JPH02298866A - 酵素検定キット及び完全細胞に適用可能な方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞集団（ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）
または細胞亜集団（ｃｅｌｌ　５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉ
ｏｎ）に特徴的な内因性酵素を検定するためのキットと
、このキットを用いて前記内因性酵素を検定するための
方法に関する。また、本発明はこれら内因性酵素を検定
することによって、前記細胞自体を検定することをも意
図している。これらの検定１よ診断に適用することがで
きる。

本発明による方法の特徴は、免疫捕獲によって細胞集団
を固相指示体上に選択的に固定化し、次いで、この細胞
集団または細胞亜集団に特徴的な内因性酵素を、この酵
素に適した基質および適切ならば必要な共働因子または
補助物質を用いることによって検定することにある。

本発明に従えば、明細書中の「内因性酵素」の語は、細
胞質内に含有され且つ次のような特徴を有する酵素を意
味する。即ち、該酵素の基質は細胞内に透過できる低分
子で、細胞内へ透過した基質はそこで該酵素により転換
され、これによって発色反応生成物または蛍光反応生成
物を媒質中に放出する。この反応生成物は、酵素活性に
比例した信号の最終的な測定を可能とする。

細胞の免疫捕獲は、一以上の細胞表面抗原類と、これら
抗原または抗原類に特異的な一以上のモノクローナル抗
体との間の結合により、前記細胞を固相指示体に保持す
るプロセスである。

細胞の表面抗原類またはマーカー類の知識は、リンパ球
交雑の発展およびに０ＥＨＬＥＲと旧ＬＳＴＥ　Ｉ　Ｎ
によるモノクローナル抗体の発見（Ｎａｔｕｒｅ、１９
７５，２５６．４９５−４９７）に伴って大きく進歩し
た。特に、モノクローナル抗体によって、極めて広範な
起源を有する細胞の表面マーカーまたは膜抗原の解明ま
たは分析が可°能になってきている。これらのマーカー
（または抗原）は、蛋白類、グリコプロティン類または
グリコリピド類のように異なった種類のものであり得る
−従って、この探索された特徴は、主に組織マーカーま
たは器官マーカーに、正常細胞の分化状態または活性化
状態のマーカーに、および正常細胞または癌細胞の同定
またはタイピングに適用される。特に重要な適用分野は
、造血細胞系（赤血球、骨髄巨核球、顆粒球、単球、リ
ンパ球）の研究である。

こうして、モノクローナル抗体によって、例えばＴリン
パ球および８９２６球の夫々の表面特性を検出すること
がＥｊＩ能となった。対応するマーカー類は、それ自体
またはその組み合わせによって、リンパ球の分化段階お
よび機能専門化の段階を同定することができる。国際条
約によって、ヒト白血球の表面マーカーは１９８４年に
　Ｉυｌ５−ＷＨＯ小委員会によって定義され、世界保
健機構の会報（１９８４，６２（５）、８１３−８１５
）に記載された分化群または分化クラス（ＣＤ）に分類
されている。

モノクローナル抗体は、現在では細胞分析に適用される
臨床生物学において不可欠の手段になっている。

細胞の表面抗原のラベリングを用いて細胞を計数する方
法が存在するが、この方法は長時間およびかなりの労力
を要し、実施が困難である。加えて、しばしばランダム
な結果を生じる。

一群の抗原４−１定方法は、全細胞集団の表面マーカー
の定量的評価に基づいている。これらの方法は、直接的
なラベリングまたは間接的なラベリングの何れかによっ
て抗原のＤ１定を可能とする。多（の場合、後者の方法
は２ステツプ、３ステツプまたは４ステツプで行われる
。全ての場合において、最終ラベリングステップで用い
られる試薬は次の何れかのプローブを有している。第一
のプローブは、例えばヨウ素１２５のような、放射免疫
検定のためのアイソトープ特性を有するものである（Ｂ
ＲＯＷ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｌ５ｓｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、１９７９．３１．２０１：５ＴＯＣＫＥＲａｎ
ｄ　ＨＥＵＳＳＥＲ，Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏ
ｄ、１９７９゜２８．１１７−９５）。第二のプローブ
は酵素免疫検定のための酵素、多くはパーオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼで
ある（ＶＡＮ　ＬＥＵＶＥＮ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｓ
ｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９７８゜２３　、１０
９−１１８　：　ＭＯＲＲＩＳ、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎ
Ｌａｔ　Ｉｏｎ　、　１９８３　、３６　（６）、７１
９；　　Ｂ＾υＭＣＡＲＴＥＮ、Ｊ、ｌ５ｓｕｎｏ１．
Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８Ｂ、９４゜９１−９３　　）　
　。

このような方法に用いられる酵素は、細胞膜の外側に露
出した抗原を認識する抗体との複合体の形態で、検定の
最中に導入される分析試薬であることに留意すべきであ
る。従って、これら酵素を、細胞の本来的な酵素系であ
る内因性酵素と混同しすることはできない。

これらの方法は、細胞物質を何回も洗浄および遠心する
必要があるため、適用に際して不便で且つ労力を要し、
また危険を伴うものである。ときには、最終的な分光学
的測定を行うために、酵素反応で得られた着色媒質のサ
ンプルを採取する必要がある。最後に、殆どの場合に用
いられる細胞の化学的固定によって、グルタルアルデヒ
ド及びメタノールのような通常用いられる化学固定剤に
特に敏感な成る種の抗原の不可逆的な破壊を生じる（Ｄ
ＲＯＶＥＲｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、１９８ｆ３．９０゜２７５−２８１　）。

固相指示体上への細胞の免疫捕獲は、特許出願１１０８
６１０２０９１に記載されている。なお、この出願の目
的は、移植を目的とした骨髄から望ましくない細胞を除
去することである。上記特許出願においては、浮遊微小
ビーズ上に細胞捕獲が行われる。

また、使用される抗体は、ネットワークリレーと称され
る複雑な巨大分子構造によって固相指示体に固定される
必要がある。このネットワークリレーは、対応する細胞
抗原の向きとの関係で、抗体の好ましい配向を確実にす
ることができる。前記特許出願は、その技術を細胞酵素
の定量的検定に適用することについて同等示唆していな
い。

細胞の免疫捕獲の分析への適用については、特許出願Ｗ
０８４１０３１５１にも記載されている。この特許出願
における目的は、被検定細胞が属する組織群を同定する
ことである（この操作は、一般的にＨＬ＾タイピングと
称される）。細胞捕獲は、特別の指示体（顕微鏡カバー
ガラス）上に特定の幾何学的形状で配列された抗体によ
って行われる。その結果は、該指示体を単純に目視観察
することにより、「０または１　（ａｌｌ　ｏｒ　ｎｏ
ｔｈｉｎｇ）Ｊの応答形式で得られる。

このように、これまでに記述された細胞の免疫捕獲シス
テムは、細胞に特徴的なマーカー、特に細胞を構成する
酵素の定量的７１−１定を可能とするものではない。

本発明の課題である検定方法は、細胞集団の如何なる内
因性酵素をも定量的に測定できるから、従来技術で用い
られている公知の技術に比較して遥かに有利である。こ
の検定は、その特異的捕獲の際に如何なる化学的または
物理的干渉を受けておらず、従って生理学的に完全な状
態にある細胞に対して行われる。更に、本発明による検
定方法は、同じ細胞に担持される異なった二つの特異的
マーカーを含む二重認識系に固有の特徴、即ち、特異性
が極めて高いという特徴を有する。これら特異的マーカ
ーのうち、一つは分析すべき細胞の免疫捕獲のために選
択された抗原であり、他の一つは捕獲された細胞中に存
在する内因性酵素である。この方法は単純かつ迅速であ
り、しかも再現性を有している。この方法は全体として
大量のサンプルの分析に適しており、これによって、大
量のサンプルを扱う臨床生物学実験室での診断目的での
使用が可能となる。

従って、本発明は細胞集団または細胞亜集団に特徴的な
少なくとも一つの内因性酵素を検定するためのキットに
関する。このキットは、下記ａ）〜Ｃ）の要素を具備し
ている。

ａ）一以上のモノクローナル抗体が、共有結合または物
理吸着によって固定された固相支持体。

但し、前記モノクローナル抗体は検定されるべき細胞集
団の表面抗原に対するものであり、かつ検定されるべき
酵素を有する亜集団の細胞を含む細胞を前記指示体に固
定化することを目的としたものである ｂ）内因性酵素の発現剤、即ち、前記酵素の活性を発現
するために必要な試薬（基質および適切なときには色原
体）を提供する一以上の溶液。この溶液には、適切なと
きには細胞膜の透過性を改善する試薬をも含有させる。

Ｃ）前記固相支持体の洗浄を目的とした緩衝溶液。

本明細書中の記述に用いる「細胞」の語には、ヒト細胞
または動物細胞、特に血小板を含む血液細胞が包含され
る。

本発明の検定方法は完全細胞、即ち非崩壊細胞に適用さ
れる。

これら細胞は、その特異的捕獲の際には如何なる化学的
または物理的干渉を受けておらず、生理学的に完全な状
壱で用いられる。この状況によって、捕獲に用いられる
抗原および検定標的として選択された内因性酵素の完全
性が最も良く保証される。

固相支持体としては、細胞懸濁液の取り扱いに適した如
何なる装置を用いることも可能である。

好ましくは、管、粒子状の磁性支持体、またはポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルもしくはニトロセ
ルロース製で且つマイクロウェルを有する剛性もしくは
可撓性のマイクロタイタープレートを用いる。細胞の固
定化のためのモノクローナル抗体は、当業者によく知ら
れた古典的な技術に従い、共有化学結合または物理的吸
着の何れかによって固相支持体に固着される。このよう
な技術は、５ＴＯＣＫＥＲおよびＩＩ　Ｅ　Ｕ　Ｓ　Ｓ
　Ｅ　Ｒによって、」。

Ｊｍｓｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９７９．ｖｏｌ、
２Ｂ、ｐ、８７−９５に記載されている。支持体は蛋白
で予め飽和しておくのが有利である。

本発明に従えば、固相支持体に固着されたモノクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体類は、検定すべき酵素
を含有する細胞集団を含む細胞集団の免疫捕獲を行うも
のでなければならない。この細胞集団がヒト細胞である
とき、免疫捕獲のための好ましいモノクローナル抗体は
、白血球及び他の多くの器官細胞系に存在するＩＩＬＡ
−＾抗原、ＩＩＬＡ−８抗原およびＨＬ　Ａ　−Ｃ抗原
の共通部分に対して特異的な抗クラスＩ　　ＩＩＬＡ抗
体類である。同様に、白血球に認められる分化段階の抗
原に対して特異的なモノクローナル抗体もまた好ましい
ものである。

これら抗体類のうちで、Ｂ　！　０８ＹＳによって販売
されているＳ−クラスＩと称されるものが特に好ましい
。

試験される細胞がヒト細胞であるような他の場合、およ
びこれら細胞がヒト細胞でない全ての場合において、試
験すべき細胞のタイピングに適切なモノクローナル抗体
もまた、本発明に従う免疫捕獲に用いることができる。

検定すべき内因性酵素のための基質および試薬は、該酵
素によって惹き起こされる反応または反応シーケンスの
最終生成物が、下記の物質を含むように選択される。

・細胞を取り囲む液体媒質中に拡散し、最終的な分光分
析測定または蛍光分析測定の対象となる着色物質または
経口物質の何れか、或いは・細胞および該細胞が固定化
される壁に付着し、反射または目視評価による光学的測
定（適切なときには標準形スケールに対して）の対象と
なり得る不溶性着色物質。

こうして基質が単独で発色物質または蛍光物質を生じる
ときは、色原体の使用は不要である。

本発明の検定キットは、追加成分として、細胞を固定化
した後に固相支持体を洗浄するための緩衝溶液を含む。

本発明は更に、細胞集団または細胞亜集団の内因性酵素
を検定する方法に関する。この方法は、下記ａ）〜ｅ）
のステップを具備している。

ａ）ｂｔ定すべき内因性酵素を含有する亜集団を含んだ
細胞集団を、該細胞表面に存在する抗原を認識でき、且
つ共有結合または物理吸着により予め固相支持体に固着
された一以上のモノクローナル抗体を用いることによっ
て、前記固相支持体に固定化する：と。

ｂ）所定時間のインキュベーションを行うことと。

Ｃ）前記指示体を洗浄し、固定化されなかった細胞を除
去すること。

ｄ）前記内因性酵素の活性発現のために必要な試薬また
は試薬類（基質および適切ならば色原体）を添加するこ
と。

ｅ）光信号（発色または蛍光）を、適切なときには標準
スケールのレファレンスと比較して測定することにより
、結果を読み取ること。

こうして、固定化された細胞集団またはその一つの亜集
団に属する検定すべき内因性酵素の発現は、この内因性
酵素に特異的な基質によって直接に行われ、その後、光
の透過もしくは反射または蛍光発行の測定光学的測定に
よって、内因性酵素の実際の検定が行われる。

本発明の検定キットおよび方法は特に簡単である。何故
なら、予め準備した免疫捕獲支持体が人手できる場合に
は、溶液または酵素活性を測定するために必要な特別な
試薬（基質および、適当な場合には色原体）を含有する
溶液のみが必要とされるだけだからである。

本発明の検定キットおよび酵素的方法は、好ましくはヒ
トの血液の構成成分（特に白血球および好ましくは顆粒
球）における内因性酵素の検定に適用される。

本発明の検定キットおよび酵素的方法は、検査される細
胞集団内に存在する細胞数およびこれら細胞内の測定す
べき内因性酵素濃度の両方に依存する信号（吸光または
発光）の測定を可能にする。

これら信号の測定は、検査される細胞集団および亜集団
の細胞内に含有される酵素分子活性の定量的評価を可能
にする。

本発明の一つの応用は、固相支持体としてマイクロタイ
タープレートを選択する場合に明らかになる。本発明の
検定キットおよび酵素的方法は−枚のプレート上で行わ
れ、検査すべき細胞集団を構成する様々な亜集団に特有
の内因性酵素系の検定に有利に使用できる。この応用の
ために、一方にでは、すぐ使用できるマイクロタイター
プレートを使用できる。このマイクロタイタープレート
には、検査すべき細胞集団の全ての細胞を保持する１つ
以上のモノクローナル抗体が予め固定されている。他方
では、評価される亜集団の一つに特有の内因性酵素に対
して夫々特異的な基質系を用いることができる。従って
、一つの同じ支持体上において、選択された亜集団を特
徴付けるために必要な全ての内因性酵素の定量的検定を
行うことが可能である。

本発明の適用として述べ得る一つの事例は、ヒト白血球
の場合である。ヒト白血球には、特に多核白血球または
顆粒球と呼ばれる細胞の亜集団がある。

ヒトの顆粒球の存在は、血中または尿中で評価され得る
。すなわち、膀胱炎や腎孟腎炎のような泌尿器感染症（
ｕｒｌｎａｒｙ　１ｎｒｅｅｉｔｏｎ）において、尿中
の顆粒球の検定を行う単純な方法は特に価値がある。

本発明の検定キットおよび酵素的方法は、顆粒球の検定
に用いることができる。この場合に、検査試料中の顆粒
球の選択的な固定化は、固相支持体の上で実行され、顆
粒球に特徴的な内因性酵素の検定は適当な基質を用いて
行われる。ミエロペルオキシダーゼは顆粒球の内因性酵
素である。その検定は、ベルオキシターゼのための基質
として過酸化水素を用いて行われる。

顆粒°球の選択的固定化は、例えば、マイクロタイター
プレートのマイクロウェルの壁のような固相支持体に固
定された抗ＣＤ１５モノクローナル抗体を用いて行われ
る。

この方法で調製されたプレートは凍結乾燥でき、好まし
くは４℃において貯蔵できる。この工程は、工業的規模
において実施可能である。従って、検査すべき血液また
は尿の試料中の顆粒球に適用し得る検定キットのための
すぐに使用可能なプレートを得ることが可能である。

正常もしくは病的な適当な体液、特に尿を起源とする検
定すべき細胞を含をした試料は、そのまま或いは調整し
た後（特に濃縮９後）に使用され得る。

適当な細胞懸濁液の一定量を固相支持体、例えば、微粒
子状の免疫捕獲支持体を有する試験管または予め準備さ
れたマイクロタイタープレートのマイクロウェルに接触
させる。洗浄した後、標的とする細胞集団に特有の内因
性酵素に対して特異的な基質を含有する溶液（外温液は
、検定キットの一部分を構成する）を加える。

細胞の固定化に必要な時間は、好ましくは１５分以下で
ある。細胞の固定化を改善するために、この間中、固相
支持体は遠心され得る。次に、未固定の細胞を除去する
ために、固相支持体（例えば、試験管またはマイクロタ
イタープレート）を洗浄する。

検定すべき内因性酵素をもった細胞集団が固定されてい
る固相支持体に、酵素のための基質を含有する溶液、お
よび必要な場合には一以上の助剤を添加することによっ
て、着色生成物もしくは蛍光生成物の出現がもたらされ
る。この溶液および助剤は、最終的に得られる反応生成
物が、先に説明したような培養液に溶解する着色物、若
しくは不溶性の着色物、或いは溶解性の蛍光物の何れか
になるようなものである。次いで、この方法で処理され
た試料からの光信号は、夫々に適した装置（例えば、透
過光度計または反射光度計或いは蛍光計）により測定さ
れる。固相支持体がマイクロタイタープレートである場
合に、光信号は、生物学研究室で通常用られる自動読取
装置により、同一のプレートの全てのウェルで連続的に
読み取ることができる。この自動読取装置は、例えば、
分光光度的読取り用のタイターチックプレート読取装置
（Ｔｌｔｅｒｔｅｋ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）若し
くは蛍光光度プレート読取装置（Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｎ
　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ　）または、それぞれの蛍
光光度的な読取り用装置である。

内因性ベルオキシターゼまたは内因性ミエロペルオキシ
ダーゼを発現さ°せるさせるために使用する試薬は、該
酵素の基質である過酸化水素および適切な色原体を含有
する。この色原体は、例えば芒色され且つ培養液に溶解
する最終反応生成物を与えるオルトフェニレンジアミン
、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン）酸またはへＢＴＳ、或いは不溶性最
終反応生成物を与える３、３゛−ジアミノベンジジン、
３−アミノ−９−エチルカルバゾール若しくは４−クロ
ロ−α−ナフトール、或いは培養液に溶解する蛍光性の
反応生成物を与えるバラヒドロキシフェニルプロピオン
酸である。

好ましい形では、顆粒球に特徴的なミエロペルオキシダ
ーゼの検定を行う本発明のキットは、ａ）一以上の抗顆
粒球モノクローナル抗体が固定されているウェルを有す
るマイクロタイタープレートと、 ｂｌ）過酸化水素（酵素のための基質）を適当な緩衝液
に溶解した溶液と、 ｂ２）酵素の活性の発現を増加させる色原体、および適
当な場合には、細胞膜の透過性を改善する試薬を含有す
る溶液と、 を具備している。

その他の好ましい形では、顆粒球特有のミエロペルオキ
シダーゼの検定を行う本発明のキットは、固相支持体と
して、１以上の抗顆粒球モノクローナル抗体が固定され
た試験管或いは微細粒状の磁性支持体を具備する。

本発明に従う内因性酵素検定の結果は、実施される試験
に適したどのような手順によっても表すことができる。

特に、これらの結果は、検査された試料の所定容量（例
えば血液１ｍり中に存在する特定の内因性酵素の総活性
量として表すことができる。

検査された試料の中に存在する特定の内因性酵素の活性
は、好ましくは検定すべき内因性酵素を含有する適当な
細胞または細胞調製品からなる標準スケール（公知の対
照方法により検量線として予め作成されたもの）を使用
して決定される。これらの標準は、好ましくは検定の対
象である細胞と起源を同じくする細胞、必要な内因性酵
素を含有する株化細胞系の細胞、または選択された酵素
を含有する無細胞調製品の何れかからなる。

次いで、これらの標準は、検査すべき試料と同様の方法
で正確に処理される。得られた信号を使用して標準スケ
ールを作る。検査すべき試料を用いて測定された信号は
、この標準スケールと比較される。その後の計算は通常
通りである。

本発明の酵素検定の方法は、単純、迅速、Ｒつ再現可能
である。この方法は、全体として多数の試料の分析に適
している。既述の他の方法と比較した本発明の利点を理
解するため、種々の工程を分析しなけらばならない。

細胞を固相支持体の上に固定化することは、通常は最も
難しく、検定を実施する上で最も重要な工程である。頻
繁に使用される手段は、グルグルアルデヒドまたはメタ
ノールを用い、ポリーＬ−リジンで処理されたカップま
たは処理されていないカップ内に細胞を化学的に固定化
する方法である（ＶＡＮ　　ＬＥＵＶＥＮ　　Ｆ、ｅｔ
　　ａｌ、、Ｊ、１ｍ５ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１
９７ｇ、２３．１０９）。しかし、この方法で化学的固
定化を行なうと、望ましい特異的検出が減少若しくは抑
制されることがある。逆に、この化学的固定化は、細胞
の偽陽性標識（１’ａｆｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ　ｏｒｃｅｌｌｓ）を誘起し得る。これら
は、極めて重大な欠点である（ＤＲＯＶＥＲａｎｄ　Ｍ
＾ＲＡＨＡＩ、Ｌ、Ｊ、Ｊ、Ｉｍ−ｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９Ｂ６．９０．２７５−２８１）
。

更に、化学的固定方法は幾つかの工程で行われなければ
ならない。即ち、細胞の遠心分離、固定化混合液の調製
、細胞の固定化、および固定化された細胞を数回洗浄す
ることである。

細胞を任意的に３７℃で乾燥し、続いてマイクロウェル
にメタノールで固定化することも提案されている（　Ｂ
ＡｌｌＭＧＡＲＴＥＮ、Ｊ、ｌ５ｇ１ｕｎｏ１．１９８
Ｂ、９４．９ｌ−９８）。

実際には、３７℃での細胞の乾燥は検定すべき内因性酵
素と同様に、細胞の免疫捕獲に利用する幾つかの虚弱な
抗体の品質を低下させる。

さらに、この方法の再現性は疑問である。事実、検定マ
イクロウェルへの細胞の定着および細胞の乾燥は、一つ
の実験と次の実験とで変化し得る。

最後に、細胞乾燥工程だけでも２時間以上かかるため、
この検定には長時間を要する。

リンパ球集団の固定化は、マイクロウェルに吸着された
ポリクローナル抗体を使用して行うこともできる（ＳＴ
ＯＣＸＥＲａｎｄ　ＨＥＵＳＳＥＲ，Ｊ、１ｓｓｕｎｏ
ｊ、ｔｏｌ。

ＭｅＬｈｏｄｓ、１９７９．２８．８７−９５）ｏこの
方法は、検定すべき単一の細胞集団と異なる細胞をも固
定化する可能性がある。このことは、幾つかの不利益を
意味する。

固相支持体、特に検定ウェル、試験管または微粒子状支
持体に吸着または固定された、特異性の高い関連モノク
ローナル抗体を使用することにより、必要な細胞の排他
的な捕獲が可能である。他の保持されなかった細胞集団
は、洗浄するうちに除去される。さらに、化学的または
非物理学的試薬は、この工程における抗体の特徴を修正
しない。

なぜなら、細胞を化学的または物理的に支持体に固定化
するための様々な操作が省略されるからである。

こうして、本発明に従い、モノクローナル抗体を用いて
細胞を固定化する方法は、検定すべき酵素をもった細胞
の固定化工程を簡略化すると同時に、より信頼性のある
結果を得ることを可能とする方法であることが明らかに
なった。

本発明の方法は、細胞自体の選択された内因性酵素の定
量的検定を可能にする初めての方法である。この方法は
、細胞に対する物理的または化学的な干渉なしに全細胞
を免疫的に捕獲する手段を使用することと、捕獲された
全ての細胞もしくは幾つかの細胞の内因性酵素の活性を
、該酵素に特異的な基質を使用してΔＰｈ定することと
を具備している。

本発明によれば、免疫学的に固定化された細胞を直接ラ
ベリングすることにより、以下のことが可能になる。

・試薬の節約。

・工程数および操作数の減少による信頼性の改善。

・時間の節約。

・もっばら従来の器具および装置を使用して、多数の試
料を同時に処理すること。

検定すべき細胞集団および細胞亜集団を固定化するため
に必要な時間は短い。この時間は、血液中または尿中の
顆粒球を測定する場合には、１５分以下である。同様に
、内因性酵素活性の検定を行う時間は、１５分間以下で
ある。

固相支持体を洗浄した後、正確かつ簡単に測定される信
号（吸光または発光）を観察するための従来の装置を用
いることにより、実際の検定が行なわれる。

こうして、本発明の方法は、全体として多くの利点を有
する。すなわち、迅速で、再現性があり、且つ単純なこ
とである。

通常の操作条件下において、記録された信号（光学的７
３１定）により、使用した細胞数の関数としての満足で
きる均一な標準曲線が得られることが実証されている。

以下の実施例において、次の用語または略語を注釈なし
に使用する。

Ｏ８＾：ウシ血清アルブミン ＰＢＳ　ニリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４）実施例１ われる検定 ミエロペルオキシダーゼは、ヘム構造を含み、糖タンパ
クの特徴を有する酵素である。ヒト血液の多核白血球中
に豊富に存在するこの酵素は、細胞の殺菌および抗微生
物機能に深く関わっている（ＫＬＥＢＡＮＯＦＦ　Ｓ、
Ｊ、、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１９６ｇ、　９５．
２１３１　；ＤＩＡＭＯＮＤ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃ
ｌＩｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、１９８０．６８．９０８−９
１７）。

この発明に従う、多核白血球中のミエロペルオキシダー
ゼの検定は次の３工程を具備し、これらは順に行なわれ
る。

１、全血からの多核白血球の分離、 ２、マイクロタイタープレートのマイクロウ□　エル内
に予め吸着されたモノクーロナル抗体による、細胞の捕
獲および選択的な固定、３、細胞酵素の活性の発現 ａ）プレートの調製 使用されるプレートは、ＮＵＮＣのマークが付いた９６
マイクロウエルを有するプラスチック製マイクロタイタ
ープレートである（レファレンス６４３９４）。各々の
マイクロウェルには、多核白血球の固定、すなわち、そ
れらの免疫学的捕獲の遂行に使用される精製抗−ＣＤ１
５モノクローナル抗体（名称ＳＭＹ１５ａ）を自弁する
溶液２００ｕＪを入れる。ＢＩＯ８ＹＳ（コンビエーニ
ュ、フランス）のマークが付き、商品名がＳＨＹ　１５
ａ　　であるこの酵素は、５ｕｇ／ｍの濃度のリン酸緩
衝食塩水（ＰＢＳ）　、ｐＨ７，４の溶液として使用さ
れる。

モノクローナル抗体の吸着は、４℃で１２時間行なわれ
る。過剰の抗体は、プレートを逆さにすることにより除
去する。

リン酸緩衝食塩水中にゼラチン０．１％及びＢＳＡＯ１
３％を含有する溶液を調製する。ウェル表面がタンパク
質で飽和するように、この溶液２５０ｕＪを各マイクロ
ウェルに導入し、３７℃で１時間放置する。このプレー
トをリン酸緩衝食塩水で３回洗浄する。このようにして
調製されたプレートを４℃で保存する。

ｂ）多核白血球の分離 血液サンプルを採り、抗凝固剤（ヘパリン）と混合する
。ＭＯＮＯ−ＰＯＬＹ分離媒体（ＰＬＯＷ　ｒｅｆ’、
　１６゜９８０−４９＞を５−溶血チューブに採り、血
液２−を表面にのせる。その後、実験室温度において、
チューブを４００ｇで４０分間遠心する。２つの細胞懸
濁リングが形成される。下のリングが多核白血球を含有
しており、マイクロピッペットで回収する。

Ｃ）細胞の免疫学的捕獲 細胞の捕獲は、吸着した抗−ＣＤ１５モノクロ一ナル抗
体によって行なう。

細胞をＰＢＳ　　１ｍ当り　５Ｘ　１０’個に調整した
細胞懸濁液１００ｕＩをプレートのマイクロウェルに入
れる。支持体上への細胞の固定を高めるために、室温で
１０分間放置した後、プレートを１５０　ｇで３分間遠
心する。

ｄ）ミエロペルオキシダーゼの発現およびＩＴＩＩ’プ
レートを逆さにすることにより、マイクロウェルを空に
する。このマイクロウェルをＰＢｓ　２００μＩで２回
洗浄する。これにより、偽の吸収シグナルの原因となる
ことがある、卓球もしくは赤血球のような望まない細胞
集団を除去することが可能になる。２回目の洗浄の後、
即時使用のために調製された発現剤（ｄｅｖｅｌｏｐｌ
ｎｇ　ａｇｅｎｔ）　　１００ｔＩＪを各ウェルに加え
る。

発現剤は、下記の方法により得られる。

水にクエン酸−水化物を溶解して２％溶液を得、７Ｎ水
酸化ナトリウム溶液を添加することによりｐｌ＋を５に
調整することによって０．１Ｍクエン酸緩衝液を調製す
る。次いで、この緩衝液で、臭化ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム（ＣＰＴＡＢ　。

ＴＯＵＺＡＲＴおよびＭＡＴＩＧＮＯＮ　Ｔ　５６５０
　）　（７）　２％溶液を：ｌ８ｉｌ！する。この試薬
は、細胞膜を透過性にし、基質に対するミエロペルオキ
シダーゼの活性を高める。使用前に、この溶液２０　ａ
＃に、オルソフェニレンジアミンジヒドロクロライド３
０ｍｇおよび過酸化水素（酵素に対する基質）４０ｔｄ
を添加する。

１０分間インキュベートした後、分光光度計で４５０ｒ
ｖの吸収を測定する（タイプ３１０　ＣＴｉｔｅｒｔｃ
ｋＭｕｌｔｌｓｋａｎ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　−Ｐｌｏ
ｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１つの実験について、
５０．００００１の細胞を用いて得た吸収を下記第１表
に示す。

第１表 発現媒体中にＣＢＴＡＢが存在することにより、ミエロ
ペルオキシダーゼによって触媒された反応による吸光度
が４倍に増加する。これにより、検定に要求される細胞
数を減らすことが可能になる。

実施例２ この実施例は、細胞の免疫学的捕獲の手順を変形するこ
とにより、実施例１に記載した条件と比較して、内在酵
素の検定に要する時間を短縮することが可能であること
を示すものである。細胞の捕獲に使用される支持体は、
ダイナビーズ（ＤＹＮ＾ＢＥＡＤＳ　）として知られる
磁性ビーズからなる。このビーズ（ｒｅｌ’、ＤＹＮ−
１１００１、ＢＩＯ８ＹＳ）は、抗−マウス免疫グロブ
リン抗体をそれらの表面に載せて運ぶ。使用前に、これ
らのビーズを抗−ＣＤ１５モノクロ一ナル抗体（ｒｅｌ
’、ｓＭＹ　１５ａ　−ＢＩＯ８ＹＳ、フランス）の溶
液を用いて４℃で１２時間処理する。これは、ビーズ懸
濁液２５μｊをＰＢＳ　１１００ｔｔ／　＠Ｉを含有す
る抗体溶液０．５＠Ｉと混合することにより行なう。

続いて、これらのビーズをＰＢＳで３回洗浄し、その後
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の０．３％溶液に４℃
で１２時間浸す。すぐに使用することができるこれらの
ビーズは４℃で保存する。

ミエロペルオキシダーゼを５ｓｊｌ溶血チユーブ内で検
定する。このチューブに、ＰＢＳ３００μｍ、ビーズの
懸濁液２５ρ、およびヘパリン酸リチウムと混合した（
　ＶＡＣＵＴ＾ｌ　ＮＥＲチューブ、ｒｅｒ、８０６４
８４　）全血１００Ａを導入する。穏やかに５分間振と
うした後、磁石によってビーズを分離し、ビーズに固定
された細胞をＰＢＳで洗浄する（５回）。

実施例１と同様に調製された基質（過酸化水素）および
色原体（オルソフェニレンジアミン）を含有し、かつＣ
ＥＴＡＢを有しもしくは含有しない混合溶液を用いて、
ミエロペルオキシダーゼを発現させる。吸光度は、実施
例１と同様の条件でｎ１定する。その結果を第２表に示
す。

泌尿器感染症にかかっている時期の、尿中に存在する顆
粒球中のミエロペルオキシダーゼの測定は、腎孟腎炎お
よび置床についての重要な診断手段である。同様の抗−
ＣＤ１５モノクロ一ナル抗体を運搬する磁性粒子が尿中
の多核白血球を捕獲することが可能であることは、実施
例の第２の部分で示した。■−当り約２Ｘ　ｔｏ’個の
顆粒球を有する尿４００ｄについて検定を行なう。ビー
ズの懸濁液２５謔で細胞を捕獲し、次いでこの細胞を前
述の実施例と同様の条件下で処理した。その結果を下記
の第２表に示す。

この実施例に記載した方法に従って、分析しようとする
細胞集団を事前に分離する必要なく、直接血液サンプル
について、次いで尿サンプルについて検定を行なった。

さらに、固体支持体として磁性ビーズを使用することに
よって、全体として見た検定の操作は特に簡潔かつ迅速
である。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞集団または細胞亜集団に特徴的な内因性酵素
   を検定するためのキットであって、 ａ）検定されるべき細胞集団の表面抗原に対する一以上
   のモノクローナル抗体が、共有結合または物理吸着によ
   って固定された固相支持体と、 ｂ）前記酵素の活性を発現するために必要な試薬（基質
   および適切なときには色原体）を提供する一以上の溶液
   と、 ｃ）洗浄用緩衝溶液と、適切なときには検定の標準化お
   よび品質制御を可能とするサンプルとからなる追加の要
   素とを具備したキット。
2. （２）細胞膜の透過性を改善する試薬をも具備した請求
   項１に記載のキット。
3. （３）前記ａ）の固相支持体が、検定すべき酵素を含有
   する細胞集団または細胞亜集団の細胞を含む細胞の固定
   化を目的とした抗体または抗体類を、ウェルに固着した
   マイクロタイタープレートである請求項１または２に記
   載の方法。
4. （４）前記ａ）の固相支持体が、粒子状の磁性支持体で
   ある請求項１または２に記載のキット。
5. （５）前記ａ）の固相支持体が管である請求項１〜３の
   何れか１項に記載のキット。
6. （６）前記ａ）の固相支持体が、一以上の抗クラス I
   ＨＬＡモノクローナル抗体が固着された固相支持体であ
   る請求項１〜５の何れか１項に記載のキット。
7. （７）前記モノクローナル抗体が、５−クラス I と称
   されるものである請求項６に記載のキット。
8. （８）前記ａ）の溶液が、必須成分としてオルトフェニ
   レンジアミン、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベ
   ンゾチアゾリン−６−スルホン）酸、３−アミノ−９−
   エチルカルバゾールおよびこれらの水溶性塩からなる群
   から選択される色原体と、過酸化水素とを含有する請求
   項１〜７の何れか１項に記載のキット。
9. （９）細胞集団または細胞亜集団の内因性酵素を検定す
   る方法であって、 ａ）検定すべき酵素を含有する細胞集団または検定すべ
   き内因性酵素を含有する亜集団を含んだ細胞集団を、該
   細胞表面に存在する抗原を認識でき、且つ共有結合また
   は物理吸着により予め固相支持体に固着された一以上の
   モノクローナル抗体を用いることによって、前記固相支
   持体に固定化することと、 ｂ）所定時間のインキュベーションを行うことと、 ｃ）前記指示体を洗浄し、固定化されなかった細胞を除
   去することと、 ｄ）前記内因性酵素の活性発現のために必要な試薬また
   は試薬類（基質および色原体）を添加することと、 ｅ）光信号（発色または蛍光）を、適切なときには標準
   スケールのレファレンスと比較して測定することにより
   、結果を読み取ることとを具備した検定方法。
10. （１０）前記固相支持体として、請求項３〜５の何れか
    に記載の固相支持体を用いる請求項９に記載の検定方法
    。
11. （１１）前記酵素活性がオルトフェニレンジアミン、２
    ，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６
    −スルホン）酸、３−アミノ−９−エチルカルバゾール
    およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される色原
    体と、過酸化水素とによって発現される請求項９または
    １０に記載の検定方法。
12. （１２）前記検定を行うために必要とされる全体の時間
    が３０分以下である請求項９〜１１の何れか１項に記載
    の検定方法。
13. （１３）前記固相指示体に固着された前記モノクローナ
    ル抗体またはモノクローナル抗体類が、抗クラス I Ｈ
    ＬＡ抗体である請求項９に記載の検定方法。
14. （１４）前記固相指示体に固着された前記モノクローナ
    ル抗体またはモノクローナル抗体類が、抗クラスＳ−ク
    ラス I と称される抗体である請求項９に記載の検定方
    法。
15. （１５）ヒト血液またはヒト尿中に存在する顆粒細胞に
    含有される、内因性ミエロパーオキシダーゼを検定する
    ための請求項９に記載の検定方法。