JPS63253255A - アレルゲン検査具およびアレルゲン検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アレルゲン検査具および該検査具を用いたア
レルゲン検査法に関するものである。

［発明の背景］ アレルギー起因物質（アレルゲン）の検査方法として、
従来よりアレルゲンを注射、切傷などを介して皮膚内に
接触させてアレルギー反応を観察する方法が利用されて
いる。しかしながら、この方法は被検者（患者）に苦痛
を与え、また場合によっては後遺症を残すこともあると
の問題がある。

従って、最近では、アレルギー、特にＩ型アレルギーの
診断に、抗原であるアレルゲンによって免疫系を介して
生成する血液中のイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）の存在
を確認する方法が一般的に利用されている。そして、Ｉ
ｇＥの存在の確認には、たとえば、ＩｇＥに特異的に結
合する抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、これにＩｇＥを結合
させ、この結合したＩｇＥに１．酵素標識を付した抗ヒ
トＩｇＥ抗体を酵素免疫反応により更に結合させる酵素
免疫測定法（エンザイムのイムノアッセイ：Ｅ　Ｉ　Ａ
）が利用されている。また、上記の結合したＩｇＥに、
放射性標識を付した抗ヒトＩ　ｇＥ抗体を更に結合させ
る方法（ラジオ・イムノアッセイ：ＲＩＡ）も利用され
ている。

に記の方法の実施に際しては、たとえば、アレルゲンを
セルロースシート表面にＣＮＢｒを用いた反応により固
定させたアレルゲン測定具を用意し、これにＩｇＥの存
在が予測される体液を付着させてアレルゲンとＩｇＥと
の結合反応を発生させて、アレルゲンにＩｇＥを固定さ
せ、次いで該測定具を洗浄したのち、さらに酵素標識Ｉ
ｇＥ抗体を固定させ、これに発色剤溶液を接触させて、
アレルゲンに結合したＩｇＥの有無を発色を介して検知
する操作が知られている。

しかしながら、上記の方法は、複数のアレルゲンに対す
るアレルギー反応を見るためには、そのアレルゲンの数
に応じた測定具が必要になるとの問題がある。すなわち
、被検者のアレルギー反応を見るためには多種類のアレ
ルゲンに対する反応を観察する必要があり、その場合に
その数に応じたアレルゲン検査具を準備し、それぞれに
ついて繰り返し観察を行なうことは煩雑になる。また。

その場合に必要な体液も少なからずの量となるとの問題
がある。また、アレルゲンの種類によっては、ＣＮＢｒ
を用いる固定化のための反応に利用する炭酸塩水溶液に
溶解しないものがあり、そのようなアレルゲンはこの固
定方法では担体上に固定することができないとの問題が
ある。さらに、このアレルゲン測定具の調製に際して、
上記のように毒性の高いＣＮＢｒを用いる必要があり、
多量のアレルゲン測定具を工業的に製造する場合におい
て、その生産性に問題がある。

これに対して、担体であるセルロースシートをニトロセ
ルロースシートに代え、このニトロセルロースシート表
面に複数のアレルゲンを吸着固定したアレルゲン検査具
が、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ。

６６．９９（１９８４）に提案されている。このアレル
ゲン測定具は、複数のアレルゲンを一枚の担体シート１
−に固定できるとの利点があるが、そのアレルゲン固定
のために長時間が必要であるとの製造上の欠点がある。

さらに、アレルゲンの固定が物理的な吸着を利用してい
るため、付与したアレルゲンが拡散しやすく、アレルゲ
ンを担体表面の所定の場所に高濃度で固定することが困
難であるとの問題もある。さらに、アレルゲン検知操作
におけるシートの洗浄、表面に付与する各種の液体のＰ
Ｈなどによって、吸着固定されたアレルゲンは所定の位
置から移動あるいは脱離しやすく、従って試験結果の定
量性、信頼性、再現性などにおいて充分満足できるもの
とはいえない。

また、特表昭５８−５０１６３７号公報には。

複数のアレルゲンとのアレルギー反応の検査手段として
、木綿糸などの糸のそれぞれに、互いに異なったアレル
ゲンを、ＣＮＢｒなどのハロゲン化シアンを用いて固定
させ、これらを束ねて複数のアレルゲンに対する検査を
一操作で行なう方法が開示されている。しかし、この方
法でも、前述のＣＮＢｒを用いるアレルゲン固定操作に
関する問題点、およびアレルゲンとＩｇＥとの間の発色
の検知、特に早足量的な検査が困難であるとの聞届があ
る。

［発明の構成］ 本発明の主な目的は、ｔＪ造が容易でかつ、複数のアレ
ルゲンに対する高い精度のアレルゲン検査を一回の被検
液付与操作にて行なうことを可能にするアレルゲン検査
具を提供することにある。

本発明は、互いに異った二種類以上のアレルゲンが、水
不溶性のフィルムの表面の区画された二以上の領域のそ
れぞれに、共有結合を介して固定されていることを特徴
とするアレルゲン検査具にある。

本発明のアレルゲン検査具は、そのアレルゲンが固定さ
れている表面に、ＩｇＥの存在が予測される９体液を付
着させたのち、該表面に酵素標識抗ＩｇＥ抗体溶液を接
触させ、次いで該表面を洗炸したのち、これに発色剤溶
液を接触させてアレルゲンに結合したＩｇＥの有無を検
知する方法により、高い精度のアレルゲン検査に利用す
ることができる。

未発１３のアレルゲン検査具の製造において使用するア
レルゲン固定用の担体は、水に実質的に溶解されないフ
ィルムで、かつアレルゲンの基本成分である蛋白質と共
有結合することのできる官能基（例えば、カルボキシル
基）を表面に有するフィルムである。そのようなフィル
ムとして、酵素反応に供する酵素を固定するための担体
として知られ（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　４４゜１１４（１９７６）に記
載されている）、かつ市販されている酵素固定用ポリア
ミドフィルム、酵素固定用ポリフルオロカーボンフィル
ムなどの公知の相体用フィルムを用いることができる。

これらは、たとえば、ポリアミドフィルムの表面にカル
ボキシル基、ｔｉなどの官能基を有していて、そのカル
ボキシル基にジシクロへキシルカルボジイミド、トリク
ロル−３−）リアジンなどの活性化合物を結合して活性
基を形成させることにより蛋白質と容易に結合するよう
になる。このように表面が活性化されたフィルムは、そ
の裏面にアレルゲン（大部分のアレルゲンは蛋白質をそ
の主成分としている）の水溶液あるいは水分散液を付着
させることにより、容易にアレルゲンを共有結合により
固定する。

本発明のアレルゲン検査具において、アレルゲンはフィ
ルム担体の表面上の、区画された二以上の領域のそれぞ
れに、固定される。すなわち、複数のアレルゲンの検査
を行なう場合、それぞれのアレルゲンは予め指定された
領域に固定される必要があり、かつ各アレルゲンは互い
に分離された領域に固定される必要がある。このために
、たとえば、円盤状の担体フィルムを円周方向に複数区
画（例、四区画、五区画、六区画、へ区画、十二区画）
に分割して、それぞれの区画にアレルゲンを固定する方
法などが利用される。アレルゲンは通常各区画の中央部
に直径１〜５ｍｍの円の形状で、あまり拡散することな
く高濃度にて固定されるが、その位置、形状、寸法など
には特に限定はない、各区画と、そこに固定したアレル
ゲンとの関係は、フィルム担体自体に文字、記号などを
印刷などによって標記してもよく、あるいはフィルム４
１体を、担体の各区画と、そこに固定したアレルゲンと
の関係を表示したマウントに一定の位置関係のもとに収
容してもよい。

なお、フィルム担体としては１通常は円盤状、あるいは
長方形（正方形を含む）のものが用いられるが、その形
状には特に限定はなく、また、アレルゲンを固定するた
めの領域の決定は任意の方法によることができる。

本発明のアレルゲン検査具には、これまでに知られてい
る蛋白質を主成分とするアレルゲンの大部分を固定する
ことができる。そのようなアレルゲンの例としては、草
木の花粉、菌類、動物の垢、ミルク、排漬物、あるいは
毛、昆虫毒、粉塵、植物成分、ある種の薬物などを挙げ
ることができる。

なお、本発明のアレルゲン検査具では、フィルム表面の
アレルゲンが固定されている領域と別の領域に抗ＩｇＥ
抗体および／または標識ＩｇＥ抗体が共有結合を介して
固定されていてもよい、このように、検査具の表面に、
抗ＩｇＥ抗体が共有結合を介して固定されている場合に
は、被検液中のＩｇＥの存在を確認することができ、ア
レルギー羅患の有無を調べることができつ、また、標識
ＩｇＥ抗体が共有結合を介して固定されている場合には
、これらの抗体をフィルム上の各アレルゲン（通常は無
色であり、その位置は目視では検知できない）の位置を
確認するためのマーカーとして、あるいは発色のポジテ
ィブコントロールとして、利用することができる。

本発明のアレルゲン検査具は、そのまま使用してもよく
、あるいはプラスチック材料などからなるマウントに収
容して用いてもよい。

本発明のアレルゲン検査具は、たとえば、下記の操作に
基づいてアレルゲンの検査に利用することができる。

まず、フィルムのアレルゲンが固定されている表面に、
ＩｇＥの存在が予測される体液を付着させる。用いられ
る体液としては、たとえば血液、血清、血漿、鼻粘液、
骨髄液、だ液などが利用される０体液は、通常マイクロ
ピペットなどを利用してｌＯ〜５００７ｔｉの量にて、
フィルム表面に滴ド、あるいは点着される６体液は、各
アレルゲン固定位置毎に付着させてもよく、あるいはフ
ィルムの中央付近に付着させて、その周囲に拡散させる
ことにより、固定させたアレルゲンの全てに接触させる
方法、またはフィルムの表面の全面に体液を塗布する方
法などを利用してもよい。

Ｌ記の操作により、固定されたアレルゲンに反応する体
液中のＩｇＥは、そのアレルゲンに結合し、その位置に
固定される。

次に、所望により、フィルム表面をリン酸緩衝液などの
緩衝液を用いて洗浄する。この洗浄操作によって、体液
は除去される。この操作において対応するＩｇＥが付与
されなかったアレルゲンには特に変化は発生しない、一
方、アレルゲン自体は、フィルム表面に共有結合により
固定されているので、そのアレルゲンに結合したＩｇＥ
はフィルム表面に固定され、洗浄によっても移動するこ
となく、フィルム上から除去されることはない。

次に、フィルムの表面（体液を付与した表面）に酵素標
識抗ＩｇＥ抗体溶液を接触させる。この操作によってフ
ィルム表面に供与された抗ＩｇＥ抗体は、体液中のＩｇ
Ｅと結合する。

次いで、フィルム表面をリン酸緩衝液などの緩衝液を用
いて洗浄する。この洗浄操作によって。

体液（前記の酵素標識抗ＩｇＥ抗体溶液の接触操作の前
に洗浄操作を行なわなかった場合）、およびは酵素標識
抗ＩｇＥ抗体溶液は除去される。ここで対応するＩｇＥ
が付与されなかったアレルゲンには特に変化は発生しな
い、一方、アレルゲン自体は、フィルム表面に共有結合
により固定されているので、そのアレルゲンに結合した
ＩｇＥ、およびそのＩｇＥに結合したは酵素標識抗Ｉｇ
Ｅ抗体もまたフィルム表面に固定され、洗浄によっても
移動することなく、フィルム上から除去されることはな
い、すなわち、ＩｇＥが結合したアレルゲンの位置にの
み、酵素標識抗ＩｇＥ抗体が固定されて、残留すること
になる。

１；記の酵素標識抗ＩｇＥ抗体に用いられる酵素の例と
しては、ペルオキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼな
どを挙げることができる。ただし、他にも、公知の酵素
標識抗ＩｇＥ抗体に用いられるｓ素を利用することがで
きる。

Ｌ記のように処理したフィルムの表面に、酵素との反応
により発色を示す発色剤を含む溶液を接触させることに
より、酵素標識抗ＩｇＥ抗体の位置を検知し、同時に、
ＩｇＥが結合しているアレルゲンを検知することができ
る。

酵素との接触により発色する発色剤は各種知られており
、そのような発色剤のいずれをも利用することができる
。そのような発色剤の例を下記に記す。

ペルオキシダーゼと接触して発色を示す発色剤の例とし
ては、２．２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）、テトラメチルベンチジン、ジアミノ
ベンチジン、４−クロロ−１−ナフトール、２．７−ジ
アミツフルオレン、Ｏ−フェニレンジアミン、アミノア
ンチピリン、ルミノールを挙げることができる。

ラクテートデヒドロゲナーゼと接触して発色を示す発色
剤の例としては、３−（４°、５°−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−２，４−ジフェニルテトラゾリウム・
プロミド［ＭＴＴ］　、２−（ｐ−ヨードフェニル）−
３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリ
ウム・クロリド［ＩＮＴ］、そして２．２°−ジ（ｐ−
ニトロフェニル）−５，５’−ジフェニル−３，３’−
（３、３’−ジメトキシー４，４゛−ジフェニレン）ジ
テトラゾリウム・クロリド［ＮＥＴ］を挙げることがで
きる。

アルカリホスホターゼと接触して発色を示す発色剤の例
としては、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを挙げるこ
とができる。

ガラクトシダーゼと接触して発色を示す発色剤の例とし
ては、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシトを挙げることができる。

以上のような一連の簡単な操作により１本発明のアレル
ゲン検査具のフィルム上に固定された複数のアレルゲン
によって感作する体液中のＩｇＥの存在の有無を容易に
、かつ半定量的に判別することができる。また、比色測
定を行なうことにより、さらに定量性の高い検査も回部
となる。

次に本発明の実施例を挙げる。

［実施例１］ アレルゲン固定フ　ルムの調製 表面にカルボキシル基を有するナイロン膜（商品名二カ
ルボキシダイン、米国ボール社製）をトリクロロ−３−
トリアジンで活性化した膜を直径３ｃｍの円盤状に切り
抜き、その円盤を円周方向に均等に六分割（角度６０度
）した区画を想定し、各区画の略中央部に１：ダニ抽出
物、２：家庭塵抽出物、３：ネコのフケの抽出物、４：
スギ花粉の抽出物、および５：抗ＩｇＥヒト抗体を含む
溶液（１０重量％溶液）をマイクロシリンジを用いて２
１ＬＪ１塗着し、室温で乾燥させた。第６の区画には、
対照（ポジティブコントロール）としてベルオキシター
ゼ標識抗ヒトＩ　ｇＥ抗体を塗着した０次いで、この膜
を２％ヤギミルクカゼイン水溶液に浸漬し、膜表面のブ
ロッキングを行なった。

上記のようにして調製したアレルゲン固定フィルムはヘ
パリン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７，２，５０牌Ｍ）中に
保存した。

アレルゲン検　操作 上記のアレルゲン固定フィルムを緩衝液より採り出し、
フィルム表面を乾燥させることなく、その表面に均一に
、患者から採血した血液（抗凝固剤添加）１００ｐ文を
塗布し、次いで室温で３時間放置した。

次に、フィルムをリン酸緩衝液（ｐＨ７，２，５０ｍＭ
、非イオン系界面活性剤０．０５％含有）で三回洗炸し
たのち、フィルム表面にペルオキシダーゼ標識抗ヒ）Ｉ
ｇＥ抗体溶液（ｐＨ７，２，１０ｍＭのリン酸緩衝液に
、ヒトＩｇＥにヤギに感作して得られた抗血清から調製
した抗ヒトＩｇをヤギ抗体に公知の方法によりペルオキ
シダーゼを結合させて標識したもの、蛋白質量として１
０ｐｇ／ｍＪ１含有）１００ｐｌをその全面に均一に塗
布し、１０分間室温に放置した。

ｌ−記のフィルムを、前記と同様にリン酸緩衝液で一三
回洗浄したのち、フィルム表面に発色液（テトラメチル
ベンチジン０．０２％溶液、１ｍＭの過酸化水素を含む
酢酸緩衝液ｐＨ４，４）を塗布し、２分間放置した後、
水で洗詐したところ、アレルゲン位置に明確な発色が見
られた。これを比色用標準色と対照させて、ＩｇＥの存
在を半定量的に判定することができた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、互いに異った二種類以上のアレルゲンが、水不溶性
   のフィルムの表面の区画された二以上の領域のそれぞれ
   に、共有結合を介して固定されていることを特徴とする
   アレルゲン検査具。 ２、フィルム表面とアレルゲンとの共有結合が、フィル
   ム表面に露出している官能基に結合した活性基とアレル
   ゲンとの反応により形成されたものであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載のアレルゲン検査具。 ３、フィルム表面とアレルゲンとの共有結合が、フィル
   ム表面に露出しているカルボキシル基に結合した活性基
   とアレルゲンとの反応により形成されたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のアレルゲン検
   査具。 ４、フィルムがポリアミドを主形成成分とするフィルム
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のア
   レルゲン検査具。 ５、フィルムがポリフルオロカーボンを主形成成分とす
   るフィルムであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載のアレルゲン検査具。 ６、フィルム表面のアレルゲンが固定されている領域と
   別の領域に抗ＩｇＥ抗体および／または標識ＩｇＥ抗体
   が共有結合を介して固定されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載のアレルゲン検査具。 ７、水不溶性のフィルムの表面上の区画された領域に、
   互いに異った二以上のアレルゲンがそれぞれ共有結合を
   介して固定されているアレルゲン検査具の該表面にＩｇ
   Ｅの存在が予測される体液を付着させたのち、該表面に
   酵素標識抗ＩｇＥ抗体溶液を接触させ、次いで該表面を
   洗浄した後、これに発色剤溶液を接触させてアレルゲン
   に結合したＩｇＥの有無を検知することからなるアレル
   ゲン検査法。 ８、酵素標識抗ＩｇＥ抗体の酵素が、ペルオキシダーゼ
   、ラクテートデヒドロゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ
   、またはアルカリホスファターゼであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第７項記載のアレルゲン検査法。