JPS6391097A - Ｄ−フエニルアラニンの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二工訟旦Ｕ二皿 本発明は、光学的に純度の高いＤ−フェニルアラニンの
分離方法に関する。

Ｄ−フェニルアラニンは鎮痛作用を有し、鎮痛剤のほか
、抗生物質の合成原料などとしても最近注目を集めてい
る医薬、医薬原料として有用なアミノ酸である。

従来の技′ｒ及び発明が一゛しようとしている。・ｉｒ
占Ｄ−フェニルアラニンの製造及び分離方法に関しては
、ベンジルヒダントインをある種の微生物が生産する酵
素ヒダントイナーゼを作用させて酵素的にＤ−フェニル
アラニンを得る方法や、（発酵と工業　Ｖｏｌ　　１３
８　ＡＩＯＰ９３７外　）また、優先晶出法、ジャスト
レオマー法などの物理化学的な手法による光学分割法に
よる方法が多数知られている。

前者においては原料ベンジルヒダントインの工・　　業
的な入手に難があり、後者は完全な光学分割はできず、
かなりの量の異性体（Ｌ一体）が混入される。

Ｄ−フェニルアラニンは用途によっては光学異性体の混
入は厳して制限されており、含有量によってはその商品
価値を低下させる。したがってＤ−フェニルアラニンの
製造においては、極力Ｌ−フェニルアラニンの含有を減
少させる必要があるが、化学的方法によるＤ−フェニル
アラニンの製造においては、得られたＤ一体及びＬ一体
のラセミ体から高純度のＤ一体のみを得る分離に大変困
難をきたす。

例えばＮ−アセチルグリシンとベンズアルデヒドの縮合
などの化学的方法で得られたラセミ体反応液から、通常
のアミノ酸の光学分割法として知られているＮ−アセチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンのみ加水分解させるアシラー
ゼ酵素を用いたアシラーゼ反応後、反応液を固液分離に
付した場合、加水分解により生成したＬ−フェニルアラ
ニンの溶解変分がＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン
の結晶に付着される。

またアシラーゼ酵素による選択的加水分解反応において
は、効率のよい分離法を考慰するのは勿論だが、Ｌ−フ
ェニルアラニンの生成物濃度が高くなる？二１反応を「
１害する。したがってＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルア
ラニンのアシラーゼ反応による光学分割においては１回
のアシラーゼ反応のみでは、限度があり、たとえ酵素を
多用してもＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンを充分
に反応せしめることはできず、得られるＮ−アセチル−
Ｄ−フェニルアラニン中にかなりの未反応し一体が混入
され、最終的に加水分解して得られるＤ−フェニルアラ
ニンの高光学純度を得るには問題があることもわかった
。

問題点を解決するための手段 本発明者らはこのような問題点を踏まえ、化学的方法に
より得られたＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンの
ラセミ体反応液からＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ンのみを効率よく分離し、高光学的純度を有するＤ−フ
ェニルアラニンを得る方法を鋭意検討し、本発明方法に
達したものである。

すなわち、本発明方法は、１）Ｎ−アセチル−ＤＬ−フ
ェニルアラニンをアシラーゼ酵素を用いて光学分割を行
い、得られたアシラーゼ反応液を、２）濃縮後冷却して
出来るだけのＬ−フェニルアラニニルアラニンのみを完
全に溶解してろ液として出来るだけＬ−フェニルアラニ
ンを分離するかのいずれかの方法で、Ｌ−フェニルアラ
ニンを分離後、３）主にＮ−アセチル−Ｄ−フェニルア
ラニン及び未反応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニ
ンよりなるろ液または結晶を、再度アシラーゼ反応に付
して、光学分割を行い、４）得られた反応終了液のＰ　
ｌ−Ｉを再度１以下にして、生成残存するＬ−フェニル
アラニンを溶解、固液分離して、５）Ｎ−アセチルーＤ
−フェニルアラニンを加水分解に付することよりなる、
光学的高純度のＤ−フェニルアラニンを得る方法である
。

本発明は以下の様にして実施する。

Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンのアシラーゼ酵
素によるアシラーゼ加水分解反応は、Ｎ−アセチルーＤ
Ｌ−フェニルアラニンの５〜４０％水溶液を苛性ソーダ
で中性付近もしくは弱アルカリ付近まで中和した水性媒
体中で、温度３０〜６０°Ｃ１反応時間１０〜７０　Ｈ
ｒで実施するのが好ましく、またアシラーゼの安定化の
ために通常行なわれている様にＣｏＣｄ２・６Ｉ−ｈｏ
を添加し系内のコバルトイオン濃度が１０−６Ｍ〜１０
−２Ｍの濃度となるようにして実施するのが望ましい。

上記の様な方法で得られたアシラーゼ反応終了液中には
、加水分解により生成したＬ−フェニルアラニンの溶解
度が２％前後であるため、溶解度分取外のＬ−フェニル
アラニンの結晶が析出しており、未反応のＮ−アセチル
−Ｌ−フェニルアラニンとＮ−アセチル−Ｄ−フェニル
アラニン及び溶解変分のＬ−フェニルアラニンは溶液と
なっている。この反応水溶液からなるべく多くのＬ−フ
ェニルアラニンを系外へ除去するために、アシラーゼ反
応マスを濃縮した後、冷却を行ない固液分離によりＬ−
フェニルアラニンを系外へ除去する。

その際、好ましくはＬ−フェニルアラニンの濃度が２０
％程度となるまで濃縮を行ない、０〜１０°Ｃまで冷却
してＬ−フェニルアラニンの結晶を固液分離するのがよ
い。

また本発明においては、上記の濃縮、冷却による方法以
外に、Ｌ−フェニルアラニンを分離する方法としてアシ
ラーゼ反応終了後、直ちにＰＨを塩酸などで１以下にし
て、生成しているＬ−フェニルアラニンを完全に溶解さ
せ、ろ液として分離することもできる。その場合はＮ−
アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反応のＮ−アセ
チル−し−フェニルアラニンは結晶として析出するので
これを単離する。その際、水でよく洗浄して付着してい
るＬ−フェニルアラニンを十分除去するのがよい。

このようにしてＮ−フェニルアラニンを固液分離して得
られた、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反
応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン及び若干のＬ
−フェニルアラニンを含むろ液または結晶は、Ｌ−フェ
ニルアラニン濃度が０．５％以内となる様に水で希釈さ
れ、この水溶液中に新たにアシラーゼ酵素を添加して再
度反応を行なわせる。

これにより、アシラーゼ酵素反応阻害もなく、未反応の
Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンは再度加水分解さ
せることができて極力減らすことができる。

二回目のアシラーゼ反応が終了したら、溶液のＰＨを塩
酸などで１以下とすることにより、生成しているＬ−フ
ェニルアラニンを溶解させ、未反応物のほとんど含まれ
ないＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンを析出させ固
液分離により単離する。その際好ましくはアシラーゼ反
応終了液は濃縮などによりＮ−アセチル−Ｄ−フェニル
アラニンの濃度を高くしておく方がよい。

かくして光学純度の高い、すなわちＤ一体音量９９％以
上のＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンを得ることが
できる。

本発明のアシラーゼ反応において使用するアシラーゼ酵
素は、選択的にＮ−アセチルアミノ酸のＬ一体のみを加
水分解するものであればいかなる菌体より取得されたも
のでもよいが、アシラーゼ反応は通常中性付近もしくは
弱アルカリ付近で行なわれており、従って本発明におい
ても至適Ｐ　Ｉ−Ｉが６〜９付近のアシラーゼを使用す
るのが好まし知釧苗−ストレプトミセス屈などの公知の
放線菌などから得られたものが使用できる。

本発明方法により得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニル
アラニンの加水分解は、常法に従い実施できる。即ち塩
酸使用量がＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの１．
２５倍モル程度、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン
の濃度が１０〜３０％の塩酸水溶液中で、加熱還流を数
時間行ない冷却、中和して析出した結晶を固液分離する
ことにより高収量で光学純度の高い（光学純度９９％以
上）のＤ−フェニルアラニンを得ることができる。

また副生したＬ−フェニルアラニンは、単離し−ＤＬ−
フェニルアラニンとして再使用することもできる。

以下実施例を示す。

実施例Ｉ Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン１００ｇをイオ
ン交換水及び２０％苛性ソーダ水溶液にて溶解し、ｐＨ
７，５に合わせる。ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０を反応系内の
Ｃｏｚ＋濃度が５Ｘ１０−４Ｍとなる様に添加した。反
応液の全重量が５５０ｇとなる様にして、大野製薬■製
アシラーゼ酵素１．Ｂ（１８゜０００Ｕ／ｇ）を添加し
て４０°Ｇ／４０Ｈｒで反応を行った。反応開始後１０
Ｉ（ｒ付近より結晶が析出し始めた。

反応終了後、反応液を減圧下（約１００＋ｘ／）Ｉｇ）
で濃縮し、水留去を行ない濃縮液１ｓｏｇｃＬ−フェニ
ルアラニン２０％濃縮液）を得た。

反応終了マスのＨＬＣ分析の結果、Ｎ−アセチル−Ｌ−
フェニルアラニンよりＬ−フェニルアラニンへの転換率
は８８％であった。

次に濃縮液を冷却して、１０°（：、／２Ｈｒ晶出後、
ヌッチェにより真空ろ過を行ない、Ｌ−フェニルアラニ
ンの粗結晶を約４０ｇ（Ｄｒｙ換算３３．０．！？）ど
ろ液１４１ｇを得た。ろ液中のＬ−フェニルアラニン濃
度は１．５％であった。

得られたろ液を水で希釈して全体を４５０ｇとし、さら
に２０％苛性ソーダ水溶液にてＰＨを７．５に合わせた
。ついで大野製薬■製アシラーゼ酵素０．７　ｇを添加
して４０℃／　４０１−ｂで２回目の反応を行なった。

２回目アシラーゼ反応終了後の反応液中のＬ−フェニル
アラニン濃度は０．４７％より１．１１％まで上昇し、
Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの大部分がＬ−フ
ェニルアラニンへ転換していることを示す。

得られた反応終了液を約３００９まで減圧下に濃縮し、
室温にて濃塩酸を加えてＰＨ１とした。引続き１０°Ｇ
／２１（ｒ品出を行ない、ヌッチェで真空ろ過後水洗、
乾燥を行ない、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの
結晶４２．８ｇを得た。

この結晶は純度９９．６％、旋光度〔α沼＝−４０，２
°（Ｃ＝　２　、　ｃｌ−１３０ｘ−ｘ　）−ｃあり、
光学的にほぼ純品のＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ンであることが確認された。

上記により得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ン２５ｇを、濃塩酸及び水に溶解して、全容量が１００
ｇ、塩酸濃度を７％として、加熱還流を８　Ｈｒ行ない
、冷却後３２％苛性ソーダ水溶液にテＰ　Ｈを５．０と
し、１０　’Ｃ／　２　Ｈｒ晶析を行なった。

ヌッチェによる真空ろ過し、水にて洗浄後、結晶を乾燥
して白色のＤ−フェニルアラニン精結晶１５．２ｇを得
た。

本品は純度１００．１％、〔α〕譬−＋３４６°（Ｃ＝
２、水）であり、光学異性体分離用カラム（ダイセル社
製キラルパック）で分析した結果、Ｌ一体は０．３％の
混入であった。

比較例 実施例１と同様に行なった。ただしアシラーゼ使用量は
倍量の２．８ｇとし、２回目のアシラーゼ反応はカット
した。得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの
旋光度〔α躍−−３６．２°　（Ｃ＝２、Ｇ−１３０Ｉ
４　）と低く、さらにこれより得られたＤ−フェニルア
ラニンの〔α）宕＝　＋２９．４°と低かった。

この場合り一体の８％が混入していた。

実施例２ 実施例１と同様にして一回目の光学分割反応を行ない、
濃縮液を得た。濃縮液に室温にて濃塩酸８６ｇを加えて
ＰＨを１．０とし、５°Ｃに冷却、２Ｈｒ晶出を行なっ
た。析出している未反応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニル
アラニンを含むＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニンの
結晶をろ別し、乾燥後４６ｇを得た。

この結晶は、純度９８．７％、旋光度〔α〕乞−−３２
．４°（Ｃ−２、Ｃｌ−１３０１１）。光学純度は約９
０％であった。

得られた結晶４０ｇを用いて水及び２０％苛性ソーダ水
溶液にてＰ　１１を７．５、全容量を２２０ｇとなる様
にし、大野製薬■製アシラーゼ酵素０．７タを添加して
４０°Ｇ／４０Ｈｒで２回目の反応を行なった。反応液
中には新たにＬ−フェニルアラニンが重量で２．９ｇ生
成しており、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンの大
部分はＬ−フェニルアラニンへ転換していることを示す
。

上記により得られた反応終了液を室温にて濃塩酸を加え
ＰＨ１，０とし、さらに１０　’Ｃ／　２１１　ｒ晶出
後ヌツチェで真空ろ過、水洗、乾燥を行ない、Ｎ−アセ
チルーＤ−フェニルアラニンの結晶３２７を得た。

コノ結晶ハ純度９９．８％。（α〕”、’　＝−４０，
３°（Ｃ＝２、ＣＨ３０Ｈ）であり、はぼ純品のＮ−ア
セチル−Ｄ−フェニルアラニンであることが確認された
。

上記により得られたＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニ
ン２５７を用いて実施例１と同様に加水分解を行ない、
Ｄ−フェニルアラニン精結晶１４．８夕を得た。本品は
純度９９．８％、〔α九＝　＋３４．８゜（Ｃ＝２、水
）であり光学異性体分離用カラム（ダイセル社製、キラ
ルパック）で分析した結果、Ｌ一体は０．２％の混入で
あった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）１）Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンをア
   シラーゼ酵素を用いて光学分割を行い、得られたアシラ
   ーゼ反応液を ２）濃縮、冷却して反応液中のＬ−フェニルアラニンを
   結晶として固液分離した後、 ３）主にＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反
   応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンよりなるろ液
   を再度光学分割を行い、 ４）得られた反応終了液のＰＨを１以下にして生成残存
   するＬ−フェニルアラニンを溶解させ、 ５）固液分離したＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン
   を加水分解に付すことよりなる、光学的に純度の高いＤ
   −フェニルアラニンの分離方法
2. （２）１）Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンをア
   シラーゼ酵素を用いて光学分割を行い、得られたアシラ
   ーゼ反応液を ２）ＰＨ１以下にして、反応液中の生成Ｌ−フェニルア
   ラニンをろ液として固液分離した後、 ３）主にＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン及び未反
   応のＮ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンよりなる結晶
   を再度光学分割を行い、 ４）得られた反応終了液のＰＨを１以下にして生成残存
   するＬ−フェニルアラニンを溶解させ、 ５）固液分離したＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン
   を加水分解に付すことよりなる、光学的に純度の高いＤ
   −フェニルアラニンの分離方法