KR100356581B1

KR100356581B1 - 플라스미드의안정화

Info

Publication number: KR100356581B1
Application number: KR10-1998-0701773A
Authority: KR
Inventors: 존 쉐라트. 데이비드; 저레인트 윌리암스. 스티븐; 쥴리안. 알렉시스. 존 하낙
Original assignee: 코브라 바이오매뉴팩쳐링 피엘씨
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2003-04-10
Also published as: EP0851932B1; JPH11511985A; WO1997009435A1; DE69611794T2; ATE199168T1; DE69611794D1; KR19990044525A; US5972708A; AU6885596A; PT851932E; ES2155620T3; DK0851932T3; AU710494B2; EP0851932A1; CA2231784A1; JP3416888B2; CA2231784C; GB9518395D0; GR3035806T3

Abstract

유전자 치료 및 재조합 단백질의 생산에 유용한 플라스미드의 보존을 위해 신규한 억제인자 적정 시스템을 이용하는 것이 개시되어 있다, 이 시스템은 트랜스형태로 발현되는 억제인자에 의해서 결합할 수 있는 작동유전자, 억제인자를 암호화하는 제1의 염색체 유전자 및 작동유전자와 기능적으로 결합되며 세포성장에 필수적인 제2의 염색체 유전자를 포함하는 플라스미드를 갖는 형질전환된 숙주세포를 이용한다. 여기에서 플라스미드는 필수유전자가 발현되므로써 세포성장이 이루어지도록 억제인자를 적정하기에 충분한 수로 세포내에 존재한다.

Description

플라스미드의 안정화

특히 고사본수(high copy number)로 플라스미드를 안정되게 보존시키는 것은 유전자 치료용 치료 유전자를 전달하는 DNA를 제조하는데 증요하다. 그러나, 플라스미드를 포함하는 배양세포들은 플라스미드가 없는 분리된 세포들에 비하여 증대된 대사적 부담을 통상적으로 가지기 때문에 숙주세포들내의 염색체외(extrachromosomal) DNA는 세포배양중에 본질적으로 불안정하게 된다. 플라스미드를 안정하게 보존하고 대사적 부담을 감소시키기 위한 노력으로서, 우세한 선택가능한 마커(marker)들을 포함하도록 설계된 플라스미드가 통상적으로 사용되어 왔다. 박테리아 또는 효모 숙주 균주들의 일정비율이 증가된 발효동안에 존재하는 선택인자가 플라스미드 DNA의 복제 및 보존의 노력으로 부담이 되지 않는 세포들에 의해서 플라스미드가 손실되고 이상증식되는 것을 막게 된다.

예를들면, 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin) 또는 테트라사이클린(tetracycline)가 같은 항생물질에 대한 내성을 암호화하는 항생물질 내성(antibiotic resistance) 유전자들은 재조합 단백질 또는 플라스미드 DNA를 생산하는 분자생물 클로닝과정과 발효과정에서 사용되는 가장 통상적인 우세한 선택가능한 마커들이다. 항생물질 존재하에서의 지속적인 발효동안에, 숙주세포에 의한 배양물의 희석과 감성(degradation)으로 인하여 발효시간 동안에 항생물질은 활성도를 잃기 때문에 선택적인 압력이 손실된다. 따라서, 몇가지의 성공적인 플라스미드의 보존방법은 항생물질의 선택을 이용하지 않고, 아미노산을 합성할 수 있으며, 이러한 합성을 플라스미드내에 제공하는 유전자를 삽입하는 돌연변이 숙주에 다소 의존하게 된다. 플라스미드가 없는 분리된 세포들에 의해 배양물이 점거되는 것을 막는 또다른 해결방법은 염색체내에 독성생산물을 암호화하는 유전자를 배치한 다음 플라스미드내에서 상응하는 억제인자(repressor) 시스템을 포함하는 단계를 수반한다. 플라스미드가 없는 세포들은 분리되자마자 사실상 죽게 된다.

그러나, 선택적인 압력을 가질지라도, 플라스미드를 포함하는 세포들의 선택성 유전자의 보충적인 생산물의 누출로 인하여 플라스미드가 없는 세포들은 지속적으로 성장할 수도 있다. 뿐만 아니라, 유전자 치료 목적을 가지는 벡터들에 대한 항생물질 내성 유전자들 또는 다른 우세한 선택가능한 마커들은 타겟 포유동물 세포 또는 숙주 포유동물 유기체내에서 이들 유전자의 발현과 관련된 잠재적인 문제들을 일으켜 왔다. 타겟 포유동물 세포내에서의 이들 유전자의 발현은 세포의 파괴 및/또는 포유동물의 유전자 생산물에 항원반응을 일으키게 할 수도 있다. 또한, 최종 생산물의 오염에 관해서는 배양중에 플라스미드 선택에 사용되는 항생물질에 대한 관심사, 항생물질에 대한 심한 면역반응, 예를들면 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock)의 잠재적인 유발에 대한 관심사가 있다. 광범위한 용도의 항생물질 내성 박테리아 유전자들도 역시 궁극적으로는 전체로서 박테리아 집단으로 전달된다. 따라서, 플라스미드 태생 유전자들 또는 항생물질의 선택을 필요로 하지 않는 플라스미드의 보존방법이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 플라스미드 태생의 우세한 선택가능한 마커의 사용을 필요로 하지 않으면서, 억제인자 적정(repressor titration) 시스템을 다소 이용하는 플라스미드 보존 시스템의 발견에 근거한 것이다.

본 발명은 트랜스(trans) 형태로 발현된 억제인자에 의해서 결합할 수 있는 작동유전자를 함유하는 플라스미드, 상기 억제인자를 암호화하는 제1의 염색체 유전자, 및 상기 작동유전자와 기능적으로 결합되고 세포성장에 필수적인 제2의 염색체 유전자를 포함하고, 여기에서 상기 플라스미드는 상기 필수 유전자가 발현될 수 있도록 상기 억제인자를 적정하기에 충분한 수로 세포내에 존재하여, 세포 성장이 가능하게 하는 형질전환된 숙주세포를 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같이, 작동 유전자 서열 및 관련 유전자에 대해서 "기능적으로 결합된(functionally associated)" 또는 "작동가능하게 결합된(operatively associated)"이란, 작동유전자에 억제인자가 결합하자마자 유전자 발현이 억제될 수 있도록 작동유전자가 유전자에 시스형태로 연결되는 것을 의미한다.

당업자들은 작동유전자라는 용어가 관련 프로모터로 부터의 전사를 막기 위해 억제인자가 결합하는 핵산 서열을 한정하는데 사용된다는 것을 이해할 것이다.플라스미드 작동유전자는 염색체 유전자의 전사를 억제하는 억제인자와 결합 필요한 최소의 서열들로만 이루어지는 것을 필요로 하기 때문에, 플라스미드상에 존재하는 작동유전자 서열은 염색체 유전자상의 작동유전자 서열과 동일한 서열일 필요는 없다. 본 발명에 따르면, 돌연변이된 작동유전자 서열들이 예를들면 하나 이상의 뉴클레오티드들이 삽입, 결실 또는 치환되어 상응하는 억제인자에 대한 친화력을 증가 또는 감소시키게 되는 유용한 서열들이라는 것도 이해될 것이다.

여기에서 사용된 바와 같이, "세포성장(cell growth)"은 배양시간 동안에 배지에서 세포들의 수가 증가하는 것을 가리키며, 또한 배양시간 동안에 세포들의 수가 증가하지는 않지만, 배양시간 동안에 살아 있는 세포들의 수가 다소 감소하지 않는 경우인 세포생존을 가리킨다.

바람직하게는, 억제인자 유전자는E. colilac 억제인자, λ 억제인자,E. colitrp 억제인자,E. coligalR 억제인자,E. coliaraC 억제인자,E. coliArg RNV 억제인자(버케 등(1994) 분자생물학, 13, 609-618) 및E. coliTet 억제인자 중에서 하나를 암호화한다. 전술한 바와 같이, 각각의 억제인자는 염색체내와 플라스미드 상에 존재하는 트랜스형태로 결합된 작동유전자 서열과 트랜스 형태로 작동가능하다. 본 발명은 하나의 염색체 억제인자 유전자가 돌연변이되거나 결실될 경우에 플라스미드의 안정성을 보장하기 위해서 하나 이상의 억제인자 유전자들, 예를들면 한 개, 두 개 또는 세 개의 억제인자 유전자들이 숙주 염색체 상에 존재하는 것을 관찰하였다.

따라서, 바람직한 작동유전자 서열들은 lac 작동유전자, λ작동유전자, trp작동유전자, gal 작동유전자, ara 작동유전자, Arg 작동유전자 및 Tet 작동유전자를 포함한다. 바람직하다면, 상응하는 프로모터는 이의 작동유전자와 기능적으로 결합할 수도 있다.

숙주세포는 포유동물 세포 및 곤충세포와 같은 동물세포, 식물세포, 효모세포와 박테리아세포와 같은 곰팡이 균류 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 그램(gram) 음성이거나 그램 양성일 수 있는 박테리아 세포이며, 예를들면 대장균(E. coli), 살모넬라(salmonella), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(streptomyces) 및 락토바실러스(Lactobacillus) 이다.

숙주 세포가 진핵세포인 경우, Lac 억제인자, Tet 억제인자 및 이들의 상응하는 억제인자들이 사용되는 것이 바람직하다. 효모, 딕티오스텔륨(dictiostelium), 식물세포 및 담배식물을 포함한 진핵세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 Lac 억제인자와 Tet 억제인자가 사용되는 것이 고센 등((1994) Current Opinions in Biotechnology, 5,516-520)에 의해 기술되었다.

작동유전자와 기능적으로 결합하는 하나 이상의 상이한 필수 염색체 유전자가 세포 염색체내에 존재할 수 있으며, 여기에서 필수유전자는 작동유전자에 연결되므로써 억제인자에 의해 억제되어 하나의 염색체 작동유전자에서의 억제인자 민감성이 손실되는 것을 억제하게 된다. 본 발명의 바람직한 하나의 구체예에서, 억제인자 단백질을 암호화하는 유전자는 하나의 염색체 위치에서 억제인자의 발현이 손실되는 것을 억제하기 위해서 염색체내의 상이한 위치에서 두 개 또는 세 개의 사본들로 존재하게 된다.

숙주 염색체상에 위치하는 바람직한 필수 유전자들은, 제한되는 것은 아니지만, 다음의 카테고리에 해당되는 유전자들을 포함한다 : 세포벽 전구물질과 같은 세포 대사산물의 생합성과 관련된 생산물을 암호화하는 유전자, 그의 생산물이 탄소대사에 수반되는 유전자, 항생물질에 대한 내성을 암호화하는 유전자 및 고분자의 생합성 또는 조절을 암호화하는 유전자, 예를들면 DNA 및/또는 RNA 합성 및 복제기능에 필수적인 유전자.

바람직하게는, 플라스미드는 숙주세포당 약 20개의 플라스미드 사본 또는 약 200개의 플라스미드 사본을 복제하는 복제기점(origin of replication)을 포함한다. 이러한 플라스미드의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 비에라와 메싱(1982, Gene,19(3), 259-268) 및 야니취-페론 등(1985, Gene,33(1), 103-119)에 의해서 기술된 바와 같이 플라스미드의 pBR322 시리즈 및 pUC 시리즈를 포함하며, 여기에서는 pUC로서 인용된다.

플라스미드는 목적하는 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 하나의 구체예에서, 플라스미드는 목적하는 유전자를 더 포함한다. 바람직하게는, 목적하는 유전자는 포유동물, 바람직하게는 인간 세포에서 발현가능하다. 이러한 유전자들의 예는 당업계에서 공지되어 있으며, 여기에 개시되어 있다. 바람직하다면, 목적하는 유전자는 숙주 균주내에서는 발현되지 않는다. 이는 숙주 균주가 박테리아인 경우 목적하는 유전자를 갖는 박테리아 프로모터를 포함하지 않으므로써 달성될 수 있다. 뿐만 아니라, 바람직하다면, 유전자의 발현이 플라스미드-형질전환 숙주세포의 성장을 억제하도록 목적하는 유전자가 플라스미드 작동유전자 서열과 결합할 수도 있다. 이는 암호화된 목적하는 단백질을 생산하는 숙주세포의 대사적 부담을 덜어 주게 된다. 선택적으로는, 목적하는 유전자의 발현을 원한다면, 예를들면, 암호화된 단백질을 생산하고 분리해내는 것이 바람직한 경우, 세포가 성장하자마자 목적하는 유전자의 발현이 억제되도록 작동유전자가 위치할 필요는 없으며, 목적하는 유전자의 발현은 숙주세포내에서 활성을 갖는 프로모터에 의해서 유도될 수 있다.

또한 본 발명은 전술한 숙주세포를 포함하며, 여기에서 플라스미드는 숙주세포에서의 복제 및 보존에 필요한 서열들만을 포함한다. 즉, 여기에서 플라스미드는 트랜스 형태로 발현되는 억제인자에 의해서 결합할 수 있는 작동유전자, 복제기점 및 목적하는 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위로 필수적으로 이루어져 있다.

또한 본 발명은 전술한 최소의 플라스미드, 즉 트랜스형태로 발현되는 억제인자에 의해서 결합할 수 있는 작동유전자, 복제기점 및 목적하는 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위로 필수적으로 이루어진 플라스미드를 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "필수적으로 이루어진"이란 플라스미드가 숙주균주내에서 플라스미드를 보존하는데 필요한 서열들과 치료용 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위만을 포함한다는 것을 의미한다. 즉, 상기 플라스미드는 숙주세포내에서의 생존에 불필요한 서열들은 포함하지 않는다. 여기에서 사용된 바와 같이, "복제기점(origin of replication)"은 세포당 주어진 사본수로 플라스미드를 보존하는데 필요한 플라스미드상의 서열들을 가리킨다.

바람직하게는, 이 최소의 플라스미드는 약 1000bP의 길이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 최소의 플라스미드는 약 2Kb의 길이를 가지며, 여기에서 작동유전자 서열, 복제기점 및 클로닝 부위와는 다른 플라스미드에 포함되는 DNA는 비-암호화(non-coding) DNA 이다.

이 최소의 플라스미드는 타겟 세포내에서의 발현을 위해 조절 서열과 작동가능하게 결합된 목적하는 유전자를 더 포함하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는 타겟 세포는 포유동물의 세포이며, 더욱 바람직하게는 인간의 세포이다.

최소의 플라스미드는 박테리아 서열과 같은 최소의 외래(foreign) DNA 서열들만을 포함하므로써, 포유동물의 세포라인에 외래 DNA 서열들을 도입하는 경우, 예를들면 플라스미드가 유전자 치료용 벡터로서의 목적을 가지는 경우에 관련되는 문제점들을 상당히 해소하게 된다. 따라서, 본 발명에 의해서 회피할 수 있는 문제점들은, 포유동물의 타겟 세포내에서 박테리아 유전자 또는 효모 유전자와 같은 플라스미드 태생 유전자들의 발현이 타겟 세포 또는 포유동물의 숙주 자체를 파괴시키게 되거나 또는 외래 DNA 또는 그러한 서열들에 의해서 암호화되는 생산물에 대한 면역반응을 발전시키게 되는 점을 포함한다.

또한 본 발명은 세포가 성장하기에 충분한 조건 및 시간동안에 전술한 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 숙주세포내에서 플라스미드를 보존하는 방법을 포함한다.

또한 본 발명은 세포가 성장하기애 충분한 조건 및 시간 동안에 전술한 형질전환된 세포를 배양하는 단계와 배양된 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리해 내는단계를 포함하는 플라스미드 DNA의 생산방법을 포함한다.

또한 본 발명은 재조합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 및 시간동안에 전술한 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산방법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 생산방법은 재조합 단백질을 분리해 내는 단계를 더 포함한다. 바람직하게는, 재조합 단백질은 사람에게는 치료적 잇점을 가지는 단백질이다.

여기에서 기술된 억제인자 적정 시스템을 사용하는 재조합 단백질의 생산방법은, 플라스미드상의 유일한 암호영역이 재조합 단백질을 암호화하는 유전자라는 이유 때문에 숙주세포에게는 경감된 대사적 부담을 주게 된다. 따라서, 숙주세포는 재조합 단백질과는 다른 플라스미드-암호화된 단백질의 생산을 지원할 필요가 없다. 뿐만 아니라, 여기에서 기술된 억제인자 적정 시스템은 항생물질의 부재하에서 재조합 단백질의 생산을 허용하므로, 배양물에서의 항생물질의 활성 손실로 인한 플라스미드 선택의 손실을 피할 수 있게 된다. 더욱이, 분리된 재조합 단백질은 항생물질로 오염되지 않는다.

여기에서 기술된 억제인자 적정시스템은, 항생물질 내성과 같은 플라스미드-암호화된 우세한 선택가능한 마커를 사용하지 않으면서 플라스미드를 적당한 사본수 또는 고사본수로 안정하게 보존할 수 있으며, 트랜스-작용(trans-acting) 억제인자/작동유전자 시스템을 지원할 수 있는 어떠한 숙주에도 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 장점은 플라스미드-함유 세포들의 항생물질 선택에 의한 것과는 다른 플라스비드 보존에 대한 확신에 있다. 즉, 항생물질의 활성도 손실에 기인하는 발효동안의 선택적인 압력의 손실이 전혀 없게 된다. 여기에서 기술된 바와 같이, 플라스미드상에서의 항생물질 내성 유전자와 같은 우세한 선택가능한 마커들의 부재도 역시 포유동물의 타겟 세포내 유전자들의 발현과 관련된 잠재적인 심각한 문제점들을 피할 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서 본 발명은 유전자 치료를 위해 의도된 생산물이 유전자 치료 벡타의 선택을 위해 사용되는 항생물질로 오염되는 것도 역시 피할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 이러한 항생물질들에 대한 심한 면역반응, 예를들면, 아나필라틱 쇼크의 잠재적인 유도를 피할 수 있다.

여기에서 기술된 플라스미드 안정화 시스템의 하나의 큰 장점은 전체로서 박테리아 집단에서의 유전자들의 전달을 촉진하는 경향이 있는, 항생물질 내성을 암호화하는 박테리아 유전자들의 광범위한 용도를 피할 수 있다는 점이다.

본 발명의 다른 특징 및 장점들은 후술되는 본 발명의 바람직한 구체예와 청구범위에서 명백해지게 된다.

본 발명은 일반적으로 플라스미드의 안정한 보존방법에 관한 것이며, 특히 유전자 치료에 유용한 유전자를 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 플라스미드-형질전환된 숙주세포의 계통도이다 ;

도 2는 본 발명에 따른 최소의 플라스미드의 계통도이다 ;

도 3은 유일한 탄소원으로서 락토오스 또는 글루코스를 함유하는 최소의 배지상에서 pUC18로 비형질전환 및 형질전환된E. coli균주 Hfr 3000 YA 694의 성장을 도시한 도면이다, A) Hfr 3000 YA694(Min/Gluc/B1), B) Hfr 3000 YA694(Min/Lac/B1), C) Hfr 1000 YA694-pUC18(Min/Gluc/B1/Ap), D) Hfr 3000 YA694-pUC18 (Min/Lac/B1/Ap) ;

도 4는 글루코스와 앰피실린을 함유하는 최소의 배지상에서 성장한 다음 a) 락토오스 및 앰피실린, b) 락토오스, c) 글루코스를 함유하는 최소의 배지내에 접종된 세포들의 플라스미드 DNA를 도시한 도면이다 ; 여기에서 트랙 1 HindⅢ 스탠다드, 트랙 2 EcoR I 제한된 접종물 플라스미드 DNA, 트랙 3∼6 대략적으로 15, 36, 55 및 72 세포세대 동안 성장한 후에 분리된 EcoR I 제한 플라스미드 DNA ;

도 5는 카나마이신의 존재하에서 JC7623 lacZ-kan의 활성화된(derepressible)성장을 도시한 도면이다 ;

도 6은 카나마이신의 존재하에서 DH1 lacZ-kan의 활성화된 성장을 도시한 도면이다 ;

도 7은 디아미노피멜레이트의 부재하에서 JC7623 dapD-kan lacZ-dapD의 활성화된 성장을 도시한 도면이다.

설명

본 발명은 다음의 물질들과 방법들이 사용된 비한정적인 실시예들에 의해서 예시된다. 이후에 인용된 각 참고문헌들은 여기에서 참고문헌으로 통합된다.

본 발명은 형질전환된 숙주세포, 플라스미드 및 신규한 억제인자 적정시스템을 사용하는 숙주세포내에서의 개선된 플라스미드의 생산방법과 보존방법에 근거한 것이다(도 1). 본 발명에 따라 생산된 플라스미드 DNA는 유전자 치료에 유용하다. 플라스미드 자체는, 도 2에 도시된 바와 같이, 일정한 최소의 서열들로 이루어질 수 있으며, 목적하는 치료 유전자를 전달할 수 있다. 신규한 억제인자 적정시스템은 다음과 같이 작동된다.

도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 억제인자 적정시스템은 플라스미드 태생 억제인자 단백질 결합 서열 16, 즉 작동유전자와 억제인자 단백질을 암호화하는 유전자의 숙주 염색체 사본 12로 형질전환된 숙주세포 10을 이용한다. 숙주세포의 성장 또는 생존에 필수적인 생산물인 또 다른 염색체 유전자 14는 억제인자 단백질을 결합하는 작동유전자 16와 작동가능하게 결합된다(즉, 작동유전자 16의 통제하에 둔다). 플라스미드 15의 부재하에서, 억제인자가 염색체 작동유전자에 결합하여 필수유전자의 발현을 저지하게 되며, 유발자(inducer)의 존재하에서만 세포가 성장하게 된다. 억제인자 단백질의 결합부위를 포함하는 플라스미드의 후속 도입으로 염색체 작동유전자와 떨어져 있는 억제인자 단백질이 적정되어 필수유전자가 발현된다. 따라서, 유발자의 부재하에서는 플라스미드를 포함하는 세포들만이 성장하게 된다. 이는 플라스미드상에 존재하는 작동유전자 서열이 플라스미드가 억제인자를 적정하게 하므로써 염색체 작동유전자에 결합하는데 이용할 수 있는 억제인자 분자들을 제거하기 때문이다. 플라스미드 작동유전자 서열들에 의한 억제인자의 적정은 필수 염색체 유전자의 발현 및 플라스미드를 함유하는 세포들만의 성장을 고려해 둔 것이다. 억제인자가 고사본수로 합성되도록 숙주 균주가 설계된다면, 플라스미드는 더욱 큰 사본수로 보존될 것이다.

도 2에 도시된 바와같이, 플라스미드 15는 작동유전자 결합을 위한 서열 16, 복제기점 18 및 클로닝 부위 20만을 필요로 한다.

본 발명에 따른 유용한 억제인자/작동 유전자 시스템

본 발명은 어떤 트랜스-작용(trans-acting) 억제인자/작동 유전자 시스템으로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에서 기술된 억제인자 적정 시스템은 DNA 결합 서열에 대하여 충분한 친화성을 지닌 어떠한 억제인자도 포함할 수도 있어서 억제인자 적정 시스템은 필수 염색체 유전자의 발현을 방해할 수 있지만, 플라스미드-태생 DNA 결합 서열에 의해서도 적정될 수 있다.

억제인자에 의하여 억제되기 쉬운 필수 염색체 유전자는 억제인자와 결합하는 작동 유전자/프로모터의 조절하에 놓여진다는 점에서 억제되기가 쉽다. 또는 억제인자 결합 서열(즉, 작동 유전자)은 삽입되거나 그러한 방법으로 필수 유전자의 원래의 프로모터와 결합하기 때문에 억제되기가 쉬워 억제인자에 의해서 결합이 될때 전사를 방해할 수 있다. 그러나 억제인자의 결합이 없을 때 필수 유전자의 전사를 개시하는 원래의 프로모터의 능력은 방해받지 않는다.

하나 이상의 상이한 필수 유전자, 예를들면 두개 또는 세개의 유전자가 염색체에 존재할 수 있는데, 각각의 유전자가 작동유전자 서열에 기능적으로 연결되어 있어서 억제인자에 의해서 쉽게 억제될 수 있다. 염색체에 존재하는 억제인자에 민감한 상이한 필수유전자들은 염색체에서 상이한 부위들에 존재하는 것이 바람직하며, 이는 필수 염색체 유전자의 억제를 감소시키는 돌연변이 또는 결실을 통하여 플라스미드의 안정성을 감소시키는 가능성을 감소시키게 된다.

억제인자는 염색체 유전자에 의해서 암호화된다. 본 발명에 따르면, 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 하나, 둘 또는 세개의 염색체 억제인자 유전자의 사본이 숙주 세포내에 존재한다. 염색체 억제인자 유전자는 변형되지 않는 자연적으로 발생하는 유전자이거나 상응하는 작동유전자에 결합하는 강도에 대하여 더 높거나 더낮은 친화성을 지닌 억제인자 분자를 제공하는 유전학적 돌연변이를 포함할 수도 있다. 그러한 돌연변이는 선행기술에 공지되어 있는데 예를 들어, lac 억제인자의 그의 작동유전자에 대한 친화성은 단일 아미노산의 변화에 의해 강화될 수 있다(베트츠, (1986) 유전자, 42, 283-392 그리고 쿠리 등., (1991) J. 분자생물학 219, 623-634를 참조). 선택적으로는, 다소의 작동유전자 결합부위의 사본들이 플라스미드에 도입될 수 있거나 또는 다소의 억제인자 유전자의 사본들이 염색체상에 또는 플라스미드에 운반된 선택적인 임바디먼트(embodiment) 내에 도입될 수 있다.

선택적으로는, 프로모터, 증폭제 등과 같은 억제인자 유전자의 발현을 개시하는 서열들이 고분자수 또는 저분자수의 억제인자 분자가 세포내에서 만들어지도록 돌연변이되거나 유전학적으로 설계될 수 있다. 예를들어, LacI 억제인자의 사본 수는 LacIq 돌연변이의 도입으로 증가될 수 있다(칼로스(1978) 네이쳐 274, 762-765 참조). 세포에 존재하는 억제인자 분자들의 수는 상응하는 작동유전자 서열을 지닌 플라스미드의 사본수와 관련이 있다. 본 발명의 억제인자 적정 시스템에 따르면, 숙주 세포에 존재하는 억제인자의 농도는 플라스미드가 존재하지 않는 경우에 목적하는 필수 유전자는 발현되지 않지만, 플라스미드가 존재하는 경우에 억제인자는 필수 유전자에서 멀리 적정된다. 하나 이상의 억제인자 유전자의 사본, 예를들면 둘 또는 세개의 억제인자 유전자의 사본들이 염색체에 존재하는 경우에, 세포 내에서 만들어진 억제인자 단백질의 양은 하나의 유전자의 존재에 비례해서 증가할 것이다 ; 이러한 증가는 상응하는 플라스미드 복제기점을 선택할때와 세포내에 존재하는 염색체 작동유전자/필수 유전자의 수를 선텍할때에 고려된다.

작동유전자의 강도와 억제인자의 친화성은 사본수가 다른 플라스미드로 사용할 수 있는 시스템에 맞춰지도록 변경될 수 있다. 예를 들어, lac 오페론의 억제정도는 최적으로 놓여진 보조적이고 이상적인 Lac 작동유전자(예를들어, 강화된 억제인자 친화력을 지닌 lac 작동유전자) 또는 프로모터내의 이상적인 작동유전자의 도입에 의해서 강화될 수 있다(뮬러 등, (1996) 분자생물학, 257, 21-29 그리고 루이스등, (1996) 싸이언스 271, 1247-1254). 선택적으로는, 작동유전자의 강도는 비-이상적인 작동유전자의 도입, 최적이 아닌 작동유전자의 위치선정 또는 보조 작동유전자의 제거에 의해서 감소될 수 있었다(뮬러 등, (1996) 분자생물학, 257, 21-29 그리고 오에홀러 등. (1990) EMBO J. 219, 973-979). 예를들면, lac 억제인자의 그의 작동유전자에 대한 친화성은 단일 아미노산의 변화에 의해 강화될 수 있다(베르쯔, (1986) 유전자, 42, 281-292).

본 발명에 따른 유용한 억제인자 시스템은, 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다.E. colilac 억제인자는 Eds., J.L. 잉그라함 등, 1987 Amer. Soc. Micro., pp. 1444-1452, 그리고 딕슨 등, 1975, Science 187 : 27-35의 대장균과 살모넬라 티피뮤리움에서J. 베르퀴트의 "락토스 오페론"에 기술되어 있다. lac 오페론은 다음과 같이 조절된다. 비-유발 조건(글루코스상에서의 성장과 같은)하에서 LacI는 Lac 오페론의 작동유전자에 결합하고 β-갈락토시다제(LacZ), 락토스 페르미아제(LacY) 및 트랜스아세틸라제(LacA)의 전사를 방해하게 된다. 유발 조건(락토스상에서의 성장, IPTG, 비-대사 유사체의 첨가와 같은)하에서 억제인자는 더 이상 작동 유전자와 결합하지 않으며, 전사가 발생하게 된다. 오페론의 발현은 β-갈락토시다제의 분석애 의해 쉽게 발견된다. 본 발명에 따른 유용한 억제인자 시스템은 전술한 lac 억제인자 시스템과 진핵세포에서의 유전자 활성을 조절하는데 사용되는 테트(tet) 억제인자 시스템을 포함한다(고센 등, (1994) 생물공학에서의 현재의 의견, 5, 516-520.). 테트 억제인자 시스템은 효모, 딕티오스텔륨(dictiostelium), 식물세포 및 담배식물에 사용된다. 본 발명에 따른 유용한 다른 억제인자 시스템은 ArgRNV 억제인자 시스템이다(부르케 등., (1994) 분자 미생물학. 13, 609-618). 통상적으로 ArgR 억제인자는 아르기닌의 존재하에서 다만 작동유전자와 결합한다. 그러나, 돌연변이체 ArgRNV 억제인자는 아르기닌의 부재하에서 작동유전자와 결합하고 아르기닌의 존재하에서는 결합상태로 남아 있게 되며, 트랜스도미넌트 효과(transdominant effect)를 지닌다. 두개의 대칭적인 Arg 박스(boxes)를 가진 이상화된 ArgR 결합부위(작동유전자)는 필수 유전자에서 멀리 ArgRNV를 적정하기 위해서 목적하는 플라스미드로 설계될 수 있으며, 이 필수 유전자의 발현은 ArgR 결합 부위에 의하여 조절된다.

당업자는 주어진 프로토콜(protocol)에 적용될 수 있는 여기에서 기술된 억제인자-적정 시스템에 대해서 어떤 변형이 이루어질 수 있다는 것을 알게 될 것이다. 예를들면, 성장 배지가 작동유전자의 억제를 허용하기 보다는 유발하는 성분들을 함유하고 있고,성장하는 동안 유발조건이 바람직하지 않은 경우에, 작동유전자 돌연변이체 또는 억제인자 돌연변이체는 억제의 유발을 극복하고, 억제를 허용하는데 사용될 수 있다.

돌연변이체 억제인자의 하나의 에는 lac 억제인자의 Lac I 돌연변이체이다.Lac I 돌연변이체는 유발자에 결합할 수 있는 능력을 더 이상 지니고 있지 않는다. Lac I 돌연변이체들은, 예를들어 Lac I⁵돌연변이체들(베이루프, 1978, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY) 및 Asp 276∼Asn274와 같은 다른 돌연변이체들(창등, 1994, Biochem, 22:3607-3616)을 포함한다. 야생형(wild type)의 억제인자를 유발에 민감하지 않은 돌연변이체 억제인자로 대체하므로서, 억제인자는 성장하는 동안에 작동유전자에 결합할 수 있고 억제인자를 통상적으로 유발하는 조건하에서도 플라스미드는 숙주 세포내에서 보존된다.

E. colitrp 억제인자도 역시 본 발명에 따라서 유용하다(Eds., J.L. 잉그라함 등. 1987, Amer, Soc. Micro., pp. 1453-1472의 대장균 및 살모넬라 티피뮤리움에서 야노프스키 및 크래포드, "트립토판 오페론" 참고). trp 억제인자는 약 50개의 사본/세포로 존재하며, 억제인자 결합의 유발자로서 발효배지에 트립토판이 존재하는 것을 필요로 한다.E. coligalR 억제인자도 역시 본 발명에 따르면 유용하다("갈락토스 오페론", S. Adhya, 대장균 및 살모넬라 티피뮤리움. Eds., J.L. 잉그라함 등, 1987, Amer, Soc, Micro. pp. 1503-1512 참고).E. coliaraC 억제인자도 역시 본 발명에 따르면 유용하다("L-아라비노스 오페론", R. Schlief, 대장균 및 살모넬라 티피뮤리움. Eds., J.L. 잉그라함 등., 1987, Amer. Soc. Micro., pp. 1473-1481 ; 둔 등, 1984, Proc. Nat. Aca. Sci. 81 ; 5017-5020 참고). araC 억제인자는 아라비노스의 존재하에서 결합 친화력을 증가시킨다. 결국, λ 억제인자는 본 발명에 따라서 유용하다(분자 생물학에서 통상의 프로토콜로 람다 파지로의 도입, Eds. 아우수벨 등, 1994, 섹션 Ⅲ, Unit 1.9 ; 호츠스차일드등, 1986, cell 47(5) ; 807-816).

본 발명에 따른 유용한 플라스미드

본 발명은 숙주세포당 적어도 10개, 바람직하기로는 적어도 20∼100개, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 200∼500개의 플라스미드 사본들의 복제를 허용하는 플라스미드 복제기점을 가지고 유리하게 이용될 수 있다. 고사본수의 플라스미드(예를 들면, 200∼500개)로의 적정한 복제(예를 들면, 2∼50개)를 허용하는 복제 기점들은 고사본수의 플라스미드로의 적정한 복제가 억제인자 분자들을 쉽게 적정할 수 있다는 점에서 특히 유용하다. 물론, 만약에 원한다면, 세포당 1000∼2000개의 사본 만큼 많은 사본수를 지닌 플라스미드도 역시 사용될 수 있다.

저사본수(예를 들면, 10개 또는 그 이하의 사본)의 플라스미드는 사본수를 증가시키는 돌연변이 이후에 본 발명에 따라 가장 유리하게 이용될 수 있다(제이. 스코트, 1984, Microbial Reviews 48:1∼23). 빈번히 사용되는 복제기점들 중에서, pBR322(20개의 사본/세포)는 본 발명에 유용하고, pUC(200개의 사본/세포)가 바람직하다. 바람직하지는 않지만, 본 발명에 유용한 다른 플라스미드들은, 복제를 위한 플리스미드 암호화 단백질, 예를들면 pT181, FⅡ 및 FI 복제기점의 존재를 필요로 하는 것들이다.

대장균과 에스. 티피뮤리엄에서 본 발명에 따른 유용한 복제기점의 예는, 제한되는 것은 아니지만, pMB1(세포당 25개 또는 그 이상의 사본, 볼리바르 등, 1977, 유전자 2:95-113), ColE1(세포당 15개 또는 그 이상의 사본, 칸 등, 1979,Methods Enzymol. 68:268-280), p15A(세포당 약 15개의 사본, 창 등, 1978, J. 박테리올, 134:1141-1156) ; pSC101(세포당 약 6개의 사본, 스토리 등, 1982, 유전자 18:335-341) ; R6K(세포당 15개 이하의 사본, 칸 등, 1979, 상기와 동일한 문헌) ; R1 (온도에 의존하는 복제기점, 우홀린 등, 1983, 유전자 22:255-265) ; 람다 dv(잭슨등, 1972, Proc. Nat. Aca. Sci. 69:2904-2909)를 포함한다. 스타필로코쿠스(Staphylococcus)에 유용한 복제기점의 예는 pT181(세포당 약 20개의 사본, 제이. 스코트, 1984, Microbial Reviews 48:1-23) 이다. 전술한 복제기점들 중에서, pMB1, p15A 및 ColE1가 바람직하며, 그 이유는 이들 기점이 복제를 위한 플라스미드-암호화 단백질을 필요로 하지 않기 때문이다.

본 발명에 따른 유용한 숙주 세포

본 발명은 포유류와 곤충세포와 같은 동물세포, 식물세포, 효소와 같은 균류 및 대부분의 박테리아 균주, 예를들면 그람 양성 박테리아 균주 및 그람 음성 박테리아 균주를 포함하는 모든 세포 타입에 적용가능하며, 배지에서의 숙주세포대에서 고사본수로 보존될 수 있는 플라스미드를 제공하게 된다.

본 발명에 따른 유용한 그람 음성 박테리아는, 제한되는 것은 아니지만,E. coli및 살모넬라, 예를들면 에스. 티피뮤리움을 포함한다.

본 발명에 따른 유용한 그람 양성종, 제한되는 것은 아니지만, 고사본수의 플라스미드가 이미 존재하는 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 락토코쿠스(Lactococcus)를 포함한다. 락토코쿠스에 있어서 본 발명에 따른 유용한플라스미드의 예는 pNZ2123 및 PIL253 이다(시몬 등, Biochimie 70:559, 1988). 락토코칼 락토스 오페론(lactococcal lactose operon)은 비정형(heterologous) 단백질의 발현을 조절하는데 사용된다(웰스 등, 1993. 분자미생물학 8(6) : 1155-1162). 이 오페론을 lacR 억제인자(반 루이젠 등, J. Biol. chem. 265:18499-l8503, 1990)를 T7 폴리머라제의 발현을 조절하는데 사용하므로써 비정형 단백질의 발현을 조절하게 된다. 바실러스(Bacillus)에 있어서 본 발명에 따른 유용한 플라스미드의 예는 pC194, pUB110 및 pT181 이다.

예를 들면, 비. 서브틸리스(B. Subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus)에서 λ 억제인자는 비정형 단백질의 발현을 조절하는데 사용되어 왔다. λ억제인자는 sak42D 프로모터의 통제 하에 배열되고, 이는 비.서브틸리스(B. Subtilis)에서 효율적으로 전사될 수 있다(브레이틀링 등, 1990, 유전자 93(1) : 35-40).

고사본수의 플라스미드가 효모내에서 보존되기 때문에, 효모는 본 발명에 따른 유용할 것이다. 그러한 플라스미드의 예는 세포당 사본수가 약 100에 이르는 YRp 플라스미드(독립적으로 복제하는 서열(ARS)에 기초함) 및 세포당 사본수가 50-100인 YEp 플라스미드(2 마이크론 써클(micron circle)에 기초함)를 포함한다(참고 시코르스키, "Extrachromasomal cloning vecters of Saccharomyces cerevisiae" in plasmids, A Practical Approach, Ed. K.G. Hardy, IRL Press, 1993 ; 및 효모 클로닝 벡터와 유전자, Section Ⅱ, UnIit 13.4, 분자생물학에서의 통상적인 프로토콜, 에드스. 아우수벨 등, 1994). 효모는E. colilacZ 유전자를 발현할 수 있으므로, 본 발명에 따라서 ura3 또는 leu2와 같은 필수 효모 유전자, 효모내에 플라스미드를 보존하기 위해 사용되는 유전자들의 발현을 조절하는 lac 억제인자 적정시스템을 사용하는 것이 고려되어진다(Gunge, 1983, Ann, Rev, Micro. 37:253-276).

본 발명에 따른 유용한 필수 유전자

본 발명은 플라스미드의 안정한 보존을 위해 많은 상이한 필수 염색체 숙주 유전자와 함께 사용될 수 있다. 이들 필수 유전자는, 제한되는 것은 아니지만, 다음의 카테고리들, 예를 들면 세포대사 산물의 생합성에 관련된 생산물을 암호화하는 유전자, 생산물이 탄소 대사와 관련 있는 유전자, 항생물질 내성을 암호화하는 유전자 및 예를들면 DNA 및/또는 RNA 합성 및 복제 기능에 필수적인 유전자와 같이 고분자의 생합성 또는 조절을 암호화하는 유전자를 포함한다.

1. 세포 구조의 성분의 합성에 관련된 생산물을 암호화하는 필수 유전자.

세포 성분의 공급, 특히 세포벽 전구물질의 공급과 관련된 효소를 암호화하는 어떤 유전자들도 역시 숙주세포 성장에 필수적이고 본 발명에 따르면 유용하다. 예를들어, 박테리아 세포벽은 메조-디아미오피멜리산(DAP)을 포함하고 있으며, 이 성분을 합성할 수 없어 세포용해의 결과를 가져오게 된다. asd 유전자(아스파르테이트 β-세미알데히드 디하이드로게나제) 또는 dapD 유전자(숙시닐 디아미노피멜레이트 아미노전이효소)가 결실된 돌연변이체는 플라스미드상에 그의 완전한 유전자 사본을 운반하는 플라스미드들을 보존하기 위해 사용될 수 있다(나카야마 등, Bio/technology 6:693-697, 1988 ; 디그리세, 미합중국 특허 제5,198,343호). DAP 생합성 경로에서 많은 다른 유전자들, 즉 dapA, dapB, dapC 및 dapE 유전자들 또한 사용될 수 있다. dapA 및 dapB는 클론화되고 서열화되며, dapB는 단일 시스트론으로서 유용하다(리샤우드 등, J. Bacteriol. 166:297-300, 1986 ; 부비에 등, J. Biol. chem. 259:14829-14834, 1984). D-알라닌 생합성과 같은, 다른 세포벽 성분의 생합성에 관련된 유전자들도 역시 본 발명에 따라 유용하다(왈쉬, 1989, J. Biol. chem. 264(5):2393-2396). D-알라닌의 성분을 암호화하는 DNA 서열은 항생물질을 사용하지 않는 플라스미드의 안정화에 사용된다(EP 85/309020호 참조).

본 발명은 그러한 유전자와 관련하여 억제인자 적정을 사용하는 것을 고려하였다. 목적하는 유전자는 우선 숙주 균주로부터 제거되고 숙주는 상기 유전자의 생산물을 위한 필요조건을 가지게 된다(위난스 등, 1985, J. Bact. 161(3) : 1219 - 1221 ; 쟈신 등, 1984, J. Bact. 159(2) : 783-786). 이어서, 유전자의 사본은 종래의 클로닝 기술에 의해서 구조화 되어서 그의 발현은 선택된 억제인자 단백질을 결합하는 프로모터/작동유전자에 의해서 행해진다. 이어서, 이 구조물(construct)은 억제인자 단백질을 합성하는 숙주 균주의 염색체내로 도입된다(위난스 등, 1985, J. Bact. 161(3) : 1219∼1221 : 쟈신 등, 1984, J. 2 Bact. 159(2):783-786). 서열과 결합하는 억제인자를 포함하는 플라스미드에 의한 균주의 형질전환으로 생합성 유전자로부터 멀리 억제인자의 적정이 되게 하며, 필수 운전자의 발현을 가능케 한다.

2. 세포성장에 필수적인 유전자들

본 발명의 억제인자-적정방법은 탄소원(carbon source)의 이용과 관련된 유전자들을 가지고 사용될 수 있다. 특히, 여기에서 기술된 바와 같이, 본 방법은 락토스 오페론 및 유일한 탄소원으로서 락토스를 활용하여 사용될 수 있다. 다른 변형들이 당업자들에게는 명백할 것이다. 존재하는 lac 억제인자의 돌연변이체는 더이상 유발자(알로락토스)와 결합할 수 없고 통상적인 유발조건하에서 lac 작동유전자와 결합한 상태로 남아있게 된다. 이들은 lac I⁵돌연변이체에 의하여 유형화된다 ; 그러나 존재하는 다른 돌연변이체는 유발자와 결합할 수 있는 능력은 없지만 다른 모든 기능들에서는 정상이다(창 등, 바이오켐. 33:3607-3616(1994)). 이들 돌연변이체를 운반하는 균주들은 lac 오페론의 유전자를 발현할 수 없으므로 유일한 탄소원으로서 락토스와 함께 성장할 수 없다. 야생형 lac 작동 유전자 서열을 지닌 고사본수의 플라스미드에 의한 그러한 균주의 형질전환은 lac 오페론으로부터 멀리 억제인자를 적정하고 락토스상에서의 성장을 허락할 것이다.

글루타민 합성효소(synthetase)는 NSO 미엘로마 세포라인(NSO myeloma cell line)과 같은 진핵 세포에 필수적인 유전자이고(베빙톤 등, (1992) 바이오/테크놀로지 10, 169-175) 숙주세포가 진핵세포일 때 사용되는 것이 더 바람직하다.

3. 핵산의 합성을 암호화하는 유전자

본 발명은 또한 DNA 및/또는 RNA 합성 또는 숙주세포의 복제 단백질을 암호화하는 필수 유전자와 관련하여 사용될 수 있다. 대장균과 살모넬라와 같은 박테리아에서의 필수적인 기능들과 관련된 그러한 유전자들의 예는 맥매켄 등에 의해서 제공되며(E. coli및 살모넬라 티피뮤리움에서, 세포생물학 및 분자생물학, 에드, 네이드하르트 등, Amer. Soc. Micro., Wash. D.C., 1987, pp. 564-612), 제한되는 것은 아니지만, 다음의 유전자들을 포함한다 : dnaA, dnaB, dnaC, ssb, dnaG,polC(dnaE), dnaQ (mutD) dnaN, dnaZX, gyrA, gyrB, polA, lig, dnaT, rpoA, rpoB, rpoC 및 rpoD.

4. 항생물질 내성을 암호화하는 유전자

본 발명은 또한 항생물질 내성파 관련하여 사용될 수 있다. 내성 유전자는 그의 발현이 원하는 억제인자 단백질과 결합하는 프로모터/작동유전자의 통제하에 있도록 구조화 된다. 이어서 이 구조물은 숙주균주의 염색체내로 삽입된다. 억제인자 결합 서열을 포함하는 플라스미드에 의한 균주의 형질전환은 항생물질 내성유전자로부터 억제인자를 적정할 것이고 발현을 허용하며 따라서 항생물질 존재하에서의 성장을 허용하게 된다. 항생물질 내성 유전자는 유용한 선택성 마커이므로 일정비율이 증가된(scale-up) 효모 방법에 사용되는 항생물질로부터 멀리 플라스미드 생산물을 정제하려는 의도였다 하더라도 본 발명의 실시자들은 숙주의 필수 유전자로서 항생물질 내성을 선택할지도 모른다.

실시예 I에서, 본 발명은 염색체 유전자로부터 멀리 억제인자를 적정하는 플라스미드 태생 서열들의 능력을 증명하는 실험에서 lac 억제인자/작동유전자 시스템을 사용하면서 적용된다.

실시예 I

E. coli균주 DH1(하나한(Hanahan), J. Molec. Biol. 166:577∼580, 1983)은 락토스 억제인자 단백질(Lac I)에 위해 조절되기 쉬운 완전한 락토스 오페론을 소유한다. Lac I 는 세포당 10∼20개의 사본으로 존재하고 높은 친화성(kd 1×10-14)으로 결합한다.

E. coliDH1은 pUC18tet로 형질전환되었다(세포당 약 100∼200개의 사본으로 존재하는 암피실린(ampicillin)과 테트라사이클린(tetracycline) 내성 유전자들을 함유하는 플라스미드에 근거한 pUC18). pUC18tet는 lac 작동유전자/프로모터를 함유하지만 억제인자 단백질을 암호화하는 Lac I 유전자를 함유하지는 않는다. 플라스미드는 또한 치료 유전자의 삽입을 위한 폴리링커(또는 다중 클로닝 부위)와 pUC 복제기점을 포함한다. 암피실린과 테트라사이클린 저항이 암호화된 플라스미드는 억제인자 적정에 불필요하고 항생물질 내성이 전혀 없는 플라스미드는 본 발명에 따라 바람직하며, pUC18tet로 쉽게 치환될 수 있다.

DH1 및 DH1:pUC18tet는 필요한 경우 암피실린(50㎍/㎖)이 추가된 탄소원으로서 락토스(10mM) 또는 글루코스(10mM)가 있는 M9 최소 염 배지상에서 성장하였다. 세포들은 로그 성장(log growth) 동안에 회수되었고 β-갈락토시다제 활성으로 분석되었다(밀러, 1972, 분자유전학 실험, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY). 표 1에 나타낸 바와 같이, 비교되는 β-갈락토시다제 활성이 글루코스 및 락토스상에서 성장된 DH1 : pUC18tet에서 관찰되었으며, 반면에 락토스와 비교되는 글루코스상에서 성장된 DH1에서 상당히 더 낮은 활성이 관찰되었다. 그러므로, 플라스미드의 존재는 β-갈락토시다제의 발현을 허용하면서 lac 오페론으로부터 멀리 lac 억제인자를 적정하게 된다.

표 1

유발조건 및 비-유발 조건하에서 성장할때 pUC18tet의 존재 또는 부재 하에서E. coliDH1에서의 β-갈락토시다제의 발현.

상기 결과들은 세개의 독립된 실험의 결과이며, 각 실험에서 DH1이 성장한 락토스에 대해서 얻어진 값을 유니트와 퍼센트로서 나타내었다.

실시예 2

억제인자 적정의 증명

E. coli균주 Hfr 3000 YA 694(CGSC 6378)lac1694,relA1,spoT1,thi-1, λ는 EMB 한천에 플레이트되어 밤새도록 성장하여, 균주가 락토스를 발효할 수 없고 예를 들면 민감하지 않은 유발자인 억제인자를 암호화하는 lac I⁵게노타입(genotype)을 포함하는 것을 나타내는 핑크 콜로니가 나타났다(위손 등,(1964) J. 분자생물학, 8:582). 단일 콜로니가 성장하였고 형질전환에 적당하였다. 이어서, 이 균주는 pUC18(lac 작동유전자를 포함하며, 상기에서 언급됨)로 형질전환되었고 암피실린을 포함하는 EMB 한천에 플레이트되었다. 결과물인 콜로니는 β-갈락토시다제 유전자의 발현을 허용하는 lac 오페론으로부터 멀리 적정되는 lac I⁵억제인자의 결과로서 락토스가 발효되었다는 것을 지적하는 블랙이었다. 단일 콜로니를 5㎖의 LB 암피실린에 접종하였으며 미드로그(mid log)로 성장하여 β-갈락토시다제의 활성을 나타내었다.

pUC18로 형질전환되지 않고 형질전환된E. coli균주 Hfr 3000 YA694는 적용가능한 경우 암피실린으로 보충된 유일한 탄소원으로서 락토스 또는 글루코스를 함유한 최소 배지상에 플레이트 되었다. pUC18의 도입은 락토스상에서 성장하는 능력으로 귀착됨을 도 3에서 관찰할 수 있다.

실시예 3

억제인자 적정에 의한 플라스미드 보존의 증명.

pUC18을 포함하는E. coli균주 YA694를 글루코스(0.1g/ℓ), 암피실린(50㎍/㎖) 및 티아민(0.5g/ℓ)이 보충된 5㎖의 M9 최소배지에 접종하였고, 14시간 동안 37℃에서 성장하였다. 이어서, 이 배양물의 0.5㎖를 다음에 따로따로 접종하였다 :

(1) 글루코스가 보충된 M9배지 100㎖,

(2) 락토스가 보충된 M9 배지 100㎖,

(3) 락토스와 암피실린이 보충된 M9배지 100㎖.

이어서, 배양물은 37℃에서 약 8시간동안 성장하였다. 성장기간 내에 OD600 측정을 하였다. 성장기간의 후반에 2 0D 유니트가 제거, 회수 및 동결되었다. 이어서, 각 배양물의 0.5㎖가 100㎖의 신선한 각각의 배지에 접종되고 14시간 더 동안 성장하였다. 그런 다음 적당한 시점에서 취해진 샘플들로 약 72세대의 성장을 이루기 위해 공정을 반복하였다.

플라스미드 DNA는 그후에 EcoR I 로 분해된 회수된 세포로부터 분리되었고 겔 전기영동에 의하여 분석되었다. 결과는 72세대의 성장이 발생한 후에 플라스미드가 글루코스 단독에서 성장한 세포에서 보다 락토스 단독에서 성장한 세포에서 더 높은 특별한 수율로 존재한다는 것을 나타내었다(도 4). 이는 락토스를 신진대사시키기 위해서 β갈락토시다제의 생성에 의존하는 성장에 의해서, β갈락토시다제 유전자의 발현을 허용하는 플라스미드가 선택적으로 보존된다는 것을 증명하였다.

실시예 4

선택적인 억제인자의 증명

억제인자 적정 시스템에서 사용될 수 있는 억제인자로서 작용하는 돌연변이체 억제인자 ArgRNV의 능력이 연구되었다. 유전학적으로 설계된 ArgR의 돌연변이체인 ArgRNV(부르케 등, 1994, 분자생물학. 13(4), 609-618)는 아르기닌의 부재일지라도 아르기닌 생합성 유전자의 프로모터내와 DNA 결합부위에 결합한 채로 남아있게 된다. 다중 사본 플라스미드상의 ArgRNV 유전자에 의한E. coli균주 DS997과 DS998의 형질전환은 최소배지에서의 성장을 방해하는 것으로 나타났다(부르케등,1994, 분자생물학. 13(4), 609-618). 따라서, 억제인자는 트랜스도미넌스(transdominance)를 나타낸다. 고사본수 플라스미드상에 암호화된 ArgRNV로 형질전환된E. coliDH1으로 실험을 반복하였고(pSelect, 프로메가(Promega)) 최소배지에서의 후속 성장은 억제인자 적정 시스템에서 사용된 억제인자의 능력을 증명하는 아르기닌의 존재하에서만 발생되었다.

ArgRNV 유전자는 DH1의 염색체내에 배치될 수 있으며, 최소배지에서의 성장을 방해하는 능력이 관찰되었다. 아르기닌 생합성 유전자 또는 Arg 작동유전자에 기능적으로 결합되어 있는 필수유전자로 부터 멀리 ArgRNV를 적정하는 ArgR 결합부위를 지니는 플라스미드의 능력이 관찰될 수 있다.

실시예 5

lacZ 카나마이신 융합의 발생

lac 작동유전자/프로모터의 통제하에서 필수 유전자의 모델로서 사용되는 lacZ 유전자와 카나마이신 유전자의 N-말단 영역의 인프레임(inframe) 융합은 다음의 방법에 따라서 구성되었다(가나마이신 유전자는 어떤 필수 유전자로 대체가능하다). 카나마이신 카세트는 Xho I 과 Pst I 로 분해되어 pUC4K(파마시아 바이오테크 회사제)로부터 제거되었으며, 이는 SaⅡ과 pstl로 분해된 pUC18에 연결되었다. 이는 카나마이신 유전자로 lacZ 유전자의 기능성 인프레임(in frame) 융합물을 만들었으며, 따라서 카나마이신 내성의 발현은 lac 작동유전자 프로모터의 통제하에서 이루어졌다.

lac/카나마이신 구조물은 HaeⅡ로 분해되어 분리되고, 블런트되었으며, styI로 분해되고, 블런트된 pN1에 연결되었다 pN1은dif로커스를 둘러싸고 있는 5.5kb의E. coli염색체 DNA를 포함하는 pUC18 기초 플라스미드이다(레슬리 등, 1995, EMBO J., 14, 1561-1570). pN1의dif로커스로의 lac/카나마이신의 삽입은 원하는E. coli숙주의 염색체내로의 구조물의 재조합을 가능케 한다. 결과로서 얻어진 플라스미드는 SaⅡ로 선형화되고,E. coliJC7623의 형질전환에 사용되며(위난스등, 1985, J. Bact.,161(3)1219-1211), 카나마이신 + IPTG 플레이트상에서 선택되었다.

카나마이신 내성 클론은 카나마이신 존재 하에서의 IPTG 성장 유발가능성(도 5), 플라스미드의 손실 및 염색체로의 구조물 삽입에 대해서 서던(southern) 분석에 의해 테스트되었다.

이어서, 구조물은 P1 형질도입 방법에 의하여 JC7623의 염색체로부터 DH1의 염색체내로 전이되었다. 결과로서 얻은 DH1 lac/kan 균주는dif로커스내의 구조물 존재와 카나마이신 내성의 유발가능성에 대하여 서던 분석법에 의해 분석되었다(도 6). pUC18Tet에 의한 DH1 lacZ-kan의 형질감염은 카나마이신 내성 유전자를 위한 억제인자의 적정을 예시하는 IPTG 없이 카나마이신내에서의 성장을 초래한다. 따라서 이는 카나마이신 존재하에서의 플라스미드 보존을 위한 숙주세포의 적합성을 예시한 것이다.

DH1 lac/kan 균주는 lac 작동유전자(pUC18, pUC18Tet 및 이들로부터 유도된 더 큰 플라스미드)를 소유하는 다수의 플라스미드들로 형질전환 되었으며, 다음에 대하여 테스트 되었다 :

1. 비-유발조건 하에서 카나마이신(60㎍/㎖)을 포함하는 배지상에서의 성장;

2. 억제인자 적정시스템에 의한 뱃치 성장동안의 플라스미드의 유지.

lac/카나마이신 구조물로부터 멀리 lac 억제인자의 적정이 증명되었고, 뱃치 성장 동안의 플라스미드의 보존도 역시 증명되었다.

실시예 6

lacZdapD 융합구조물의 구조와E. coliDH1 dapD-균주의dif로커스로의 삼입은 lac 작동유전자/프로모터의 통제 하에서 필수 유전자를 제공하기 위하여 이루어졌다.

lacZdapD 융합물의 구조

dapD 유전자는 EcoR I 부위가 설계된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 DH1으로부터 클론화되었다. PCR 생성물은 EcoR I 로 분해되고, EcoR I 로 분해된 pUC18에 연결되었다. 결과로서 얻은 플라스미드(pUC18dapD)는E. coli균주 AT982(dapD4. thil, relA1, λ-, spoT1)을 형질전환하는데 사용되었으며, dapD 유전자가 클론화 되었음을 증명하는 dapD 돌연변이에 상보적임을 보여주었다. pUC18의 lacZ 유전자와 dapD 유전자의 융합은 pUC18dapD와 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의하여 안출되었다 :

EcoR I 에 의한 분해 및 EcoR I 로 분해된 pUC18내로의 연결을 lacZ 유전자와 dapD 유전자간에 인프레임 융합물을 만들어내었다. 이 구조물(pUC18dapD2)은 형질전환 후에 AT982의 성장회복에 의하여 다시 기능성이 있는 것으로 나타났다.

lac/dapD 융합물은 HaeⅡ 단편으로 분리되고, 블런트되며,styl로 분해된 PN1으로 연결된 후애 블런트되었다. 이 플라스미드(pN1 dap D2)는 균주 AT982에서 dapD 돌연변이에 상보적이었다.

당업자들에게는 분명하듯이, 예를들면, 다양한 콘트롤 서열에 대한 변형이 구조물에 대해서 이루어질 수가 있다.

WT DH1 dap D 유전자의 불활성화

DH1 염색체로의lacZdapD 융합물의 삽입 전에 WT 유전자의 발현이 우선 불활성화 되었다.dapD 유전자는 더욱 효율적인 재조합이 가능하도록 다음의 올리고 뉴클레오티드를 사용하여dapD 유전자에 DNA5'과 3'의 더 큰 단편으로 PCR에 의하여 재클론화되었다 ;

결과로서 얻은 PCR 생성물은 EcoR I로 분해되고PstI 부위가 결심된 pUC18에 연결되었다. 결과로서 생성된 플라스미드(pUC18 dapD3)는 AT982에서의 dapD 돌연변이에 상보적이다.dapD 유전자는dapD 유전자내에 위치한 Pst I 부위내로 pUC4K의 카나마이신 카셋트를 도입하므로써 삽입 불활성화 되었다. 이 플라스미드(pUC18dapDkan)는 AT982에서의 dapD 돌연변이에 더 이상 상보적이지 아니하다. 구조물은BamH I에 의한 분해에 의하여 선형화된 pUC18dapDkan으로 형질전환된E. coliJC7623의 염색체내로 도입되었다. 클론들은 보충된 디아미노피멜레이트의 부재하에서는 성장능력이 없지만, 카나마이신의 존재하에서는 성장능력이 있는 것으로 스크리닝되었다. dapD 유전자내의 카나마이신 유전자의 존재는 서던 분석에 의하여 확인되었다. 불활성화 dapD 유전자는 P1 형질도입애 의하여 DH1의 염색체로 전이되어 DH1 dapDkan을 생산하게 된다.

lacZdapD 구조물은 Sca I 로 선형화된 pN1dapD2를 이용한 형질전환에 의해 JC7623 dapDkan의 염색체내로 도입되었다. 클론들은 분리되고 디아미노피멜레이트의 부재하에서 IPTG 성장 유발이 증명되었다(도 7).

그후에, lac/dapD 융합물은 P1 형질도입에 의하여 DH1dapDkan내로 도입되고, 서던 분석에 의하여 확인된dif로커스내에서 이의 위치와 IPTG 성장유발에 대하여 스크리닝되었다.

DH1 dapDkan-lacdapD 균주는 lac 작동유전자(pUC18Tet)를 소유하는 플라스미드로 형질전환되었으며 다음의 특성들이 증명되었다 :

1. lac/dapD 구조물로부터 멀리 lac 억제인자의 적정을 증명하는, 비-유발조건하에서의 디아미노피멜레이트가 결핍된 배지상에서 : DH1 dapDkan-lacdapD-pUC18 Tet의 성장 ;

2. 플라스미드의 보존은 뱃치 성장 동안에 테스트 되었으며, 플라스미드 수율은 테트라사이클린의 존재(즉, 항생물질 내성 유전자에 의하여 플라스미드를 선택하기 위해서)하에서 성장된 세포들 및 유발자(IPTG)의 존재(즉, 플라스미드의 보존이 필요치 않은 조건)하에서 성장된 세포들과 비교했다.

테트라사이클린의 부재하에서 플라스미드의 특별한 수율은 테트라사이클린의 존재하에서 관찰된 수율에 필적하므로, 이는 항생물질의 부재하에서의 플라스미드의 선택적인 보존을 증명하는 것이다. 상기 양쪽 경우에 있어서, 수율은 유발자의 존재하에서 성장된 세포들에서 보다 상당히 컸다.

실시예 7

본 발명에 따라서 숙주세포내에 안정하게 보존된 플라스미드 DNA는 다음과 같이 분리된다. 세포들은 분해되고 플라스미드 DNA는 당분야에 잘 알려진 방법들에 의해서 정제되었다(브린보임 등, 1979, NAR 7 : 1513-1523 및 번보임, 1983, Methods Enzymol. 150 : 243-255, 또는 퀴아겐 플라스미드, 미니, 맥시 또는 메가킷트 사용(퀴아겐, Chatsworth, CA). 100mg 또는 그 이상의 플라스미드 DNA의 대규모 정제를 위해서 혼 등, 1995, 사람의 유전자치료 6 : 565-573 참고.

실시예 8

재조합 단백질을 암호화하는 목적하는 유전자자 플라스미드상에 운반되어 숙주세포 조절서열(즉, 최소한 숙주세포내에서 기능을 하는 프로모터)의 통제 하에 있게 되는 경우, 재조합 단백질은 세포성장 동안에 생산될 수 있으며, 이어서 다음과 같은 당업계에서 공지된 방법에 따라서 분리된다.

E. coli내에서의 재조합 단백질의 생산과 정제는 다음의 참고문헌들에 기술된 바와 같이 수행된다. 다스, 1990, "Overproduction of Proteins inE. coli: Vectors, host and Strategies", Methods in Enzymol. 182 : 93-112 , 마스톤 등, 1990, "Solubilization of protein aggregates", Methods in Enzymol. 182 : 264-276 ; 및 타처 등, 1994, "Protein folding in biotechnology", in Mechanisms of Protein Folding. Ed. R.H. Pain, Frontiers in Molecular Biology Series, IRL Press, Oxford University. UK.

E. coli내에서의 가용성 및/또는 주변세포질(periplasmic) 재조합 단백질의 생산과 정제는 다음의 참고문헌들에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 하트 등, 1994, 바이오/테크놀러지 11 : 1113-1117 ; 스케인, 1989, 바이오/테크놀러지 7 : 1141-1149 ; 및 라발리 등, 1993, Bio/Technology 11 : 187-193.

에스. 세레비지에(S. cerevisiae)내에서의 재조합 단백질의 생산과 정제는 다음의 참고문헌에 기술된 바에 따라서 수행될 수 있다 : 로마노스 등, 1992, "Foreign gene expression in yeast ; a review", in Yeast 8 : 423-488.

효모 피치아(phichia) 패스토리스(pastoris)내에서의 재조합 단백질의 생산과 정제는 다음의 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다 : 스릭크리슈나 등, 1989. 생화학 28 : 4117 - 4125.

포유동물세포내에서의 재조합 단백질의 생산과 정제는 다음의 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다 : 레프, 1993, Curr. Opin. Biotech., 4, 573-576 또는 in Cartwright, 1994, Animal cells as Bioreactors, Cambridge studies inBiotechnology, 11, 캠브리지 대학교 출판부.

용도와 투여

본 발명에 따라서 생산된 플라스미드 DNA는 플라스미드가 치료 유전자를 함유하는 경우에 유전자 치료에 유용하다. 치료 유전자는 포유류, 바람직하게는 사람의 세포내에서 발현가능한 것이며, 포유동물, 바람직하게는 인간에게 치료적 잇점이 있는 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 것이다. 이러한 유전자들의 예는 당분야에 잘 알려져 있으며. 제한되지는 않지만, β-글루코세레브로시다제 유전자들 브루톤스 티미딘 키나제 유전자들 TNF, 인터로이킨 1-12, 인터페론(α, β, γ), Fc 수용체 및 T-세포 수용체와 같은 시토킨을 암호화하는 유전자들을 포함한다. 다른 예로는 천연단백질의 경쟁적 억제인자로서 역할을 하는 TAT 또는 REV 돌연변이체와 같은, HIV의 억제인자를 암호화하는 유전자들을 포함한다. 또한, 플라스미드 DNA는 약물 내성 유전자와 같은 마커유전자, β-갈락토시다제 유전자, 디하이드로포레이트 리덕타제 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 포함할 수 있다.

치료 유전자가 결손 유전자의 대체 또는 잠재적으로 유리한 부가적인 유전자 기능과 같이 생리학적으로 중요한 생성물을 암호화하는 경우, 생체내 또는 생체외에서의 이러한 DNA의 사용은 세포들의 장기간 유전자 변형을 부여하며, 질병의 치료에 효과적일 것으로 기대가 된다. 치료 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA는 생체내 또는 생체외 유전자 치료에 있어서 비루스성 또는 비-비루스성 방법에 의하여 투여된다. 투여방법은 본 발명에서는 중요치 않으며, 네이키드(naked) DNA의 투여를 위한 유전자총의 사용, 예를 들어 리포좀/항체 콤플렉스와 비루스성 벡터를 사용하는 수용체 중개 유전자 치료법을 포함할 수 있다.

예를들면, 비루스성 또는 유전자 질병에 걸린 환자는 생체내 또는 생체외 방법을 통하여 본 발명에 따라서 치료될 수 있다. 예를들면, 생체내 치료방법에 있어서 본 발명의 플라스미드 DNA는, 바람직하게는 생물학적 친화성 용액 또는 약학적으로 허용가능한 운반 부형제 상태로 섭식, 주사, 흡입 또는 어떤 다른 방법들에 의하여 환자에게 투여될 수 있다.

투여량은 환자에 따라 달라질 수 있으며 "치료학적으로 유효량"은 어떤 위험 또는 해로운 부수적인 효과들에 대하여 균형이 잡힌 전이된 유전자 물질의 기능 향상의 수준에 의해 결정될 수 있다. 유전자 도입수준, 유전자 발현 및/또는 암호화된 생성물의 존재 또는 수준의 모니터는 투여량의 선택 및 조절에 도움을 줄 수 있다. 일반적으로, 운반 부형제를 포함하는 조성물은 체중 kg당 10ng∼100㎍, 바람직하게는 체중 kg당 100ng∼10㎍의 범위로 단일양으로 투여되며, 따라서 적어도 하나의 치료 유전자의 사본(copy)이 각각의 타겟 세포에 전달된다.

생체외 치료 방법도 역시 본 발명의 범위내에서 예측된다. 세포 집단은 환자로부터 제거될 수 있거나 또는 그렇지 않으면, 본 발명에 따르는 치료 유전자를 포함하는 플라스미드에 의하여 형질도입된 후 환자에 다시 도입될 수도 있다.

본 발명에 따라서 생체외 유전자 전이를 위해 타겟이 된 세포들은 치료 유전자의 운반이 요구되는 세포들, 예를들면, T-세포, B-세포 및 마크로파아지와 같은 면역시스템의 세포들, 조혈세포 및 수지상 세포들을 포함한다. 확립된 기술을 사용하여, 간(stem)세포들은 영양강화 과정 후에 유전자 전이를 위해 사용될 수 있다. 선택적으로는, 비분리된 조혈세포와 간세포 집단은 여기에 설명된 바와 같이 DNA를 흡수하게 될 수도 있다.

사람의 유전자 질병의 치료를 위한 두 개의 대표적인 플라스미드가 아래에서 설명된다. 본 발명에 따르는 플라스미드는 X-연결된 β-글로불린혈증을 치료하는데 사용될 수 있다. 이 플라스미드는 여기에 설명된 최소 서열, 즉 박테리아 또는 효모 숙주세포에서의 복제를 위한 복제기점, 작동유전자 서열 및 치료 유전자의 삽입부위를 포함할 수 있다. 예를들면, pUC18tet 플라스미드는 최소 플라스미드, 바람직하게는 결실된 tet 유전자를 갖는 플라스미드로서 사용될 수 있다. 치료 유전자는 부르톤의 키나제 유전자일 수 있으며(베트리 등, 1993, Nature 361 : 226-233), 다음의 DNA 단편들상에서 운반되어, 당분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 함께 클론화된다. 부르톤의 티로신 키나제 사람의 유전자는 위치(+33)의 Pvu I 부위와 위치(+2126)의 HindⅢ 부위에 의하여 묘사된 2.1Kb 단편상에서 운반된다. 원한다면, PCT/GB88/00655에서 지적된 바와 같이, 플라스미드는 위치 독립적이고 조직특이성의 유전자 발현을 일으키는 서열도 포함할 수도 있다. 치료 유전자는 사람의 β 글로빈 로커스 스플라이스와 폴리 A 시그널부분, 즉, 엑손 2-IVSⅡ-엑손 3-폴리 A 서열을 포함하는 BamH I -Xba I 2.8Kb 3' 스플라이스/폴리 A 후랜킹(flanking) 서열을 포함할 수 있는 스플라이스(splice)부위와 폴리 A 꼬리를 암호화할 수도 있다.

플라스미드 DNA는 여기에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있고, 마텐슨 등, Eur. Jour. Immunol. 1987, 17:1499 ; 오까베 등, Eur. Jour. Immunol. 1912, 22 :37 ; 및 바네르지 등, cell 33 : 729, 1983에 기술된 바와 같이, 생체외치료를 위한 프리(pre)-B 세포내에 또는 생체내 유전자치료를 받는 환자에게 직접 구조물을 도입하고 X-연결 β-글로불린혈증으로 고생하고 있는 환자에게 형질감염된 프리-B 세포를 투여하므로써 X-연결 β-글로불린혈증을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따라서 제조된 플라스미드 DNA는 고오시에씨병을 치료하는데도 사용될 수 있다. 고오시에씨병은 두 개의 다른 유전자 돌연변이중의 하나로부터 유래한다. 고오시에씨병의 유형 1은 CCG …〉CAG 돌연변이이며, 이는 β-글루코세레브로시다제 폴리펩타이드의 119 위치에서 Arg …〉Gln 치환이 된다(Graves, DNA 7:521, 1988). 고오지에씨병의 유형 2는 CTG …〉CCG 돌연변이이며, 이는 β-글루코세레브로시다제 폴리펩타이드의 444 위치에서 Leu …〉 Pro 치환이 된다(Tsuji, NEJM 316 : 570, 1987).

야생형의 폴리펩타이드를 암호화하는 β-글루코세레브로시다제 유전자의 존재는 실질적으로 고오시에씨병을 고치는 것으로 여겨진다. 따라서, 호로위쯔 등, 1989, Genomics, 4 : 87-96에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따르는 유용한 다른 플라스미드는 여기에서 설명된 최소 요소들(즉, 복제기점, 작동유전자 서열 및 클로닝 부위) 및 라이소자임 유전자 프로모터 및 β-글루코세레브로시다제 트랜스유전자를 포함하는 것이다. 이 플라스미드는 다음과 같이 구성된다.

사람의 β-글루코세레브로시다제 유전자는, 호로위쯔 등이 개시한 바에 따라서, 엑손 1에서의 BamH I 부위로부터 폴리아데닐화부위의 EcoRV 부위 3'로 연장된 9722 염기쌍 단편상에서 운반된다. 이 단편은 엑손 2에서 해독 출발부(start)를 갖는, 11개 엑손과 모든 간섭서열들을 포함한다. 위치-독립적이고 조직-특이성 유전자 발현을 부여하는 서열은 구조물내에 포함될 수 있으며, 보니퍼 등 1990, Euro, Mol. Biol. Org. Jour. 9 ; 2843에 기술된 바와 같이 pⅢ.lyx 구조물의 11.8Kb Xho I-Sac I 단편상에서 운반된다.

플라스미드 DNA는 여기에 설명된 바와 같이 제조되며, 그후에 면역학과 세포 생물학, 1993, Vol. 71, 75∼78 페이지에 설명된 바와 같이, 생체내 치료를 위하여 숙주에 직접 도입시키거나, 또는 생체외 치료를 위하여 마크로파아지에 도입하고, 고오시에씨병을 앓는 환자에게 형질감염된 마크로파아지를 도입하므로써 고오시에씨병을 치료하는데 사용된다. 고오시에씨병을 앓는 환자의 야생형 트랜스유전자의 발현으로 질병을 고치게 된다.

다른 실시예

다른 실시예들은 당업자들에게는 분명할 수 있다. 전술한 상세한 설명은 명쾌한 이해를 위하여 제공되는 것이며 단지 예시적인 것에 불과한 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 상기 실시예들로 한정되는 것은 아니며, 다음의 청구범위에 의하여 한정된다.

Claims

E.coli lac억제인자, λ억제인자,E.coli trp억제인자,E.coli galR억제인자,E.coli araC억제인자,E.coli tet억제인자 및E.coli ArgGNV억제인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제인자에 의하여 결합될 수 있는 작동유전자를 포함하는 플라스미드,

상기 억제인자를 암호화하는 제1의 염색체 유전자, 및

상기 작동유전자와 기능적으로 결합되고 세포성장에 필수적인 제2의 염색체 유전자를 함유하고,

여기에서 상기 플라스미드는 상기 필수적인 유전자가 발현될 수 있도록 상기 억제인자를 적정하기에 충분한 수로 상기 세포내에 존재하므로써, 세포성장이 가능하게 되는 형질전환된 박테리아 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 그램 음성 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 2 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는E. coli세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 2 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 살모넬라 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 그램 양성 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 5 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 바실러스 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 박테리아 세포 당 약 10∼50개의 상기 플라스미드 사본을 복제할 수 있는 복제 기점을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 박테리아 세포 당 약 100∼200개의 상기 플라스미드 사본을 복제할 수 있는 복제 기점을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 7 항에 있어서, 상기 플라스미드는 pBR322인 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 8 항에 있어서, 상기 플라스미드는 pUC인 것을 특징으로 하는 형질전환된박테리아 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 목적하는 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 억제인자에 의해 결합할 수 있는 작동유전자, 복제 기점 및 목적하는 유전자의 삽입을 위한 클로닝 부위로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
제 12 항에 있어서, 상기 플라스미드는 약 1000bp의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포.
세포가 성장하기에 충분한 조건 및 시간 동안에 제1항, 제2항 내지 제6항, 제7항 내지 제11항, 제12항 내지 제13항 종 어느 한 항에 따른 형질전환된 박테리아 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 박테리아 세포내에서의 플라스미드의 보존방법.
세포가 성장하기에 충분한 조건 및 시간동안에 제1항, 제2항 내지 제6항, 제7항 내지 제11항, 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 박테리아 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양된 박테리아 세포로부터 플라스미드 DNA를분리해내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA의 생산방법.
세포가 성장하기에 충분한 조건 및 시간 동안에 제12항 또는 제13항중 어느한 항에 따른 형질전환된 박테리아 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양된 박테리아 세포로부터 재조합 단백질을 분리해내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 생산 방법.