JPS63233790A - 細菌中に含まれるプラスミドの安定化方法及びこれにより得られる菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡの技術を微生物による目的分子の生産に実
際に適用してみると、一般に組換えプラスミドが不安定
であるという問題がある。

実験室で通常用いられるクローニング及び発現ベクター
ｉヨ、通常マルチコピープラスミドであり、それらの後
代への安定した伝達は１つの細胞ゲノムあたりの多数の
プラスミドにより確保される（ジョーンズ（Ｊ　ｏｎｅ
ｓ）　　ら、１９８０）。しかし、外来遺伝子のこれら
のプラスミドへの導入は、バクテリアの増殖サイクルの
期間に種々の程度の不安定性をもたらす。従って、工業
的生産工程では、１０００！：ｌの培養物が必要であり
、５０世代以上の世代交代後の１０１６個以上の細胞が
必要となる。従って、バクテリア中のプラスミドの存在
、惹いては外来分子（ｆｏｒｅｉｇｎ　ｍｏｌｅｃｕｌ
ｅ）の発現を確実にするために、醗酵器内での培養が終
了するまでバクテリア中のプラスミドを安定化させるこ
とが必須である。

抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子を組み込むこ
とによりプラスミドを安定化させることは、実験室で通
常行なわれているが、下記の如き理由で、工業的スケー
ルでは適用できない。即ち、０抗生物質耐性゛菌株の使
用は、環境に対して危険を呈する可能性がある。

０培養中に必要な抗生物質の量は生産コストを有意に増
加させる。

Ｏ構成物質の使用は、ヒト及び動物の治療で用いられる
物質の生産においては考えられない。

従って、組換えプラスミドを保有するバクテリアの選択
のために他の方法を開発することが必要である。既に使
用されている数種のモデルは、同一の原理に基づいてい
る。即ち、宿主の欠失を補う性質をコードするプラスミ
ドの不存在下に宿主細胞が増殖することを防ぐため、宿
主細胞に突然変異（栄養素要求性突然変異又はバクテリ
アに対して致死的な遺伝子の導入）を起こさせるもので
ある。

例えば、スコグマン（Ｓ　ｋｏｇｍａｎ）及びニルソン
（Ｎ１１ｓｏｎ　）　　（１９８４及び１９８５）はプ
ラスミドにより保育されるｖａｌ　Ｓ遺伝子による温度
感受性ｖａｔ　Ｓ突然変異の相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ　）を用いた。このモデルでは、トリプ
トファンオペロンを保有するプラスミドの安定性は非許
容温度下で２００世代後も完全である。一方、非選択温
度条件下（３０℃）では、各叶代に１．２％のプラスミ
ドの消失が観察される。

ミワ（Ｍｉｗａ）等（１９８４）は、宿主株として、ス
トレプトマイシン依存性（Ｓｍ　ｄ）大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｉｌ）突然変異体、及び表現型Ｓｍｄを不顕化してス
トレプトマイシン非依存性株とする遺伝子を有するプラ
スミド（Ｓｍ　Ｒ株のｒｐｓＩ２）を用いて、９９％以
上のプラスミド安定性を確立した。

バーシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ）及びロス
チック（Ｒｏｓｔｅｃｋ）　　（１９８４）は、リプレ
ッサーが欠失されているプロファージλを溶原化するバ
クテリアを作った。該細胞は、λｃＩリプレッサーを有
するプラスミドの存在下でのみ細胞溶解を免れることが
できる。

新規な選択モデルを、ｄａｐ＋プラスミド遺伝子と染色
体突然変異体ｄａｐ−との相補性に基づき、開発した。

該モデルはプラスミドを有する細胞のみの生存を確保す
るものである。

ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、バクテリア細胞壁の
成分であり、又アスパラギン酸塩からリジンを生合成す
る過程での中間体でもある。ＤＡＰ生合成のための酵素
が欠失している細胞株は、最少培地では増殖できない。

リジンを培地へ添加すると増殖を開始するが、しかし、
細胞膜にＤＡＰを取り込まない細胞の溶解をすぐにもた
らす（ワーク（Ｗｏｒｋ　）　　１９５０−デービス（
Ｄ　ａｖｉ　ｓ）等、１９７３）。

ＤＡＰ生合成のための酵素の欠失は、プラスミド上に、
特に生産されるべき外来蛋白の発現ベクター上に、対応
する遺伝子を導入することにより補償することができる
。バクテリアが該プラスミドを失う場合、該バクテリア
はｄａｐ−となり、もはや増殖できなくなる。このモデ
ルは、ＤＡＰを含有しない任意の培地、即ち工業的スケ
ールの生産に使用される任意の培地或いはリジンが添加
された任意の最少又は富培地にも適用できるという利点
を有する。

又、このシステムはＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質の合成を
妨げないという利点がある。

ｄａｐ　Ｄ−株（テトラヒドロピコリン酸−Ｎ−コハク
酸転移酵素に対応する、リジンの生合成過程の９種の遺
伝子の１つ、遺伝子りが欠失している）が横築され、通
常用いられる発現プラスミド（プロモーターＰｔ、のコ
ントロール下に発現する遺伝子を有する）上のｄａｐ　
Ｄ遺伝子が導入される。選択条件下で該プラスミドは少
くとも１５０世代安定である。

リジンの生合成のための酵素をコードする他の遺伝子（
ｄａｐ　Ａ）のプラスミド上でのクローニングは、リジ
ンの生産増加を目的として既に実施されている（ダウス
ール　レヴエレンド（Ｄ　ａｕｅｅ−Ｌｃ　Ｒｅｖｅｒ
ｅｎｄ　）等１９８２）、しかし、該文献の著者等は、
プラスミドの安定性をコントロールすることは出来なか
った。

大腸菌のｄａｐ　Ｄ遺伝子は、プラスミドｐＢＲ３２２
中に既にクローン化されており、そのヌクレオチド配列
はりチャウド（Ｒｌｃｈａｕｄ）等（１９８４）により
公表されている。しかし、この研究の目的は遺伝子ｄａ
ｐ　Ｄの調節を研究することにのみあった。

この理由で、本発明はバクテリア中に含まれるプラスミ
ドベクターを安定化させる方法であって、該バクテリア
がｄａｐ−染色体変異を含み、上記プラスミドベクター
はｄａｐ＋遺伝子を有することを特徴とする方法に関す
るものである。

ｄａｐ−染色体変異の内でも、ｄａｐ　Ｄ−を用いるこ
とが望ましい。しかしＤＡＰ生合成のための酵素をコー
ドする他の遺伝子も、対応する遺伝子を保有するベクタ
ープラスミドを用いる限り使用できる。ｄａｐ　Ｄ−株
の場合、プラスミドに挿入されるべき遺伝子はｄａｐ　
Ｄである。

ｄａｐミル安定化システム蛋白質の発現を妨げない。従
って、どのような発現ベクターをも用いることができる
。

ｄａｐ　Ｄ＋プラスミドと染色体の変異されたｄａｐＤ
遺伝子との間の相同性組換えの可能性を回避するために
は、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を染色体から実質的に欠失させる
ことが望ましい。

従って、より詳しくは、本発明は、上述のようなバクテ
リアに含まれるプラスミドベクターを安定化させる方法
であって、ｄａｐ染色体変異がｄａｐＤ遺伝子の少くと
も一部の欠失であり、プラスミドベクターがインダクト
なｄａｐ　Ｄ遺伝子を有することを特徴とする方法に関
するものである。

いかなる組換えをも回避するためには、ｄａｐ　Ｄ遺伝
子の完全な欠失が最も好ましい解決法であることは明ら
かである。

しかし、選択システムは、それがいかに強力であっても
、プラスミドの内在的な不安定性を克服することはでき
ない。このため、遺伝学的方法により発現ベクターの安
定性を増大させるためには、該ベクターをモノマー状態
に維持する配列、特に、“ｅ（３ｒ″配列をベクターに
導入することができる。

上記“ｃｅｒ”（サマーズ（Ｓ　ｕｍｍｅｒｓ）及びシ
ャーラット（Ｓｈｅｒｒａｔ）　、　　１９８４）は、
いかなる蛋白質もコードせず、これが存在するとプラス
ミドをモノマー状態に維持することを促進させる要素で
ある。プ喪スミドが多量体（ｍｕｌｔｌｍｅｒ）を形成
する場合、娘細胞（ｄａｕｇｈｔｅｒ　ｃｅｌｌｓ）に
分配され得るユニット数が減少し、プラスミドを持たな
い細胞が得られ易くなる。従って、ｃｅｒはモノマー状
態にプラスミドを維持することにより、プラスミドを間
接的に安定化させる。

従って、本発明は産業上有用な蛋白質をコードする遺伝
子及び宿主バクテリア中で遺伝子を発現させる要素を更
に有するプラスミドベクターに関し、特に、ヒルジン又
はその天然或いは合成変異型（ｖａｒｉａｎｔ　）の１
つ、Ｃ２−３０、インターフェロン−γ又はα−アンチ
トリプシンをコードする遺伝子、これらの種々のベクタ
ーにより形質転換された細胞株、及び該形質転換株を完
全培地中で培養し、培養後に蛋白質を回収することによ
る工業的蛋白質の製造法に関する。

以下の記載において、発現システムはファージλの左向
きのプロモーターＰｔ、を含有する。しかし、本発明の
バクテリア中で活性であるのは別のプロモーターであっ
てもよい。異種蛋白質（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）の発現要素について完全な記載を行なっ
ていないのはこのためである。

この種のプラスミドは現在広く知られている。単に、ｄ
ａｐ　Ｄ又は他の遺伝子をプラスミドベクターの非本質
的部位に挿入することが望ましい。

本発明のプラスミドは、ｄａｐ　Ｄ−とされた任意の大
腸菌株を形質転換するのに使用することができる。

本発明の方法によれば、発現プラスミドが完全培地中で
、例えば抗生物質による選択圧、又は特定のアミノ酸を
含有しない培地を必要とせずに安定である細菌株が得ら
れる。更に、本発明の方法はプラスミドを失ってしまっ
たバクテリアに対し、対向選択（ｃｏｕｎｔｅｒ　５ｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ　）を及ぼす。

従って、本発明は、また、ｄａｐ＋遺伝子及び産業上有
用な蛋白質の発現を確実にする要素を持つプラスミドベ
クターにより形質転換された菌株、特にｄａｐ−大腸菌
株（Ｅ、　ｃｏｌｌ）に関するものでもある。

又、本発明は、バクテリアから産業上有用な蛋白質を製
造する方法であって、本発明のプラスミドにより形質転
換されたバクテアを完全培地中で培養することを特徴と
する方法にも関する。該プラスミドは、更に該蛋白質の
遺伝子及び宿主バクテリア中でのこの蛋白質発現のため
の調節シグナルを有する。

下記実施例は、ｄａｐ−バクテリア中でのｄａｐ　Ｄ遺
伝子を有するプラスミドの安定性を、Ａｍｐｒ遺伝子を
有するプラスミドと比較して示すものである。

更に、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を保有するこれらプラスミドは
、ヒルジン及びインターフェロン−γをコードする遺伝
子を発現するために用いることもできた。

これら２種の遺伝子はファージλ、プロモーターＰＬの
制御下に置かれており、宿主大腸菌は温度感受性リプレ
ッサーＣｌ８５７を有する。このシステムは、温度を挙
げることにより、ＰＬによりコントロールされた遺伝子
の発現を誘導（ｉｎｄｕｃｅ）する。

リプレッサーＣｌ８５７を有する大腸菌株ＴＧＥ９００
をｄａｐＤ’″になるよう変異させ、菌株ＴＧＥ７６１
５又はＴＧＥ７２１４を得た。また、株Ｎ５９６９を変
異させ、ＴＧＥ７３０３とした。

次いで、下記プラスミドを添付図面に従い調製した： 人肚ｒｄａｐＤ　　外来蛋白 第１図：ｐＴＧ７６４　　＋　　　＋　　　　０第２図
：ｐＴＧ７２０　　　＋　　　　Ｏヒルジン第２図：ｐ
ＴＧ７７１　　　＋　　　　＋　　ヒルジン第３図：ｐ
ＴＧ７７５　　０　　　　＋　　ヒルジン第３図：ｐＴ
Ｇ７７６　　０　　　　＋　　ヒルジン第４図：ｐ’ｒ
ａｙｅｅ　　　Ｏ＋　　　　　Ｑ第４図：ｐＴＧ７６７
　　０　　　　＋　　　　　０第５図：　　ｐＴＧ７８
７１　　０　　　　＋　　　ＩＰＮ−ガンマ第６図は、
ｐＤＢ６のＨｌｎｄ　ｍ−ＢＢｍＨＩフラグメントの制
限地図を示す。

第７図は、Ｍ１３ｍｐ８におけるｐＤＢ６のＰｓｔＩ挿
入物及び導入されたＥｃｏＲ１部位の概略図である。

第８図は、ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントの制限地図を示す。

第９図は、種々の菌株の染色体ＤＮＡにおけるｄａｐ遺
伝子の欠失を、“サザンブロ・ソト（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒ
ｎ　ｂｌｏｔ）”オートラジオグラフイーニより示すも
のであり、 第９Ａ図において、 プローブ＝ｐＴＧ４７のＥｃｏＲＩフラグメントにより
保有されるＫ　ａｎＲ遺伝子 バンド６−９ＰｓｔＩで切断されたＤＮＡ１Ｏ−１４Ｂ
ａｍＨＩ及びＨｌｎｄｍで切断されたＤＮＡ バンド６及び１０＝株ＧＣ４５４０ ７及び１１＝ＴＧＥ７２１３ ８及び１２＝ＴＧＥ７２１４ ９及び１３−ＴＧＥ９０１ １４＝ｐＤＢ６ １５−分子量マーカー 第９Ｂ図においてニ プローブ＝Ｍ１３ＴＧ６２０のＥｃｏＲＩフラグメント
により保有されたｄａｐ　Ｄ遺伝子の５′側 バンド４−７ＰｓｔＩで切断されたＤＮＡ８−１１　　
ＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄＩ［Ｉで切断されたＤＮＡ バンド４及び８＝株ＧＣ４５４σ ５及び９＝ＴＧＥ７２１３ ６及び１０＝ＴＧＥ７２１４ ７及び１１＝ＴＧＥ９０１ バンド１３−分子量マーカー １及び１２＝ＰｓｔＩ又はＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｕで
切断されたｐＤＢ ２＝ＰｓｔＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０３＝Ｐｓｔ
ｒで切断されたＭ１３ＴＧ５９７第９Ｃ図においてニ プローブ＝ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントにより保有されるｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方（ｆ　Ｉ
ａｎｋｉｎｇ）領域 ＰｓｔＩで切断された染色体ＤＮＡ バンド４＝株ＧＣ４５４０ ５＝　　ＴＧＥ７２１３ ６＝　　ＴＧＥ７２１４ ７＝　　ＴＧＥ９０１ バンド８＝分子量マーカー １＝ＰｓｔＩで切断されたｐＤＢ６のＢａｍＨＩ−Ｈ１
ｎｄｌｌｌｌ断片 ２＝ＰｓｔＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０３＝Ｐｓｔ
Ｉで切断されたＭ１３ＴＧ５９７第９Ｄ図においてニ プローブ＝ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片によ
り保有されるｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方領域ＰｓｔＩで切
断された染色体ＤＮＡ バンド４＝株ＲＨ５３４５ ５＝ＲＬ５８ ６＝ＴＧＥ７６１５ １．２及び３（第９Ｃ図におけると同様）７＝分子量マ
ーカー 第１０図は、ｐＴＧ７９０についてのダイアグラムと制
限地図を示す。

第１１図は、ｐＴＧ７９２についてのダイアグラムと制
限地図を示す。

第１２図は、ｐＴＧ７９２２についてのダイアグラムと
制限地図を示す。

第１３図は、ｐＴＧ７６９についてのダイアグラムと制
限地図を示す。

第１４図は、ｐＴＧ７４０６についてのダイアグラムと
制限地図を示す。

第１５図は、クーマシーブルー （Ｃｏｏｍａｓｓｉｃ　　ｂｌｕｅ）で顕現化して行な
った、ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７により合成され
た蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示
す。

バンド−１８＝分子量マーカー バンド２〜５＝３０℃で４時間（２及び３）又は７時間
（４及び５）の培養 バンド６−１２＝４２℃で４時間（６，１１及び１２）
又は７時間（７，９及び１０）の培養 Ｃ＝不溶性フラクション；２０μΩ Ｓ＝可溶性フラクション；４０μｇ 第１６図は、ｐＴＧ７６７５についてのダイアグラム及
び制限地図を示す。

第１７図は、ｐＴＧ７９１４についてのダイアグラム及
び制限地図を示す。

方法 特に断らない限り、各種酵素は公知の方法に従って用い
られる。

形質転換 コンピテント細胞がハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）　　（
１９８３）の方法に従って製造された。その受容能は、
細胞株ＲＬ５８で１０’〜１０５形質転換体／μｇＤＮ
であり（ボレン（Ｂｏｌｌｅｎ　）等、１９７９）　、
ＴＧＥ７６１５、ＴＧＥ７２１４又はＴＧＥ７３０３株
で１０”〜１０θ形質転換体／μｇＤＮである。

一般に、細胞株に導入されるべきプラスミドを含有する
ＤＮＡ試料の適当に希釈された１〜１０μＱ溶液を、コ
ンピテント細胞株のストック０．２ｍＧに添加する。該
コンピテント細胞を０℃で、１５分間ＤＮＡと反応させ
、次いで３７℃で９０秒間インキュベートする。５分間
０℃に戻し、ＬＢ培地０．８ｍＱを添加する。細胞株Ｒ
Ｌ５８又はＴＧＥ７６１５については、該培地は８γ／
ｍＱの割合でＤＡＰを含有していなければならない。

このことは、ｄａｐ　Ｄ−細胞の増殖に必要であり、ｄ
ａｐ　Ｄ遺伝子を持つプラスミドを含有している細胞に
ついてさえも必要である。細胞は一般に強く攪拌しなが
ら３０℃でインキュベートされる。

（但し、プラスミドがプロモーターＰｔ、を有しない場
合は３７°Ｃに保持される）。インキュベーション時間
は６０分間であるが、株ＴＧＥ７６１５を３０°Ｃで培
養する場合は９０分間に延長できる。

次に、決められた容量（０，１ｍ１２）をＬＢ固体培地
上に塗布する。アンピシリン耐性のための遺伝子を有す
るプラスミドの場合、クローンは１００γ／或のアンピ
シリンを添加することにより選択される。ｄａｐ　Ｄ遺
伝子を有するクローンは概してｄａｐ　Ｄ−である培養
物から、他の添加物を含有しないＬＢ培地上で選択され
る。ディツシュは、３０°Ｃで２４時間インキュベート
される。次いで、コロニーをつまようじで３或のＬＢ培
地に移し、３０’Ｃで一夜増殖させた後、プラスミドを
単離し、適当な制限酵素で消化後、アガロースゲル上で
その構造を確認する。

ｄａｐ　Ｄ遺伝子を有するプラスミドは、ｄａｐＤ−変
異を保有する任意の大腸菌（例えばＲＬ５８、ＴＧＥ７
６１５、ＴＧＥ７２１４又はＴＧＥ７３０３）中で形質
転換することができる。該プラスミドが更にバタテリオ
ファジλプロモーターＰｔ。

、　を有する場合は、プラスミド上又は染色体中のいず
れかでバクテリオファージλリプレッサーｃＩ８５７或
いはｃｌ及びＲｅｃ突然変異（例えばＲｅｃＡ４４１）
を発現するｄａｐ　Ｄ−大腸菌株中で必然的に形質転換
されねばならない。

大腸菌宿主ＴＧＥ９００を既知のｄａｐ　Ｄ−変異株Ｒ
Ｌ５８と接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　）させて、・
ｄａｐ−とした。

株ＴＧＥ９００はゴッテスマン（Ｇ　ｏｔｔｅｓｍａｎ
）等（１９８０）により記載された株Ｎ４８３０の誘導
体であり、その特性は、次の如くである＝ｓｕ−Ｆ−ｈ
ｉｓ　　ｉｌｖ　　ｂｉｏ　　　（λｃ１８５７Δ　Ｂ
ａｍ　　Δ　ＨＩ）Ｓ、’０該株は、外来ａ　伝子がλ
プロモーターＰｔ、の制御下におかれている発現ベクタ
ー用の宿主として一般に用いられている。これは、該バ
クテリアが有する温度感受性リプレッサー（λｃＩ８５
７）を不活性化させる温度上昇（３７℃以上）により、
自由に発現を誘導できるものである。

ｄａｐ−ＲＬ　５８　（ｍｅｔ　　Ｂ　ｄａｐＤ２　　
ｌｌ１ｅｔ　　Ｄ２７９　　Ｈｆｒ　　Ｐ４　　Ｘ　　
）株は、ボレン（Ｂｏｌｌｅｎ　）等（１９７９）によ
り記載されている。

この菌株を出発原料として、トリメトプリム耐性の自然
突然変異体が選択された（トリメトプリム２ガンマ／ｌ
Ｔｌ１２を含有するプッシュ上に該菌株を塗り広げ、４
ガンマ／軛のトリメトプリムを含有する培地より選択さ
れたコロニーの耐性を確認した後に）。事実、この耐性
をコードする遺伝子は、ｄａｐＤ−″突然変異に充分類
似しているので、接合後、受容株がトリメトプリム耐性
となった場合は、それは同時にｄａｐＤ−″ともなる。

耐性菌株はＴＧＥ７５５と称された。その特徴は、Ｈｆ
ｒ　　ｄａｐ　Ｄ　−Ｔｍｐ　　である。

ＴＧＥ９００株（Ｆ　−Ｓｍ　ｒｏＳｄａｐ”　）及び
ＴＧＥ７５５の接合後（１５分間後に停止）、ＤＡＰ、
ストレプトマイシン及びトリメトプリムを含有する最少
培地に塗布することにより、Ｓｍｒ　Ｔｍｐ　　コロニ
ーが選択される。選択された株のｄａｐ−の性質及びＤ
ＡＰを含有する最少培地中の親株（ｈｉｓ　　ｉｌｖ　
）における栄養素要求性変異の存在が、ＬＢ培地上で確
認される。

一つの菌株（ｈｉｓ　　ｉｌｖ　　ｄａｐ−）が選択さ
れた：ＴＧＥ７６１５゜ 実施例２ 構築は、ヌクレオチド１０８９から２４９１を除去する
ことにより、ｐＢＲ３２２から誘導されたｐＭＬ２プラ
スミド（ラスキー（Ｌ　ｕｓｋｙ）及びボッチャン（Ｂ
ｏｔｃｈａｎ）　、　　１９８１　）を出発物質として
開始した。該プラスミドはｐＢＲ３２２の複製起点及び
β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）を有して
いた。

ＰｓｔＩ酵素認識配列は、エタンスルホネートで誘発さ
れたＰｓｔｌ’突然変異（ヴイエイラ（Ｖｉｅｌｒａ　
）及びメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、１９８２）を有
するｐＵＣ８のＡ　ｈａＩ［Ｉ　−Ａ　ｈａＩＩＩフラ
グメントを、ｐＭＬ２の２つのＡ　ｈａＩＩ［部位の間
に挿入することにより除かれた。これにより、ｐＭＬ２
から１９塩基対が欠失される。得られたプラスミドｐＴ
Ｇ１９０は、ｐＵＣ８のＰｓｔＩ’変異を保有する。

８ｇｌｎリンカ−（５’　−ｄＣＡＧＡＴＣＴＧ−３′
　；コラボラテイブ　リサーチ （Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
）　）を、ラセ（Ｌ　ａｔｈｅ）等（１９８４）により
記載された“リンカ−ティリング”　　（Ｉｉｎｋｅｒ
　ｔａｌｌｉｎｇ）法により、ＮｒｕＩ部位にのみ挿入
した。得られた構築物は、ｐＴＧ１９１である。

ｐＴＧ１９１を、ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで開環しく
これはテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失する）、１２
の制限酵素認識配列を含有するポリリンカーを持つファ
ージＭ１３ＴＧ１３１　（、キーニー（Ｋ　１ｃｎｙ）
他、１９８３）のＥｃｏＲＩ　−ＢｇｌＩＩセグメント
と再すゲートした。

得られたプラスミドは、ｐＴＧ１９２である。

ｂ）ｐＴＧ１９２プラスミドにおけるｄａｐ　Ｄ遺伝大
腸菌のｄａｐ　Ｄ染色体遺伝子をプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４内に挿入し、ｐＤＢ６を得た（ペンディアク（Ｂ
　ｅｎｄｉａｋ）及びフリーセン（Ｆ　ｒｉｅｓｅｎ）
、１９８１）、該ｄａｐ　Ｄ遺伝子を、１．　３−ｋｂ
Ａ　Ｉｕ　Ｉフラグメントの形でｐＤＢ６から回収し、
ｐＴＧ１９２のＥｃｏＲＩ部位に挿入した（　Ｅ　ｃｏ
ＲＩ末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（ＫＩｅ
ｎｏｗ　）フラグメントで予め処理され、修復されてい
る）。

得られたプラスミドより、単一のＥｃｏＲＩ部位が再横
築されているｐＴＧ７６４を選択する。こうして、ｐＴ
Ｇ７６４は、ｄａｐ　Ｄ遺伝子及びｐ’ｒＧ１９２の（
当初はｐＵＣ８の）アンピシリン耐性遺伝子を持つ。

実施例３ 現プラスミド（第２図） フランス国特許第８４１０４７５５号に記載のｐＴＧ７
２０プラスミドは、λプロモーターＰｔ。

のコントロール下にあるヒルジン遺伝子を本来有する。

プラスミドｐＴＧ７２０をＢｇｌＩＩ及びＢｇｌＩで消
化し、ヒルジン遺伝子及びａＩｌｌｐｒ遺伝子の一部を
保有する２、７４−ｋｂのフラグメントを得る。

該フラグメントをホスファターゼで処理し、ｄａｐＤ遺
伝子及び上記ａａｌｐｒ遺伝子のもう片方のフラグメン
トを持つプラスミドｐＴＧ７６４のＢｇｌＩＩ−Ｂｇｌ
Ｉフラグメントと再すゲートする。得られたプラスミド
ｐＴＧ７７１は、再構築された完全なａＩＩＩｐｒ遺伝
子、ｄａｐ　Ｄ遺伝子及びヒルジンをコードする遺伝子
を含有する。

該プラスミドにより形質転換されたＴＧＥ７６１５のコ
ロニーをＬＢ培地（ｄａｐ＋性に対する選択）又はＬＢ
＋アンピシリン培地上で選択する。

誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　）後、上記形質転換体は、
ヒルジンを産生ずる。

実施例４ 出発プラスミドはｐＴＧ７７１である。

Ａ　ｍｐｒをコードする遺伝子の３′末端を含有する小
さなフラグメントを除去するため、Ａ　ｈａｍで消化を
行ない、ＥｃｏＲＩ　　“リンカ−”　（ＣＣＧＡＡＴ
ＴＣＧＧ）の存在下リゲーションによりプラスミドを再
び閉じる。

こうして、プラスミドｐＴＧ７７５を得る。

ＥｃｏＲＩ消化後、リゲーションにより、Ａ１１ｐｒを
コードする遺伝子が完全に除去される。

こうしてプラスミドｐＴＧ７７６を得る。

このプラスミドにより形質転換されたバクテリアＴＧＥ
７６１５は、無添加のＬＢ培地上で選択される（　ｄａ
ｐ＋に対する選択）。

誘導後、この形質転換株はヒルジンを産生ずる。

出発プラスミドは、プラスミドｐＴＧ１９２である。

ＳｍａＩ及びＡ　ｈａＩＩ［で消化し、ホスファターゼ
で処理後、０．９５−ｋｂのベクターフラグメントを単
離し、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を含有するｐＤＢ６の１゜３−
ｋｂ　　Ａｌｕｌフラグメントとリゲートする。従って
、ａｍｐｒ遺伝子は完全に欠失される。ＴＧＥ７６１５
株をこの新しいプラスミドで形質転換し、ＬＢ培地上で
選択を行ない、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を保有するクローンを
得る。

２つのオリエンテーション（ｏｒｉｅｎｔａｔｌｏｎ　
）でｄａｐ遺伝子を保有するプラスミドが得られる。挿
入物のオリエンテーションはＰｓｔＩによる消化に　　
′より決定できる。選択された下記２種のプラスミドに
ついて： ｐＴＧ７６６は１．３４−ｋｂ及び０．９−ｋｂのフラ
グメントを遊離し、 ｐＴＧ７６７は、１．８５−ｋｂ及び０．４−ｋｂのフ
ラグメントを遊離する。

ｐＴＧ４０　（ＰＥＤ）（ＥＰ−Ａ−０１４６４６２）
プラスミドは、１．　２−ｋｂのＨｌｎｄｌＩ［フラグ
メント上に、プロモーターＰｔ、のコントロール下にあ
るインターフェロン−γ遺伝子を持つ。

ＨｌｎｄＩＩＩによる消化後、このフラグメントを回収
し、フォスファターゼで予め処理さたｐＴＧ７６７のＨ
１ｎｄｍ部位に挿入する。リゲーション後、ＴＧＥ７６
１５を形質転換し、ｄａｐ　Ｄ遺伝子の存在に対する選
択をＬＢ培地上にて行なう。反対のオリエンテーヨンで
挿入物を保有する２つのプラスミドが選択される： ｐＴＧ７６７１　（複製起点の近傍に且つ同一オリエン
テーヨンでＰｔ、を有する）及びｐＴ０７これらプラス
ミドにより形質転換されたＴＧＥ７６１５バクテリアは
、無添加のＬＢ培地上で選択できる（　ｄａｐ＋性につ
いての選択）。

誘導後、上記形質転換株は、インターフェロン−γを産
生ずる。

下記実施例は、本発明に従って形質転換された菌株の特
性を示すものである。

ｄａｐ　Ｄ遺伝子を有する全てのプラスミドは、ＴＧＥ
７６１５株中にあり、その他はＴＧＥ９００株中にある
。

種々のプラスミドの安定性が適当な培地中で試験された
。

“選択培地”とは、本発明のプラスミドの場合はＬＢ培
地のことであり、プラスミドｐＴＧ７２０及びｐＴＧ４
０の場合はＬＢ＋アンピシリン培地である。

“非選択培地”とは、本発明のプラスミドの場合はＬＢ
培地＋ＤＡＰであり、他のプラスミドの場合はＬＢ培地
である。

１１０世代に亘る安定性の試験を、バクテリアの希釈と
増殖を成度繰返し行なう。この増殖期の終わりに、プラ
スミドの安定性を下記のように測定する： 培養物中の生菌数を適当に希釈して、非選択性寒天培地
内の細胞を計数することにより測定する；増殖時の後、
これらコロニーの有意な試料を選択及び非選択寒天培地
に移し、プラスミドをロスしたコロニーの百分率、即ち
選択培地での増殖を測定する。

インターフェロン遺伝子を有するプラスミドについて得
られた結果を第１表に示す。

第　　１　　表 １１０世代後のバクテリアによるプラスミドロスの測定
′ｘＣ＝　生菌数 ｐ−＝プラスミドを失なった細胞 ｐ’−／Ｃ／世代＝　（ｐ−の数／試験したＣの数）×
は代数 同様の試験を、ＬＢ培地中で１７０世代に亘るバクテリ
ア増殖後に、ヒルジンを遺伝子を有するプラスミド及び
クローニングベクターｐＴ０７６６について行なった。

その結果を下記に示す。

第　　２　　表 ＬＢ培地中１７０世代後のバクテリアによるプラスミド
第１表及び第２表の結果は、下記のことを示す。

１）ｄａｐミルベクタ一定性は、ａｍｐｒ遺伝子を有す
るプラスミドに対して１０のファクターで増加する； ２）選択培地と非選択培地との間での相異は最少である
； ３）クローニングベクターｐＴＧ７６６及びｐＴＧ７６
７は５ｘｌＯ−５ｐ−／Ｃ／世代未満のロスである； ４）ｐＴＧ４０の安定性は、ｄａｐ＋ベクターの安定性
よりも有意に小さい。しかし、この減少は５０１！！代
後に特に顕著になり、培養の初期段階でのロスはわずか
２．５Ｘ１０−４Ｔ）−／Ｃ／世代である；及び ５）ａｍｐ’コントロールプラスミドｐＴＧ４０及びｐ
ＴＧ７２０　（各々インターフェロン及びヒルジン遺伝
子を持つ）のロスは同程度である。経時的なプラスミド
のロスは、プラスミドがｄａｐ　Ｄ遺伝子を有する場合
に減少する（ｐＴＧ７６６．７６７．７６７１及び７７
６）。

しかし、ｄａｐ　Ｄ遺伝子及びアンピシリン耐性をコー
ドする遺伝子を持つプラスミド（ｐＴＧ７７１）の安定
性は他に比べて低く、ｐＴＧ７２０のそれと同等のまま
である。この結果は、アガロースゲル中でプラスミド含
量の分析をすることにより説明される。即ち、ｐＴＧ７
７１は四量体を形成することが示され、この現象はプラ
スミドの分割（ｐａｒｔｌｔｉｏｎ　）に影響を与えロ
スを増大させる（サマーズ（Ｓ　ｕ［ＩＩｆｌｌｅｒｓ
）とシャーラット（Ｓｈｃｒｒａｔｔ　）　、１９８４
）　ｏ更に、より少ない“　　数の計代（３０）に亘る
場合、この多量体化現象は出現せず、計７０世代に亘る
場合のｐＴＧ７７１のロスは２．８Ｘ１０−’ｐ’″／
Ｃ／助代以下のま末代以下。

従って、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を有するプラスミドの安定性
は、ａｍｐｒ遺伝子を有するプラスミドに比し増大し、
そのロスは最小となる。

実施例７ ３７℃又は４２℃におけるプラスミドの安定性プラスミ
ド類がプロモーターＰｔ、の制御下にある外来蛋白質を
コードする遺伝子を含む場合には、該蛋白質の発現を誘
導（ｉｎｄｕｃｅ）させることなく、これらプラスミド
類の安定性を調べることは出来ない。それにも拘らず、
作業条件下には、誘導に引き続いて、ＯｌＤ、が０．３
から３．６に増大し、これは３．６世代に相当すること
を指摘しておくべきである。従って、事実、バクテリア
は、誘導に先立って、先行の実施例で既に決定されたロ
スを伴って、３０℃で最大数のけ代を形成しする。

外来蛋白質の発現が生じる場合（例えば、ｐＴＧ７２０
についてはヒルジン、ｐＴＧ４０についてはインターフ
ェロン−γ）には、一定時間（２〜４時間）経過後に、
９０〜９５％の割合の大腸菌培養物の死滅率が観察され
た。これらは、プラスミドを含む細胞群である（何故な
らば、ｐ−宿主細胞は、３７〜４２℃で生育可能だから
である）。必然的に、この死滅率は、生存細胞に対する
ｐ′″細胞の割合を１０乃至２０のファクターで増大さ
せる。生存細胞の全体数が有意的に減少し、ｐ−細胞が
個体数の大きな割合を占める様になると、ｐ−細胞の増
殖が決定され、これがｐ＋／ｐ−比を有意的に減少させ
る（例えば、５時間３０分及び７時間後に得られた結果
を示す第３表を参照）。

ｐ−／細胞／世代というパラメーターは、ｐ＋細胞が最
早増殖しないので、この様な条件下では、その意義を失
っていることが明らかである。従って、以下のパラメー
ターを提案する：即ち、各培養期間に於けるｐ−細胞の
みを測定するｐ−／ｍＩ２／光学密度単位である。更に
、これは、２つの異なる培養物をそのプラスミドのロス
について比較することを可能とする。このパラメーター
は、以下の式に従って計算される： ｐ−／鵬１０Ｄ＝　（１−Ｃ％ｐ”　／１００　）　）
　ｘ生存細胞／ｍＱ１０Ｄ。

最後に、若し、このパラメーターが、細胞の全数（現在
の条件下では、４×１０８である）を基準として表現さ
れるならば、培地中の細胞パーセンテージ（Ｆｐ−）を
得ること、及び各期間に於けるｐ−細胞による培地の汚
染度合いを決定することが可能となる。Ｆｐ−は、以下
のようにして計算される： Ｆｐ−＝４Ｘ１０Ｂ　ｃ／ＩＱ１０Ｄ ｘ１００（ｐ”／ｍＱ１０Ｄ） Ｆｐ’″は、分子の生産のための培養物が十分に純粋で
それ以上の培養に値するか否かを決定することを可能と
し、且つ誘導条件下に異なるプラスミドを互いに比較す
ることを可能とする客観的パラメーターである。

以下の実施例に示す誘導において、生存細胞の数及びｐ
＋のパーセンテージが決定され、次いで、ｐ　／　ｍＱ
　／　ＯＤ及びＦｐ−が計算される。これらのデータは
、表として呈示される。

実施例８ ヒルジンの誘導 ヒルジン誘導の結果は、先ず、アンピシリン耐性遺伝子
を含むベクターに関して、次いで、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を
更に含むベクターに関して、呈示する。

１）プラスミドの安定性 ａ）３７℃のＬＢ培地におけるアンピシリン耐性ＴＧＥ
９００／ｐＴＧ７２０についての代表的な結果を第１表
に示す。

３時間後には、ＯＤ単位当たりの生存細胞の数は、ｐ＋
細胞の割合とともに、平行的に減少していることが明ら
かである。５時間３０分後には、Ｆｐ−（細胞の全数に
対するｐ−細胞の％）２．３５％のオーダーである。７
時間後には、この数は、二倍となるであろう。おそらく
これは、ｐ″″の成長にのみよるものである。

第４表に示す結果は、ｐＴＧ７２０について得られた結
果に比較し得るものである。

第４表から、以下のことが判る。即ちＴＧＥ９００／ｐ
ＴＧ７７１について記録された死滅率に匹敵する死滅率
を呈しているにもかかわらず、プラスミド（％ｐ＋）の
ロスは低い（５時間後に９８％のｐ＋）。これは、ｐ−
細胞の絶対量（ｐ−／１１１ｆ２１０Ｄ）についても同
様である。５時間後のＦｐ−の量は、０．０４％であり
、これは、同一期間におけるｐＴＧ７２０の場合の１１
５０以下である。このことは、ｐＴＧ７２０に比して、
ｐＴＧ７７１がより大きい安定性を有することを示して
いる。誘導実験において、ｐＴＧ７７１は、四量体を形
成せず、又、そのロスは、３０℃で１７０は代に亘り測
定されたロス（第２表参照）よりも小さいものと思われ
ることを指摘しておく。

結果は、ｐＴＧ７２０に比して、プラスミドｐＴＧ７７
１の安定性がより大きいことを示している。

２）プラスミド含有量 誘導期間中に数回に亘り、プラスミドｐＴＧ７２０とｐ
ＴＧ７７１とを単離した。一般に、誘導の初期段階の対
数増殖期に、細胞当りプラスミド含有量が低いことが観
察されたが、時間の経過とともに実質的に増大した。ヒ
ルジンは、この期間中に生成された。

興味深いことに、このプラスミド濃度の増大は、９５％
以上の細胞が死滅した集団で生じていた。

３）誘導された活性 ｐＴＧ７２０及びｐＴＧ７７１から得られたヒルジンの
活性は、有意差を示さなかった。その値（アンチトロン
ビン単位、ＡＴＵ）は、誘導５時間後に、ｐＴＧ７２０
については。２７２０ＡＴＵ／ｆ２１０Ｄであり、ｐＴ
Ｇ７７１については２３８０ＡＴＵ／Ω１０Ｄであった
。

結論として、ｐＴＧ７７１は、ｐＴＧ７２０に比して安
定性が大きく、同時に、対数増殖期の終わりに、ｐＴＧ
７２０と同じ生産能及びそのコピー数増大と言う点で同
じ特性を維持していると言うことができる。

実施例９ ガンマ−インターフェロンの誘導 ガンマ−インターフェロンの誘導についてのデータも、
ヒルジンについてと同様にして提示されている。

導 第５表の結果は、プラスミドのロスは、ｐＴＧ７２０の
ロスと同等であり、５時間後にＦｐ−は６％に増大する
ことを示している。しかしながら、ｐＴＧ７２０とは異
なって、生存の低下は、より急速で、生存細胞数の最小
値は、３時間後にすでに生じている（これに対し、ｐＴ
Ｇ７２０の場合には５時間後に観察されている）。更に
、培養物中に存在するｐ−細胞は、生存し続け、３時間
後にはすでに著るしく分裂しており、５時間後のこのＦ
ｐ″″６％に貢献している。

ｂ）４２℃のＬＢ培地におけるｄａｐ　Ｄ遺伝子を含Ｌ
Ｂ培地中４２℃でのＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７１発
現データを第６表に示す。第６表から以下のことが明ら
かである。５時間が経過するまでは最大死滅率には達し
ない。この期間中、％ｐ＋は、ｐＴＧ４０についての値
（１０％）に比肩し得るがｐ−細胞の数（ｐ−／ｍ１２
１０Ｄ）は、ｐＴＧ４０について３時間後に得られた値
の１７５である。事実、５時間後には、Ｆｐ−は、０．
３％であるのに対し、ｐＴＧ４０についてのＦｐ−は、
すでに６％となっている。従って、２０倍にも達する相
違があり、これは、ｐＴＧ７６７１の増大した安定性を
反映しており、３０℃における安定性データを確認する
ものである（第１表参照）４２℃におけるＴＧＥ７６１
５／ｐＴＧ７６７１誘導条件下に、選択及び非選択培地
中で、プラスミドの安定性は実質上同一であった。一方
、ｐＴＧ７６７１の安定性は、選択の不存在下において
も極めて高いものであった。従って、プラスミドのロス
は、極めて満足すべき、工業的スケールでの生産に適し
たレベルにまで下げられた。

２）プラスミド含有量 アガロースゲル上でのプラスミド含有量の分析は、プラ
スミドｐＴＧ４０及びｐＴＧ７６７１により形質転換さ
れた細胞株が等量の材料を含んでいること、及びこの細
胞当りのプラスミド含ｆ＝ｉ−ｉが誘導期間中に時間と
ともに増大することを示している。ｐＴＧ４０は、二量
体型で存在する（アガロースゲルに示される通り）。

３）　ｄａｐ　Ｄ遺伝子を含むｐ＋細胞の選択細胞の主
要部分がその生存能力を大巾に低下させたら直ちに発生
しなくなるｐ−細胞の成育状況を考慮しつつ、ｄａｐ　
Ｄシステムの選択能を明らかにするために、誘導を行な
った。この誘導期間中に培養物は２時間毎に３回に亘り
５倍に希釈され、その後、定常期に達するまで放置され
た。４２℃におけるＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７１誘
導の結果は、選択培地中での生育について第７表に、又
非選択性Ｌ　Ｂ　＋ＤＡ　Ｐ培地中で成育について第８
表に示す。

第８表から、誘導開始９時間後に、選択的ＬＢ培地中で
は、全ての生存細胞は、プラスミドを含んでいることが
明らかである（プラスミドの存在は、ＬＢ培地中の全数
６０のポジティブコロニー（ｐｏｓｉｔｌｖｅ　ｃｏｌ
ｏｎｙ　）中の３０コロニーからのミニプレバレージョ
ン（＋＋＋ｉｎｉ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）により確
認され、アガロースゲル電気泳動によりプラスミドが同
定される）。これとは対照的に、非選択性培地中では、
生存率は５倍よりも大きいが、培地では、プラスミド含
有細胞を５％含むのみである。ＬＢ培地中よりもＬＢ＋
ＤＡＰ培地中での生存率が高いということは、ＤＡＰが
加えられた培地中でのｐ−細胞の成育、並びにそれ以上
に明確に選択的培地中でのｐ″′細胞の死滅率を示して
いる。従って、ＬＢ培地は、ｐ−細胞の対抗選択を効率
よく行なうものである。

４）インターフェロンの生産 ｐＴＧ７６７１は、原プラスミドｐＴＧ４０と同様のガ
ンマ−インターフェロン産生能を保持している。

実施例１０ プラスミドｐＤＢ６とＭ１３ａ＋ｐ８をＰｓｔＩで切断
し、リゲートする。遺伝子の５′末端及び３′末端を含
むＭ１３をこの領域に対して特異的なオリゴヌクレオチ
ド、ＴＧ５９６　（ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴ
ＴＧ）およびＴＧ５９８　（ＴＧＴＧＣＡＴＡＣＴＴＴ
ＡＧＴＣ）により夫々スクリーニングする。候補体とし
て５Ｂ９６及び５Ｂ９８を選び、所望のフラグメント、
の挿入を配列決定法により確認する（第６図のダイアダ
ラム参照のこと）。

ｏｄａｐＤ遺伝子の５′及び３′末端へのＥｃｏＲＩ部
位の導入 点変異により５Ｂ９６及び５Ｂ９８中にＥｃｏＲ１部位
を導入する。

５Ｂ９８には、オリゴヌクレオチドＴＧ５９７：ＧＴＡ
ＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＴＧＣＣＧを使用す
る。これは、遺伝子末端の３′領域と対合するが、推定
される転写ターミネータ−（ａｓｓｕｍｅｄ　ｔｒａｎ
ｓｃｒｌｐｔｌｏｎ　ｔｅｒｔｓｌｎａｔｏｒ）の前で
ある。

５Ｂ９６には、オリゴヌクレオチドＴＧ６２０　：ＡＧ
ＡＧＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＧを使用する。こ
れは、ｄａ９　Ｄ遺伝子の推定されるプロモーターの上
流側の５′領域と対合する。

形質転換体は、ＥｃｏＲＩ部位を導入するに使用したも
のと同じプローブにより分析する。このＥ　ｃｏＲＩ　
８位の存在は、ＤＮＡミニプレバレージョンにより、次
いで、選ばれたＭ１３候補体を配列決定することにより
確認される（第７図参照）。

０欠失ベクター（ｄｅｌｅｔｌｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　）
の構築プラスミドｐＵＣ−４Ｋ　（ファルマシア社によ
り市販）のカナマイシン耐性遺伝子をＥｅｏＲＩフラグ
メントの形態で回収する。Ｍ１３ＴＧ５９７及び６２０
をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより切断する。

これにより、ｄａｐ　Ｄ遺伝子の３′末端（推定される
ターミネータ−を有しない）及び遺伝子の５′末端（推
定されるプロモーターを有する）を遊離する。

クローニングベクターｐＴＧ１９２　（実施例２ａ参照
）をＰｓｔＩにより切断する。

これら全てのフラグメントをリゲートする。５に細胞の
形質転換ｉ及びＬＢ培地＋アンピシリン０．１μｇ／ｍ
Ｑ＋カナマイシン０．０２μｇ／ｍＱ上への塗布（ｓｐ
ｒｅａｄｉｎｇ　）後に、コロニーをオリゴヌクレオチ
ドＴＧ５９６によりスクリーニングする。

一つの構築物ｐＴＧ４７を選択する。その構造をＤＮＡ
ミニプレバレージョンにより分析し、Ｈｌｎｄｍにより
プラスミドを消化してカナマイシン耐性遺伝子のオリエ
ンテーションを決定する。

かくして、５．３ｋｂ及び４．０ｋｂの大きさの２本の
バンドが遊離される。ｐＴＧ４７中のカナマイシン耐性
遺伝子のオリエンテーションは、ｐＤＢＧ中のｄａｐ　
Ｄ遺伝子のそれと同じである（他方のオリエンテーショ
ンでは、４．９ｋｂ及び４．４ｋｂの大きさのバンドが
得られたはずである）。

ｐＴＧ４７についてのダイアグラムを第８図に示す。

０染色体からのｄａｐ　Ｄ遺伝子の欠失中間細胞株から
の染色体のｄａｐ　Ｄ遺伝子の除去を行なう。

ＲＨ５３４５細胞（その受容能力は、ｐＴＧ４７のＤＮ
Ａのμｇ当り２．５Ｘ１０″″７形質転換体に達する）
を、予めＫｐｎＩ及びＢｇｌｎにより切断したプラスミ
ドｐＴＧ４７により形質転換させる（第８図参照）。

この消化により、ｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方領域（ｆｌａ
ｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ）を含むフラグメントが遊
離される。該遺伝子自身は、カナマイシン耐性遺伝子に
よって置き換えられる。

ＬＢ培地＋ＤＡＰ十カナマイシン０．０１μｇ／−への
塗布後に、９つの候補が選択される。即ち、ＴＧＥ７２
１からＴＧＥ７２９までであり、そのｄａｐ−、ｋａｎ
　Ｆ２表現型が確認される。

ｄａｐ　Ｄ遺伝子の欠如は、ｐＴＧ７６４によるこれら
細胞株の形質転換後に、そのＬＢ培地中での増殖能力に
より確認された。

ｏＴＧＥ９０１及びＮ５９６９株からのｄａｐ　Ｄ遺伝
子の欠失 細胞株ＴＧＥ７２１のｄａｐ　Ｄ欠失は、ファージトラ
ンスデユーサ−Ｐ　１ｖ１ｒ　／ＴＧＥ７２１により、
細胞株ＴＧＥ　９０１及びＮ５９６９内に形質導入され
、ｄａｐ″″組換体は、カナマイシン０．０１μｇ／−
に対する耐性により選択される。

選ばれた候補は、それぞれＴＧＥ７２１３．７２１４及
びＴＧＥ７３０３である。一つの候補、ＴＧＥＴ２１４
については、ｄａｐ−ｋａｎＲ特性に加えて、親株ＴＧ
Ｅ９０１の１１ｅ　、　ｖａｌ及びｈｉｓ要求（ｒ（ｌ
Ｑｕｉ　ｒｅｆｆｉｅｎｔｓ）が適当な培地上で確認さ
れた。

実施例１１ 下記の遺伝子を分析した： ０親株ＴＧＥ９０１及びＲＨ５３４５、ｄａｐＤ”；０
欠失株ＴＧＥ７２１３及びＴＧＥ７２１４　；ｏＴＧＥ
９０１にｄａｐ　Ｄ−突然変異を導入するのに用いられ
た親株ＲＬ５８、及びそれにより得られたｄａｐ　Ｄ−
変異株ＴＧＥ７６１５；ｏＴｎ５の組み込みによりカナ
マイシンに対し耐性を持つＧＣ４５４０゜これに対し、
トランスジーン　ソシエテ　アノニムの株においては、
カナマイシン耐性遺伝子はＴｎ９０３由来である（２つ
の遺伝子は相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）がないため、交
差雑種形成（ｃｒｏｓｓ　ｈｙｂｒｌｄｉｚａｔｌｏｎ
　）を起こさないはずである：ベツク（Ｂｅｃｋ）等、
１９８２）。

制限酵素の選択は、ｐＤＢ６の配列に基づく：ＢａｍＨ
ＩとＨｌｎｄＩＩＩによる切断は、野生株の場合、ｄａ
ｐ　Ｄ遺伝子及びその側゛方領域を含有する９−ｋｂの
染色体フラグメントを遊離する。欠失株の場合、耐性遺
伝子はＢａｍＨＩによる消化で遊離し、ＨｌｎｄＩＩＩ
による消化で２つのフラグメントに切断される； ＰｓｔＩは、野生型株の場合、各々ｄａｐ　Ｄ遺伝子の
一部を含有する２つのフラグメント（５′領域から２．
８ｋｂ及び３′領域から３．４ｋｂ）を遊離する。欠失
株の場合、ＰｓｔＩによる消化は、カナマイシン耐性遺
伝子及び２つの側方領域（５′側上の２．４ｋｂフラグ
メント及び３′側上の２．８ｋｂフラグメント）を遊離
する（第６及び８図）。

ｄａｐ　Ｄ遺伝子又はその側方領域或いはｋａｎ　Ｒ遺
伝子を明らかにするべく、プローブが選択された：カナ
マイシン耐性遺伝子を調べるために、該耐性遺伝子のみ
を有するｐＴＧ４７のＥｃｏＲＩ断片（第８図）を単離
する： ｄａｐ　Ｄ遺伝子を調べるため、ｄａｐ　Ｄ遺伝子の５
′領域のみを有し、ＴＧＥ７２１．７２１３及び７２１
４中では完全に欠失されるべきＭ１３７Ｇ６２０の２．
４ｋｂＥｃｏＲＩ断片が用いられる（第７図）； 染色体ｄａｐ　Ｄ遺伝子及びその側方領域を調べるため
、カナマイシン耐性遺伝子及びｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方
にある染色体の２つの領域（５′及び３′側）を有する
ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片が用いられる。

従って、下記が明らかにされるものと期待される： 野生株においては、ｄａｐ　Ｄ遺伝子の５′領域に対応
する２、　８−ｋｂバンド及び該遺伝子の３′領域に対
応する３、４−ｋｂバンド（第６図）；欠失法において
は、カナマイシン耐性遺伝子、ｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方
に尚存在する５′領域（２，４ｋｂ）及びｄａｐ　Ｄ遺
伝子の側方に尚存在する３′領域（２，８ｋｂ）　　（
第８図）０カナマイシン耐性遺伝子の取り込みの証明Ｐ
ｓｔＩ又はＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄｍで切断されたＧＣ
４５４０、ＴＧＥ７２１３、ＴＧＥ７２１４及びＴＧＥ
９０１の染色体ＤＮＡを比較し、ｐ’ｒＧ４７のＥｃｏ
ＲＩフラグメントをプローブとして調べた。

ＰｓｔＩは、１．３−ｋｂバンドを遊離する。

ＢａｍＨＩ及びＨ１ｎｄＩＩＩ制限は、欠失法について
のみ０．７ｋｂ及び０．６ｋｂの２つのフラグメントを
与え得る。ＴＧＥ９０１又はＧＣ４５４０においては、
バンドは認められない（第９Ａ図）。

これらの結果より、カナマイシン耐性遺伝子が欠失法の
染色体に組み込まれ、該遺伝子がｐＵＣ−４Ｋに由来す
ることがわかる。

ｏｄａｐＤ遺伝子の染色体からの欠失の証明ＧＣ４５４
０、ＴＧＥ７２１３．７２１４及びＴＧＥ９０１の染色
体ＤＮＡを、対照としてＭ１３ＴＧ６２０、Ｍ１３ＴＧ
５９７１、ｐＤＢ６のＢａｍＨＩ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩ［
フラグメント及びＰｓｔｌで切断された同フラグメント
（第６図）を用いて、比較する。

染色体ＤＮＡは、ＰｓｔＩ又はＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄ
ｍで切断される。

ＥｃｏＲＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０は、ｄａｐ　
Ｄ遺伝子の５′側を特異的に含有するバンドから単離さ
れ、これをプローブとして使用する（第９Ｂ図）。

ＰｓｔＩで消化後、野生株においては、ｄａｐ　Ｄ遺伝
子の５′領域に対応する２、　８−ｋｂバンド及び予期
しなかった１、７−ｋｂバンドが認められることが判る
。

ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＤ８６由来
のバンド（９ｋｂ）よりも大きい約１２−ｋｂのバンド
が認められる。更に、付加的な２．　５−ｋｂバンドも
野生株に存在する（第９Ｂ図）。

欠失法については、どの消化フラグメントにも有意な相
同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は認められない。

これらの観察により下記のことが判る：ｄａｐ　Ｄ遺伝
子の５′部分をカバーするプローブは、株ＴＧＥ７２１
３及び７２１４の染色体中のいかなるバンドも明らかに
しない。このことは該遺伝子の５′側の欠失を示す； 野生株においては、ｄａｐ　Ｄ遺伝子に特異的な第２の
バンドが、予測されたバンドの他にも認めらるため、該
遺伝子はこれらの菌株中では重複していると思われる。

ｄａｐ　Ｄ遺伝子の重複は予期されなかったことてあっ
たので、我々は数種の野生株においてこの重複を確認し
、５′側に加えて３′側からのｄａｐ　Ｄ遺伝子の欠失
を確認した。

ＰｓｔＩで消化後、同じ染色体ＤＮＡ及び対照ＤＮＡが
用いられる（第８図）。

プローブはＫｐｎＩ及びＢｇ’ｌＩＩで切断されたｐＴ
Ｇ４７である。上記予期されたバンドの他に、このプロ
ーブは少くとも１．７−ｋｂのバンドを認識するはずで
あ゛る。事実、ｐＴＧ４７は５′及び３′側からのｄａ
ｐ　Ｄ遺伝子に対し相同性を有する３００ｂｐ及び１０
０ｂｐを各々有し、これ等は、欠失法でも認められねば
ならない。

第９Ｃ図は下記のことを示す。： ２、８−ｋｂ及び２．４−ｋｂのバンドは、欠失法で認
められ、３．４−ｋｂ及び２．８−ｋｂバンドが野生株
で認めらる。加えて、カナマイシン耐性遺伝子に対応す
る１、３−ｋｂバンドが認められる。

このことは、株ＴＧＥ７２１３及び７２１４の欠夫を証
明するものである； 重複したｄａｐ　Ｄ遺伝子による２つの強度の弱いバン
ドも又、野生株においてのみ現れる。１．７−ｋｂバン
ドは５′部について認められることが知られているので
、２．１−ｋｂバンドは３′側より由来したものである
に違いない。このことは、これ等株が、欠失株では消失
している重複を有することを証明するものである。

株ＲＨ５３４５及びＲＬ５８のＰＳｔＩで切断された染
色体のＤＮＡを、ＴＧＥ９０１とＲＬ５８の接合により
得られたｄａｐＤ−変異株と比較した。

これらＤＮＡは、Ｋ　ｐｎ　Ｉ　、カナマイシン耐性遺
伝子（何も明らかにしない）を有するｐＴＧ４７より単
離されたＢｇｌＩＩ断片及び遺伝子ｄａｐ　Ｄの側方に
ある領域を用いて調べられた。第９Ｄ図は、ＲＨ５３４
５において３．４及び２．８−ｋｂのバンドのみが認め
られ、ＧＣ４５４０及びＴＧＥ９０１に存在する遺伝子
の重複によるバンドは認められないことを示す。更に、
７−ｋｂバンドのみが、ＲＬ５８及びＴＧＥ７６１５に
ついて認められ、このことはＰｓｔ１部位の欠失を示す
。これにより、これら２つの変異株が同一であり、少く
ともｄａｐＤ遺伝子のｐｓｔｒ部位において影響を受け
ることが証明されている。

結論として、これらの実験は下記のことを示す：株ＴＧ
Ｅ７２１３及び７２１４は、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を欠失し
、カナマイシン耐性遺伝子を有する；ＲＬ５８及びＴＧ
Ｅ７６１５のｄａｐＤ−突然変異は少くともｄａｐ　Ｄ
遺伝子のＰｓｔＩ部位に存在する； いくつかの大腸菌株はｄａｐ　Ｄ遺伝子の重複があり、
この重複は欠失株では認められない。

受容株の２つのｄａｐ　Ｄ遺伝子は、形質導入により欠
失するので、重複遺伝子は、第一のｄａｐ　Ｄ遺伝子と
近接（大腸菌の染色体地図上の２′未満）している。

実施例１２ ｃｅｒ遺伝のクローニング ｅｏｒ遺伝子をＣｏｔ　　Ｅｌプラスミド（その配列は
チャン（Ｃｈａｎ）等（１９８５）により公表されてい
る）より１．８５−ｋｂ　　ＨａｅＵフラグメントの形
で回収する。

その後、該ＨａｅＩＩフラグメントをＨｐａＩＩで切断
し、クレノーで処理し、０．４−ｋｂバンドを回収する
。Ｍ１３［１１１）１３０をＥ　ｃｏＲＶで切断し、ホ
スファターゼで処理する。Ｃｏｔ　　Ｅｌの０．４−ｋ
ｂフラグメントをＭ１３ｍｌ）１３０にリゲートし、株
ＪＭ１０３に導入する。Ｃｏｌ　　Ｅｌｃｅｒフラグメ
ントの存在は、Ｓｍａｌ及びＨｌｎｄＩ［ｒで切断され
て遊離した０、４−ｋｂバンドの配列決定により確認さ
れた。

Ｍ　１３ｍｐｌ　３１のポリリンカー中に挿入されたｅ
ｏｒ遺伝子を、Ｓｍａｊ及びＨｉｎｄ■による消化後単
離し、ＢｇｌＩＩで切断したｐＴＧ７２０ベクター（ヒ
ルジン遺伝子を有する、第２図）にリゲートし、クレノ
ーで処理する。得られたプラスミドがｐＴＧ７２０ｃｅ
ｒである。

ｐＴＧ１９２　（第１図）をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ
で切断しＭ１３ｍｐ１３１ポリリンカーを遊離させ、Ｈ
ａｅＩＩＩ消化により短くする。例えば、ｐＴＧ７３０
（フランス特許８６／１６．７２３に記載の、ヒルジン
の発現ベクター）等のアンピシリン耐性遺伝子を含むプ
ラスミドを用いる；このプラスミドは、ＢｇｌＩＩ及び
ＥｃｏＲＩで切断され、ｐＴＧ１９２のＥｃｏＲＩ−Ｂ
ｇｌ　Ｕフラグメントに結合（Ｉ　ｉｇａｔｃ）される
。こうして、ｐＴＧ７３０のヒルジン構造遺伝子とＰＬ
を含有する発現ブロックが失われ、Ｍ　１３ｍｐｌ　３
１ポリリンカーで置換される。この新しいプラスミドを
ｐＴＧ７９０と呼ぶ（第１０図）。

Ｏｅｅｒフラグメントのクローニングベクターへの導入 ｐＴＧ７９０を５ｓｔＩ及びＫｐｎＩで切断し、ホスフ
ァターゼで処理する。この消化により得られるフラグメ
ントは、ｐ　Ｔ　Ｇ　７２０　ｅｅｒにリゲートされ、
５ｓｔＩ及びＫｐｎＩで切断され（これにより、ｅｏｒ
フラグメントが遊離される）　、ＢｇｌＩＩ消化により
短くされる。得られるベクターｐＴＧ７９２は、ｃｅｒ
フラグメントを含有する（第１１図）。

ｏｄａｐＤ遺伝子のｅ（３ｒフラグメント含有ベクター
への導入 ｐＴＧ７９２をＥｃｏＲＩで切断し、フレノウ（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）及びホスファターゼで処理する。得られるフラ
グメントと、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を含有するｐＤ８６山来
の１．　３−ｋｂ　　Ａｌｕｌフラグメント（第６図）
とをリゲートする。２つのプラスミドｐＴＧ７９２２及
びｐＴＧ７９２３が得られる。

両者は、２つのＥｃｏＲＩ部位間に位置するｄａｐ　Ｄ
遺伝子のオリエンテーションにおいてのみ異なる。

ｐＴＧ７９２２に関しては、上記３つの遺伝子即ち、複
製起源、アンピシリン耐性及びｄａｐ　Ｄの各遺伝子用
のプロモーターが同一方向に配向している（第１２図）
。

Ｏアンピシリン耐性遺伝子の欠失 下記構築法は、複数の目的を有する。即ち、−ｄａｐ　
Ｄ遺伝子を含有するベクターからアンピシリン耐性遺伝
子を欠失させること、 −ＣＱｒ遺伝子を含有するｄａｐ　Ｄクローニングベク
ターを得ること、 −Ｍ　１３ａ＋ｐ１３１ポリリンカー（ｃｅｒのクロー
ニングに用いられたＥ　ｃｏＲＶ部位がない）を含有す
るｄａｐ　Ｄクローニングベクターを得ること、及び 一単−ＥｃｏＲＩ部位を有するｄａｐ　Ｄベクターを得
ること。

ＰｓｔＩフラグメントを、夫々ｄａｐ　Ｄ遺伝子の３′
及び５′部分及びｃｅｒ遺伝子を含有するｐＴＧ７９２
２及びｐＴＧ７９２３から回収し、これを類似している
が、ＥｃｏＲＩ又はＡｖａＩ部位又はｅｏｒを有しない
フラグメントを含有するｄａｐミルベクター導入する。

この類似するベクターは、夫々前記ｐＴＧ７６７及びｐ
ＴＧ７６６である。

即ち、ｐＴＧ７９２２及びｐＴＧ７９２３をＰｓｔＩで
切断し、Ｂｇｌｎ消化により短くし、ＰｓｔＩで切断さ
れホスファターゼで処理されたｐＴＧγ６７及びｐＴＧ
７６６に夫々リゲートする。得られるクローニングベク
ターは、夫々ｐＴＧ７６９及びｐＴＧ７６８である（ｐ
ＴＧ７６９を第１３図に示す）。

実施例１４：カテコール２，３−オキシゲナーゼ（Ｃ２
、３０）用の発現ベクターの 構築へのｄａｐミルモデル用 ＯＣ２、３Ｏの上流のＢａｍＨｒ部位を有しないベクタ
ー Ｃ２、３０の構造遺伝子を上記ｄａｐベクターｐＴＧ７
６７１中へ導入すべく、ｐＴＧ４４４から回収する。

ｐＴＧ４４４は、非再生Ｘ　ｍａ■部位を除けばツコウ
スキー（Ｚ　ｕｋｏｖｓｋｉ　）ら（１９８４）により
記載されたｐＴＧ４４５と同一である。ｐＴＧ４４４を
ＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及
びＨｌｎｄＩ［Ｉで切断されホスファターゼで処理され
たｐＴＧ７６９にリゲートする。得られるプラスミド、
即ちｐＴＧ７４０１は、ｃ２，３ｏの構造遺伝子を含有
しない。

ｐＴＧ７６７１は、２つのＢｇｌＩＩ部位、即ち、ポリ
リンカーのＰｔ形成部の上流の部位及びリポソーム結合
部位中に位置するＰｔ、の下流でγ−インターフェロン
の構造遺伝子の上流の部位を有する。ｐＴＧ７６７１を
ＢｇｌＩＩで切断し、ＫｐｎＩ消化により短くする。得
られる混合物をｐＴＧ７４０１にリゲートし、Ｂｇｌｌ
Ｉ及びＢａｍＨＩにてそのポリリンカーにおいて切断し
、ホスファターゼで処理する。ＢｇｌＩＩ部位は、この
リゲーションにより再構成されるが、Ｂｇｌｎ部位にリ
ゲートされたＢａｍＨＩ部位は失われる。Ｃ２、３Ｏの
構造遺伝子について、ＰＬの２つのオリエンテーション
が可能である。Ｃ２、３ＯがＰＬの制御下にある構造を
区別するために、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩを用いて切
断を行なう（事実、所望のオリエンテーションに関して
は、Ｂａａ＋ＨＩ部位がＢｇｌＩＩ部位の近傍に存在し
、実際上、消化により４．３−ｋｂのバンドのみが得ら
れるであろう。また、他のオリエンテーションにおいて
は、消化により３．９−ｋｂのバンドと０．４−ｋｂの
バンドが遊離される。

ＰＬの制御下にあるＣ２−３０を有する、選択されたプ
ラスミドｐＴＧ７４０７は、下記に示すｐＴＧ７４０６
　（第１４図参照）と近似した構造を有するが、Ｃ２１
３０の上流のＢａｍＨＩ部位を失っている。

ｏ（：２　、３０の上流のＢａｍＨＩ部位を有するベク
ター ｐＴＧ７６９をＢｇｌＩＩ及びＢａａ＋ＨＩで切断し、
ホスファターゼで処理し、λの完全なＮ遺伝子及びＰｔ
、を含有する任意の発現プラスミド（ｐＴＧ９０７）の
ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ７ラグメントにリゲートする。

構築物ｐＴＧ７４００が得られるが、これはＢａｍＨＩ
及び８ｇｌＩｒ切断により２．　６−ｋｂ及び１．３−
ｋｂの２つのバンドを遊離することにより同呈される。

この構築物は、ＰＬ及び完全なＮ遺伝子を含有する。

次いで、上記ｐＴＧ７４００をＨｐａＩで切断し、リン
酸化されハイブリダイズされたＢａ１ＨＩリンカ−１Ｃ
ＣＧＧＡＴＣＣＧＧ　（ベセスダ　リサーチ　ラボラト
リ−（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　ＲｅｓｅａｒｃｈＬ　ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　）により市販さ゛れている）をその中
へ挿入す゛る。こうして、ＨｐａＩ部位を失ったが２つ
のＢａｍＨＩ部位を含有するｐＴＧ７４０２を得る。

該ｐＴＧ７４０２をＢａｍＨＩで切断し、再すゲートし
てｐＴＧ７４０４を得る。この方法により、１つのＢａ
ｍＨＩ部位を除去し、Ｎ遺伝子を切形（ｔｒｕｎｃａｔ
ｅ）する。

ＯＣ２、３Ｏ遺伝子のｄａｐ−ｃｏｒベクターへの導入 上記ｐＴＧ７４０２をＢａａ＋ＨＩ及びＨｌｎｄｍで切
断し、ホスファターゼで処理し、ｐＴＧ４４４のＢｇｌ
ＩＩ−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントをその中へ導入し、ｐ
ＴＧ７４０６を得る（第１４図参照）。これは、ｐＴＧ
７４０７と比べると、Ｃ２、３Ｏ遺伝子がＢａｍＨＩ　
−Ｈｌｎｄ　ｍ切断により除去されてｐＴＧ４４４から
導入されたフラグメントが回収される点において異なっ
ている。

０プラスミドｐＴＧ７４０７により形質転換されバクテ
リアＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７中でのＣ２，３ｏ
遺伝子の発現を、３０℃にて４時間及び７時間培養後に
及び４時間及び７時間後に４２℃にて誘導中に観察した
。夫々の観察のため、サンプルを培養物から回収し、遠
心分離し、ペレットをリン酸塩緩衝液で洗浄し、同緩衝
液中にとり（ツコウスキー（Ｚ　ｕｋｏｖｓｋｌ　）ら
、１９８３に記載の方法に従う）、次いで、超音波で３
回２０秒間処理する。

１０．０００ｇにて１０分間遠心分離後のベレットを不
溶性フラクション（Ｐ）、上清を可溶性フラクション（
Ｓ）とする。

各フラクション中に存在する蛋白質をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル上での電気泳動により分析する。各バンド
は、クーマシーブルー （Ｃｏｏｔｎａｓｓｊｅｂｌｕｅ　）で染色することに
より顕現化する。結果を第１５図に示す。ＭＷ３５，０
００のバンドの強度が、特に４２℃にて誘導７時間後に
、観察される。ゲルの“スキャニングにより、フラクシ
ョンＳ及びＰにおいて夫々的６４％及び７５％のＣ２、
３Ｏが得られる。

よりリッチなサンプル（Ｓ、４２℃にて７時間）におい
て、Ｃ２、３Ｏの特異的活性を、（ツコウスキー（Ｚ　
ｕｋｏｗｓｋｉ　）ら、１９８３記載の方法に従い）基
質としてカテコールを添加することにより測定する。２
８〜３！５Ｕ／ｍｇの特異的活性が測定される。

純粋な酵素組成物の特異的活性は２８０Ｕ／ｍｇであり
、分析された抽出物は約１２％の活性Ｃ２、３Ｏを含有
する。

上記ｐＴＧ７６７１をそのポリリンカーにおいてＳ　ｓ
ｔ　Ｉ　（Ｓ　ａｃ　Ｉと同一）及びＫｐｎＩで切断し
、次いでホスファターゼで処理し、５ｓｔＩ及びＫｐｎ
ｌで切断されたｐＴＧ７２０ｃｅｒフラグメントにリゲ
ートする。ＴＧＥ７６１５中に形質転換後、１つの候補
ｐＴＧ７６７５を選択する（第１６図）。これは、５ｓ
ｔＩ及びＫｐｎｌで消化すると４００ｂｐ及び３．４−
ｋｂの２つのフラグメントを遊離する。

実施例１６：γ−インフーフエロン発現の誘導（ｉｎｄ
ｕｃｔｉｏｎ　）中のプラスミドの安定性の観察 結果を第９表に示す。総細胞数／ＩＩＩＱ１０Ｄユニッ
トを測定し、生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　）のロスが
真実の現象であって、例えば細胞体積の変化によるもの
ではないことを確認する。これ等データを第９表に併記
する。Ｆｐ−は、実施例７で定義した通りであり、所定
時刻に存在する総細胞数に対するｐ−細胞の数である。

誘導７時間３０分後のＦｐ−が約２％に達することが判
る。従って、それは、前記実験（実施例９参照）におけ
るよりも低いものであり、これら２つの実、験における
プラスミドｐＴＧ４０の構造上の差にのみ起因し得る。

即ち、実際のところ、誘導の各時点においてプラスミド
の量は同一であるが、最初の実験においてはプラスミド
はダイマーの形態であり、他方ここに記載の実験におい
ては、主としてモノマー形態にある（ゲル上の分析によ
り示される）。プラスミドの状態（ｃｏｎｄｉｔｉ。

ｎ）は、γ−インターフェロン産生に影響を与えないが
、プラスミドのモノマー形態が推持されない場合は、結
論として安定性が失われるものと説明できる。

結果を第１０表に示す。総細胞数／ｍＱ１０Ｄユニット
を測定する。ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０に比し大差は認
められない。従って、生存率の現実の消失（ｌｏｓｓ）
が確認される：誘導７時間３０分後、培養物のわずか０
．０２％が生存し続けるに過ぎない。この結果を、２．
４％の値が得られたＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０について
の結果と比較すべきである。このことは、Ｆｐ−にも現
れており、ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０に比し、ＴＧＥ７
６１５／ｐＴＧ７６７５の場合は１０００分の１に減少
している。しかし、いくつかのｐ−細胞は生存し続け、
誘導終期に現れる。プラスミド含量は前記と同一の特徴
を何し、換言すれば、増殖終期にコピー数が増加するが
、ｅｅｒを有しないプラスミドと共に変化し得る数で存
在する多量体形態（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ　ｆｏｒｍ　
）のものが、この場合は殆んど存在しない。γ−インタ
ーフェロン産生量は、ｐＴＧ４０の場合に比し、わずか
に大きい。

結果を第１１表に示す。結論は、ＴＧＥ９０１／　ｐ　
Ｔ　Ｇ　４０とＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７５との比
較から導き出されたものと同一である。即ち、死滅率（
ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　）は、３．５Ｘ１０−４のファク
ターに達し、総細胞数／ｍＱ１０Ｄユニットの値は誘導
中有意に変化しない。これと対照的に、誘導７時間３０
分後であっても、ｐ−細胞は現れない（２４時間後、全
培養物は、ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０の場合はｐ−とな
り、ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７６７５の場合は１００％
ｐ＋のままであった）。プラスミド含量は、多量体（ｍ
ｕｌｔｉｍｅｒ）の不存在下、ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ
７６７５のそれと同等である。γ−インターフェロン産
生量は、ＴＧＥ７６ユ５　／　ｐ　Ｔ　Ｇ　７６７５に
より得られたよりもわずかに大きい。

実施例１７：アルファー１抗トリプシン用の発現ベクタ
ーの構築へのｄａｐミルモデル 用 ｐＴＧ２９０１（フランス国特許８５１０７゜３９３号
記載のｐＴＧ９８３の切形された（　ｔｒｕｎＣａｔθ
ｄ）誘導体）由来のアルファ−１抗トリプシン発現ブロ
ックを含有するＰｓｔＩフラグメント１即ち〜ファージ
ラムダプロモーターＰＬ１切形されたＮ遺伝子、リポソ
ーム結合部位及びアルファー１抗トリプシンの構造遺伝
子 （Ａｒｇ３５　Ｂ　）を前記ｐＴＧ７９２中へ導入し、
Ｐｓｔｌで切断しホスファターゼで処理する。

得られる発現ベクターｐＴＧ７９１３を、次いで、Ｂｇ
ｌｎ及びＳ　ｓｔ　Ｉで切断し、アルファー１抗トリプ
シン及びｃｅｒ　１４伝子を含有する発現ブロックを、
ｐＴＧ７６７中へ導入し、ＢｇｌＩＩ及び５ｓｔＩで切
断し、ホスファターゼで処理する。

得られるプラスミドｐＴＧ７９１４は、ｄａｐ　Ｄ遺伝
子、ａｅｒ遺伝子及びアルファ−１抗トリプシン発現ブ
ロック（Ａｒｇ３５８）を含有する（第１７図）。

本発明の代表的菌株の寄託 下記菌株は、パリ　リュ　デュ　ドクトル　ルー　２５
のコレクシオン・ナシオナル・ド・クルチュール・デ・
ミクロオルガニスム （Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｌｏｎａｌｅ　ｄｏ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅｓＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｓＳＮａｔｌｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔ１ｏｎ　ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）に寄託さ
れた。

（１）ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７１　　　寄託番号
ｌ−５８６ （２）ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７７１　　　寄託番号（
１）　（２）いずれも寄託日は１９８６年７月２５日で
ある。

（３）ＴＧＥ７２１４、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を欠失された
コリ（ｃｏｉｌ）株　　寄託番号ｌ−６５２（４）ＴＧ
Ｅ７３０３、ｄａｐ　Ｄ遺伝子を欠失されたコリ株　　
寄託番号ｌ−６５３ （上記２つの菌株は、ｄａｐ　Ｄ及びｃｅｒ遺伝子を含
有するプラスミドｐＴＧ７６８で形質転換されている。

） （５）ＴＧＥ７２１４／ｐＴＧ７４０４、Ｃ２、３Ｏの
発現プラスミドで形質転換されたｄａｐＤ−株　　寄託
番号ｌ−６５５ （３）、（４）、（５）いずれも寄託日は、１９８７年
３月１０日である。

参考文献 １、ジョーンズ　アイ、エム°（Ｊｏｎｅｓ　　１．　
Ｍ、　）、ブリムローズ　ニス、ビー、　　（Ｐｒｉｍ
ｒｏｓｏＳ。

Ｂ、）、ｏビンソン　ニー、　　（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　
Ａ、　）、エルウッド　ディー、シー−（Ｅｌｌｗｏｏ
ｄ　　Ｄ。

Ｃ，）（１９８０）　、モレキュラー　アンドジェネラ
ル　ジエネテツイクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、）１８０，５７９−５８４゜２、ニルソン
　ジエイ、　　（Ｎｉｌｓｓｏｎ　　Ｊ、　）、スコグ
マン　ジー、　　（Ｓｋｏｇｍａｎ　　Ｇ、　）、（１
９８５）欧州特許出願節８４８５０３１３．２号３、ス
フグマン　ジー、　　（Ｓｋｏｇｎ＋ａｎ　　Ｇ、　）
　、ニルソン　ジエイ、　　（Ｎｉｌｓｓｏｎ　　Ｊ、
　）、（１９８４）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　、３１．
　１１７−１２２゜ ４、ミワ　ケー、　　（Ｍｆｗａ　Ｋ、　）　、ナヵモ
リエス、　　ＣＮａｋａｍｏｒｉ　Ｓ、　）　、サノ　
ケー。

（Ｓａｎｏ　Ｋ、　）　、モモセ　エイチ、　　（Ｍｏ
ｍｏｓｅＨ，）、（１９８４）　、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ　。

４８．２２３３−２２３７゜ ５、ミワ　ケー、　　（Ｍｉｗａ　Ｋ、　）　、ナヵモ
リ　ニス、　　（Ｎａｋａｍｏｒｉ　Ｓ、　）　、サノ
　、ケー。

（Ｓａｎｏ　Ｋ、　）　、モモセ　エイチ、　　（Ｍｏ
ｍｏｓｅＨ，）、（１９８４）　、ジーンＣＧｅｎｅ　
）　、３１．２７５−２７７゜ ６、バーシュバーガー　シー、エル。

（Ｈｃｒｓｈｂｅｒｇｅｒ　　Ｃ，Ｌ、　）　、ｏステ
ック　ビー、アール、　　（Ｒｏｓｔｅｃｋ　　Ｐ、　
Ｒ，）、（１９８４）米国特許第４，４３６，８１５号
。

７．７−ク　イー、　　（Ｗｏｒｋ　　Ｅ、）、（１９
５０）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ　）　、１６５．
　７４−７５゜ ８、ディビス　ビー、デ４　　、　　（Ｄａｖｌｓ　　
Ｂ。

Ｄ、）、ドウルベッコ　　アール、（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
　Ｒ５）、アイゼン　エイチ、エヌ、　　（Ｅｉｓｅｎ
　　Ｈ。

Ｎ、）、ギンスバーグ　エイチ、ニス。

（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　Ｈ，Ｓ、　）　、ウッド　ダブリ
ュー。

ビー（Ｗｏｏｄ　Ｗ、　Ｂ、　）　　（第２版、１９７
３）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｄ、　　Ｈａｒｐ
ｅｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｌｏｎａｌ、第７２頁。

９、ダウスール　リベレンド　ビー、　　（Ｄ　ａｕｃ
ｅ−Ｌｅ　Ｒｅｖｅｒｅｎｄ　Ｂ、　）　、ボワテル　
エム。

（ＢｏｌｔｅｌＭ、）、テシャンフエー、エム。

（Ｄｅｓｃｈａａ＋ｐｓ　　Ａ、　Ｍ、）　、ルボール
　ジエイーエム、　　（Ｌｅｂｅａｕｌｔ　Ｊ　−Ｍ、
　）　、サノケー、（Ｓａｎｏ　Ｋ、　）　、タキナミ
　ケー。

（Ｔａｋｉｎａｍｌ　Ｋ、　）　、パｙテ　ジェイーシ
−（Ｐａｔｔｃ　　Ｊ−Ｃ）、　（１９８２）、Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ　　Ｊ、　　Ａｐｐｌ、Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ
　　。

Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｏ１．１５．　２２７−２３１゜１
０６リチヤウド　シー、　　（Ｒｌｅｈａｕｄ　　Ｃ，
）　、リチャウド　エフ、　　（Ｒｌｃｈａｕｄ　　Ｆ
、　）　、？ルチン　シー、　　（Ｍａｒｔｉｎ　Ｃ，
）　、ハジザ　シー。

（Ｈａｚ１ｚａ’Ｃ，）　、パッテシエイーシー。

（Ｐａｔｔｅ　　Ｊ−Ｃ）、（１９８４）　、ジャーナ
ル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ。

Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅａ＋）　、２５９．１４８２４−１４
８２８゜ １１、ハナハン　ディ、　　（Ｈａｎａｈａｎ　　Ｄ、
）、（１９８３）、ジャーナル　オブ　モレキュラー　
バイオロジー　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、　
　１６６．５５７−５８０゜ １２、ボレン　エ＋、　　（ＢｏＪＩｅｎ　Ａ、　）　
、ラセ　アール、　　（Ｌａｔｈｅ　　Ｒ，）　、ハー
ツォグ　ニー。

（Ｈｅｒｚｏｇ　Ａ、　）　、ｙ’＝コート７’イ＋。

（Ｄｅｎｉｃｏｕｒｔ　　Ｄ、　）　、ルコッ’７　　
’）エイーヒ−，（Ｌｅｅｏｃｑ　Ｊ−Ｐ、　）、テア
し”）　　エル。

（Ｄｅｍａｒｅｚ　、Ｌ、　）　、ラバ１　アール。

（Ｌａｖａｌｌｃ　　Ｒ９）、（１９７９）、ジャーナ
ル　オブ　モレキュラー　バイオロジー　（Ｊ。

Ｍｏｂ　Ｂｉｏｌ、）　、１３２，２１９−２３３゜１
３、ゴッテスマン　エム、イー、　　（Ｇ　ｏｔｔｅｓ
ｍａｎＭ、Ｅ、　）　、アドヒア　ニス（Ａｄｈｙａ　
　Ｓ、　）、ダスｊ−−，ＣＤａｓ　　Ａ、　）、　（
１９８０）、ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオ
ロジー　　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、１４０
．　５７−７５゜ １４、ラスキー　エム、　　（Ｌｕｓｋｙ　　Ｍ、　）
　、ボチャン　　エム、　　　（Ｂｏｔｃｈａｎ　　　
Ｍ、　）　　、　　（１９８１）　　、ネイチ−？　−
（Ｎａｔｕｒｅ　）　、２９３．　７．９−８１゜１５
、ヴイエイラ　ジエイ、　　（Ｖｉｅｉｒａ　　Ｊ、　
）、メシング　ジエイ、　　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　　Ｊ、
　）　、　　（１９８２）、ジーン（Ｇｅｎｅ　）　、
２２，２５９−２６８゜ １６、ラセ　アール（Ｌａｔｈｃ　　Ｒ，）　、キーニ
ーエム、ビー（Ｋｉｅｎｙ　　Ｍ、Ｐ、　）　、スコー
リーエス（Ｓｋｏｒｙ　　Ｓ、　）　、ルコック　ジエ
イーピー、（Ｌｅｃｏｅｑ　Ｊ−Ｐ、　　）、　（１９
８４）、ディーエフエイ　（ＤＮＡ）、３，１７３−１
８２゜ １７、キーニー　エム−ビー（Ｋｉｅｎｙ　　Ｍ−ｐ、
　）、ラセ　アール（Ｌａｔｈｅ　　Ｒ，）　、ルコッ
ク　ジエイーピー、　　（Ｌｃｃｏｃｑ　Ｊ−Ｐ、　）
、（１９８３）、ジーン（Ｇｅｎｅ）２６．９１−９９
゜１８、ペンディアク　ディー、ニス、　　（Ｂ　ｅｎ
ｄｉａｋＤ、Ｓ、）　、フリーセン　ジエイ、ディー。

（Ｆｒｉｅｓｅｎ　　Ｊ、　Ｄ、　）、（１９８１）　
、モレキュラー　アンド　ジェネラル　ジェネテイクス
（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ）　１８１．３５６
−３６２゜ １９、サマーズ　ディー、ジエイ、　　（Ｓ　ｕｍ［ｌ
１ｃｒｓ　　Ｄ　。

Ｊ、）、シャーラット　ディー、ジエイ（Ｓ　ｈｅｒａ
ｔ　Ｄ、　　Ｊ、　）、（１９８４）、セル（Ｃｅｌｌ
　）３６．１０９７−１１０３゜ ２０、ベック　イー、　　（Ｂｅｃｋ　Ｅ、　）　、ル
ードウイッヒ　ジー、（Ｌｕｄｗｉｇ　　Ｇ、　）　、
アウエルスヴアルト　イー６エー、　　（Ａ　ｕｅｒｓ
ｗａｒｄ　　Ｅ　。

Ａ、）、ライス　ビー、　　（Ｒｅｉｓｓ　　Ｂ、　）
及びシャシー　エム、　　（Ｓｃｈａｌｌｅｒ　Ｍ、　
）　、ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）、１９，３２７−３３６　
（１９８２）。

２１　　ベンディアク　ディー、ニス、　　（Ｂ　ｅｎ
ｄｉａｋＤ、　　Ｓ、　）及びフリーセン　ジエイ、デ
ィー。

（Ｆｒｉｅｓｅｎ　　Ｊ、　Ｄ、　）　、モレキュラー
　　７：／ド　ジェネラル　ジエネティクス（Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　、１８１．３５６−３６２（
１９８１）。

２２、ボレン　ニー、　　（Ｂｏｌ！ｅｎ　Ａ、　）　
、ラセ　アール、　　（Ｌａｔｈｅ　　Ｒ，）　、ハー
ツｔグ　ニー（Ｈｅｒｚｏｇ　Ａ、　）　、デニ：７−
トティ＋。

（Ｄｃｎｉｃｏｕｒｔ　　Ｄ、　）　、ルコツク　ジエ
イ、ビー、　　（Ｌｅｃｏｃｑ　Ｊ、　　Ｐ、　）　、
デスマレツエル。

（Ｄｃｓｍａｒｅｚ　Ｌ、）及びラバレアー）Ｉｙ。

Ｌａｖａｌｌｅ　　Ｒ，’）　、ジャーナル　オフ　モ
レキュラー　バイオロジー　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏ
ｌ、）、１３２．２１９−２３３　（１９７９）。

２３、ブクハリ　ニー、アイ、（Ｂｕｋｈａｒｉ　　Ａ
、　　Ｉ　、）、ティラー　ニー、エル、　　（Ｔａｙ
ｌｏｒ　Ａ、　　Ｌ、　）、ジャーナル　オフ　バクテ
リオロジー（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　、１０５．８４４−８５４
　（１９７１）。

２４、チャン　ビー、ティー、　　（Ｃｈａｎ　Ｐ、　
　Ｔ、　）、オーモリ　エイチ、　　（Ｏｈｍｏｒｉ　
Ｈ，）　、）ミザワ　ジエイ、アイ、　　（Ｔｏｍｉｚ
ａｗａ　Ｊ、　　Ｉ、　）及びレポウィッツ　ジエイ、
　　ジエイ。

（Ｌｅｂｏｗｉｔｚ　　Ｊ、　　Ｊ、　　）　　、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ　、　　２６０．８９２５−８９３５　
　（１９８５）。　。

２５、フリ　アール（Ｄ’　ＡｒＩ　　Ｒ，）及びライ
スマン　オー、　　（Ｈｕｉｓｍａｎ　　Ｏ，）　、ジ
ャーナルオフ　バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　）、１５６，２４３−２５０　（１９８３）
。

２６、リチャウッド　シー、　　（Ｒｌｃｈａｕｄ　　
Ｃ，）、リチャウッド　エフ、　　（Ｒｌｃｈａｕｄ　
　Ｆ、　）　、？ルチン　シー、　　（Ｍａｒｔｌｎ　
Ｃ０）　、ハジザ　シー、　　（Ｈａｚｉｚａ　Ｃ，）
及びパッチ　ジエイ、シー、　　（Ｐａｔｔａ　　Ｊ、
　　Ｃ，）　、ジャーナルオフバイオロジカル　ケミス
トリー（Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｌ　。

Ｃｈｅｆｌｌ、）　、２５９．１４８２４−１４８２８
．１９８４゜ ２７、　　サマーズ　ディー、ケー、　　（Ｓ　ｕｍｍ
ｅｒｓ　　Ｄ　。

Ｋ、　）及びスファーラット（Ｓ　ｐｈｅｒｒａｔｔ）
　、セル（Ｃｅｌｌ　）　、３６．１０９７−１１０３
　（１９８４）。

２８、ツコウスキー　エム、エム、　　（Ｚｕｋｏｗｓ
ｋｊ　Ｍ。

Ｍ、）、ガフニー　ディー、エフ、　　（Ｇａｆｆｎｅ
ｙＤ、　　Ｆ、　）　、スペック　ディー　（Ｓｐｅｃ
ｋ　　Ｄ。

）、カウフマン　エム、　　（Ｋａｕｆｆｍａｎ　Ｍ、
　）、フィンプリ　ニー、　　（Ｆｌｎｄｅｌｉ　　Ａ
、　）　、ワイズカップ　ニー、　　（Ｗｉｓｅｃｕｐ
　　Ａ、）及びルコック　ジエイ、ピー、　　（Ｌｅｃ
ｏｃｑＪ、　　Ｐ、　）　。

プロシーデインダス　オブ　ザ　ナショナルアカデミ−
オブ　サイエンス　オブ　ザ　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）８０．１１
０１−１１０５　（１９８３）。

２９、ツコウスキー　エム、エム°、　　（Ｚｕｋｏｗ
ｓｋｉ　Ｍ。

Ｍ、）、スペック　ディー、　　（Ｓｐｅｃｋ　　Ｄ、
　）、カウフマン　エム、　　（Ｋａｕｆｆｍａｎｎ　
　Ｍ、　）及びルコック　ジエイ、ピー、　　（Ｌｅｃ
ｏｃｑ　Ｊ、　　Ｐ、　）、ジエネティクス　アンド　
バイオテクノロジー　オブ　バシリ（Ｇ　ｅｎｅｔｌｃ
ｓ　ａｎｄＢ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ　ｏｆ　Ｂａ
ｃｉｌｌｉ）　３０９−３１９（１９８４）　　。

【図面の簡単な説明】

第１図から第５図は下記のプラスミドの構築を示す。 Ａｍｐｒｄａｐ　Ｄ　　外来蛋白 第１図：ｐＴＧ７６４　　＋　　　＋　　　　Ｑ第２図
：ｐＴＧ７２０　　　十〇　　　ヒルジン第２図：ｐＴ
Ｇ７７１　　　＋　　　　＋　　ヒルジン第３図：ｐＴ
Ｇ７７５　　０　　　　＋　　ヒルジン第３図：ｐＴ０
７７６　　０　　　　＋　　ヒルジン第４図：ｐＴ０７
６６　　０　　　　＋　　　　　０第４図：ｐＴＧ７６
７　　０　　　　＋　　　　　０第５図：ｐＴ０７６７
１　　０　　　　＋　　　ＪＰＮ−ガンマ第６図は、ｐ
ＤＢ６のＨ１’ｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩフラグメントの
制限地図を示す。 第７図は、Ｍ１３ｍｐ８におけるｐＤＢ６のＰｓｔ■挿
入物及び導入されたＥｃｏＲＩ部位の概略図である。 第８図は、ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントの制限地図を示す。 第９図は、種々の菌株の染色体ＤＮＡにおけるｄａｐ遺
伝子の欠失を″サザンプロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂ
ｌｏｔ）　”オートラジオグラフィーにより示すもので
あり、 第９Ａ図において、 プローブ＝ｐＴＧ４７のＥｃｏＲＩフラグメントにより
担持されるＫａｎＲ遺伝子 ハンド６−９ＰｓｔＩで切断されたＤＮＡ１Ｏ−１４Ｂ
ａｍＨＩ及びＨｌｎｄＩ［Ｉで切断されたＤＮＡ バンド６及び１０＝株ＧＣ４５４０ ７及び１１＝ＴＧＥ７２１３ ８及び１２＝ＴＧＥ７２１４ ９及びＬ３＝ＴＧＥ９０１ １４＝ｐＤＢ６ １５＝分子量マーカー 第９Ｂ図においてニ プローブ＝Ｍ１３ＴＧ６２０のＥｃｏＲＩフラグメント
により担持されたｄａｐ　Ｄ遺伝子の５′側 バンド４−７ＰｓｔＩで切断されたＤＮＡ８−１１　　
ＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄＩＩＩで切断されたＤＮＡ バンド４及び８＝株ＧＣ４５４０ ５及び９＝ＴＧＥ７２１３ ６及び１０＝ＴＧＥ７２１４ ７及び１１＝ＴＧＥ９０１ バンド１３＝分子量マーカー １及び１２＝ＰｓｔＩ又はＢａｍＨＩ及びＨｌｎｄｍで
切断されたｐＤＢ６ ２＝ＰｓｔＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０３＝Ｐｓｔ
Ｉで切断されたＭ１３ＴＧ５９７第９Ｃ図において： プローブ＝ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントにより保有されるｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方（ｆｌａ
ｎｋｉｎｇ）領域 ＰｓｔＩで切断された染色体ＤＮＡ バンド４＝株ＧＣ４５４０ バンド５＝ＴＧＥ７２１３ ６＝ＴＧＥ７２１４ ７−ＴＧＥ９０１ バンド８＝分子量マーカー １−ＰｓｔＩで切断されたｐＤＢ６のＢａｒａＨＩ−Ｈ
ｌｎｄＩＩ［断片 ２＝ＰｓｔＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０３＝Ｐｓｔ
Ｉで切断されたＭ１３ＴＧ５９７第９Ｄ図においてニ プローブ＝ｐＴＧ４７のＫｐｎＩ−ＢｇｌｌＩ断片によ
り保有されるｄａｐ　Ｄ遺伝子の側方領域ＰｓｔＩで切
断された染色体ＤＮＡ バンド４−株ＲＨ５３４５ ５＝ＲＬ５８ ６＝ＴＧＥ７６１５ １．２．３　（第９Ｃ図におけると同様）７＝分子量マ
ーカー 第１Ｏ図は、ｐＴＧ７９０についてのダイアグラムと制
限地図を示す。 第１１図は、ｐＴＧ７９２についてのダイアグラムと制
限地図を示す。 第１２図は、ｐＴＧ７９２２についてのダイアグラムと
制限地図を示す。 第１３図は、ｐＴＧ７６９についてのダイアグラムと制
限地図を示す。 第１４図は、ｐＴＧ７４０６についてのダイアグラムと
制限地図を示す。 第１５図は、クーマシーブルー （ＣｏｏＩＩＩａｓｓｉｃｂｌｕｃ）で顕現化して行な
った、ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７により合成され
た蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示
す。 バンド−及び８＝分子量マーカー バンド２〜５＝３０℃で４時間（２及び３）又は７時間
（４及び５）の培養 バンド６−１２＝４２℃で４時間（６，１１及び１２）
又は７時間（７，９及び１０）の培養 Ｃ＝不溶性フラクション；２０μρ Ｓ＝可溶性フラクション；４０μｇ 第１６図は、ｐＴＧ７６７５についてのダイアグラム及
び制限地図を示す。 第１７図は、ｐＴＧ７９１４についてのダイアグラム及
び制限地図を示す。 （以　上） ＩＧ−９Ａ −、ダ１　　・ ’　ｎＧ、９Ｃ 襠 で 休 一 り　　　　　　　　　　　　　　　　　　【α さ く 手続辛市正書（自発） 昭和６２年１１ηつ下戸

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）細菌中に含有されるプラスミドベクターを安定化
   させる方法であって、該細菌がｄａｐ＾−染色体変異を
   含み、該プラスミドベクターがｄａｐ＾＋遺伝子を保有
   することを特徴とする方法。
2. （２）ｄａｐ＾−染色体変異がｄａｐＤ遺伝子の変異で
   あり、プラスミドベクターがインダクトなｄａｐＤ遺伝
   子を保有する特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）ｄａｐ染色体変異が、ｄａｐＤ遺伝子の少なくと
   も一部の欠失であり、プラスミドベクターがインダクト
   なｄａｐＤ遺伝子を有する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。
4. （４）欠失が、ｄａｐＤ遺伝子の全欠失である特許請求
   の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）プラスミドベクターが、モノマー状態を保持する
   配列を有する特許請求の範囲第１項乃至４項のいずれか
   に記載の方法。
6. （６）配列が、“ｃｅｒ”配列である特許請求の範囲第
   ５項に記載の方法。
7. （７）プラスミドベクターが、産業上有用な蛋白質をコ
   ードする遺伝子を有し、宿主細菌中でのその発現を確保
   するための要素を含有する特許請求の範囲第１項乃至６
   項のいずれかに記載の方法。
8. （８）宿主細菌が、イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であ
   る特許請求の範囲第１項乃至７項のいずれかに記載の方
   法。
9. （９）産業上有用な蛋白質が、ヒルジン、γ−インター
   フェロン、Ｃ＿２＿、＿３Ｏ及びアルファー抗トリプシ
   ンから選ばれるものである特許請求の範囲第７項又は第
   ８項に記載の方法。
10. （１０）特許請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに
    記載の方法を実施することにより得られる安定化された
    発現プラスミドベクターを含有する細菌。
11. （１１）イー．コリ株であって、ｄａｐＤ遺伝子の少な
    くとも部分的な欠失を有し、ｄａｐＤ遺伝子及び産業上
    有用な蛋白質の発現をコードする遺伝子及び該宿主細胞
    中でのその発現を確保する要素を有するプラスミドベク
    ターにより形質転換されたイー．コリ株である特許請求
    の範囲第１０項に記載の細菌。
12. （１２）産業上有用な蛋白質が、ヒルジン、γ−インタ
    ーフェロン、Ｃ＿２＿、＿３Ｏ及びアルファー抗トリプ
    シンから選ばれるものである特許請求の範囲第１１項に
    記載の細菌。
13. （１３）特許請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれ
    かに記載の細菌であって、その産業上有用な蛋白質の発
    現をコードする遺伝子がＣ＿２＿、＿３Ｏをコードする
    遺伝子である細菌を、完全培地中で培養することを特徴
    とするＣ＿２＿、＿３Ｏの製造法。
14. （１４）特許請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれ
    かに記載の細菌であって、その産業上有用な蛋白質の発
    現をコードする遺伝子がヒルジン類はその天然の又は人
    工的な変異型をコードする遺伝子である細菌を完全培地
    中で培養することを特徴とするヒルジン類の製造法。
15. （１５）特許請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれ
    かに記載の細菌であって、その産業上有用な蛋白質の発
    現をコードする遺伝子がγ−インターフェロンをコード
    する遺伝子である細菌を、完全培地中で培養することを
    特徴とするγ−インターフェロンの製造法。