472（1988）］をＸｈｏＩで消化し平滑末端化したＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより作成されたプラスミド［J. Biol. Chem., 272, 13835-13842（1997）］300ng、（３）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミド［J. Biol. Chem., 273, 21145-21152（1998）、Ludwig Institute for Cancer Research より譲渡］500ng、（４）ベータ・ガラクトシダーゼが動物細胞中でＣＭＶプロモーターの制御下で発現するように設計されているプラスミドｐＣＭＶβ（クロンテック社製）300ngをそれぞれリン酸カルシウム法により上記培養で得られた細胞に遺伝子導入し、更に10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、1g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地を用いて炭酸ガスインキュベーター内において３７℃で培養し、形質転換細胞を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、J. Biol. Chem., 267, 16385-16389（1992）に従ってウシ卵胞液より精製された20ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢまたはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄後、100μLの細胞溶解液（1%TritonX-100、15mmol/L 硫酸マグネシウム、4mmol/L EGTA、1mmol/L ジチオスレイトール、25mmol/L グリシルグリシン、ｐH7.8）に懸濁し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。
【０２０３】
ルシフェラーゼの活性測定は、上記の50μＬの細胞を溶解した溶解液と5μLの30mmol/L ATP溶液、100μLの0.5mmol/L luciferin溶液とを混合し、ルミノメーター（ベルトルド社）により発光量を測定することにより行い［Anal. Biochem., 171, 404-408（1988）］、ベータ・ガラクトシダーゼの活性測定は、o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）を基質として用いることにより、既報に従って行った［Bitechniques, 7, 576-579（1989）］。ルシフェラーゼの活性値はベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した［Endocrinology, 136, 5493-5503（1995）］。
【０２０４】
図１に示すように、アクチビンＡＢ、アクチビンＢによりＡＬＫ７遺伝子導入HEK293細胞で転写活性の顕著な上昇が観察された。
【０２０５】
実施例２：内因性ＡＬＫ７発現膵臓β細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析
内因性にＡＬＫ７を発現している細胞株を検索する為、配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、マウス膵臓β細胞種MIN6細胞［Endocrinology, 127, 126-132（1990）］、ヒト腎上皮細胞ＨＥＫ２９３細胞（ATCC CRL-1573）、マウスインスリノーマ細胞ＮＩＴ−１細胞（ATCC CRL-2055）、マウス膵臓α細胞種αＴＣ１細胞（ATCC CRL-2350）、ラット膵管上皮細胞ＡＲＩＰ細胞（ATCC CRL-1674）などから調製した全ＲＮＡを元に作成した一本鎖ＤＮＡを鋳型としてPCR反応を行った。その結果、マウス膵臓β細胞のモデル系として使用されているMIN6細胞で他の細胞よりも高い発現が認められた。
【０２０６】
次にこの細胞を用いて、転写活性の測定、マウスのドミナントネガティブＡＬＫ７受容体ｃＤＮＡ導入によるシグナル伝達の抑制効果を検討した。
マウス膵臓β細胞種細胞であるMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに8×10⁴細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養した。翌日、（１）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミド1μg、（２）ｐＣＭＶβ500ngをそれぞれリポフェクション法により上記培養で得られた細胞に遺伝子導入し、更に炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養することで形質転換細胞を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、60ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢまたはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該細胞を洗浄後、100μLの細胞溶解液に懸濁し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼの活性値はベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した。
【０２０７】
次に、配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして用い、配列番号１０で表される塩基配列を有するラットＡＬＫ７ｃＤＮＡを含むプラスミド［Mol. Cell Neurosci., 7, 467-478（1996）］を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。続いて該反応産物中の増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化した。反応終了後、該反応産物をアガロース電気泳動により分離し、約５００塩基対のＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片とプラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片とをＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応物を用いて大腸菌をトランスフォームし、アンピシリンを含む寒天プレート上で37℃にて培養し、アンピシリン耐性を獲得したクローンを選択した。出現したコロニーをアンピシリンを含む培地にて培養した後、プラスミドを回収し、挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を確認し、目的の塩基配列を有するクローンを選択した。
【０２０８】
以上の操作により、細胞内のキナーゼ領域を欠損し、Ｎ末端より１６７個のアミノ酸残基をコードするドミナントネガティブ型ＡＬＫ７受容体ＤＮＡを含むプラスミドを取得した。
【０２０９】
マウス膵臓β細胞種細胞であるMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、12ウェル細胞培養用プレートに8×10⁴細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養した。翌日、（１）SBE-luxルシフェラーゼレポータープラスミド1μg、（２）ベータ・ガラクトシダーゼが動物細胞中でＣＭＶプロモーターの制御下で発現するように設計されているプラスミド（クロンテック社製）500ng、（３）上記で作製したドミナントネガティブ型ＡＬＫ７受容体ＤＮＡ3μgをそれぞれリポフェクション法によりＭＩＮ６細胞に遺伝子導入し、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養することで形質転換株を得た。翌日、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄し、上記培地に懸濁後、60ng/mlのアクチビンＡ、ＡＢ、またはＢを添加した。炭酸ガスインキュベーター内において37℃で16時間培養した後、PBS緩衝液で該形質転換細胞を洗浄後、100μLの細胞溶解液に懸濁し、50μLをルシフェラーゼアッセイに、40μLをベータ・ガラクトシダーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼの活性値はベータ・ガラクトシダーゼの活性値で標準化した。
【０２１０】
図２に示すように、アクチビンＡＢ、アクチビンＢにより内因性ＡＬＫ７発現MIN6細胞で転写活性の上昇が観察され、ドミナントネガティブＡＬＫ７ｃＤＮＡの導入により転写活性の上昇は阻害された。
【０２１１】
実施例３：マウス膵臓β細胞種細胞からのインシュリン分泌の促進
内因性ＡＬＫ７受容体を発現し、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＢに反応性を有することが確認されたMIN6細胞を10％ウシ胎児血清、2mmol/L グルタミン、4.5g/Lグルコースを含有するＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、24ウェル細胞培養用プレートに7×10⁴細胞/ウェルになるように播き、炭酸ガスインキュベーター内において37℃で培養した。二日後にPBS緩衝液で細胞を洗浄し、40または80ng/mlのアクチビンＡＢを加えた培養液300μLに該細胞を懸濁した。更に二日間炭酸ガスインキュベーター内において３７℃で培養し、培養終了後上清を回収して、上清30μLを用いて市販インスリン測定キット（森永生化学研究所）を用いてELISA法によりインスリン分泌量を測定した。
図３に示すように、アクチビンＡＢにより内因性ＡＬＫ７発現MIN6細胞でインスリンの分泌亢進が認められた。
【０２１２】
【発明の効果】
本発明により、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびアクチビン受容体様キナーゼ７（ＡＬＫ７）より選ばれる蛋白質を有効成分として含有する糖尿病治療剤、該蛋白質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する糖尿病治療剤、該蛋白質または該ＤＮＡを利用した糖尿病治療剤のスクリーニング方法、該ＤＮＡまたは該蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の診断薬および診断用キット、ならびＡＬＫ７を特異的に認識する抗体を用いた糖尿病の治療および／または予防のための医薬の腎臓への輸送方法が提供される。
【０２１３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０２１４】
【配列表】

【０２１５】

【０２１６】

【０２１７】

【０２１８】

【０２１９】

【０２２０】

【０２２１】

【０２２２】

【０２２３】

【０２２４】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＬＫ７過剰発現細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析結果を示す図である。（−）はアクチビン無添加を示し、ＡＬＫ７（−）はＡＬＫ７遺伝子を導入していない細胞株を、ＡＬＫ７（＋）はＡＬＫ７遺伝子導入株を示す。
【図２】内因性ＡＬＫ７発現膵臓β細胞におけるリガンド依存性の転写活性の解析結果を示す図である。塗りつぶしカラムはＭＩＮ６細胞、白抜きカラムはドミナントネガティブＡＬＫ７発現ＭＩＮ６細胞を用いた結果を示す。また（−）はアクチビン無添加を示す。
【図３】アクチビン添加によるマウス膵臓β細胞腫細胞からのインシュリン分泌量を測定した結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to orphan receptor ALK7, activin AB, which is a ligand protein of the receptor, activin B, DNA encoding the receptor, or treatment and / or prevention of diabetes containing the DNA encoding the ligand protein. For pharmaceuticals and diagnostics. Further, a method for screening a drug for treating and / or preventing diabetes using the receptor, the ligand protein, DNA encoding the receptor, or DNA encoding the ligand protein, and a drug obtained by the screening method About.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is one of the lifestyle-related diseases that has become the biggest problem in developed countries.
Diabetes is a disease caused by an absolute deficiency of insulin, which is a hormone secreted from pancreatic β cells (type 1 diabetes), or a relative deficiency and a lack of action (type 2 diabetes). The pathophysiology of type 2 diabetes is composed of two factors: insulin secretion failure from β cells and impaired insulin action in insulin target cells (insulin resistance), and other factors that involve multiple genetic and environmental factors in a complex manner It is known that In human type 2 diabetes, there is a report that pancreatic β-cells are reduced to about 60% compared to healthy individuals [Tohoku J. Exp. Med.,129, 273-283, (1979)], it has been suggested that a decrease in the number of β-cells is associated with pathological conditions not only in type 1 but also in type 2 diabetic patients.
[0003]
Pancreatic transplantation has been carried out since the 1960s as a way to fundamentally restore insulin secretion, but in addition to the difficulty of securing donors and transplantation materials, pancreatic transplantation requires very advanced techniques. The problem is that it is a transplant [Nature Med.,6, 250-251, 2000].
[0004]
On the other hand, in recent years, pancreatic Langerhans Islet transplantation, which is technically easier compared to pancreatic transplantation, has been attempted. However, the yearly correct arrival rate is as low as 27%, and a sufficient number from the individual pancreas The difficulty of obtaining the island of Langerhans has been a problem.
[0005]
The pancreatic islets of Langerhans are composed of four types: not only β-cells that secrete insulin, but also α-cells that produce glucagon, PP cells that produce PP, and δ-cells that produce somatostatin. These pancreatic endocrine cells are highly terminally differentiated cells, and almost no neonatal phenomenon is observed in adults, and their cell division ability is extremely low. However, it has been proved mainly in animal models that the regeneration of β-cells is observed in very special situations, especially in situations involving pancreatic destruction and Langerhans island destruction [Diabetes,45, 941-945 (1996), Diabetes,46, 1281-1290 (1997), Endocrinology,138, 1750-1762 (1997), Development,118, 33-46, (1993)]. Thus, at least in rodents, the adult pancreas also has the potential to proliferate and regenerate endocrine cells, and it is believed that adult pancreatic stem cells are present in the pancreatic duct.
[0006]
In humans, the regeneration of adult β-cells as observed in rodents as described above has not been observed. However, in an autopsy of a non-diabetic dead person, insulin-positive cells consisting of several cells in the vicinity of the pancreatic duct ( single beta cell unit) is reported to be observed with high frequency. This single beta cell unit is thought to be a more undifferentiated β-cell because its morphology is smaller than that of β-cells that form the islets of Langerhans, suggesting the possibility of β-cell regeneration even in adult humans. [Diabetologia,41, 629-633 (1998)].
[0007]
As a β-cell replacement method replacing pancreas transplantation, a substance that induces β-cell proliferation / neogenesis in vivo by administration of a specific substance includes nicotinamide (Biomed. Res., A poly ADP ribose synthetase inhibitor).18, 171 (1997), Diabetes Res. Clin. Pract.,41, 1 (1998)], Reg protein [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91, 3589 (1994)]. However, nicotinamide is effective only for about one year in cases where insulin secretion ability is maintained to some extent when administered orally after the onset of diabetes [Molecular Medicine,38, 62-67 (2001)], and in transgenic mice overexpressing Reg, the number of β cells decreased and the insulin content decreased. As a result, impaired glucose tolerance was observed and 38% developed diabetes. Most of the deaths of mice that died by the age of 100 weeks were malignant tumors and lymphomas in the pancreatic duct and ovary [Abstracts of the Japan Diabetes Society, 2000]. There are also reports showing that reg gene expression is associated with canceration [Brit. J. Cancer,83, 188-1 (2000)], both nicotinamide and Reg protein are considered difficult to use in the treatment of human diabetes.
[0008]
In recent years, the existence of adult stem cells has been clarified in all tissues of adults, and the possibility of regenerative therapy for various organ dysfunctions and diseases is expected. If it is possible to efficiently induce differentiation of the above-described adult pancreas, mainly adult pancreatic stem cells that are supposed to be hidden in the pancreatic duct, into β-cells that secrete insulin, not only in type 1 but also in type 2 diabetic patients. Although it is considered that the decrease in pancreatic β-cell count and functional decline can be compensated for and lead to the radical treatment of diabetes, such a technique has not been established.
[0009]
On the other hand, in recent analysis of pancreatic development, it has been revealed that activin receptor-like kinase 7 (ALK7) is specifically expressed in pancreatic cells [Biochem. Biophys. Res. Comm.,254, 707-712 (1999)]. ALK7 is a molecule belonging to the TGF-β receptor family [Mol. Cell Neurosci.,7, 467-478 (1996); J. Biol. Chem.,271, 30603-30609 (1996)], although it has been classified as a type I receptor, its ligand has not been clarified so far.
[0010]
In general, it has been clarified that the functions of receptors belonging to the TGF-β receptor family are borne by different molecules of type I and type II. The ligand first binds to the type II receptor, and the ligand and II The complex of type I receptor forms a complex with type I receptor, and when the type I receptor is activated, a signal is transmitted into the cell [Endocrinol.,141, 2281-2284 (2000)].
[0011]
In JP-T-10-510143, rat-derived ALK7 was obtained, and the amino acid and cDNA sequences of the ALK7 were shown. By analyzing the expression distribution of the ALK7 mRNA in each organ of the rat, the ALK7 was Although it is estimated to be effective for the treatment of neurological diseases, there is no description that the ligand of ALK7 was specifically identified and acquired.
[0012]
On the other hand, activins are cytokines belonging to the TGF-β superfamily and have a dimer structure like TGF-β, etc., but five types of subunits (called β subunits) are known. In mammals, it has been clarified that βC and βE exist in addition to βA and βB [Biochem. Biophys. Res. Commun.,228, 669-674 (1996); Biochim. Biophys. Acta.,1307, 145-148 (1996)]. Activins that have been confirmed to be expressed as proteins in mammals so far are activin A (βA-βA), activin AB (βA-βB), and activin B (βB-βB). As described above, the receptor structure of activins (activin A, activin AB, activin B) is typical of the TGF-β receptor family and binds to a type II receptor (ActRIIA or ActRIIB). Signals are thought to be transmitted by activating type I receptor (ALK4) [Endocrinol.,141, 2281-2284 (2000)]. In addition, no clear difference in activity has been recognized between activins A, AB, and B according to current knowledge.
[0013]
Analysis of mutant type II activin receptor genes lacking enzyme activity and constitutively active type I activin receptor gene-introduced mice indicate that activins are important for functional differentiation of pancreatic β cells [J. Clin. Invest.,102, 294-301 (1998)], the effect of duplication of functions with molecules belonging to other TGF-β families has not been determined, and details of the functions of activins have not been clarified. No functional differences are suggested. Until now, it has been clarified that the expression of βB is relatively limited compared to βA such as pituitary gland and ovary [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85247-251 (1988)]. Subsequently, it has been reported that both βA and βB are expressed in the pancreas [Endocrinology,133, 624-630 (1993); FEBS Letters,319, 217-220 (1993); J. Gastrointest. Surg.,Four, 269-275 (2000)], these examination results only show examinations on mRNA expression, and it is not pointed out that there are functional differences in activins A, AB and B.
[0014]
Thus, although activins have been suggested to have some effect on pancreatic function and the like, there is no knowledge that causes functional differences between molecular species, and activins A, AB, B It is not expected that different functions are involved in pancreas development / differentiation and functional control.
As described above, the search for a pancreatic regeneration factor has attracted attention as a therapeutic agent having a novel pancreatic function improving action, but no molecule applicable to actual medical treatment has been identified. In addition, it has been revealed that ALK7 is expressed in pancreatic β cells, and although it has been suggested that it plays some role in pancreatic function control etc., its specific function and its ligand are known. Not.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
If adult pancreatic stem cells that are thought to be present in the adult pancreas can be induced to differentiate into functionally mature pancreatic beta cells that secrete insulin, the number and function of pancreatic beta cells in patients with type 1 and type 2 diabetes It compensates for the decrease and leads to the curative treatment of diabetes. It is desired to identify a molecule having such activity and develop a drug that improves pancreatic function using the molecule.
[0016]
That is, an object of the present invention is to provide a substance exhibiting an action of promoting glucose-dependent insulin secretion as a pharmaceutical for the treatment and / or prevention of diabetes.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and a ligand of ALK7 belonging to a type I receptor of the TGF-β receptor family known to be specifically expressed in pancreatic β cells is Known activins AB and B were identified. Furthermore, it was clarified that information is transmitted through the type I receptor ALK7 and the type II receptor ActRIIA expressed in pancreatic β cells. Furthermore, the inventors found that administration of activin AB to a pancreatic β-cell-like model cell shows a glucose-dependent insulin secretion promoting action, thereby completing the present invention.
That is, the present invention provides the following (1) to (35).
[0018]
(1) A medicament for the treatment and / or prevention of diabetes comprising a protein selected from the group consisting of activin AB, activin B, and ALK7 as an active ingredient.
(2) A medicament for treating and / or preventing diabetes comprising any of the following proteins as an active ingredient.
[A] a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
[B] From a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein having a function as a ligand of ALK7;
[C] From a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein having a function as a ligand of ALK7; or
[D] a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A dimeric protein composed of a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added, and having a function as a ligand for ALK7:
[0019]
(3) A medicament for treating and / or preventing diabetes comprising any of the following proteins as an active ingredient.
[A] a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
[B] From a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein having a function as a ligand of ALK7; or
[C] a dimeric protein composed of a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A protein having a function as a ligand of ALK7:
[0020]
(4) A medicament for treating and / or preventing diabetes comprising any of the following proteins as an active ingredient.
[A] a protein encoded by a cDNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6; or
[B] a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 And a protein having a function as a receptor protein of activin AB or activin B:
[0021]
(5) A medicament for treating and / or preventing diabetes comprising any of the following polypeptides as an active ingredient.
[A] a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2; or
[B] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in SEQ ID NO: 1 or 2, and constitutes a protein having a function as a ligand of ALK7 A polypeptide to do;
[0022]
(6) The medicament according to any one of the above (1) to (5), wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes has an action of improving pancreatic function.
(7) The medicament according to any one of (1) to (5) above, wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes has an action of promoting insulin secretion from pancreatic β cells.
(8) The medicament according to any one of (1) to (5) above, wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes has an action of promoting regeneration of pancreatic exocrine cells and pancreatic endocrine cells.
(9) An insulin secretagogue comprising a protein selected from the group consisting of activin AB, activin B, and ALK7 as an active ingredient.
[0023]
(10) A gene therapy agent for treating and / or preventing diabetes, comprising DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7.
(11) A gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes containing any of the following DNAs.
[A] DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2;
[B] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and function as a ligand of ALK7 DNA encoding a polypeptide constituting a protein having
[C] DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 4:
[0024]
(12) A gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes containing any of the following DNAs.
[A] DNA encoding a protein encoded by cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6; or
[B] a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 And a DNA encoding a protein having a function as a receptor protein of activin AB or activin B:
[0025]
(13) The gene therapy agent according to any one of the above (10) to (12), wherein the gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes has an action of improving pancreatic function.
(14) The gene therapy agent according to any one of (10) to (12) above, wherein the gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes has an action of promoting insulin secretion from pancreatic β cells.
(15) The gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes has the action of promoting regeneration of pancreatic exocrine cells and pancreatic endocrine cells, as described in any one of (10) to (12) above Gene therapy agent.
(16) An insulin secretagogue comprising a DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7.
[0026]
(17) A diagnostic agent for diabetes containing the DNA, oligonucleotide or derivative of the oligonucleotide according to any of [a] to [c] below.
[A] DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7, or a DNA that is a partial fragment thereof;
[B] DNA selected from DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, cDNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and 6, or DNA which is a partial fragment of these DNAs
[C] an oligonucleotide having a sequence consisting of 5 to 60 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or the base sequence of cDNA comprising the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, Oligonucleotide having a sequence complementary to oligonucleotide or derivative of said oligonucleotide
[0027]
(18) A diagnostic agent for diabetes containing an antibody that recognizes a protein selected from the group consisting of activin AB, activin B, and ALK7.
(19) A diagnostic kit for diabetes containing the DNA, oligonucleotide or derivative of the oligonucleotide according to (17) above, or the antibody according to (18) above.
[0028]
(20) (i) an expression level of the polypeptide or protein in a cell expressing the polypeptide or protein according to any one of [a] to [d] below, and (ii) the polypeptide or protein. The expression level of the polypeptide or protein according to any one of [a] to [d] below from the test sample is compared with the expression level of the polypeptide or protein when the cell to be expressed is brought into contact with the test sample. A method for screening a drug for the treatment and / or prevention of diabetes, characterized by selecting a compound that increases the blood pressure.
[A] a protein selected from activin AB, activin B, and ALK7;
[B] a polypeptide or protein selected from a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a protein encoded by a cDNA comprising the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6;
[C] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and ALK7 A polypeptide constituting a protein having a function as a ligand of
[D] a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 And a protein having an activity as a receptor protein of activin AB or activin B:
[0029]
(21) (i) the function of a cell expressing the polypeptide or protein according to any one of the following [a] to [d], and (ii) contacting the cell expressing the polypeptide or protein with a test sample A method for screening a drug for the treatment and / or prevention of diabetes, comprising comparing a function of a cell in the case of treatment and selecting a compound having an activity of controlling the function of the cell from a test sample.
[A] a protein selected from activin AB, activin B, and ALK7;
[B] a polypeptide or protein selected from a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a protein encoded by a cDNA comprising the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6;
[C] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and ALK7 A polypeptide constituting a protein having a function as a ligand of
[D] a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 And a protein having an activity as a receptor protein of activin AB or activin B:
[0030]
(22) The screening method according to (20) or (21) above, wherein the cell is a cell expressing a type II activin receptor.
(23) The screening method according to any one of (20) to (22), wherein the cell is a pancreatic β cell type cell.
(24) Reporter gene downstream of a region that controls transcription of a gene encoding a polypeptide or protein according to any one of [a] to [d] belowChildA transformant transformed with DNA containing linked DNA is contacted with a test sample, and expression of a gene encoding the polypeptide or protein according to any one of the following [a] to [d] from the test sample: A method for screening a drug for the treatment and / or prevention of diabetes, characterized by selecting a compound that increases the blood pressure.
[A] a protein selected from activin AB, activin B, and ALK7;
[B] a polypeptide or protein selected from a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a protein encoded by a cDNA comprising the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6;
[C] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and ALK7 A polypeptide constituting a protein having a function as a ligand of
[D] a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 And has activity as a receptor protein of activin AB or activin Bprotein
[0031]
(25) The method according to any one of (20) to (24), wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes is a compound having an action of improving pancreatic function.
(26) The method according to any one of (20) to (24) above, wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes is a compound having an action of promoting insulin secretion from pancreatic β cells.
(27) The method according to any one of (20) to (24) above, wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes is a compound having an action of promoting regeneration of pancreatic exocrine cells or pancreatic endocrine cells.
(28) A compound obtained by the method according to any one of (20) to (24) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[0032]
(29) A medicament for the treatment and / or prevention of diabetes comprising the compound according to (28) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(30) A medicament for the treatment and / or prevention of diabetes obtained by combining an antibody recognizing ALK7 and the compound of the above (28) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(31) The medicament for treating and / or preventing diabetes according to the above (29) or (30), which is a medicament having an effect of improving pancreatic function.
(32) The medicament for treating and / or preventing diabetes according to the above (29) or (30), which is a medicament having an action of promoting insulin secretion from pancreatic β cells.
(33) The medicament for treating and / or preventing diabetes according to the above (29) or (30), which is a medicament having an action of promoting regeneration of pancreatic exocrine cells or pancreatic endocrine cells.
[0033]
(34) A treatment for diabetes characterized by selectively accumulating in the pancreas a fusion antibody obtained by combining an antibody recognizing ALK7 and a drug for the treatment and / or prevention of diabetes that acts on ALK7. And / or a method of transporting a medicament for prevention.
(35) The method according to the above (34), wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes is the compound according to the above (28) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[0034]
According to still another aspect of the present invention, an effective amount of the protein or polypeptide according to any one of (1) to (5) above for treatment and / or prevention is administered to mammals including humans. A method for the treatment and / or prevention of diabetes is provided.
According to still another aspect of the present invention, there is provided use of the protein or polypeptide according to any one of (1) to (5) above in the manufacture of a medicament for treating and / or preventing diabetes. .
[0035]
According to still another aspect of the present invention, diabetes comprising administration of an effective amount of the DNA according to any one of (10) to (12) above to mammals including humans for treatment and / or prevention Methods for the treatment and / or prevention of are provided.
According to still another aspect of the present invention, there is provided use of the DNA according to any one of (10) to (12) above in the manufacture of a gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes.
[0036]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the protein contained in the medicament of the present invention include activin AB, activin B, and ALK7. As long as activin AB and activin B are proteins having an activity as a ligand protein of ALK7, they may be proteins derived from natural products or proteins produced by genetic engineering techniques. Can include ALK7 ligand proteins derived from all mammals such as humans, monkeys, pigs, cows, sheep, horses and rats.
Specific examples of activin AB include a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, Specific examples of activin B include a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
ALK7 is a protein produced by genetic engineering techniques, even if it is a protein that is activated by activin AB or activin B and is activated by activin AB and has the activity of promoting cell insulin secretion. For example, examples of the naturally-derived protein include ALK7 derived from all mammals such as human, monkey, pig, cow, sheep, horse, and rat.
A specific example of ALK7 includes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
[0037]
Moreover, as a protein contained in the medicament of the present invention,
(A) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A protein that is a dimeric protein composed of a polypeptide and has an activity as an ALK7 ligand,
(B) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A protein which is a dimeric protein composed of a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the above amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added, and which has activity as an ALK7 ligand;
(C) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A dimeric protein composed of a polypeptide and having an activity as an ALK7 ligand,
(D) a dimeric protein composed of a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and ALK7 A protein having activity as a ligand,
(E) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 And a protein having ALK7 activity.
[0038]
Examples of the polypeptide contained in the medicament of the present invention include activin βA chain and activin βB chain. Specifically, the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be mentioned. And a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an activity as activin AB. A polypeptide comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and as activin AB or activin B Polypeptides constituting a protein having the above activity are also exemplified as polypeptides contained in the medicament of the present invention.
[0039]
Furthermore, a fusion protein with the protein or polypeptide obtained by adding various polypeptides to the protein or polypeptide is also a protein or polypeptide contained in the medicament of the present invention. Examples of fusion proteins include maltose binding proteins, oligo-histidines, antibody peptide epitopes, human immunoglobulin constant regions, protein A and the like. The fusion protein may also have a sequence that can be specifically cleaved by a known method.
[0040]
One or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 A protein comprising an added amino acid sequence and having an activity as activin AB, activin B or ALK7, or a polypeptide constituting a protein having an activity as activin AB or activin B is known as Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter "Current Protocols in Molecular Biology"). (Abbreviated as biology), Nucleic Acids Research,Ten, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 6409 (1982), Gene,34, 315 (1985), Nucleic Acids Research,13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488 (1985) and the like, for example, comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and 6 It can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a protein encoded by cDNA.
[0041]
The number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is 1 or more, and the upper limit is not particularly limited. However, the number can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-specific mutation method. 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
[0042]
In the amino acid sequence of the protein or polypeptide contained in the medicament of the present invention, one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in any one or more amino acid sequences in the same sequence. Means that there is a deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues, and a deletion, substitution, insertion and / or addition may occur simultaneously. The added amino acid residue may be a natural type or a non-natural type. Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine , L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
[0043]
Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
Group C: asparagine, glutamine
Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
Group F: serine, threonine, homoserine
Group G: phenylalanine, tyrosine
[0044]
In addition, in order for the protein or polypeptide contained in the medicament of the present invention to be a polypeptide constituting a protein having an activity as activin AB or activin B or a protein having an activity as activin AB or activin B, It preferably has at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. In addition, in order for the protein contained in the medicament of the present invention to have activity as ALK7, at least 60% or more of the amino acid sequence encoded by the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, usually Preferably has an identity of 80% or more, particularly 95% or more.
[0045]
The identity of amino acid sequences and base sequences is determined by the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, Karlin and Altschul,90, 5873 (1993)] and FASTA (Methods Enzymol.,183, 63 (1990)]. Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed [J. Mol. Biol.,215, 403 (1990)]. When a base sequence is analyzed by BLASTN based on BLAST, the parameters are, for example, Score = 100 and wordlength = 12. Further, when the amino acid sequence is analyzed by BLASTX based on BLAST, the parameters are set to, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
[0046]
Examples of the method for confirming whether the protein or polypeptide contained in the medicament of the present invention has activity as a ligand for ALK7 include, for example, recombinant cells expressing type II activin receptor and ALK7, Method for measuring cellular response when contacted with the protein, or measurement of insulin secretion from the cultured cell when contacting the polypeptide or protein with a cultured cell possessing a pancreatic β-cell trait And how to do it.
[0047]
Examples of cellular responses include arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, c-fos activation, pH reduction, cell proliferation activity, melanin pigment Aggregation or diffusion, or expression level of reporter gene can be raised.
[0048]
As a method for confirming whether or not the protein contained in the medicament of the present invention has an activity as ALK7, a recombinant cell in which a type II activin receptor and the protein are expressed, activin AB or activin B is used. And a method of measuring the response of the cells when they are contacted or the amount of insulin secretion from the cells. The above-mentioned response can be given as an example of the cellular response.
[0049]
1. Method for obtaining activin AB, activin B and ALK7
When a full-length cDNA is known, such as activin AB and activin B, a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared based on the full-length cDNA as necessary. .
[0050]
When the full-length cDNA is not known as in human ALK7, a rat-derived ALK7 gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a known human ALK7 EST (expressed sequence tag) is used as a probe, for example. By screening a human pancreatic cDNA library, cDNA encoding human ALK7 can be isolated. When the obtained cDNA is not a full-length cDNA, screening of a cDNA library using this clone as a probe or RACE method (rapid amplification of cDNA ends; Frohman MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998 (1988)], a full-length cDNA can be obtained.
[0051]
The nucleotide sequence of the obtained cDNA clone was determined using a DNA sequencer or the like, and the nucleotide sequence was obtained by translating the nucleotide sequence into an amino acid sequence in each frame and then comparing the amino acid sequence with a known rat-derived ALK7. It can be confirmed whether the cDNA is DNA encoding human ALK7. Using the obtained DNA encoding human ALK7, a DNA fragment having an appropriate length is prepared as necessary as described above.
[0052]
A recombinant expression vector of the protein is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of the promoter in the expression vector. Specifically, for example, an expression vector into which a cDNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a full-length cDNA containing the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 has been inserted. Is made. Alternatively, the cDNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the cDNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are arranged so that expression is regulated by an independent promoter. May be inserted into the same expression vector.
[0053]
The recombinant expression vector is introduced into a host cell compatible with the expression vector.
Any host cell that can express the target DNA can be used, for example, Escherichia (Escherichia) Genus, Serratia (Serratia) Genus, Corynebacterium (Corynebacterium) Genus, Brevibacterium (Brevibacterium) Genus, Pseudomonas (Pseudomonas) Genus, Bacillus (Bacillus) Genus, Microbacterium (Microbacterium) Bacteria belonging to the genus, Kluyveromyces (Kluyveromyces) Genus, Saccharomyces (Saccharomyces) Genus, Schizosaccharomyces (Shizosaccharomyces) Genus, Trichosporon (Trichosporon) Genus, Siwaniomyces (Schwanniomyces) Yeasts belonging to genera, animal cells, insect cells, etc. can be used.
[0054]
As the expression vector, a vector that can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA can be transcribed is used.
[0055]
When a bacterium is used as a host cell, the recombinant expression vector is capable of autonomous replication in the bacterium, and at the same time, a recombinant expression composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the polypeptide DNA and a transcription termination sequence. A vector is preferred. The vector may contain a gene that controls the promoter.
[0056]
Examples of expression vectors include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all manufactured by Boehringer Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE- 8 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 [JP 58-110600], pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry,48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.,53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 4306 (1985)], pBluescript II SK (-) (Stratagene), pGEX (Amersham Pharmacia Biotech), pET-3 (Novagen), pTerm2 (USP4686191, USP4939094, USP5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 (J. Bacteriol.,172, 2392 (1990)].
[0057]
As the expression vector, it is preferable to use a vector in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
[0058]
Any promoter can be used as long as it functions in the host cell. For example, trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), P_LPromoter, P_RExamples include promoters derived from Escherichia coli and phages such as T7 promoter, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, and the like. In addition, two Ptrp promoters (Ptrpx2), tac promoter, letI promoter [Gene,44, 29 (1986)], and artificially designed and modified promoters such as the lacT7 promoter can also be used.
[0059]
Improve the production rate of the desired polypeptide or protein by substituting the base sequence of the DNA coding for activin AB, activin B, and ALK7 so as to be the optimal codon for expression in the host cell. be able to.
A transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA encoding the above polypeptide or protein, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
[0060]
As host cells, microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, Microbacterium, etc.Escherichia coli XL1-Blue,Escherichia coli XL2-Blue,Escherichia coli DH1,Escherichia coli MC1000,Escherichia coli KY3276,Escherichia coli W1485,Escherichia coli JM109,Escherichia coli HB101,Escherichia coli No. 49,Escherichia coli W3110,Escherichia coli NY49,Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefaciens,Brevibacterium ammoniagenes,Brevibacterium immariophilum ATCC14068,Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066,Corynebacterium glutamicum ATCC13032,Corynebacterium glutamicum ATCC14067,Corynebacterium glutamicum ATCC13869,Corynebacte rium acetoacidophilum ATCC13870,Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354,Pseudomonas sp. D-0110 and the like.
[0061]
As a method for introducing the recombinant expression vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell, for example, a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), or Gene,17, 107 (1982) and Molecular & General Genetics,168, 111 (1979).
[0062]
When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
[0063]
Any promoter can be used as long as it functions in yeast. For example, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, CUP 1 A promoter etc. can be mentioned.
[0064]
Host cells include Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces  cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe), Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces lactis), Trichosporon Pulllance (Trichosporon pullulans), Schwaniomyces Albius (Schwanniomyces alluviusAnd the like.
[0065]
As a method for introducing the recombinant expression vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, an electroporation method [Methods. In Enzymol.,194, 182 (1990), spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,75, 1929 (1978)], lithium acetate method [J. Bacteriol.,153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978).
[0066]
When animal cells are used as host cells, examples of expression vectors include pcDNA1.1 (manufactured by Invitrogen), pCDM8 (manufactured by Invitrogen), pAGE107 (Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979; Cytotechnology,Three133 (1990)], pAS3-3 (JP-A-2-27075), pcDNA1.1 / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem.,1011307 (1987)], pAGE210 and the like.
[0067]
Any promoter can be used as long as it functions in animal cells. For example, cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, Examples include metallothionein promoter, heat shock protein promoter, SRα promoter and the like. In addition, an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
[0068]
Examples of host cells include human cells, such as Namalwa cells, monkey cells, COS cells, Chinese hamster cells, CHO cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299).
[0069]
As a method for introducing the recombinant expression vector, any method capable of introducing DNA into animal cells can be used. For example, electroporation [Cytotechnology,Three, 133 (1990)], calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,84, 7413 (1987), Virology,52, 456 (1973)].
[0070]
When insect cells are used as host cells, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38 ( 1987-1997), Bio / Technology,6, 47 (1988) etc., the polypeptide or protein can be expressed.
[0071]
In other words, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells to express the polypeptide or protein. Can be made.
Examples of the vector for gene introduction include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (both manufactured by Invitrogen) and the like.
As the baculovirus, for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects the night stealing insects, can be used.
[0072]
As an insect cell,Spodoptera frugiperdaSf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, (1992)],Trichoplusia niHigh 5 (manufactured by Invitrogen) etc., which are ovarian cells of the above, can be used.
[0073]
Examples of a method for co-introducing the recombinant gene introduction vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-27075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad Sci., USA,847413 (1987)].
[0074]
As a gene expression method, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition.
When expressed in yeast, animal cells or insect cells, a polypeptide or protein to which a sugar or sugar chain has been added can be obtained.
[0075]
A transformant having recombinant DNA incorporating the DNA of the protein is cultured in a medium, the target polypeptide or target protein is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide or protein is collected from the culture. Thus, the target polypeptide or the target protein can be produced.
The method of culturing a transformant for producing activin AB, activin B or ALK7 in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
[0076]
When the transformant is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host cell, the culture medium for culturing these transformants contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, etc. that can be assimilated by the host cell. Any medium may be used as long as it is a medium that can be efficiently contained in the culture of the transformant.
[0077]
Any carbon source may be used as long as each host cell can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
[0078]
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of various organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like are used.
[0079]
Examples of inorganic substances that can be used include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
[0080]
The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 16 hours to 7 days. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0081]
When cultivating a transformant using an expression vector having an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating a transformant using an expression vector having a lac promoter, cultivate a transformant using isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like and an expression vector having a trp promoter. Sometimes indoleacrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium.
[0082]
As a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host cell, a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association,199519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science,122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology,8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73, 1 (1950)] or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums.
[0083]
Culture is usually pH 6-8, 30-40 ° C., 5% CO₂Perform for 1-7 days under conditions such as presence.
Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin and penicillin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0084]
As a medium for culturing a transformant obtained by using insect cells as host cells, generally used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 (Both made by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Grace, TCC, Nature,195, 788 (1962)] and the like.
The culture is usually performed for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, and the like.
Moreover, you may add antibiotics, such as a gentamicin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
[0085]
In order to isolate and purify the target polypeptide or target protein from the culture of the transformant, conventional methods for isolating and purifying the polypeptide or protein may be used.
For example, when a polypeptide or protein is produced in a dissolved state in a cell, after culturing, the cell is recovered by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer. Then, the cells are disrupted with dynomill or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary polypeptide or protein isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent Precipitation method, anion exchange chromatography using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) Electrophoresis such as cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Using methods such as methods alone or in combination, a purified polypeptide or protein preparation can be obtained. The
[0086]
When the polypeptide or protein is produced by forming an insoluble substance in the cell, the cell is collected and then crushed and centrifuged to recover the polypeptide or protein insoluble substance as a precipitate fraction.
The recovered polypeptide or protein insoluble matter is solubilized with a protein denaturant.
The solubilized solution is diluted or dialyzed to lower the concentration of the protein denaturing agent in the solubilized solution to return the polypeptide or protein structure to the normal three-dimensional structure, and then the same isolation and purification method as above. A purified preparation of the polypeptide or protein is obtained.
[0087]
When a polypeptide or protein or a sugar modification product thereof is secreted outside the cell, the polypeptide or protein or a sugar modification product thereof can be recovered from the culture supernatant. That is, the culture supernatant is recovered from the culture by a technique such as centrifugation, and a purified sample can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
[0088]
Examples of the polypeptide or protein thus obtained include a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, and a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2. A dimeric protein, a dimeric protein composed of a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a protein encoded by a cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 Can do.
[0089]
The polypeptide or protein can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Also, use peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Amersham Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu, etc. It can also be synthesized.
[0090]
2. Production of antibodies that specifically recognize activin AB, activin B or ALK7
A polypeptide or protein partial fragment purified preparation obtained in 1 above or a protein encoded by a cDNA comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6 An antibody that recognizes activin AB, activin B, or ALK7, such as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, can be prepared using the amino acid sequence.
[0091]
(1) Preparation of polyclonal antibody
Activin AB, activin B or ALK7, or a purified preparation of a partial fragment polypeptide of the protein, or a peptide having a partial amino acid sequence of the protein as an antigen and producing a polyclonal antibody by administering it to an animal it can.
Rabbits, goats, rats, mice, hamsters and the like can be used as animals to be administered.
[0092]
The dose of the antigen is preferably 50 to 100 μg per animal.
When using a peptide, it is desirable to use a peptide covalently bound to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine thyroglobulin as an antigen. The peptide used as an antigen can be synthesized with a peptide synthesizer.
[0093]
The antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood was collected from the fundus venous plexus, and the serum reacted with the antigen used for immunization. Enzyme immunoassay [Enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical School (1976) ), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
[0094]
Polyclonal antibodies can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, caprylic acid precipitation (Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)), or DEAE-Sepharose column, anion exchange. Examples of the method include a chromatography using a column, a protein A or G column, a gel filtration column, or the like, alone or in combination.
[0095]
(2) Production of monoclonal antibodies
(A) Preparation of antibody-producing cells
Rats whose serum showed a sufficient antibody titer against the partial fragment polypeptide of the protein used for immunization are used as a source of antibody-producing cells.
The spleen is removed 3 to 7 days after the final administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer.
[0096]
The spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
The spleen cells of the obtained precipitate fraction were treated with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes and then washed 3 times with MEM medium. Used as a cell.
[0097]
(B) Preparation of myeloma cells
As myeloma cells, cell lines obtained from mice or rats are used. For example, 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3-U1) [Curr. Topics. Microbiol. Immunol.,81, 1 (1978), Europ. J. Immunol.,6, 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 (SP-2) (Nature,276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol.,one two Three, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) (Nature,256, 495 (1975)]. These cell lines consisted of 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mmol / l), 2-mercaptoethanol (5 × 10 5^-Fivemol / l), gentamicin (10 μg / ml) and fetal calf serum (FCS) (manufactured by CSL, 10%) were added to 8-azaguanine (15 μg / ml). The culture medium was subcultured with normal medium 3 to 4 days before cell fusion, and the cells were cultured at 2 × 10 2 for fusion.⁷Use more than one.
[0098]
(C) Production of hybridoma
The antibody-producing cells obtained in (a) and the myeloma cells obtained in (b) are mixed with MEM medium or PBS (1.83 g of disodium phosphate, 0.21 g of monopotassium phosphate, 7.65 g of sodium chloride, 1 liter of distilled water). Wash well with pH 7.2), mix so that the number of cells is antibody-producing cells: myeloma cells = 5 to 10: 1, centrifuge at 1,200 rpm for 5 minutes, and discard the supernatant.
[0099]
Thoroughly loosen the cell group of the obtained precipitate fraction and stir the cell group at 37 ° C. with stirring.⁸0.2 to 1 ml of a solution prepared by mixing 2 g of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), 2 ml of MEM and 0.7 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to each antibody-producing cell, and MEM medium is added every 1 to 2 minutes. Add 1-2 ml several times.
[0100]
After the addition, MEM medium is added to prepare a total volume of 50 ml. The preparation is centrifuged at 900 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. Loosely loosen the cells of the resulting precipitate fraction, and then gently suck in and blow out with a pipette to gently add HAT medium [hypoxanthine (10%^-Fourmol / l), thymidine (1.5 × 10^-Fivemol / l) and aminopterin (4 × 10^-7 The medium added with mol / l) is suspended in 100 ml.
[0101]
The suspension was dispensed at 100 μl / well into a 96-well culture plate, and 5% CO 2 was added.₂Incubate in an incubator at 37 ° C for 7-14 days.
[0102]
After culturing, a part of the culture supernatant is taken and activated by an enzyme immunoassay described in Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988), or the like. A hybridoma that specifically reacts with the ALK7 partial fragment polypeptide is selected.
[0103]
Specific examples of the enzyme immunoassay include the following methods.
During immunization, activin AB, activin B or ALK7 partial fragment polypeptide used as the antigen is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in (d) described below is reacted as the first antibody. Furthermore, after reacting with an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radiation compound as a second antibody, a reaction according to the labeling substance is performed, and activin AB, activin B or ALK7 is reacted. Those that react specifically are selected as hybridomas producing the monoclonal antibodies of the present invention.
[0104]
Using this hybridoma, cloning was repeated twice by the limiting dilution method (the first time was HT medium (a medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), the second time was using a normal medium), a stable and strong antibody Those having a recognized valence are selected as a hybridoma strain producing the monoclonal antibody of the present invention.
[0105]
(D) Preparation of monoclonal antibody
Obtained in (c) to 8-10 week-old mice or nude mice treated with pristane [0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) intraperitoneally and bred for 2 weeks] Monoclonal antibody-producing hybridoma cells 5-20 × 10⁶Cells / animals are injected intraperitoneally. The hybridoma becomes ascites tumor in 10 to 21 days.
[0106]
Ascites is collected from the mouse with ascites tumor, and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids.
From the obtained supernatant, the monoclonal antibody can be purified and obtained by the same method as that used for the polyclonal antibody.
[0107]
The subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit. The amount of polypeptide is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
[0108]
3. Method for detecting mRNA of activin AB, activin B or ALK7 gene using DNA encoding activin AB, activin B or ALK7
Examples of the DNA used in the detection method include DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, cDNA containing the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, or a DNA fragment obtained therefrom Is mentioned. Hereinafter, these are also referred to as DNA used in the present invention.
Examples of a method for detecting the expression level or structural change of mRNA of the gene include (1) Northern blotting (2)in  situExamples include hybridization methods, (3) quantitative PCR methods, (4) differential hybridization methods, (5) DNA chip methods, and (6) RNase protection assay methods.
[0109]
Samples to be analyzed by the above method include biological samples such as pancreatic tissue, serum, saliva and the like obtained from diabetic patients and healthy subjects, or primary cells obtained by obtaining cells from the biological samples and culturing them in an appropriate medium in a test tube. MRNA or total RNA obtained from a cultured cell sample is used (hereinafter, the mRNA and total RNA are referred to as specimen-derived RNA). Moreover, what isolated the tissue acquired from the biological sample as a paraffin or a cryostat section can also be used.
[0110]
In Northern blotting, sample-derived RNA is separated by gel electrophoresis, transferred to a support such as a nylon filter, and then subjected to hybridization and washing using a labeled probe prepared from the DNA used in the present invention. By detecting a band specifically bound to the gene mRNA, changes in the expression level and structure of the gene mRNA can be detected. When performing hybridization, the probe is incubated under conditions that allow the gene mRNA in the sample-derived RNA to form a stable hybrid. In order to prevent false positives, it is desirable to perform hybridization and washing steps under highly stringent conditions. This condition is determined by a number of factors such as temperature, ionic strength, base composition, probe length, and formamide concentration. These factors are described, for example, in Molecular Cloning 2nd edition.
[0111]
The labeled probe used in the Northern blotting method may be, for example, a radioisotope, biotin, a fluorescent group, a chemiluminescent group, etc. by the known method (nick translation, random priming or kinking). It can be prepared by incorporating into an oligonucleotide designed from the sequence of Since the binding amount of the labeled probe reflects the expression level of the gene mRNA, the expression level of the gene mRNA can be quantified by quantifying the amount of bound labeled probe. In addition, the structural change of the gene mRNA can be known by analyzing the labeled probe binding site.
[0112]
in  situIn the hybridization method, the expression level of mRNA of the gene is detected by performing hybridization and washing steps using the labeled probe and a tissue obtained from a living body isolated as a paraffin or cryostat section. Is the method.in  situIn order to prevent false positives in the hybridization method, it is desirable to perform the hybridization and washing steps under highly stringent conditions. This condition is determined by a number of factors such as temperature, ionic strength, base composition, probe length, and formamide concentration. These factors are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology.
[0113]
Methods for detecting mRNA of the gene, such as quantitative PCR, differential hybridization, or DNA chip method, are based on synthesizing cDNA from specimen-derived RNA using oligo dT primer or random primer and reverse transcriptase. (Hereinafter, this cDNA is referred to as “sample-derived cDNA”). When the sample-derived RNA is mRNA, any of the above primers can be used, but when the sample-derived RNA is total RNA, an oligo dT primer is used.
[0114]
In the quantitative PCR method, a cDNA derived from the mRNA of the gene is obtained by performing PCR using a specimen-derived cDNA as a template and a primer designed based on the base sequence of DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7. This is a method for amplifying a DNA fragment. Since the amount of the amplified DNA fragment reflects the expression level of the mRNA of the gene, the amount of mRNA of the gene is quantified by placing DNA encoding actin or G3PDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) as an internal control. It is possible. Further, by separating the amplified DNA fragments by gel electrophoresis, it is possible to know the change in the mRNA structure of the gene. In this detection method, it is desirable to use an appropriate primer that specifically and efficiently amplifies the target sequence. Appropriate primers can be designed based on conditions such as binding to the target cDNA at the annealing temperature without causing binding between primers or binding within the primer, and deviating from the target cDNA under denaturing conditions. Quantification of the amplified DNA fragment needs to be performed within a PCR reaction in which the amplification product increases exponentially. Such a PCR reaction can be known by collecting the amplified DNA fragment produced for each reaction and quantitatively analyzing it by gel electrophoresis.
[0115]
Differential hybridization (Trends in Genetics,7, 314-317 (1991)] and DNA chip method [Genome Research,6, 639-645 (1996)] using a specimen-derived cDNA as a probe, hybridization and washing are performed on a filter or a slide glass or a substrate such as silicon on which DNA used in the present invention is immobilized. This is a method for detecting changes in the expression level of gene mRNA. In either method, by immobilizing an internal control such as actin or G3PDH on a filter or a substrate, it is possible to accurately detect the difference in mRNA expression of the gene between the control sample and the target sample. In addition, by performing labeled cDNA synthesis using different labeled dNTPs based on RNA from the control sample and the target sample, and by simultaneously hybridizing two labeled cDNA probes to a filter or substrate, an accurate expression level of mRNA of the gene Can be quantified.
[0116]
The RNase protection assay is performed by the following method. First, promoter sequences such as T7 promoter and SP6 promoter were bound to the 3 'end of the DNA used in the present invention, and RNA polymerase was used.in  vitroA labeled antisense RNA is synthesized using rNTP labeled by the transcription system of The labeled antisense RNA is bound to the sample-derived RNA to form an RNA-RNA hybrid, then digested with RNase, and the RNA fragment protected from digestion is detected by forming a band by gel electrophoresis. By quantifying the obtained band, the mRNA expression level of the gene can be quantified.
[0117]
4). Immunological detection or quantification method using an antibody that specifically recognizes activin AB, activin B, or ALK7 protein
Activin AB, activin B expressed in or outside of microorganisms, animal cells, insect cells or tissues using an antibody (polyclonal antibody or monoclonal antibody) that specifically recognizes activin AB, activin B, or ALK7 protein As a method for immunologically detecting and quantifying ALK7 protein, fluorescent antibody method, enzyme immunoassay method (ELISA method), radioactive substance-labeled immunoantibody method (RIA), immunohistochemical staining method, immune cell staining method, etc. Immunohistochemical staining method (ABC method, CSA method, etc.), Western blotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method, sandwich ELISA method [Monoclonal antibody experiment manual (Kodansha Scientific) (1987), secondary biochemistry experiment Lecture 5 Immunological Biochemistry Research Method ), And the like (1986)].
[0118]
The fluorescent antibody method is a method in which an antibody of the present invention is reacted with a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing activin AB, activin B or ALK7 protein inside or outside the cell, and then fluorescein isothiocyanate (FITC). ) And the like, and a fluorescent dye is measured with a flow cytometer after reacting with an anti-mouse IgG antibody or fragment thereof labeled with a fluorescent substance.
[0119]
The enzyme immunoassay (ELISA method) is a method in which the antibody of the present invention is reacted with a microorganism, animal cell or insect cell or tissue in which activin AB, activin B or ALK7 protein is expressed intracellularly or extracellularly, and further peroxidase. In this method, after reacting an anti-mouse IgG antibody or binding fragment to which an enzyme label such as biotin is applied, the coloring dye is measured with an absorptiometer.
[0120]
Radioactive-labeled immunoantibody method (RIA) is a method in which an antibody of the present invention is reacted with a microorganism, animal cell or insect cell or tissue in which activin AB, activin B, or ALK7 protein is expressed intracellularly or extracellularly, This is a method in which a radiolabeled anti-mouse IgG antibody or fragment thereof is reacted and then measured with a scintillation counter or the like.
[0121]
Immunohistochemical staining methods such as immune cell staining method and immunohistochemical staining method are used for microorganisms, animal cells, insect cells or tissues expressing activin AB, activin B, or ALK7 protein inside or outside the cell. And then reacting with an anti-mouse IgG antibody or a fragment thereof with a fluorescent substance such as FITC, or an enzyme label such as peroxidase or biotin, followed by observation using a microscope.
[0122]
Western blotting refers to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of extracts of microorganisms, animal cells, insect cells or tissues expressing activin AB, activin B, or ALK7 protein inside or outside the cells [Antibodies-A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)], the gel is blotted onto a PVDF membrane or a nitrocellulose membrane, the antibody of the present invention is reacted with the membrane, and a fluorescent substance such as FITC, peroxidase, biotin This is a method of confirming after reacting an anti-mouse IgG antibody or a fragment thereof with an enzyme label such as
[0123]
In the dot blotting method, an extract of a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing activin AB, activin B, or ALK7 protein inside or outside the cell is blotted on a nitrocellulose membrane, and activin AB, A method of confirming after reacting an antibody specifically recognizing activin B or ALK7 protein and further reacting with an anti-mouse IgG antibody or binding fragment to which an enzyme label such as FITC or the like, a peroxidase, biotin or the like is applied It is.
[0124]
The immunoprecipitation method specifically refers to an extract of a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing activin AB, activin B or ALK7 protein inside or outside the cell, and specifically activates activin AB, activin B or ALK7 protein. In this method, after reacting with the antibody to be recognized, a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-Sepharose is added to precipitate the antigen-antibody complex.
The sandwich ELISA method is an antibody that specifically recognizes activin AB, activin B, or ALK7 protein. Of the two types of antibodies having different antigen recognition sites, one antibody is adsorbed on a plate in advance, and the other antibody Is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase or biotin, and a microorganism, animal cell or insect cell in which activin AB, activin B or ALK7 protein is expressed intracellularly or extracellularly on an antibody adsorption plate or In this method, a tissue extract is reacted, then a labeled antibody is reacted, and detection is performed using a bound labeled substance.
[0125]
5. Method for identifying mutation of DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7
Examples of the DNA used in the method include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, cDNA containing the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, or a DNA fragment obtained therefrom. can give.
[0126]
The most specific test to assess the presence of a mutation that causes diabetes in the activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 locus is the gene from the control population and the gene from the diabetic patient. A direct comparison.
[0127]
Specifically, human biological samples such as pancreatic tissue, serum, saliva, etc., or samples derived from primary cultured cells established from the biological samples are collected from diabetic patients and healthy individuals, and the biological samples and samples derived from the primary cultured cells are collected. DNA is extracted from the DNA (hereinafter referred to as “sample-derived DNA”). The sample-derived DNA is amplified directly or using a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or a primer designed based on the base sequence of a cDNA containing the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6. The DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 can be used as sample DNA. Alternatively, a primer designed based on the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or the cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, using the sample-derived cDNA as a template DNA fragments amplified by performing PCR can be used as sample DNA.
[0128]
As a method for detecting whether there is a mutation causing diabetes in the DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7, hybridization between a DNA strand having a wild type allele and a DNA strand having a mutant allele A method for detecting a heteroduplex formed by soybean can be used.
[0129]
Methods for detecting heteroduplex include (1) heteroduplex detection by polyacrylamide gel electrophoresis [Trends Genet.,7, 5 (1991)], (2) Single strand conformation polymorphism analysis method [Genomics,16, 325-332 (1993)], (3) chemical cleavage of mismatches (CCM) [Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited], (4) Enzymatic cleavage of mismatch (Nature Genetics,9, 103-104 (1996)], (5) Denaturing gel electrophoresis [Mutat. Res.,288, 103-112 (1993)].
[0130]
The heteroduplex detection method by polyacrylamide gel electrophoresis is represented by DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or SEQ ID NOs: 5 and 6, using specimen-derived DNA or specimen-derived cDNA as a template. PCR using primers designed based on the base sequence of the cDNA including the base sequence was used to amplify a DNA fragment encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 as a fragment smaller than 200 bp, and the amplified DNA fragment In this method, polyacrylamide gel electrophoresis is performed, and the degree of migration is compared with a homoduplex having no mutation. When heteroduplexes are formed by mutations in DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7, the gel mobility is slower than homoduplexes without mutations, It can be detected as a band different from the strand. For the electrophoresis, a commercially available gel (such as Hydro-link, MDE (manufactured by FMC)) can also be used. In addition, the heteroduplex detection method using a DNA fragment smaller than 200 bp can detect insertion, deletion and substitution of one base. Heteroduplex analysis is preferably performed on a single gel combined with single-strand conformation polymorphism analysis described below.
[0131]
Single strand conformation polymorphism analysis (SSCP analysis) is a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 using a sample-derived DNA or a sample-derived cDNA as a template, or SEQ ID NO: 5 After denatured DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 amplified as a fragment smaller than 200 bp by PCR using a primer designed based on the base sequence of cDNA containing the base sequence represented by (6) and (6) In this method, electrophoresis is performed using a native polyacrylamide gel. When DNA is amplified, the primer is labeled with a radioisotope or fluorescent dye, or the unlabeled amplification product is silver-stained, whereby the DNA encoding amplified activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 is amplified. It can be detected as a band. In order to clarify the difference from the wild-type migration pattern, when a control sample is also electrophoresed simultaneously, a fragment having a mutation in the base sequence can be detected from the difference in mobility.
[0132]
The mismatch chemical cleavage method (CCM method) is a DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, using a sample-derived DNA or a sample-derived cDNA as a template. A DNA fragment encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 is amplified with a primer designed based on the base sequence of the cDNA containing the DNA, and the amplified DNA fragment and DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 Or a cDNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, hybridized with a labeled DNA in which a radioisotope or a fluorescent dye is incorporated, and treated with osmium tetroxide. In this method, one strand of DNA is cleaved to detect a base sequence mutation. The CCM method is one of the most sensitive detection methods and can be applied to specimens of kilobase length.
[0133]
The mismatch can also be cleaved enzymatically by combining RNase A with an enzyme involved in mismatch repair in cells such as T4 phage resol base and endonuclease VII instead of osmium tetroxide.
[0134]
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE method) is DNA represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or DNA represented by SEQ ID NO: 5 or 6, using specimen-derived DNA or specimen-derived cDNA as a template. DNA fragments encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 amplified with primers designed based on the base sequence of the cDNA containing the base sequence to be synthesized using a gel having a chemical denaturant concentration gradient or temperature gradient This is a method of electrophoresis. The amplified DNA fragment moves in the gel to a position where it is denatured into a single strand and does not move after denaturation. Since the mobility of the amplified DNA in the gel differs depending on whether or not there is a mutation in the DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7, the presence of the mutation can be detected. It is also possible to increase the detection sensitivity by attaching a poly (G: C) terminal to each primer used for PCR.
[0135]
As another method for detecting a causative gene of diabetes, a protein truncation test (PTT method) [Genomics,20, 1-4 (1994)]. The test can specifically detect frameshift mutations, splice site mutations, and nonsense mutations that produce protein defects. In the PTT method, a T7 promoter sequence and a eukaryotic translation initiation sequence are placed at the 5 ′ end of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or the cDNA comprising the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6. The connected primer is designed, and cDNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 is prepared from the sample-derived RNA by reverse transcription PCR (RT-PCR) using the primer. Using the cDNA,in in vitroTranscription and translation produce proteins. If the protein is subjected to polyacrylamide electrophoresis and the migration position of the protein is at a position corresponding to the full-length protein, there is no mutation that produces a defect, and if the protein is defective, a position shorter than the full-length protein In addition, the protein is electrophoresed, and the extent of the defect can be known from the position.
[0136]
In order to determine the base sequence of the sample-derived DNA and the sample-derived cDNA, it was designed based on DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or cDNA containing the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6. Primers can be used. By analyzing the determined base sequence, it can be determined whether or not there is a mutation causing diabetes in the sample-derived DNA or the sample-derived cDNA.
[0137]
Mutations other than the activin βA chain, activin βB chain, or coding region of the ALK7 gene can be detected by examining non-coding regions, such as introns and regulatory sequences near or within the gene. Diabetes due to mutation in the non-coding region can be detected by the same method as described above.
[0138]
For the gene thus suggested to have a mutation in the non-coding region, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 Can be cloned as a hybridization probe. Mutations in the non-coding region can be searched according to any of the methods described above.
[0139]
SNPs (single nucleotide polymorphisms) that are linked to diabetes by performing statistical processing according to the method described in Handbook of Human Genetics Linkage. The John Hopkins University Press, Baltimore (1994). Can be identified as Moreover, a gene causing diabetes can be identified by obtaining DNA from a family having a history of diabetes according to the method described above and detecting a mutation.
[0140]
6). Diabetes diagnosis method using DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7
Examples of the DNA used in the above method include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, cDNA containing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, or a DNA fragment obtained therefrom. can give.
The cause of diabetes can be confirmed by detecting gene mutations in any human tissue. For example, if there is a mutation in the germline, individuals who inherit the mutation may be prone to develop diabetes. Such mutations can be detected by examining DNA extracted from any tissue of the individual's body. For example, diabetes can be diagnosed by extracting DNA from blood cells collected from humans and detecting gene mutations using the DNA. In addition, diabetes can be diagnosed before birth by collecting fetal cells, placental cells or amniotic cells, extracting DNA, and detecting gene mutations using the DNA.
[0141]
In addition, by obtaining DNA from a living tissue of a lesion site of a patient who has developed diabetes and detecting a gene mutation, the type of diabetes can be diagnosed and used for selecting a drug to be administered. For DNA from living tissue, isolate the lesion site from the surrounding normal tissue, treat it with trypsin, etc., culture the resulting cells in an appropriate medium, and extract chromosomal DNA and mRNA from the cultured cells. Can be obtained.
[0142]
Hereinafter, DNA obtained from a human specimen by any of the above methods for the purpose of diagnosis is referred to as diagnostic specimen-derived DNA. Further, cDNA synthesized from RNA obtained from a human specimen by any of the above methods for the purpose of diagnosis is referred to as diagnostic specimen-derived cDNA.
Using the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or the cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, and the diagnostic specimen-derived DNA or diagnostic specimen-derived cDNA, the activin βA chain of 5 above Diabetes can be diagnosed by a method in accordance with a method for detecting a mutation in the DNA encoding activin βB chain or ALK7, and a mutation that has been found to have a causal relationship with diabetes by the above method 5. As a method for diagnosing whether or not a diagnostic specimen-derived DNA or diagnostic specimen-derived cDNA has, (1) detection of a restriction enzyme site, (2) a method using an allele-specific oligonucleotide probe (ASO: allele specific oligonucleotide hybridization) (3) PCR using ARMS (amplification refractor) y mutation system), (4) oligonucleotide ligation assay (OLA), (5) PCR-PHFA (PCR-preferential homoduplex formation assay), (6) a method using an oligo DNA array [protein nucleic acid enzyme,43, 2004-2011 (1998)].
[0143]
The restriction enzyme site can be detected according to the method described below. That is, when the restriction enzyme site disappears or occurs due to a single base change, the diagnostic specimen-derived DNA or the diagnostic specimen-derived cDNA is converted to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or SEQ ID NO: 5 and Amplify by PCR using primers designed based on the base sequence of the cDNA containing the base sequence represented by 6, digest with restriction enzymes, and compare the resulting restriction enzyme-cleaved DNA fragments with those of normal individuals Can easily detect mutations. More specifically, as a method for diagnosing a base change, the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or the nucleotide sequence information of the cDNA containing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 and the above 5 Designing an oligonucleotide probe by combining the information on mutations identified by the above method and detecting the mutation by reverse dot blotting in which the oligonucleotide probe is bound to a filter and hybridized Can do.
[0144]
The method using an allele-specific oligonucleotide probe (ASO) is a method that makes use of the feature that a short synthetic DNA probe hybridizes only with a perfectly paired base sequence and easily detects a single base mutation. can do. Specifically, the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or the cDNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 and the mutation of the base identified in the above 5 The oligonucleotide designed based on this is bound to a filter, DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or DNA represented by SEQ ID NO: 5 or 6 is used using a DNA derived from a diagnostic sample or cDNA derived from a diagnostic sample as a template The reverse dot blot method which hybridizes using the amplified DNA fragment obtained by PCR using the primer designed using the base sequence of cDNA containing a base sequence and labeled dNTP can be mention | raise | lifted.
[0145]
A reverse dot blot is a method of synthesizing an oligonucleotide designed based on a DNA sequence that has not been mutated directly corresponding to the DNA to be measured and a DNA mutation separately identified on a substrate such as a glass slide or silicon. This is a method for detecting various mutations more easily by reacting a small amount of DNA derived from a diagnostic sample or cDNA derived from a diagnostic sample using a DNA chip which is a high-density array. This method is a mutation detection method suitable for large-scale diagnostic purposes.
[0146]
Base mutations can also be detected by the oligonucleotide ligation assay (OLA) method described below.
An oligonucleotide having about 20 bases having a mutation site of DNA encoding activin βA chain, activin βB chain or ALK7 to be examined at its 3 ′ end, and an oligonucleotide of about 20 bases following the mutation site are represented by SEQ ID NO: Design and synthesis based on the DNA having the base sequence represented by 3 or 4 or the base sequence of cDNA containing the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6. At this time, for example, biotin is added to the 5 'end of the former oligonucleotide, and a different label such as digokesigenin is added to the 3' end of the latter oligonucleotide. Next, based on the base sequence of the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or the cDNA containing the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, using the diagnostic specimen-derived DNA or the diagnostic specimen-derived cDNA as a template Using the designed primer, DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 is amplified by PCR. Next, the amplified DNA fragment is hybridized with the two oligonucleotides. After hybridization, the two oligonucleotides are ligated with DNA ligase. After the ligation reaction, biotin-labeled single-stranded DNA obtained by heat denaturing the double-stranded DNA is recovered, for example, as DNA that binds to avidin. Since the above-mentioned two kinds of oligonucleotides hybridized with the amplified DNA fragment having a displacement site are linked by the above ligation reaction, it is obtained as DNA having digokesigenin at its 3 ′ end, and the bound DNA can be easily detected Can do. Therefore, DNA encoding Activin βA chain, Activin βB chain, or ALK7 having a displacement can be detected quickly and easily. OLA is a mutation detection method suitable for diagnosing a large number of samples effectively in a short period of time because it does not require electrophoresis or centrifugation.
[0147]
A trace amount of a mutated gene can be detected quantitatively and easily by the following PCR-PHFA method.
PCR-PHFA is an ED-PCR (enzymatic detection of PCR product) that detects PCR products by gene amplification (PCR), hybridization in a liquid phase with very high specificity, and ELISA. This is a combination of the three. Using a primer set labeled with dinitrophenyl (DNP) and biotin, PCR was performed using DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or cDNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and 6 as a template. To prepare a double-end labeled amplified DNA fragment. Next, an unlabeled amplified DNA fragment obtained by amplifying a diagnostic sample-derived DNA or a diagnostic sample-derived cDNA with a template using an unlabeled primer set having the same base sequence as the labeled primer is mixed with the labeled amplified DNA fragment. To do. At this time, the unlabeled amplified DNA fragment is used in a large excess of 20 to 100 times the labeled amplified DNA fragment. After the heat denaturation treatment, the mixture is cooled with a gentle temperature gradient of about 1 ° C./5 minutes to 10 minutes to form a complete complementary strand preferentially. The reformed labeled DNA is captured and adsorbed on a streptavidin-immobilized well via biotin, and an enzyme-labeled anti-DNP antibody is bound via DNP and detected by an enzyme color reaction. When a gene having the same sequence as the labeled DNA does not exist in the sample, the original double-stranded labeled DNA is preferentially reformed and develops color. On the other hand, when a gene having the same base sequence is present, the complementary strands are randomly substituted, and the labeled DNA that is reformed is reduced. Therefore, the color development is significantly reduced. This makes it possible to detect and quantify known mutations / polymorphic genes.
[0148]
7. Diabetes diagnosis method using an antibody that specifically recognizes activin AB, activin B, or ALK7 protein
Identification of changes in the expression level of activin AB, activin B, or ALK7 protein in human biological samples and human primary cultured cells, as well as the structural change of the expressed protein, is a risk of developing diabetes or has already developed It is useful to know the cause of pancreatic function decline.
[0149]
Methods for detecting and diagnosing activin AB, activin B, or ALK7 protein expression levels and structural changes include the fluorescent antibody method, enzyme immunoassay method (ELISA method) described above, radioactive substance labeled immunoantibody method ( RIA), immunohistochemical staining methods (ABC method, CSA method, etc.) such as immunohistological staining method and immune cell staining method, Western blotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method, sandwich ELISA method and the like.
[0150]
As a specimen to be diagnosed by the above method, a tissue sample of a pancreatic lesion obtained from a patient, a biological sample such as blood, serum, urine, feces, saliva, or a cell and a cell extract obtained from the biological sample are used. . Moreover, what isolated the tissue acquired from the biological sample as a paraffin or a cryostat section can also be used.
[0151]
8). Activin AB, activin B or ALK7 protein, DNA encoding the protein, or screening method for antidiabetic drug using antibody recognizing one of the proteins
Examples of the protein used in the screening method of the present invention include activin AB, activin B and ALK7. As long as activin AB and activin B are proteins having an activity as a ligand protein of ALK7, they may be proteins derived from natural products or proteins produced by genetic engineering techniques. Can include ALK7 ligand proteins derived from all mammals such as humans, monkeys, pigs, cows, sheep, horses and rats.
Specific examples of activin AB include a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, Specific examples of activin B include a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
ALK7 is a protein produced by genetic engineering techniques, even if it is a protein that is activated by activin AB or activin B and is activated by activin AB and has the activity of promoting cell insulin secretion. For example, examples of the naturally-derived protein include ALK7 derived from all mammals such as human, monkey, pig, cow, sheep, horse, and rat.
Specific examples of ALK7 include a protein encoded by a cDNA containing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, and a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
Examples of DNA used in the screening method of the present invention include DNA encoding activin AB, activin B and ALK7. The DNA may be any DNA as long as it encodes a protein used in the screening method of the present invention.
Specific examples of DNA encoding activin AB or activin B include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4. Specific examples of DNA encoding ALK7 include cDNA containing the base sequences represented by SEQ ID NOs: 5 and 6, and DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
Examples of the antibody used in the screening method of the present invention include an antibody that recognizes the protein used in the screening method of the present invention or a polypeptide fragment thereof.
[0152]
(1) Screening for compounds that specifically act on activin AB, activin B or ALK7 protein
Microorganisms, animal cells, or insect cells transformed to express ALK7 protein with type II activin receptor, and purified activin AB, activin B, or ALK7 protein are specific for activin AB, activin B, or ALK7 protein It is useful for screening compounds that act on The type II activin receptor may be any protein having activity as a type II activin receptor, for example, Cell,65, 973-982 (1991). The compound obtained by the screening is useful as a therapeutic agent for diabetes.
[0153]
One method of the above screening is a compound that specifically induces activation of ALK7 in an animal cell transformed to produce ALK7 protein and type II activin receptor (hereinafter referred to as a search transformant). Is to select. Examples of the method for detecting the activation of ALK7 include a method for measuring the cellular response of the search transformant.
[0154]
Specific cell responses include, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, c-fos activation, pH reduction, cell proliferation activity, melanin pigment Aggregation or diffusion, or reporter gene expression fluctuation can be raised [J. Biol. Chem.,271, 1857 (1996), Science,268, 98 (1995), Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,275, 1274 (1995), J. Biol. Chem.,272, 1822 (1997), Journal of Receptor and Signal Transduction Research,17, 57 (1997), Endocrinology138, 1400 (1997), Endocrinology138, 1471 (1997), Nat.Biotechnol.,16, 1334 (1998), Biochem. Biophys. Res. Commun.,251, 471 (1998), Brit. J. Pharmacol.,125, 1387 (1998), Trends Biotechnol.,15, 487 (1997), Anal. Biochem.,252, 115 (1997), Nature,358, 325 (1992), Nature,393, 272 (1998), Cell,92, 573 (1998), J. Biol. Chem.,272, 27497 (1997), Trends Pharmacol. Sci.,18, 430 (1997), Trends Pharmacol. Sci.,20, 370 (1999), WO98 / 46995].
[0155]
When monitoring a cellular response using a reporter gene, for example, a DNA having an appropriate reporter gene linked downstream of the promoter sequence of a gene whose expression is induced by activation of ALK7 is applied to the transformant for search. By introducing, activation of ALK7 can be measured by reporter gene expression. Examples of the promoter include ICAM-1 gene promoter, c-fos promoter, Krox-24 promoter [Biochem. J.,320, 145 (1996)], an insulin gene promoter, a choline acetyltransferase gene promoter, a tyrosine hydroxylase gene promoter, and the like. The promoter may be an artificial promoter composed of a binding sequence of an appropriate transcription factor and a basic promoter. Examples of transcription factor binding sequences include CRE (CREB binding element), TRE (TPA responsive element), SRE (serum responsive element), and SBE-lux promoter [J. Biol. Chem.,273, 21145-21152 (1998)]. As a reporter gene, a chloramphenicol acetyltransferase gene, a β-glucuronidase gene, a β-galactosidase gene, a β-lactamase gene, an aequorin gene, a luciferase gene, a green fluorescent protein gene, and the like can be used.
[0156]
The purified activin AB, activin B or ALK7 protein, or a polypeptide constituting a part of the protein can be used to select a target compound that specifically binds to activin AB, activin B or ALK7 protein. it can. For example, the protein is immobilized on a solid phase carrier, and after contact with a test sample, the plate is sufficiently washed to release a compound bound to activin AB, activin B or ALK7 protein from the protein. By doing so, the target compound can be selected.
[0157]
As another method of the above screening, a large number of peptides constituting a part of activin AB, activin B or ALK7 protein are synthesized on a high density on a plastic pin or a certain solid support, and the peptides are selectively used. There is a method for efficiently screening for a compound or protein that binds to a protein (WO84 / 03564).
[0158]
(2) Screening method for compounds that regulate transcription or translation of DNA encoding activin βA chain, activin βB chain or ALK7
A compound having activity to promote the expression of activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene mRNA or activin AB, activin B or ALK7 protein in a pancreatic cell line is also useful as a therapeutic agent for diabetes. As a cell line derived from the pancreas, mouse pancreatic β cell type MIN6 cell [Endocrinology,127, 126-132 (1990)], mouse insulinoma cell NIT-1 cell (ATCC CRL-2055), mouse pancreatic α cell type αTC1 cell (ATCC CRL-2350), rat pancreatic duct epithelial cell ARIP cell (ATCC CRL-1674), etc. Can be mentioned.
[0159]
Measure and compare the expression level of activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene mRNA in the cell line when the pancreas-derived cell line is contacted with various test samples and when the test sample is not contacted Thus, a substance that suppresses or promotes transcription of activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene can be screened. The expression level of activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene mRNA can be detected by the PCR method, Northern blotting method, and RNase protection assay method described above.
[0160]
In addition, activin is measured by measuring and comparing the expression level of activin AB, activin B or ALK7 protein in the cell line when the pancreas-derived cell line is contacted with various test samples and when the test sample is not contacted Substances that suppress or promote the transcription or translation of AB, activin B, and ALK7 gene can be screened. The expression level of activin AB, activin B or ALK7 protein is determined by the fluorescent antibody method, enzyme immunoassay method (ELISA method), radioactive substance labeling using the antibody specifically recognizing activin AB, activin B or ALK7 protein described in 4 above. Measured by immuno-antibody method (RIA), immunohistochemical staining method (ABC method, CSA method, etc.) such as immunohistochemical staining method and immune cell staining method, Western blotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method, sandwich ELISA method be able to.
[0161]
Furthermore, when various test samples are contacted with animal cells transformed with recombinant DNA in which a reporter gene is linked downstream of the promoter of activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene, the test sample is not contacted. A substance that suppresses or promotes the expression of activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene can be screened by measuring and comparing the expression level of the reporter gene in the animal cell. If the nucleotide sequence of the activin βA chain, activin βB chain or ALK7 gene is known, an chromosomal DNA derived from an animal is used as a template using an oligonucleotide that can be designed and synthesized according to the promoter sequence. It can be obtained by PCR. If the promoter sequence is not known, a known method [Edited by the Institute for Cancer Research, University of Tokyo, New Cell Engineering Experiment Protocol, Shujunsha (1993)] using DNA or oligonucleotide of the above gene as a probe. Can be used to obtain the promoter region of the gene.
[0162]
The expression level of the reporter gene in the cells can be determined by a known method (The University of Tokyo Institute of Medical Science, Cancer Research Division, New Cell Engineering Experimental Protocol, Shujunsha (1993), Biotechniques,20, 914 (1996), J. Antibiotics,49, 453 (1996), Trends in Biochemical Sciences,20, 448 (1995), Cell engineering,16, 581 (1997)].
[0163]
Examples of the reporter gene include chloramphenicol acetyltransferase gene, β-galactosidase gene, β-lactamase gene, luciferase gene, green fluorescent protein (GFP) gene and the like.
[0164]
The compound obtained by the above method is administered as a drug to a diabetes model animal such as a NOD (Non-Obese Diabetes) mouse, and the insulin secretion amount and blood glucose level of the animal are measured according to a known method, whereby the compound It is possible to evaluate its therapeutic effect on diabetes.
[0165]
9. Medicament for the treatment and / or prevention of diabetes containing activin AB, activin B or ALK7 protein as an active ingredient
Activin AB, activin B, or ALK7 protein can be used to reconstruct the structure and function of the pancreas and promote insulin secretion from the pancreas in various diabetes caused by pancreatic hypofunction.
[0166]
The activin AB and activin B may be naturally derived as long as they are ALK7 ligand proteins, or may be recombinant proteins produced by genetic engineering techniques. Examples of naturally-occurring ALK7 ligand proteins include ALK7 ligand proteins derived from all mammals such as humans, monkeys, pigs, cows, sheep, horses, mice, rats, etc., and treatment and / or prevention of human diabetes. When using as a drug for the above, ie, pancreatic function improving agent or pancreatic regeneration promoting agent, it is preferable to use a protein whose amino acid sequence matches that of human-derived ALK7 ligand protein.
[0167]
A medicament for the treatment and / or prevention of diabetes containing activin AB, activin B or ALK7 protein as an active ingredient may contain only the protein as an active ingredient. It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more acceptable carriers. Preferably, a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of salt, glycine, glucose, human albumin or the like is used. Also, pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and isotonic agents for bringing the formulation solution close to physiological conditions, such as sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, citric acid Sodium or the like can also be added. Moreover, it can also be freeze-dried and stored, and can be used by dissolving in an appropriate solvent at the time of use.
[0168]
It is desirable to use the administration route that is most effective in the treatment, and examples thereof include oral administration and parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous. Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
[0169]
Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like. Liquid preparations such as emulsions and syrups include saccharides such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoate Preservatives such as acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives. Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin and the like can be used as additives.
[0170]
Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like. For example, an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both. Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid. The spray is prepared using a carrier that does not irritate the polypeptide itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that disperses the polypeptide as fine particles to facilitate absorption. Specific examples of the carrier include lactose and glycerin. Depending on the properties of the polypeptide and the carrier used, preparations such as aerosols and dry powders are possible. In these parenteral preparations, the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
[0171]
The dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 μg / kg to 8 mg / kg per day for an adult.
[0172]
10. A medicament for treating and / or preventing diabetes comprising an antibody that specifically recognizes activin AB, activin B or ALK7 as an active ingredient
A drug for the treatment and / or prevention of diabetes containing an antibody that specifically recognizes activin AB, activin B or ALK7 as an active ingredient can usually be administered alone, although the active ingredient can be administered alone. The active ingredient is desirably mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers and provided as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical arts. Preferred pharmaceutical preparation forms, administration methods and the like are as described in 9 above.
[0173]
11. The pharmaceutical for the treatment and / or prevention of diabetes which contains the compound obtained by the screening method of said 8 as an active ingredient
In the medicament for the treatment and / or prevention of diabetes containing the compound obtained by the screening method of 8 above as an active ingredient, it is possible to administer the active ingredient alone. It is desirable to provide a pharmaceutical preparation that is mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers and manufactured by any method well known in the pharmaceutical arts. The preferred pharmaceutical preparation form, etc., and the administration method are as described in 9 above.
[0174]
12 Gene therapy for diabetes containing DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 protein
Examples of methods for using DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 protein as a gene therapy agent for diabetes include single or retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. And a method of formulating, prescribing and administering in accordance with a conventional method described in 9 above, or a method of administering by a non-viral gene transfer method.
[0175]
A recombinant virus vector can be prepared according to the method described below.
Based on the full-length cDNA of activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 protein, if necessary, a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared.
A recombinant viral vector is constructed by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of the promoter in the viral vector.
[0176]
In the case of an RNA viral vector, a recombinant virus is constructed by preparing RNA fragments homologous to the full-length cDNAs of activin AB and activin B and inserting them into the downstream of the promoter in the viral vector. In addition to the double strand, the RNA fragment selects either the sense strand or the antisense strand depending on the type of the viral vector. For example, in the case of a retroviral vector, RNA homologous to the sense strand is selected, and in the case of a sense viral vector, RNA homologous to the antisense strand is selected.
[0177]
The recombinant viral vector is introduced into packaging cells compatible with the vector.
The packaging cell may be any cell as long as it can replenish the deficient protein of a recombinant viral vector lacking at least one gene encoding a protein necessary for virus packaging. For example, human kidney-derived HEK293 cells, mouse fibroblasts NIH3T3, and the like can be used. Proteins to be replenished by packaging cells include gag, pol, env, etc. derived from mouse retrovirus in the case of retrovirus vectors, gag, pol, env, vpr, vpu, vif, derived from HIV virus in the case of lentiviral vectors. Examples of tat, rev, nef, and the like include adenovirus-derived E1A and E1B, and adeno-associated viruses include Rep (p5, p19, p40), and Vp (Cap).
[0178]
As the viral vector, a vector containing a promoter at a position where a recombinant virus can be produced in the packaging cell and a DNA encoding activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 can be transcribed in the target cell is used. As a plasmid vector, MFG [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 6733-6737 (1995)], pBabePuro [Nucleic Acids Res.,18, 3587-3596 (1990)], LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG [Journal of Virology,72, 8150-8157 (1998)], pAdex1 [Nucleic Acids Res.,twenty three, 3816-3821 (1995)]. Any promoter can be used as long as it functions in human tissues. For example, cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, Examples include metallothionein promoter, heat shock protein promoter, SRα promoter and the like. In addition, an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
Examples of methods for introducing a recombinant viral vector into packaging cells include the calcium phosphate method (JP-A-2-27075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413 (1987)].
[0179]
In addition to the above-mentioned method 9, the recombinant virus vector can be administered directly in vivo using liposome delivery (in vivoIn combination with gene transfer, viral vectors can also be directed to pancreatic lesions.
That is, a complex is prepared by combining a DNA encoding an activin βA chain, activin βB chain, or ALK7 of an appropriate size with a polylysine-conjugated antibody specific for an adenovirus hexon protein. A viral vector can be prepared by binding to a viral vector. The viral vector stably reaches the target cell, is taken up into the cell by the endosome, is degraded in the cell, and can efficiently express the gene.
[0180]
Activin AB, activin B, or ALK7 gene DNA can also be transported to the lesion by non-viral gene transfer methods.
Non-viral gene transfer methods known in the art include calcium phosphate coprecipitation [Virology,52, 456-467 (1973); Science,209, 1414-1422 (1980)], microinjection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 5399-5403 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 7380-7384 (1980); Cell,27, 223-231 (1981); Nature,294, 92-94 (1981)], liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413-7417 (1987); Biochemistry,28, 9508-9514 (1989); J. Biol. Chem.,264, 12126-12129 (1989); Hum. Gene Ther.,Three, 267-275, (1992); Science,249, 1285-1288 (1990); Circulation,83, 2007-2011 (1992)] or direct DNA uptake and receptor-mediated DNA transfer [Science,247, 1465-1468 (1990); J. Biol. Chem.,266, 14338-14342 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 3655-3659 (1991); J. Biol. Chem.,264, 16985-16987 (1989); BioTechniques,11, 474-485 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 3410-3414 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 4255-4259 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 4033-4037 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 8850-8854 (1991); Hum. Gene Ther.,Three, 147-154 (1991)].
[0181]
It has been reported in tumor studies that liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer allows local administration and uptake of the gene by direct administration of the liposome preparation to the target tissue. [Hum. Gene Ther.Three, 399-410 (1992)]. Therefore, the same effect is expected in the pancreatic lesion. Direct DNA uptake techniques are preferred for direct targeting of DNA to pancreatic lesions. Receptor-mediated DNA transfer is performed, for example, by conjugating DNA (typically in the form of a covalently closed supercoiled plasmid) to a protein ligand via polylysine. The ligand is selected based on the presence of the corresponding ligand receptor on the cell surface of the target cell or tissue. The ligand-DNA conjugate can be injected directly into the blood vessel, if desired, and can be directed to the target tissue where receptor binding and internalization of the DNA-protein complex occurs. In order to prevent intracellular destruction of DNA, adenovirus can be co-infected to disrupt endosomal function.
[0182]
13. Method of specifically transporting drug to pancreas using antibody that specifically recognizes ALK7 protein (drug delivery method)
The antibody used in the drug delivery method may be any antibody that specifically recognizes the ALK7 protein, but it is particularly desirable to use a humanized antibody.
[0183]
Examples of humanized antibodies include human chimeric antibodies, human CDR (Complementary Determining Region; hereinafter referred to as CDR) transplanted antibodies, and the like.
The human chimeric antibody is a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter, the heavy chain is also referred to as H chain, the variable region is also referred to as HV or VH) and an antibody light chain variable region (hereinafter, light chain is referred to as light chain). An antibody comprising a human antibody heavy chain constant region (hereinafter also referred to as C region as CH region) and a human antibody light chain constant region (hereinafter also referred to as CL). means. Any animal other than a human can be used as long as it can produce a monoclonal antibody-producing hybridoma, such as a mouse, rat, hamster, or rabbit.
[0184]
From the hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to the ALK7 protein, cDNAs encoding VH and VL are obtained and inserted into expression vectors for animal cells having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively. Antibody expression vectors can be constructed and expressed and produced by introducing them into animal cells.
[0185]
The CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class, and more preferably hIgG1, hIgG2, hIgG3 belonging to the hIgG class, Any of the subclasses such as hIgG4 can be used. The CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of κ class or λ class can be used.
[0186]
The human CDR-grafted antibody means an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to appropriate positions of the human antibody VH and VL.
The human CDR-grafted antibody is a V region that reacts with the ALK7 protein and binds to the ALK7 protein by replacing the VH and VL CDR sequences of the non-human animal antibody with the CDR sequences of any human antibody VH and VL, respectively. A cDNA encoding a human antibody, inserted into an animal cell expression vector having a gene encoding a human antibody CH and a human antibody CL, respectively, to construct a human CDR-grafted antibody expression vector, introduced into the animal cell, It can be produced by expression.
[0187]
The CH of the human CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, but the hIgG class is preferable, and any of the subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to the hIgG class may be used. it can. The CL of the human CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of κ class or λ class can be used.
[0188]
A human antibody originally means an antibody naturally present in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental technology Also included are antibodies obtained from production transgenic animals.
[0189]
Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by the following method.
Human peripheral blood lymphocytes are isolated, immortalized by infection with EB virus or the like, and then cloned. The obtained lymphocytes producing the desired antibody can be cultured, and the antibody can be obtained from the culture.
[0190]
The human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and single chain antibody are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing antibody fragments having a desired antigen-binding activity can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a fully human antibody by genetic engineering techniques.
[0191]
A human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells. Specifically, a human antibody-producing transgenic animal can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, and transplanting the ES cell into an early embryo of another mouse, followed by generation. As a method of producing a human antibody from a human antibody-producing transgenic animal, a human antibody-producing hybridoma is obtained by a hybridoma production method performed in a normal non-human mammal and cultured to obtain a human antibody in the culture. A method for producing and accumulating is mentioned.
[0192]
Antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′)₂Single chain antibodies, disulfide stabilized V region fragments (dsFv), peptides containing CDRs, and the like.
Fab is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), and the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonds. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000.
Fab can be obtained by treating an antibody that specifically reacts with activin AB, activin B, or ALK7 protein with proteolytic enzyme papain. In addition, after inserting the DNA encoding the Fab of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, the vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism, and the DNA is expressed to obtain the Fab. can do.
[0193]
F (ab ')₂Is slightly larger than the fragment obtained by treating IgG with the protease pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain) with Fab bound via a disulfide bond in the hinge region An antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 100,000.
F (ab ')₂Can be obtained by treating an antibody that specifically reacts with activin AB, activin B, or ALK7 protein with the protease pepsin. In addition, F (ab ′) of the antibody₂Is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, the vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism, and the DNA is expressed, thereby F (ab ′)₂Can be obtained.
[0194]
Fab 'is the above F (ab')₂An antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of.
Fab ′ can be obtained by treating an antibody that specifically reacts with activin AB, activin B, or ALK7 protein with a reducing agent dithiothreitol. Further, after inserting the DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, the vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism, and the DNA is expressed, Fab 'can be acquired.
[0195]
A single chain antibody (hereinafter also referred to as scFv) is a VH-P-VL or VL-P in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P). -Indicates a VH polypeptide. As VH and VL contained in scFv used in the present invention, antibodies that specifically react with activin AB, activin B, or ALK7 protein, for example, those derived from humanized antibodies or human antibodies can be used.
[0196]
Single chain antibodies can be obtained by the following method.
After obtaining cDNAs encoding VH and VL of an antibody that specifically reacts with the ALK7 protein, a DNA encoding a single chain antibody is constructed. A single-chain antibody can be obtained by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism, and expressing the DNA. it can.
[0197]
A disulfide-stabilized V region fragment (hereinafter also referred to as dsFv) is a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue, which are linked via a disulfide bond between the cysteine residues. Say. Amino acid residues to be substituted for cysteine residues are determined by the method shown by Reiter et al. [Protein Engineering,7, 697 (1994)] based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody. As VH and VL contained in dsFv used in the present invention, antibodies that specifically react with ALK7, for example, those derived from humanized antibodies or human antibodies can be used.
[0198]
The disulfide stabilized V region fragment (dsFv) can be obtained by the following method.
After obtaining cDNAs encoding VH and VL of an antibody that specifically reacts with the ALK7 protein, a DNA encoding dsFv is constructed. DsFv can be obtained by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism, and expressing the DNA.
A peptide containing CDR can be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method or tBoc method.
[0199]
A fusion antibody prepared from an antibody that specifically recognizes the ALK7 protein can be used for drug delivery, which carries a drug or protein specifically to the pancreatic lesion.
Fusion antibodies are antibodies that react specifically with the ALK7 protein, for example, antibodies in which drugs such as proteins and low-molecular compounds are chemically or genetically bound to humanized antibodies, human antibodies and antibody fragments thereof. Say.
The fusion antibody includes an antibody that specifically reacts with the ALK7 protein and an N- or C-terminal side of the H or L chain of the antibody fragment, an appropriate substituent or side chain in the antibody and the antibody fragment, It can be produced by chemically or genetically linking a drug such as a protein or a low molecular weight compound to a sugar chain in an antibody fragment.
[0200]
Examples of the low molecular weight compound include compounds obtained by the screening method described in 8 above. The compound can be bound to the above antibody by a chemical method [Introduction of antibody (Osamu Kanmitsu, 1994, Jinshokan)].
As the protein, an activating cytokine that enhances pancreatic function is preferable, and examples thereof include human betacellulin, human activin AB, human activin B, human HGF (Hepatocyte Growth Factor) and the like.
[0201]
A fusion antibody with a protein can be obtained by the following method.
A cDNA encoding a fusion antibody is constructed by linking a cDNA encoding a protein to a cDNA encoding an antibody or antibody fragment. A fusion antibody can be obtained by inserting the DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, introducing the expression vector into a host cell such as a prokaryotic or eukaryotic organism, and expressing the DNA. .
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0202]
【Example】
Example 1: Analysis of ligand-dependent transcriptional activity in ALK7 overexpressing cells
A human renal epithelial cell HEK293 cell (ATCC CRL-1573) that does not endogenously express ALK7 is suspended in a D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mmol / L glutamine, and 1 g / L glucose. 6 × 10 in well cell culture plate^FourCells / well were seeded and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator (5% carbon dioxide, 95% air). The next day, (1) a plasmid containing the full-length cDNA of rat ALK7 [Mol. Cell Neurosci.,7, 467-478 (1996)]SmaI-XbaI fragment and animal cell expression plasmid pcDNA1 (manufactured by Invitrogen)EcoRV-XbaPlasmid [Mol. Cell Neurosci., Produced by ligation with I fragment7467-478 (1996)] 1.5 μg, (2) a plasmid containing the mouse type II activin receptor ActRIIA cDNA [Cell,65, 973-982 (1991)]BamA DNA fragment blunted by digestion with HI and a known animal cell expression plasmid pcDLSR-α [Mol. Cell. Biol.,8, 466-472 (1988)]XhoA plasmid prepared by ligation with a DNA fragment digested with I and blunt-ended [J. Biol. Chem.,272, 13835-13842 (1997)] 300 ng, (3) SBE-lux luciferase reporter plasmid [J. Biol. Chem.,273, 21145-21152 (1998), assigned by Ludwig Institute for Cancer Research] 500 ng, (4) Plasmid pCMVβ designed to express beta-galactosidase in animal cells under the control of the CMV promoter (Clontech) 300 ng of each was introduced into the cells obtained by the above-mentioned culture by the calcium phosphate method, and further 37% in a carbon dioxide incubator using a D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mmol / L glutamine, and 1 g / L glucose. The cells were cultured at 0 ° C. to obtain transformed cells. The next day, the transformed cells were washed with PBS buffer, suspended in the above medium, and J. Biol. Chem.,267, 16385-16389 (1992), 20 ng / ml of activin A, AB or B purified from bovine follicular fluid was added. After culturing at 37 ° C. for 16 hours in a carbon dioxide incubator, the transformed cells were washed with PBS buffer, and then 100 μL of cell lysate (1% TritonX-100, 15 mmol / L magnesium sulfate, 4 mmol / L EGTA, 1 mmol) / L dithiothreitol, 25 mmol / L glycylglycine, pH 7.8), 50 μL was used for luciferase assay and 40 μL for beta-galactosidase assay.
[0203]
The luciferase activity is measured by mixing the above-mentioned lysate containing 50 μL of cells with 5 μL of 30 mmol / L ATP solution and 100 μL of 0.5 mmol / L luciferin solution, and measuring the amount of luminescence with a luminometer (Bertold). [Anal. Biochem.,171, 404-408 (1988)], the activity of beta-galactosidase was measured according to the previous report by using o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) as a substrate [Bitechniques,7, 576-579 (1989)]. The activity value of luciferase was normalized with the activity value of beta-galactosidase [Endocrinology,136, 5493-5503 (1995)].
[0204]
As shown in FIG. 1, a marked increase in transcriptional activity was observed in ALK7 gene-introduced HEK293 cells by activin AB and activin B.
[0205]
Example 2: Analysis of ligand-dependent transcriptional activity in pancreatic β cells expressing endogenous ALK7
In order to search for a cell line that endogenously expresses ALK7, a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 7 and 8 was synthesized, and the DNA was used as a primer set to obtain a mouse pancreatic β cell type MIN6 cell [ Endocrinology,127, 126-132 (1990)], human renal epithelial cells HEK293 cells (ATCC CRL-1573), mouse insulinoma cells NIT-1 cells (ATCC CRL-2055), mouse pancreatic α cell type αTC1 cells (ATCC CRL-2350), PCR reaction was carried out using a single-stranded DNA prepared from total RNA prepared from rat pancreatic duct epithelial cells ARIP cells (ATCC CRL-1674) or the like as a template. As a result, higher expression was observed in MIN6 cells used as a model system for mouse pancreatic β cells than other cells.
[0206]
Next, using these cells, the transcriptional activity was measured and the effect of suppressing signal transduction by introducing a mouse dominant negative ALK7 receptor cDNA was examined.
MIN6 cells, which are mouse pancreatic β cell type cells, are suspended in a D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mmol / L glutamine, and 4.5 g / L glucose, and 8 × 10 8 on a 12-well cell culture plate.^FourCells / well were seeded and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. The next day, (1) 1 μg of SBE-lux luciferase reporter plasmid and (2) 500 ng of pCMVβ were transfected into the cells obtained by the lipofection method, and further cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Got. The next day, the transformed cells were washed with PBS buffer, suspended in the above medium, and 60 ng / ml of activin A, AB or B was added. After culturing at 37 ° C. for 16 hours in a carbon dioxide incubator, the cells were washed with PBS buffer, suspended in 100 μL of cell lysate, 50 μL was used for luciferase assay, and 40 μL was used for beta-galactosidase assay. The activity value of luciferase was normalized with the activity value of beta-galactosidase.
[0207]
Next, a plasmid containing a rat ALK7 cDNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 10 [Mol. Cell Neurosci.7, 467-478 (1996)] as a template. Subsequently, the amplified DNA fragment in the reaction product is converted into a restriction enzyme.EcoRI andXhoDigested with I. After completion of the reaction, the reaction products were separated by agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 500 base pairs was recovered. Of the obtained DNA fragment and plasmid pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)EcoRI-XhoThe I fragment was ligated using DNA ligase. Escherichia coli was transformed with the reaction product and cultured on an agar plate containing ampicillin at 37 ° C., and a clone that acquired ampicillin resistance was selected. The emerged colony was cultured in a medium containing ampicillin, and then the plasmid was recovered, the base sequence of the inserted DNA fragment was confirmed, and a clone having the target base sequence was selected.
[0208]
By the above operation, a plasmid containing a dominant negative ALK7 receptor DNA that lacks the intracellular kinase region and encodes 167 amino acid residues from the N-terminus was obtained.
[0209]
MIN6 cells, which are mouse pancreatic β cell type cells, are suspended in a D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mmol / L glutamine, and 4.5 g / L glucose, and 8 × 10 8 on a 12-well cell culture plate.^FourCells / well were seeded and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. The next day, (1) 1 μg of SBE-lux luciferase reporter plasmid, (2) 500 ng of a plasmid (manufactured by Clontech) designed to express beta-galactosidase in animal cells under the control of the CMV promoter, (3) above 3 μg of the dominant negative ALK7 receptor DNA prepared in 1 above was introduced into MIN6 cells by the lipofection method and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator to obtain a transformant. The next day, the transformed cells were washed with PBS buffer, suspended in the above medium, and 60 ng / ml of activin A, AB or B was added. After culturing at 37 ° C. for 16 hours in a carbon dioxide incubator, the transformed cells were washed with PBS buffer, suspended in 100 μL of cell lysate, 50 μL was used for luciferase assay, and 40 μL was used for beta-galactosidase assay. . The activity value of luciferase was normalized with the activity value of beta-galactosidase.
[0210]
As shown in FIG. 2, an increase in transcriptional activity was observed in endogenous ALK7-expressing MIN6 cells by activin AB and activin B, and the increase in transcriptional activity was inhibited by introduction of dominant negative ALK7 cDNA.
[0211]
Example 3: Promotion of insulin secretion from mouse pancreatic β cell type cells
MIN6 cells expressing endogenous ALK7 receptor and confirmed to be reactive with activin AB and activin B were treated with D-MEM containing 10% fetal bovine serum, 2 mmol / L glutamine, and 4.5 g / L glucose. Suspend in culture medium and add 7 x 10 to 24-well cell culture plate^FourCells / well were seeded and cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Two days later, the cells were washed with PBS buffer, and the cells were suspended in 300 μL of a culture solution to which 40 or 80 ng / ml of activin AB was added. Incubate at 37 ° C in a carbon dioxide incubator for 2 days, collect the supernatant after completion of the culture, and use 30 μL of the supernatant to secrete the amount of insulin by ELISA using a commercially available insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Laboratories). Was measured.
As shown in FIG. 3, activation of insulin was observed in MIN6 cells expressing endogenous ALK7 by activin AB.
[0212]
【The invention's effect】
According to the present invention, a therapeutic agent for diabetes containing a protein selected from activin AB, activin B and activin receptor-like kinase 7 (ALK7) as an active ingredient, a therapeutic agent for diabetes containing a DNA encoding the protein as an active ingredient, Diabetes therapeutic screening method using protein or DNA, diagnostic agent and diagnostic kit for diabetes using antibody specifically recognizing DNA or protein, and antibody specifically recognizing ALK7 Provided is a method of transporting a medicament to the kidney for the treatment and / or prevention of diabetes.
[0213]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 7--Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 8-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
[0214]
[Sequence Listing]

[0215]

[0216]

[0217]

[0218]

[0219]

[0220]

[0221]

[0222]

[0223]

[0224]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of analysis of ligand-dependent transcriptional activity in ALK7 overexpressing cells. (-) Indicates no activin addition, ALK7 (-) indicates a cell line into which no ALK7 gene has been introduced, and ALK7 (+) indicates an ALK7 gene-introduced line.
FIG. 2 shows the results of analysis of ligand-dependent transcriptional activity in endogenous ALK7-expressing pancreatic β cells. The solid column shows the result using MIN6 cells, and the white column shows the results using dominant negative ALK7-expressing MIN6 cells. Moreover, (-) shows no activin addition.
FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the amount of insulin secreted from mouse pancreatic β-cell tumor cells upon addition of activin.

Claims

A medicament for the treatment and / or prevention of diabetes comprising activin AB as an active ingredient.

A medicament for treating and / or preventing diabetes comprising any of the following proteins as an active ingredient.
[A] a dimeric protein composed of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
[B] A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid wherein 1 to 5 amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A dimeric protein composed of a polypeptide comprising a sequence and having a function as a ligand of ALK7;
[C] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 A dimeric protein composed of a polypeptide comprising a sequence and having a function as a ligand of ALK7; or [d] 1 to 5 amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and 1 to 5 amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted, inserted and / or added. A dimeric protein composed of a polypeptide having an amino acid sequence, which has a function as a ligand for ALK7 :

The medicament according to claim 1 or 2, wherein the medicament for treating and / or preventing diabetes has an action of improving pancreatic function.

The medicament according to claim 1 or 2, wherein the medicament for the treatment and / or prevention of diabetes has an action of promoting insulin secretion from pancreatic β cells.

An insulin secretagogue comprising activin AB as an active ingredient.

A gene therapy agent for treating and / or preventing diabetes, comprising a DNA encoding an activin βA chain and a DNA encoding an activin βB chain.

A gene therapy agent for treating and / or preventing diabetes, comprising any of the following DNAs:
[A] DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2;
[B] A polypeptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, and as a ligand for ALK7 DNA encoding a polypeptide that constitutes a protein having the following functions; or [c] DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 4:

The gene therapy agent according to claim 6 or 7, wherein the gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes has an action of improving pancreatic function.

The gene therapy agent according to claim 6 or 7, wherein the gene therapy agent for the treatment and / or prevention of diabetes has an action of promoting insulin secretion from pancreatic β cells.

An insulin secretagogue, comprising DNA encoding activin βA chain and activin βB chain.