JPS63503381A - 合成の、血漿不含有で輸血可能な血小板貯蔵用媒質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成の、血漿不含有で輸血可能な血小板貯蔵用媒質本発明は合成の血小板懸濁媒 質に関する。更に詳しくは本発明は、（１）血漿及び蛋白質を含有せず、（２） 血小板の貯蔵寿命を延長し、かつ輸血用に貯蔵される血小板濃縮物の品質を改良 し、そして（３）デキストロース及びクエン酸塩以外の有機化合物を含有しない 合成の血小板保存用媒質に関する。

血液は二つの主要部分より構成される。これらの部分は血液の標本が採取され、 凝固が防止された場合に認めることができる。標本を入れた容器の底部に沈殿し た血液の該部分は「成形要素（ｆｏｒｍｅｄ　ｅｌｅｍｅｎＱｊと称する。該成 形要素は赤血球と、白血球及び紡錘細胞（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）としても知 られている血小板のような、その他の微粒子成分を含んで成る。該成形要素は特 徴的に通常の人血の容量の４０〜５０％を占めている。血液標本中において沈澱 しない曇った液体は血漿として知られている血液の部分である。血漿は主として 水であるけれど無機物質及び有機物質ならびに溶解したガス及び種々雑多な異物 質を含有する。血漿中に含有される無機物質は主として電解質である。これら電 解質の最も重要なものを表１に示す。

表−一」− ナトリウム　１４２．０　ミリ当量／！カリウム　４．３　ミリ当量／！ カルシウム　５．０　ミリ当量／！ マグネシウム　３．４　ミリ当量／ｌ 塩化物　１０４．０　ミリ当量／２ 重炭酸塩　２７．０　ミリ当量／！ リン酸塩　２．３　ミリ当量／２ 硫酸塩　０．６　ミリ当量／！ 血漿中に見出される最も重要な有機物質は乳酸、尿素、アミノ酸、タレアチニン 、グルコース、ホルモン、蛋白質、アルブミン、及びグロブリンである。

現代医学は生体内（ｉｎ　ｖｉν０）血液に添加、及び／又は試験管内（ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ）血液と混合する溶液を開発して来た。

生体内における血液に添加するために使用される生成物は主として静脈注射、薬 学的媒質及び／又は寝たきりの患者の電解質交換用に使用される。これらの溶液 は主としてデキストロース及び随意的に電解質を含有する水より成る。デキスト ロースは典型的にはこれらの溶液において約５％の濃度において存在し、血球及 び組繊細胞に対して栄養を与える。

これらの溶液中に含有される電解質は広く変動する。

血漿に最もよく類偵する、電解質を含有する溶液は表１に示される電解質の複数 種を含有する。血液に生体内添加するのに好適なデキストロース及び電解質の溶 液の特定例はロック・リンゲル（Ｌｏｃｋ−Ｒｉｎｇｅｔ’ｓ）　’１３液であ る。

ロック・リンゲル溶液の処方を表２に示す。

表−−１ 塩化ナトリウム試薬　９．ＯＧｍ 塩化カリウム試薬　０．４２　Ｇｍ 塩化カルシウム試薬　０．２４　０ｍ 塩化マグネシウム試薬　０．’２　Ｇｍ重炭酸ナトリウム　、０．５　０ｍ デキストロース　０．５　０ｍ 最近に硬質ガラスフラスコから Ｗ、留シタ、　１０００　ｍｆ！ とするのに十分な量の水 生体内血液に添加するのに適する、その他の溶液はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ発行、第１４版（１９７０年）、第８１５〜８４７頁に見出すこ とができる。

試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の血液に添加される溶液は主として全血液か、又 は赤血球、白血球もしくは種々の物質の混合物のような血液の分離された成分か のいずれを保存するかに関係する。試験管内に採集され、かつ保存されるべき血 液成分に血小板が包含される場合には抗凝固剤を添加する。採集された全血に添 加するのに最も屡々使用される抗凝固剤は「酸−クエン酸二デキストロース」又 はｒＡＣＤＪとして知らているものである。この抗凝固剤溶液は（１）　最適の 生理学的ｐＨを生ずるのに十分な濃度におけるクエン酸及びクエン酸ナトリウム 、及び（２）赤血球の長期保存に対して十分な濃度におけるデキストロースを含 有する。全血及び全血の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）の両方を保存するのに望まし いことがわかった溶液は「クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース抗凝固剤溶液 」又はｒＣＰＤＪとして知られているものである。該クエン酸塩−リン酸塩−デ キストロース抗凝固剤溶液の成分を表クエン酸（無水物）　３．０　Ｇｍ クエン酸ナトリウム（三水和物）　２６．３　０ｍ酸性リン酸ナトリウム （−水和物ｉ　ＮａＨｉＰＯａＨｔＯ）　２．２２　Ｇ　ｍデキストロース　２ ５．５　０ｍ １０００　ｍｌ とするのに十分な量の注射用水 血液の微粒成分の特定の要素はその後の輸血のために分離し、かつ保存すること ができる。伝統的な方法を使用して白血球及び血小板を一緒に採取し、保存する ことができる。更に近代的な方法は血小板を分離し、貯蔵し、次いで血小板欠乏 症の受血者に再注入することを可能にした。これらの方法による分離及び貯蔵後 に、これらの要素の迅速な劣化が生ずる。貯蔵中における血小板の品質の劣化は 貯蔵中に解放（ｒｅｌｅａｓｅ）された血漿凝固因子（ｐｌａｓｍａ　ｃｌｏｔ ｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）の活性化に起因するという仮説が立てられている。

輸血用として意図される、分離された血小板、又は「血小板濃縮物」の貯蔵は典 型的には三つの方法の一つによって行われる。これらの方法は血小板をゼラチン 中に懸濁させ、次いで該懸濁液を冷却し、血小板を凍結又は凍結及び凍結乾燥し 、次いで血小板を液体貯蔵することを包含する。これらの方法は一般的に＄、Ｗ ｉｌｌｉａｍｓら、第２版、ＭｃＧｒａｗ−旧１１　Ｂｏｏｋ　Ｃｏｏ＋ｐａｎ ｙ（１９７７年）、第１５５３〜６１頁に記載されている。

血小板の貯蔵の最も有望な方法は、約２２°Ｃの温度のような、貯蔵される血小 板の形態的損傷を生ずることのない温度における血小板の液体貯蔵を包含する。

血小板の液体貯蔵のための溶液は一般的に表１に示される電解質の１種又はそれ 以上、デキストロースもしくはグルコース、抗凝固剤、及び１種又はそれ以上の 添加剤を包含する。これらの溶液は典型的には血小板を約２４ないし約７２時間 保存する。成る種の添加剤は実験目的のためにのみ使用することができる。なぜ ならば該添加剤は安全性又は規定要件に適合しないか、又は多くの有機化合物、 特に蛋白質化合物におけるように受血者を敏感にし、該化合物に反復露出したと きアレルギー反応を起こすことがあるからである。

大部分の臨床目的用血小板濃縮物は現在、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロー スで凝固阻止された全血の採集単位から製造され、かつ約５０〜６０ミリリツト ルの凝固阻止された血漿又はｒ　ＣＰＤ−血漿」中において貯蔵される。ＣＰＤ −血漿は血小板輸血を必要とする患者に血小板と共に注入される。この方法は血 小板の貯蔵のために血漿の使用を必要とするのであるから患者の治療における他 の目的に対しては該血漿は有効ではない。それ故、生活力ある（ν１ａｂｌｅ） 血小板を血漿不含有媒質中において貯蔵又は懸濁させて、患者への輸血に有効な 採集血漿の量を減らさないようにすることが望ましい。そのほか、血小板を懸濁 するのβ使用される血漿は輸血血小板の提供者と受血者との間に血液型又はｒＡ ＢＯＪ不適合性の故に輸血後の患者にアレルギー反応を生じさせることがある。

Ｒｏｃｋらに対する米国特許第４，４４７，４１５号明細書は血漿を含有しない 血小板に対する液体貯蔵用媒質を開示している。この発明の媒質は塩水と、抗凝 固剤と、望ましくはＣＰＤ−Ｔｙｒｏｄｅ溶液の形態であるデキストロース含有 溶液と共に１種又はそれ以上の添加剤を使用している。この発明に使用するのに 好適であるとして開示されている添加剤は（１）インドメタシン、キナクリン、 又はビタミンＥのような有機化合物である可逆抑制剤（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｉ ｎｈｉｂｊｔｏｒ）、と（２）プロスタグランジンＥ＋、Ｄｉ又は■２のような 環式アデノシン　モノリン酸塩水準を高めるための物質とを包含する。これらの 添加剤の多くが、人体内に輸血する物質に対して必要な安全性及び規定要件を満 たしておらず、それ故実駅用又は試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）用にのみ適して いる。この発明に使用するのに適しているとして開示された、そのほかの添加剤 は（１）フラクトース及びその他のＩ！類、アデニン又はアセチルＣｏＡのよう な栄養素と、（２）リン酸塩及び成る種のアミノ酸のような緩衝剤とを包含する 。栄養物と確認された有機化合物又は添加剤は媒質中におけるデキストロースを 存在させる必要性を取り除くことがなく、しかも約５日以上の長い貯蔵期間にわ たる血小板の栄養要件を満足させない。

緩衝剤と確認された添加剤は約５日以上の長期の血小板貯蔵期間中、平衡したｐ ）Ｉを維持することができない。これらの緩衝剤は、血小板が少なくとも約２２ ゛Ｃの温度において貯蔵された場合に生ずるデキストロースの消費からの副性物 としての生活可能な、懸濁した血小板により生成される量の乳酸を適度に緩衝す ることができない。

血漿と、デキストロース、及びクエン酸のような抗凝固剤以外の有機化合物とを 含有せず、しかも冷却しないか又は少なくとも約２２°Ｃの温度において、７日 間以上の貯蔵期間にわたり、生活力（ｖｉａｂｉｌｉ　ｔｙ）の減少が最小であ り、不安全であるか、又は生体人間用に認められないかのいずれかである添加剤 を使用することなく血小板を保存する血小板貯蔵用媒質は工業界に存在していな い。

本発明は： 無菌の、血漿不含有血小板貯蔵用媒質において、電解質溶液１リツトルが： 約３．０グラムと約７．５グラムとの間のデキストロース；約３．０グラムと約 ６．０グラムとの間のクエン酸ナトリウム；及び 約２．０グラムと約４．２グラムとの間の重炭酸ナトリウム；を有するものであ る生理学的に適合性の電解質水溶液を含んで成り； 該血小板貯蔵用媒質は等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）であり、かつ約６．８と約７． ４　との間の範囲のｐＨを有し、該血小板貯蔵期間中は血小板を少なくとも約２ ２°Ｃの温度において少なくとも約１０日間にわたって保存することができるも のである前記無菌の血漿不含有の血小板貯蔵用媒質、である。

また本発明は： 電解質溶液の１リツトルが 約３．０グラムと約７６５グラムとの間のデキストロース；約３．０グラムと約 ６．０グラムとの間のクエン酸ナトリウム； 約２．０グラムと約４．２グラムとの間の重炭酸ナトリウム； を有するものである生理学的に適合性の電解質水溶液を８周整し； 血小板を血小板貯蔵用媒質中に懸濁させ、該血小板貯蔵用媒質は等張であり、か つ約６．８と約７．４との間の範囲のｐ）Ｉを有し、それにより実質的・濃度の 血小板が少なくとも約２２°Ｃの温度において少なくとも約１４日間にわたって 生活可能のままでいる； ことを含んで成る、血小板を無菌の血漿不含有血小板貯蔵用媒質中に保存する方 法をも包含する。

更に特定的には本発明は無菌の血漿不含有血小板貯蔵用媒質である。該血小板貯 蔵用媒質は生理学的に適合性の電解質水溶液を包含する。この電解質溶液１リツ トル中には約３．０グラムと約７．５グラムとの間のデキストロース、約３．０ グラムと約６．０グラムとの間のクエン酸ナトリウム、及び約２．０グラムと約 ４．２グラムとの間の重炭酸ナトリウムが存在する。該血小板貯蔵用媒質は等張 （ｉｓｏｔｏｎｉｃ）であり、かつ約６．８と約７．４との間の範囲のｐＨを有 する。デキストロース及びクエン酸又はクエン酸誘導体を除いて、本発明の最も 望ましい血小板貯蔵用媒質は有機化合物添加剤を含有しない。本明細書において 使用される用語「生活可能なｊ血小板とは血小板貯蔵用媒質中に懸濁している単 離された実質的濃度の血小板が、貯蔵された血小板が受血者に注入され、かつ機 能することができるような、それら血小板の通常の、かつ固有の生理学的、機能 的かつ構造的な特性を保持していることを意味する。

本発明の生理学的に適合する電解質水溶液は、血小板貯蔵用媒質の貯蔵性能に対 して最低の影響のみを伴って変動することができる。該血小板貯蔵用媒質の最も 望ましい実施態様は血漿中に見出される最も重要な電解質を含有する。該電解質 は通常の血漿中に見出されるものとほぼ同一の濃度において血小板貯蔵用媒質中 に含有される、最も望ましい電解質は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カル シウム、硫酸マグネシウム、及び第一リン酸ナトリウムを包含する。これらの、 及びその他の電解質は通常には受血者への注射又は注入用の水溶液の状態で得ら れる。血小板貯蔵用媒質の製造に当って、これら電解質の濃度を公知技術によっ て変えて等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）溶液を得ることができる。血小板貯蔵用媒質 の望ましい実施態様は、該媒質１リツトル中に約６．４グラムと約７．６グラム との間の塩化ナトリウム、約０．２グラムと約０．４グラムとの間の塩化カリウ ム、約０．１グラムと約０．４グラムとの間の塩化カルシウム、約０．２グラム と約０．４グラムとの間の硫酸マグネシウム、及び約０．１グラムと約０．６グ ラムとの間の第一リン酸ナトリウムを含む電解質を有する。

デキストロースは血小板に対する天然の栄養素であり、しかも生活可能な血小板 を約７日間以上の長期貯蔵期間にわたって保存し、かつ維持する血小板貯蔵用媒 質の能力に有意に寄与する０本発明の血小板貯蔵用媒質は貯蔵された血小板に対 する唯一の重要な栄養素としてデキストロースを使用する。別の栄養素のわずか な存在又はグルコースの使用は本発明の血小板貯蔵用媒質の有効性を殆ど変えな い。別の栄養素の存在は、血小板の長期保存に当って該別の栄養素がデキストロ ースはどに効果的でないので望ましくない。

本発明の血小板貯蔵用媒質中におけるデキストロースの濃度は血液又は血液成分 と共に使用するための溶液において典型的に使用されるデキストロースの濃度よ りも大きい。このより大きいデキストロース濃度は、貯蔵される血小板の貯蔵期 間全体にわたって該貯蔵される血小板に対して栄養素を与えるのに十分でなけれ ばならない。

望ましくはデキストロースは血小板貯蔵用媒質中において１リットル当り少なく とも約３．０グラムの濃度において存在する。典型的には１リットル当り約３． ０から約７．５グラムまでの間のデキストロースの濃度が、本発明にしたがって 貯蔵される血小板に対し、少なくとも約１４日間にわたって十分な栄養素を与え るのに十分である。

本発明の血小板貯蔵用媒質の緩衝系は血小板の５日以上の貯蔵を成功させること に対して臨界的である。

ＣＰＤ−血漿中における血小板濃縮物のｐＨは約１０日ないし約１４日の貯蔵後 において６．０以下の水準に低下する。約６．０以下のｐＨ水準は血小板の生活 力及び生理機能（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の減少をも たらす。低ｐＨを有する媒質における血小板の生活力及び機能の、この減少ｌ　 に対する原因は、貯蔵中における、血小板による連続的かつ一定速度のグリコー ル化゛から生じた、血漿中における乳酸の蓄積に起因すると思われる。実質的濃 度の重炭酸ナトリウムを血小板貯蔵用媒質に添加することにより血小板の貯蔵中 に生成された乳酸が中和される。重炭酸ナトリウムの濃度は、貯蔵された血小板 に対する血小板貯蔵用媒質のｐＨを、貯蔵期間を通して約６．７以上に維持する のに十分でなければならない。約６．７以下の血小板貯蔵用媒質のｐＨ値は血小 板総数、ＬＤＨ放出、ＡＴＰ水準、低張ショック反応（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　５ ｈｏｃｋ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、ＡＩＩＰと共に存在する血小板の形状変化（ｓ ｈａｐｅ　ｃｈａｎｇｅ）の程度、及び血小板の酸素消費速度のような試験管内 パラメータによって反映されるように貯蔵血小板に対し′で有害である場合があ る。

本発明の血小板貯蔵用媒質の緩衝系は主要なアルカリ性剤として重炭酸ナトリウ ムを使用する０重炭酸ナトリウムは血小板の貯蔵期間を通して沈澱を生ずること なく血小板貯蔵用媒質の所望ＯｐＨ値を維持するのに十分な濃度において使用す る。血小板貯蔵用媒質１リツトル中に約２．０グラムと約４．２グラムとの間の 濃度において重炭酸ナトリウムが存在することが望ましい。本発明の血小板貯蔵 用媒質の緩衝系は第一リン酸ナトリウムを包含する。小さな濃度の他の塩を本発 明の緩衝系と共に適当に含有することができる。

本発明の血小板貯蔵用媒質において使用される抗凝固剤はクエン酸ナトリウムを 包含する。本発明の最も好ましい実施態様においてはクエン酸゛が包含される。

本発明の抗凝固剤は長期貯蔵期間中、血小板の実質的な凝固を阻止するのに十分 な濃度において存在しなければならない、クエン酸ナトリウムは血小板貯蔵様媒 質１リツトルそしてクエン酸は血小板貯蔵用媒質１リツトル中に約０．４グラム と約０．６グラムとの間の濃度において存在することが望ましい、小さな濃度の 他の抗凝固剤を本発明の血小板貯蔵用媒質に含有させることが適当である場合が ある。

本発明による血小板用の血小板貯蔵用媒質は表４に列挙した化学成分により構成 される。本発明の最も望ましい実施態様は有意濃度のすべての他の化合物を排除 して、これらの化合物から実質的に成る０本発明の血小板貯蔵用媒質における他 の化合物の排除は受血者における鋭敏化を阻止し、かつ血小板に対する貯蔵期間 を最大化するために望ましい。

塩化ナトリウム　６．４−７．６　ｇｅｌ　６．４５　ｔｅｌ塩化カリウム　０ ．２−０．４　ｇ／４１！　０．３７５　ｇｅｌ塩化カルシウム　０．１−０． ４　ｔｅｌ　０．２４８　ｇｅｌ硫酸マグネシウム　０．２−０．４　ｇｅｌ　 Ｏ，２０００ｇ＃！リン酸ナトリウム （−塩基）　０．１−０．６　ｇｅｌ　Ｏ，３５５ｇ／４２デキストロース　３ ．０−７．５　ｇ／ｊ！　７．０３５ｇ＃！クエン酸　０．４−０．６　ｇ＃！ 　０．５１０ｇ＃！クエン酸三ナトリウム３．０−６．０　ｇ／　１　４．４７ １ｇ／　１重炭酸ナトリウム　２．０−４．２　ｇｅｌ　３．０００ｇ／ｊ２Ｃ Ｏ２雰囲気　２．５−７．５　’／　５χ溶液の、ｔａＥ／　ｌにおける個々の イオン特性は下記表５のとおりである。

Ｎａ″　１９Ｂ、８０−２３６．１０　２０７．６０Ｋ”　２．６８−　５．３ ６　５．０３Ｃａ　”　１．３６−　５．４５　３．３８Ｍ　ｇ　”　１．７０ −　３．４０　１．７０ＨＰ　Ｏ，−”　１．３８−　５．５０　２．５８Ｃｊ ２−　１１０．００−１３８．００　１１７．３８Ｓｏ−”　１．７０−　３． ４’０　１．７０ＨＣＯ３−２３，８０−５０，０３５，７１血小板貯蔵用媒質 のｐＨは約６．８と約７．４との間の範囲に維持する。

本発明の血小板貯蔵用媒質の製造に当って使用するに適当な基本溶液（ｂａｓｉ ｃ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）及び成分は、無菌、非発熱性（ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎ ｉｃ）の、注射可能な溶液として多数の販売元から入手することができる。該成 分の供給者は、それぞれニューシャーシー州、オラデル市、ＭｅｄｉｃａｌＥｃ ｏｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより刊行される Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ及びＲｅｄ　Ｂｏｏｋ のような普通の刊行物から確認することができる。下記の工業用成分の例は本発 明に使用するのに有効な受け入れ得る市販製品の抽出見本を示すものである。リ ンゲル注射薬ＵＳＰ（アメリカ薬局方）、注射用無凹非発熱性水１リットル当り 塩化ナトリウム８．６グラム塩化カリウム０．３グラム及び塩化カルシウム０． ３３グラムを含有する。

注射用無菌水は静脈注射のための非発熱水である。硫酸マグネシウム注射薬ＵＳ Ｐは注射用の無菌非発熱水中における硫酸マグネシウムの５０パーセント溶液で ある。

重炭酸ナトリウム注射薬ＵＳＰは注射用無菌非発熱性水中における重炭酸ナトリ ウムの８．４パーセント溶液である。デキストロース注射用溶液ＵＳＰは注射用 無菌非発熱性水中におけるデキストロースの５０パーセント溶液である。塩化カ リウム注射薬ＵＳＰは注射用無菌非発熱性水中における塩化カリウムの２２パー セント溶液である。抗凝固剤のクエン酸塩−リン酸塩−デキストロース溶液は無 菌非発熱性水１リットル中クエン酸３．０グラム、クエン酸ナトリウム２６．３ グラム、酸性リン酸ナトリウム２．２２グラム、デキストロース２５．５グラム を有し、ＣＰＤ７０ミリリットル対全血５００　ミリリットルの割合で使用され る。

好ましい実施態様においては上記に列挙した溶液は本発明の血小板貯蔵用媒質に 対する化学的コンシスチンシー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｎ５ｉｓｔｅｎｃｙ） を達成するように下記の量において組み分けされる。血小板貯蔵用媒質溶液はリ ンゲル溶液７５０　ミリリットル、Ｃ′ＦＤ１７０　ミリリットル、重炭酸ナト リウム溶液４０ミリリツトル、デキストロース注射用溶液５．４　ミリリットル 、塩化カリウム０．７　ミリリットル、硫酸マグネシウム溶液０．４　ミリリッ トル及び注射用無菌水３３．５ミリリツトルを含有する。すべての溶液は殺菌さ れた無菌の状態下に混合される。血小板を血小板貯蔵用媒質と共に接種（ｉｎｎ ｏｃｕｌａｔｉｏｎ）する以前に該溶液の混合物を、組織培地の減圧源適用に設 計された０、２ミクロンの濾過単位装置を使用して濾過殺菌（ｆｉｌｔｅｒｓｔ ｅｒｉｌｉｚｅ）する。

本発明の血小板貯蔵用媒質の好ましい組成とＣＰＤ−血漿とを表６において比較 する。

ナトリウム　２０７．６０　１７３−１８０カリウム　５．０３　１．９−３． ８ カルシウム　３，３８　３．４−４．０マグネシウム　１．７０　１．１−１． ９リン酸塩　２．５８　３．９ 重炭酸塩　３５．７１　２０．９ クエン酸塩　４５．００　６７．２ 硫酸塩　１．７０　０．４−１．１ 塩化物　１１７．３８　７５−８０ 蛋白質　０．　１２．２ 有機酸　０４，４ クエ　ンｉｌ　２．６０ミリモル＃２　３．９　ミリモル／！デキストロース　 ４０．００ミリモ；し＃２　２５．０ミリ干ル／１合計　＋ｎＥｇ／ｆ　２０２ ．８（ｘ２）　１８９．７（ｘ２）血球内に浸入しないことを仮定し、かつ、４ ２．５のへマクリット値（ｈｅｍａ　ｔｏｃｒ　ｉ　ｔ）とＨａｐｅｒ著Ｒｅｖ ｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙに示されるような通常の限界内の血清 化学値（ｓｅｒｕａ＋ｃｈｅｍｉｃａｌνａｌｕｅ）とを有する全血５００　ミ リリットル中におけるＣＰＤ抗凝固剤７０ミリリットルの溶液を基準とするもの である。

血小板の保存及び貯蔵の操作においては血小板貯蔵用媒質の調整後において、血 小板を他の成分から分離する必要がある。慣用の血液処理技術を使用する全血単 位の処理後に血小板の沈殿又は塔底′ＪｊｙＪ（ｂｏｔｔｏｍ）が得られる。

すべての血漿が「しぼり出され」、次いで無菌バッグ中に採集される。次いで該 血小板貯蔵媒質を血小板の沈澱の入った容器に移すことができる。この移送は血 小板貯蔵用媒質を入れた無菌バッグを連結する接続配管か又は最初には採集バッ グのセットに取りつけられていなかった容器から媒質を移送することのできる市 販の、無菌の接続装置かの、いずれかによることができる。分離された血小板を 血小板貯蔵用媒質中に再懸濁させた後、血小板を約２２°Ｃにおいて血小板培養 器／回転子において貯蔵する。

慣用のＰ　Ｌ−７３２血小板容器はＣＯ□に対して高い透通ることにより、容器 からのＣＯ２の逃出に起因するｐＨの初期上昇が阻止される。この問題はＣＯ□ を透過させることの少ない容器を使用すること、又は重炭酸ナトリウムと組も合 わせて別の非毒性緩衝剤を使用することにより解決することができる。

血小板の保存に対する本発明の血小板貯蔵用媒質の適合性を実証するために試験 管的研究を行って、本発明の血小板貯蔵用媒質中に貯蔵した血小板濃縮物の品質 と血景抗凝固中にクエン酸塩−リン酸塩−デキストロースと共に貯蔵した血小板 濃縮物の品質とを比較した。下記の実施例は比較試験の結果を示す比較例である 。

実施例１〜５及び比較例Ａ−Ｅ 血小板を分離するため、及び血小板貯蔵用媒質を製造するために、これらの実施 例及び比較例において使用した手順は本発明の好ましい実施態様に対し７て上記 に記載したとおりであった。血小板貯蔵用媒質に対して示されるデータは記号ｒ Ｐ、Ｓ、Ｍ、　Ｊにより示し、かつ本発明の実施例１〜５を表わす。ＣＰＤ−血 脩中における血小板の貯蔵に対して示されるデータは記号ｒＣＰＤ−ｐｉｆによ り示し、かつ比較例Ａ−Ｅを表わす。比較例は本発明を代表しない。

これらの実施例及び比較例に対し、血小板を分離し、それらのそれぞれの媒質中 において貯蔵し、第１日、第５日、第１０日及び第１５日に試験した。これらの 日　において血小板数について行った試験により第１日日の血小板数に対するパ ーセント、血小板の形状変化のパーセント、低張ショック反応（ｈｙｐｏｔｏｎ ｉｃｓｈｏｃｋ　ｒｅｓｐｏｎｅｓ）のパーセント、血小板中のアテノシント１ ．１ボスフエ−１・又はｒＡＴＰｊの濃度、及びラクテート脱水素酵素、又は血 小板により放出される’Ｌ　Ｄ　ＨＪにより明示される乳酸放出の景が定められ る。

これらの試験の結果をそれぞれ表７〜１工に示す。

Ｐ、Ｓ、Ｍ、　１００　９４±３　９１±２　８２±４ＣＰＤ−ｐ　７！、　１ ００　９４±３　８４±６　７７±３Ｐ、Ｓ、Ｍ、　１６±１１４±１　１０± １　７±ＩＣＰＤ−ｐ　ｆ　、１６±１１１±１　５±１　４±ＩＰ、Ｓ、Ｍ、 　７５±６６５±４　６３±５　４０±３ｃｐｏ−ｐ　Ｉ！、８２±３７８±５ 　４９±２　１２±５Ｐ、Ｓ、Ｍ、　８．５±０．４　７．７±０．３　５．４ ±０．４　３．１±０．４ｃｐｏ−ｐ！、７．５±０．７　６．０±０．４　３ ．５±０．３　０．８±０．２表　１１ Ｐ、Ｓ、Ｍ、　１３６±１６　１７７　±２２　３０５±３３　４３０±４３ｃ ｐｏ−ｐ　１　、　１２０±　８２１５　±１５　４３０±２３　５８５±３５ ＊結果は平均上標準偏差を表わす。

これらの比較研究の結果は下記に示される゛ように血小板貯蔵用媒体中において 貯蔵された血小板が形態学的及び生理学的な統合性（ｉｎｔｅｇｒｉ　ｔｙ）の 、より良好な維持を示すことを実証する。本発明の血小板貯蔵用媒質中に懸濁さ せた血小板は試験期間中にわたっての血小板数の差によって明らかであるように 、より良好な保存を実証した。血小板の減少は血小板の凝集及び崩壊（Ｉｙｓｉ ｓ）を反映する。本発明の血小板貯蔵用媒質中に懸濁された血小板は、より良好 な光学歪み、又は形状変化に耐える能力、もしくは生理学的活性化剤の使用によ り活性化して来る血小板の能力の維持を実証した。本発明の血小板貯蔵用媒質中 に懸濁された血小板は低張応力（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ　５ｔｒｅｓｓ）から回復 するそれら血小板の能力により、ＣＰＤ−血柴中に懸濁された血小板よりも、よ り良好な保存状態を実証した。本発明の血小板貯蔵用媒質中に懸濁された血小板 は血小板細胞のた血小板は貯蔵中における細胞内Ｌ　Ｄ　Ｈの、より少ない減少 により示される゛ように膜統合性（ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をよ り良好に維持することを実証した。

これらの実施例及び比較例は、非凍結温度又は少なくとも約２２℃の温度におい て少なくとも１０ないし１４日間にわたる、血小板貯蔵用媒質中における血小板 濃縮物の貯蔵によりミＣＰＤ−血漿中における５〜１０日にわたる血小板の貯蔵 によって得られる生活力に類似する生体内生活力を反映する試験管内性質が維持 されることを実証する。

大止斑斐 ル較拠り２且 本実施例及び比較例は実施例１〜５及び比較例Ａ〜Ｅに記載と同一の手順を使用 した。これらの実施例及び比較例は異なる血小板貯蔵用媒質中における種々の量 のクエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、ナトリウム　ジホ スフェート、重炭酸ナトリウム、ｐＣＯ□張力、デキストロース及び血景の効果 を実証する。これらの改質は（１）血小板数と、（２）低張ショック反応のパー セントと、（３）サイズ分布の変化、血小板凝集塊の外観、気球形状、顕微鏡に より判断される断片、及びＬＤＨの放出により特徴づけられる血小板の構造的統 合性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）と、（４）血小板のエネル ギー代謝、又は酸素消費速度、乳酸塩生成速度及びグルコース消費速度に対する 、ＡＤＰによる形状変化の程度により特徴づけられる血小板機能と、（５）　Ａ 　Ｔ　Ｐ水準とに対する１０日間の貯蔵期間にわたる、異なる血小板貯蔵用媒質 の効果を比較することにより実証された。これらの特性を実証するデータを表１ ２〜１６にそれぞれ示す。

実施例６は本発明の血小板貯蔵用媒質に対する五つの特性についてｍ≠可のデー タを示し、記号ｒＰ、ｓ、Ｍ、Ｊにより示す。本実施例に使用される血小板貯蔵 用媒質は本発明の好ましい実施態様である。

比較例は記号ｒＢＳＭＪ、ｒＢＳＭ＋グルコース」及びｒＤＭＳＭＪにより示さ れる血小板貯蔵用媒質に対する五つの特性についてのデータを示す。記号ｒＢＳ ＭＪは本発明の好ましい血小板貯蔵用媒質と同一の特性を有するけれどデキスト ロースを含有せず、しかも１リットル当り５．２３グラムの低い塩化ナトリウム 濃度を有する血小板貯蔵用媒質を表わす。記号ｒＢＳＭ＋デキストロース」はデ キストロースを包含し、本発明の血小板貯蔵用媒質と同一の特性を有するけれど １リットル当り５．２３グラムの低い塩化ナトリウム濃度を有する血小板貯蔵用 媒質を表わす。記号ｒＤＭ針」は好ましい血小板貯蔵用媒質と同一の特性を有す るけれどデキストロースを含有しない貯蔵用媒質を表わす。比較例は本発明を代 表するものではない。

、表−一二形 ″″１日の血ハキ　に対する血ハ反　の％８第１日　第５日　１シυΣ旦− ＲＳＭ　６６±８４７±１１ ＲＳＭ＋デキストロース　８３±８　７３±１００Ｍ５Ｍ　８２±１０５６±９ Ｐ、Ｓ、Ｍ、　９５±２９１±３ 表　１３ 一張ショック反応、口′％０ 第１日　第５日　第１０日 ＢＳＭ　２８±５　２０±６４±１１ ０Ｂ５＋デキストロース　４４±１０４４±１０２２±１００Ｍ５Ｍ　７５±１ ３４１±１０８±５Ｐ、Ｓ、Ｍ、　７３±２０６１±１３５１±６表　１４ 、と旦上二」１痩虹化工几１」罎敬す支１１吋ｒ−第１日　第５日　第１０日 ８５Ｍ　１３±２　７±３　２±２ ＢＳＭ＋デキストロース　１６±３　１０±４　５±３ｒ）ＭＳＭ　１５±３８ ±２　１±Ｉ Ｐ、Ｓ、Ｍ、　１７±４　１４±２　１０±３スーー二匝 ＢＳＭ　１．０±０．１　０．５±０．３　０．３±０．１ＢＳＭ＋デキストロ ース１．０±０．３　０．６±０．１　０．６±０．２０Ｍ５Ｍ　０．９±０． ３　０．６±０．１　０．２±０．ＩＰ、Ｓ、Ｍ、　１．０±０．１　０．７± ０．１　０．４±０．３０Ｍ５Ｍ　７．１±１．５　５．３±２．２　０．７± ０．２ＰＳＭ　８．５±１．５　８．４±１．３　６．５±０．８本実施例及び 比較例は下記の事項を実証する。

（１）血小板の凝集及びその後における血小板の劣化を回避するためには１リッ トル当り最低３０００ないし６０００ミリグラムのクエン酸ナトリウムが絶対必 要であった・ （２）１リットル当り６４０００ないし７６０００　ミリグラムの濃度範囲にお ける塩化ナトリウムにより血小板の円盤形態構造（ｄｉｓｃｏｉｄ　ｍｏｒｐｈ ｏｌｏｇｙ）の良好な維持及び無視し得る凝集が得られた。１ミリリットル当り ５．２３グラムの濃度における塩化ナトリウムにより、血小板濃縮物の貧弱な品 質が表１２のデータにおいて観察された。

（３）血小板の円盤形態構造を維持することに対しては２価カチオン（Ｍ　ｇ　 ”及びＣａＩ２）、！添加することが必要であった。塩化カルシウムは１リット ル当り１００ないし４００ミリグラムの濃度範囲において使用して、塩化マグネ シウムは２００ないし４００ミリグラムの範囲において使用して良好な結果を得 ることができた。

（４）　塩化カリウムは１リットル当り２２０ないし４００ミリグラムの濃度範 囲において使用して、良好な結果を得ることができた。

（５）ナトリウム　ジホスフェートは１リットル当り１００ないし５８０ミリグ ラムの濃度範囲において使用して良好な結果を得ることができた。

（６）重炭酸ナトリウムは１リットル当り２９００ないし４２００ミリグラムの 濃度範囲において使用して良好な結果を得ることができた。７日以上の貯蔵によ るｐｌ（の減少を防止するためには１リットル当り最低２９００ないし４２００ ミリグラムが必要であることがわかった。

（７）一定ｐＨを維持するためには重炭酸ナトリウムの添加量に関係して２．５ ないし７．５パーセントの二酸化炭素雲囲気が好首尾に使用された。

（８）　表１２のデータによって明らかであるように、血小板の良好な試験管内 性質を維持するためにはグルコース（デキストロース）の添加が絶対に必要であ った。デキストロースは３０００ないし７５００ミリグラムの濃度範囲において 使用して良好な結果が得られた。

（９）　血小板貯蔵用媒質のｐＨは２２°Ｃにおいて測定して６．８ないし７． ４の範囲内に維持した。７．４以上のｐＨは血小板の凝集をもたらし、一方にお いて６．８以下のｐＨは膨潤と平盤形態構造の減少をもたらした。

ｈ″′７　び　争六例Ｉ ＣＰＤ−血漿に対する、血小板貯蔵用媒質の化学的特質及び生理学的特質の類似 性は患者への注入に対する血小板貯蔵用媒質の固有の非毒特性及び安全使用特性 を表わす。この故に、本発明の血小板貯蔵用媒質と共に保存される血小板の生体 内研究が行われたのである。これらの研究は、２１才以上であって、精神的又は 物理的欠陥を有することが知られておらず、かつ薬剤治療を受けていない男性を 使用する１対の研究のような１０対の研究を包含した。慣用の血小板部分切除（ ａｐｈｏｒｅｓ　ｉｓ）技術を使用して取り出した血小板に冨む血漿の１単位を 有志者が提供した。この手順を２回行った。現在免許されている手順を使用して 血小板濃縮物をＣＰＤ−血漿中、又は血小板貯蔵用媒質中のいずれかにおいて２ ２℃で７日間の貯蔵処理をした。

血小板濃縮物を約２２℃においてかくはん機／培養基中に貯蔵した。ＣＰＴ）− 血漿中の血小板濃縮物は通常の空気雰囲気下に貯蔵した。血小板貯蔵用媒質中に おける血小板濃縮物は７．５バーセン）　ＣＯｔ雰囲気下に貯蔵した。ＣＰＤ− 血漿中における血小板の、この処理及び貯蔵は現在免許された手順に合致する。

Ｈｅｙｎｓ　らのＰｌａｔｅｌｅｔ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ａｒｉｄ　Ｔｍａｇｉ ｎｇ−、第１巻、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｐｌａｔｅｌ ｅｔ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｓフロリダ州、ボカラトン市、ＣＲＣＰｒｅｓｓ社発 行（１９８５年）に検討されているような、当業界に周知の放射性同位元素標識 技術を使用して、慣用の回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）パーセント及び生存（ｓｕｒ ｖｉｖａｌ）パラメータにより血小板の生体内生活力を測定した。

７日間の貯蔵完了時に、１１１インジウム−オキシンによる血小板の放射性同位 元素標識のために血小板濃縮物１０ミリリツトルを採取した。最初の提供者に注 入するために、洗浄し、標識した血小板を非放射性の自知（ａｕｔｏｌｏｇｏｕ ｓ）血漿６ミリリツトル中に再懸濁させた。注入後に１．２、及び３時間間隔で 提供者から血液試料２ミリリンドルを取り出し、次いで生体内の回復パーセント 及び生存パーセントを計算するために７日間にわたり毎日取り出した。該研究は 第１期間中において５人の提供者は本発明の血小板貯蔵用媒質中に貯蔵した血小 板を注入され、５人の提供者はＣＰｒ）−血漿中に貯蔵した血小板を注入される ように設計された。これを、２個月後の第二期間中に、貯蔵媒質を提供者に戻し つつ、くり返した。ガンマ関数マルチプルヒツト　プログラム（ｇａａｍａ　ｆ ｕｎｃｔｉｏｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｈｉｔｐｒｏｇｒａｍ）を使用して回復（ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）パーセント及び生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）パーセントを測定 した。１対のｔ−試験（ｔ−ｔｅｓｔ）を使用して有意差を検出した。低張ショ ック反応及びＡＤＰによる形状変化の程度により血小板の試験管内生活力を評価 した。生体内の回復パーセント及び生存パーセントの結果をそれぞれ表１７及び 平均上標準偏差　１１０±３２　１４４±１６生体内の回復及び生存の平均パー セントは血小板貯蔵用媒質中に貯蔵された血小板濃縮物において実質的により高 く、ＣＰＤ−血未中に貯蔵された血小板濃縮物についてそれぞれ３７±１１パー セント及び１１０±３２時間゛であるのに対し５１±８パーセント及び１４４± １６時間であることがわかった。　この差は０．００５のｔ−試験値により立証 されるように大いに、しかも十分に有意であった。血小板貯蔵用媒質中に貯蔵さ れた血小板濃縮物に対するｐ＜ｏ、ｏｔの１対のｔ−試験の値によって示１０さ れる統計的にすぐれた結果を以って表１９及び２０に示されるデータによって明 示されるように試験管内生活力の成績は生体内の成績に匹敵する。

表　１９ 低張ショック　応、回′％ 平均上標準偏差　４４±１５６５±１４議−二り更 ＡＤＰによる形状・化の程度 平均上標準偏差　９±４　１４±３ この実施例及び比較例の結果は血小板濃縮物の生体内生活力がＣＰＤ−血漿中に 貯蔵された血小板と比較した場合に、血小板貯蔵用媒体において実質的に改良さ れていることを示す。

国際調査報告 入ＮＮＺＸ　Ｔｏ　’１ｌ（Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＥ八へＣＨＲ ＩＪＯＲＴ　ＯＮ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．無菌、血漿不含有の血小板貯蔵用媒質において、電解質溶液１リットルが： 約３．０グラムと約７．５グラムとの間のデキストロース； 約３．０グラムと約６．０グラムとの間のクエン酸ナトリウム；及び 約２．０グラムと約４．２グラムとの間の重炭酸ナトリウム； を有する、生理学的に適合性の電解質水溶液を含んで成り； 前記血小板貯蔵用媒質は等張であり、かつ約６．８と約７．４との間の範囲のｐ Ｈを有し、前記血小板貯蔵用媒質は血小板を少なくとも約２２℃の温度において 少なくとも約１０日間にわたって保存することができることを特徴とする前記無 菌、血漿不含有の血小板貯蔵用媒質。
2. ２．更にクエン酸を含んで成り、前記クエン酸は、前記血小板貯蔵用媒質１リッ トル中約０．５１グラムの濃度であり、しかも前記デキストロースは約７．０３ ５グラムの濃度であり、前記クエン酸ナトリウムは約４．４７１グラムの濃度で あり、そして前記重炭酸ナトリウムは約３．０グラムの濃度である請求の範囲第 １項記載の血小板貯蔵用媒質。
3. ３．無菌、血漿不含有の血小板貯蔵用媒質において、電解質溶液１リットルが： 約３．０グラムと約７．５グラムとの間のデキストロース； 約３．０グラムと約６．０グラムとの間のクエン酸ナトリウム；及び 約０．４グラムと約０．６グラムとの間のクエン酸；約２．０グラムと約４．２ グラムとの間の重炭酸ナトリウム； を有するものである生理学的に適合性の電解質水溶液より実質的に成り； 前記血小板貯蔵用媒質は等張であり、しかも約６．８と約７．４との間の範囲の ｐＨを有し、それにより前記血小板貯蔵用媒質は血小板を少なくとも約２２℃の 温度で少なくとも約１４日間にわたり保存することを特徴とする前記無菌、血漿 不含有の血小板貯蔵用媒質。
4. ４．１リットル中において、前記デキストロースが約７．０３５グラムの濃度で あり、前記クエン酸ナトリウムが約４．４７１グラムの濃度であり、前記クエン 酸が約０．５１グラムの濃度であり、前記重炭酸ナトリウムが約３．０グラムの 濃度である請求の範囲第３項記載の血小板貯蔵用媒質。
5. ５．前記電解質溶液１リットルが： 約６．４グラムと約７．６グラムとの間の塩化ナトリウム； 約０．２グラムと約０．４グラムとの間の塩化カリウ．ム； 約０．１グラムと約０．４グラムとの間の塩化カルシウム； 約０．２グラムと約０．４グラムとの間の硫酸マグネシウム；及び 約０．１グラムと約０．６グラムとの間の第一リン酸ナトリウム； を包含する電解質を有する請求の範囲第１項又は第３項記載の血小板貯蔵用媒質 。
6. ６．前記電解質溶液１リットルが： 約６．４５グラムの塩化ナトリウム； 約０．３７５グラムの塩化カリウム； 約０．２４８グラムの塩化カルシウム；約０．２グラムの硫酸マグネシウム；及 び約０．３５５グラムの第一リン酸ナトリウムを包含する電解質を有する請求の 範囲第１項又は第３項記載の血小板貯蔵用媒質。
7. ７．更に人間血小板濃縮物を含んで成り、前記血小板貯蔵用媒質が人間血液に対 して等張である請求の範囲に第６項記載の血小板貯蔵用媒質。
8. ８．無菌、血漿不含有の血小板貯蔵用媒質中に血小板を保存する方法において： 電解質溶液１リットルが： 約３．０グラムと約７．５グラムとの間のデキストロース； 約３．０グラムと約６．０グラムとの間のクエン酸ナトリウム；及び 約２．０グラムと約４．２グラムとの間の重炭酸ナトリウム； を有する生理学的に適合性の電解質水溶液を調製し；血小板を前記血小板貯蔵用 媒質中に懸濁させ、前記血小板貯蔵用媒質は等張であり、かつ約６．８と約７． ４との間の範囲のｐＨを有し、それにより実質的濃度の前記血小板を少なくとも 約２２℃の温度において少なくとも約１４日間にわたり生活可能に維持すること を特徴とする前記血小板保存方法。
9. ９．前記調製工程においてクエン酸を有する血小板貯蔵用媒質が得られ、前記血 小板貯蔵用媒質１リットルは： 約０．５１グラムの前記クエン酸； 約７．０３５グラムの前記デキストロース；約４．４７１グラムの前記クエン酸 ナトリウム；及び約３．０グラムの前記重炭酸ナトリウムを有する請求の範囲第 ８項記載の血小板保存方法。
10. １０．前記調製工程において、 約６．４グラムと約７．６グラムとの間の塩化ナトリウム； 約０．２グラムと約０．４グラムとの間の塩化カリウム； 約０．１グラムと約０．４グラムとの間の塩化カルシウム； 約０．２グラムと約０．４グラムとの間の硫酸マグネシウム；及び 約０．１グラムと約０．６グラムとの間の第一リン酸ナトリウム； を包含する電解質を有する前記血小板貯蔵用媒質１リットルを得る請求の範囲第 ９項記載の血小板保存方法。
11. １１．前記調製工程により、 約６．４５グラムの塩化ナトリウム； 約０．３７５グラムの塩化カリウム； 約０．２４８グラムの塩化カルシウム；約０．２グラムの硫酸マグネシウム；及 び約０．３５５グラムの第一リン酸ナトリウム；を包含する電解質を有する前記 血小板貯蔵用媒質１リットルを得る請求の範囲第９項記載の血小板保存方法。