JPS63219384A - ライノウイルス株ｈｒｖ８９のポリペプチドおよびこれをコ−ドするｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトライノウィルス株８９（ＨＲＶ８９）の
ウィルスタンパクの一部または全体に対応するペプチド
、これらペプチドをコードするＤＮＡ分子およびこれら
物質の調製並びに使用に関するものである。

古典的な分類によれば、ライノウィルスはＲＮＡウィル
スであり、これらはピコルナ（ｒ’１ｃｏｒｎａ）ウィ
ルス科の一つの属をなす〔クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）Ｐ
、Ｄ、　；アーゴル（Ａｇｏｌ）　Ｈ，Ｌ、　；バクラ
ッハ（Ｂａｃｈｒａｃｈ）　Ｈ，Ｌ、　；ブラウン（Ｂ
ｒｏｗｎ）Ｆ、　；ゲンドン（Ｇｈｅｎｄｏｎ）　Ｙ、
　　；ギップス（Ｇｉｂｂｓ）　Ａ、　Ｊ、　；ギルス
ビ−（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）　Ｊ、　Ｈ，；ロン−バー
グーホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏ１ｍ）　Ｋ、　；マ
ンデル（Ｍａｎｄｅｌ）　Ｂ、　；メルニク（Ｍｅｌｎ
ｉｃｋ）　Ｊ、　Ｌ、　；モハンティー（Ｍｏｈａｎｔ
ｙ）　Ｓ、　Ｂ、　；ホビー（Ｐｏｖｅｙ）　Ｒ，Ｃ，
；ルーカート（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）　Ｒ，Ｒ，；シア７
ｙ　　（Ｓｃｈａｆｆｅｒ）Ｆ、Ｌ、　、およびチレル
（Ｔｙｒｒｅｌ）　Ｄ、八、Ｊ、のインターパイロロジ
ー（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９７８．１０゜
１６５−１８０　：Ｍ、Ｒ，？ツクツートン（ＭａｃＮ
ａｕｇｈｔｏｎ）　、カレント　トピックス　オブ　マ
イクロバイオロジー＆イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、［ｍｍｕｎｏｌ、）、１９８２．
９７．１−２６〕。

これらはヒトの上部気道を侵して、カゼ、セキ、声かれ
などを生じる一般には感冒と呼ばれている急性感染症を
引き起こす〔ストット（Ｓｔｏｔｔ）　Ｂ、　Ｊ。

およびキリンブト：／　（Ｋｉｌｌｉｎｇｔｏｎ）　Ｒ
，Ａ、、アニュアル　レビュー　オブ　マイクロバイオ
ロジー（Ａｎｎ、ＲｅｖｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）　
、１９７２．２６．５０３−５２４］。ライノウィルス
により生ずる感染症はヒトにおいて最も一般的な病気に
含まれる。これら疾患の過程は一般に無害であるが、感
冒は一時的に生物を弱める。これにより、二次的に他の
ウィルスまたは細菌による感染を生ずる恐れが生じ、こ
れら他のウィルス等はある環境下で重い病気をもたらす
可能性である。更に、ライノウィルスによる経済的損害
はかなりのものとなる。

米国において、年間ライノウィルス感染症は２００万以
上の出勤日または登校日の損失を生ずるものと計算され
ている〔デービス（Ｄｅｖｉｓ）　Ｂ、　Ｄ、　；ドゥ
ルベッコ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）　Ｒ，；アイゼン（Ｅ
ｉｓｅｎ）Ｈ，Ｎ、　、およびギンスバーグ（Ｇｉｎｓ
ｂｅｒｇ）　Ｈ，Ｓ、　；　？イクロバイオロジー（Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、第３版、ハーバ−＆ロウ
社刊１ニューヨーク、１９８０、ｐ、１１１４）。

更に、最近巨大な集合都市において、ライノウィルス感
染症が著しく増加している。また、多くの他の感染症が
当該病原体から永続的即ち長期に渡る免疫を受けるのに
対して、ライノウィルスによって生ずる感染症は再発を
何度も繰返す。永続的な免疫性がない理由はライノウィ
ルスに多数の株（種）があることにある。これまでに、
１００種にも及ぶライノウィルス株が単離され、これら
は相互にまったくあるいはほんのわずかに免疫的交叉反
応を示すにすぎない〔フォックス（Ｆａｘ）Ｊ、Ｐ、　
ｉアメリカン　ジャーナル　オプ　エビデミオロジ−（
Ａｗ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｊ、　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、）　
、１９７６．１０３．３４５−３５４；メルニク（Ｍｅ
ｌｒ＋１ｃｋ）Ｊ、Ｌ、、プロシーディングズ　オブ　
ザ　メディカル　バイオロジー（Ｐｒｏｃ、　Ｍａｄ、
　Ｖｉｏｌ、）　、１９８０、■、２１４−２３２）、
感染症に感染した後、特定のウィルス株に対する抗体が
検出できるが、これらは他のライノウィルス株に対する
防御を何等与えない。集団中で多数の株が循環している
ので、ライノウィルスによる感染症の繰返しが起こり得
る。

本発明の目標は、従ってライノウィルスにより引き起こ
される感染症の予防をもたらす薬剤を調製することにあ
った。

高度免疫血清を用いることにより、全体で９０のライノ
ウィルスの血清型の５０を１６群に分類することが可能
となった。〔コニ−（Ｃｏｎｎｅｙ）Ｍ、に、　、フォ
ックス（Ｆａｘ）　Ｊ、Ｉ’、およびケニー（Ｋｅｎｎ
ｙ）　Ｇ、Ｅ、　、インフェクシャス　イムノロジー　
（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｎ＋ｕｎ、）　、１９８２．３
７．６４２−６４７）。もう一つの分゛類法は細胞受容
体に対する結合を基に得られる。実際に、これらの免疫
学的特性に顕著な異質性があるにも拘らず、ライノウィ
ルスは細胞表面上の受容体に対する結合に関して相互に
類似の挙動をする。

競合実験により、ＨｅＬａ細胞（クローン　Ｒ−１９）
で研究された８８種のライノウィルス株につき唯２つだ
けの異る受容体があるにすぎないことが確認された〔ア
ブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）　Ｇ、およびコロン（Ｃｏ
ｌｏｎｎｏ）　Ｒ，Ｊ、　、ジャーナル　オブ　バイロ
ロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、１９８４．５１．３４ｏ
−３４４；コロンＲ，Ｊ、　、カラハン（Ｃａｌｌａｈ
ａｎ）Ｐ、Ｌ、　；およびロング（Ｌｏｎｇ）　Ｗ、Ｊ
、、ジャーナル　オブバイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ
、）、１９８６．５７．７−１２〕。しかしながら、こ
れらの結果はＨｅＬａ細胞につき得られた結果であって
、必ずしもヒトの上部気道における天然宿主細胞上の受
容体に対しても適用されるものでないことを指摘すべき
である。

本発明の更なる目的はオリゴペプチドを調製することに
あり、これらは完全にまたは部分的にウィルスタンパク
に対応し、かつ完全なウィルスに対する免疫応答を刺激
するか、あるいは細胞受容体に結合しかつこれを遮断す
るのに使用できる。

典型的なピコルナウィルスとしてのライノウィルスは一
本鎖ＲＮＡを含み、これはＶ　Ｐ　１　（ＰＩＤ）、Ｖ
Ｆ６　（ＰＩＢ）　、ＶＦ６　（ＰＩＣ）およびＶＦ６
（ＰＩＡ）としての既知の４つのポリペプチドからなる
カプシドによって包囲されている〔メダフパ（Ｍｅｄａ
ｐｐａ）　Ｋ、Ｃ，；マフクリーン（ＭｃＬｅａｎ）　
Ｃ６およびルッカート（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）　Ｒ，Ｒ，
、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、１９７１　、
↓↓、２５９−２７０；カッコ内の用語はジャーナルオ
ブ　バイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、１９８４、
■、９５７−９５９においてルッカートＲ，Ｒ，および
ライマー（Ｗｉｍｍａｒ）　Ｅ、により提案されたもの
に対応する新しい命名法によるものである〕。単一のウ
ィルス粒子はこれらポリペプチドの各々の６０個のコピ
ーを含む。異るライノウィルスにおける相対分子質量は
ＶＰＩに対し３４〜３６０００、ＶＦ６について２７−
３００００．ＶＦ６につき２４−２８０００およびＶＦ
６について７−８０００である〔マツクツ−トン（Ｍａ
ｃＮａｕｇｈｔｏｎ　）　Ｍ、Ｒ，；上記文献中、１９
８２）。ライノウィルスのもう一つの特徴は、これらが
ｐＨ５以下で急速に不活化されることおよび高濃度塩溶
液に敏感なことである。更に、大多数のライノウィルス
は３３〜３４℃にて最適成長を示す〔ルリア（Ｌｕｒｉ
ａ）　Ｓ、ＩＥ、、ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）　Ｊｒ
、、　Ｊ、Ｅ、　；バルチモア（ＢａｌＬｉｍｏｒｅ）
　Ｄ、およびキャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌ　Ｉ）＾、ジ
ェネラル　バイロロジ−（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）、１９７８年、第３版、ジョンウィリー＆サン
ズ社、ニューヨーク、３０８ｆｆ）。

約７１００のヌクレオチドに相当する長さをもつ一本ｔ
ｉ　ＲＮ　Ａがウィルスのゲノムを構成する。

また、これは同時にウィルスタンパク構成のマトリック
スとして機能できる。ヌクレオチド配列の大部分はまず
長いポリタンパクに翻訳され、これからタンパク分解開
裂により完全なウィルスタンパクが形成される〔バック
ワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ）Ｂ、Ｅ、、パイロロ
ジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、１９７３、■、４３９−
４５３；マツクリーン（ＭｃＬｅａｎ）Ｃ０およびルッ
カー）　（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）　Ｒ，Ｒ，、ジャーナル
　オブ　バイｏｏジーＤ、　Ｖｊｒｏｌ、）、１９７３
、土工、３４１−３４４；マツクリーンＣ０；マレュー
ズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）　Ｔ、Ｊ、およびルッカートＲ
，Ｒ，、ジャーナル　オプ　バイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉ
ｒｏｌ、）、１９７６．１エ、９０３−９１４）。この
方法による生成物は、ウィルス被覆タンパク即ちＶＰＩ
、ＶＦ６、ＶＦ６およびＶＦ６の他に、多数のタンパク
、例えばＰ２Ａ、Ｐ３Ｃ，Ｐ３Ｂ、Ｐ３ＣおよびＰ３Ｄ
などである。Ｐ３Ｂ　（一般にＶＰｇとして知られてい
る）はウィルスＲＮＡの５′−末端ヌクレオチドに共有
結合的に結合している。ポリオウィルスと同様に、Ｐ２
ＡおよびＰ３Ｃはウィルスポリタンパクの処理に部分的
に応答し得るプロテアーゼであると推定できる〔マツク
ツ−トンＭ、Ｉ？、　ｉ上記文献、１９８２；Ｉ−ヨダ
（Ｔｏｙｏｄａ）＋１．、ニッタリン（Ｎｉｃｋｌｉｎ
）　Ｍ、　Ｊ、　Ｈ，；マレ−（Ｍｕｒｒａｙ）　Ｍ、
Ｇ、　ｉアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）Ｃ，Ｗ、　
；ダン（Ｄｕｎｎ）　Ｊ、Ｊ、　；ステユディエ（Ｓｔ
ｕｄｉｅｒ）Ｐ、Ｗ。

およびライマー（Ｗｉｍｍｅｒ）　Ｅ、、セル（Ｃｅｌ
ｌ）、１９８６．４５．７６１−７７０）。

従って、Ｐ３ＤはウィルスＲＮＡの複製用のポリメラー
ゼである。現在のところ、タンパクＰ２Ｃの機能につい
ては殆ど知られていない。

ウィルスポリタンパクの処理中に、アミノ酸配列の一部
が除去され、次いで減成される〔マツクリーン（ＭｃＬ
ｅａｎ）　Ｃ，；マシュ−（Ｍａｔｔｈｅｕ）　Ｔ、Ｊ
、；およびルッカート（Ｌｕｅｃｋｅｒｔ）　Ｒ，Ｒ，
上記文献、１９７６）。現在、これらペプチドがこれま
でに未発見の機能を有しているか否か述べられることは
できない。

最近、ライノウィルスに関する我々の知識は、２種のヒ
トライノウインレス血清型ＨＲＶ２　　（ドイツ特許出
願第Ｐ３５　０５　１４８．５；スカーフ（Ｓｋｅｒｎ
）　Ｊ、　　；シンマーグルーバー（Ｓｏｍｍｅｒｇｒ
ｕｂｅｒ）　Ｗ、　；ブラース（Ｂｌａａｓ）　Ｄ、　
　；ゲランドラ−（Ｇｒｕｅｎｄｌｅｒ）　Ｐ、　　；
フロインドルファー　（Ｆｒａｕｎｄｏｒｆｅｒ）　Ｆ
、　　；ピーラ−（Ｐｉｅｌｅｒ）　Ｃ０；フォジー（
Ｆｏｇｙ）　１．およびケヘラー（Ｋｕｅｃｈｌｅｒ）
Ｅｏ、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１９８５．１３．２１１１
−２１２６）およびＨＲＶ１４Ｃスタンウェイ（Ｓｌａ
ｎｗａｙ）　Ｇｏ、ヒユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ）　　Ｐ、
Ｊ、　　；　？ロンドンｔ）ｌ／ド（Ｍｏｕｎｔｆｏｒ
ｄ）　Ｒ，Ｃ０；−’イナー（Ｍｉｎｏｒ）　Ｐ、Ｄ、
；およびアルモンド（Ａ　１ｍａｎｄ）　Ｊ、Ｗ、、同
上、１９８４．１２．７８５９−７８７５；カラハン（
Ｃａｌｌａｈａｎ）　Ｐ、Ｌ、；ミズタ＝　（Ｍｉｚｕ
ｔａｎｉ）Ｓ、およびコロン　（Ｃｏｌｏｎｎｏ）　Ｒ
，Ｊ、　　、プロシーディンゲス　オブ　ナショナル　
アカデミ−オブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）　、口Ｓ＾、１９８５．８２
，７３２−７３６　；欧州特許出願第８５．４０１　４
６５．１）のヌクレオチド配列が決定できたことにより
大巾に拡大した。更に、ＨＲＶ　１４の構造は解像度３
人のＸ−線構造解析により明らかにされた〔ロスマン（
Ｒｏｓｓｍａｎｎ）Ｍ、Ｇ、；アーノルド（Ａｒｎｏｌ
ｄ）　Ｂ、；　ｘリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）　Ｊ、
Ｖ４．；フランケンバーガー（Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇ
ｅｒ）　Ｂ、＾、ニゲリフイス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）Ｊ
、Ｐ、；ヘクト（Ｈｅｃｈｔ）　ｔｌ、Ｊ、　　；ジョ
ンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）　Ｊ、Ｂ、　　；クラ？　−
（Ｋｒａｍｅｒ）　Ｇ、；　ルオ（Ｌｕｏ）　Ｍ、：　
％−／サー（Ｍｏｓｓｅｒ）　Ａ、Ｇ、　；　ルー）カ
ー）　　（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）　Ｒ，Ｒ，；シェリー　
（Ｓｈｅｒｒｙ）　Ｂ、　；およびフリーエンド（Ｖｒ
ｉｅｎｄ）　Ｇ、、ネイチャー（ロンドン）　　（Ｎａ
ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　）　、１９８５．３１７
．１４５−１５３）。また、ＨＲＶ１４の中和に対して
応答性の４つのエピトープの位置はＨＲＶ１４のモノク
ローナル抗体に耐性の変異株によって同定された〔シェ
リー（Ｓｈｅｒｒｙ）　Ｂ、、モッサー（Ｍｏｓｓｅｒ
）　Ａ、Ｇ、、コロン　（Ｃｏｌｏｎｎｏ）　Ｒ，Ｊ。

およびルッカート（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ）　Ｒ，Ｒ，、ジ
ャーナルオブ　バイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、１
９８５、エエ、２４６−２５７）。これら知見のすべて
はポリオウィルスに極めて類似していることを示す。

このことは核酸またはタンパクの配列およびウィルス構
造両方についてもいえて、ポリオウィルスのＸ−線構造
解析の比較から明らかとなる〔ホグル（■ｏｇｌｅ）　
Ｊ、Ｍ、　　；チ！！　−（Ｃｈｏｗ）　Ｍ、およびフ
ィルマン（ＦｉｌＩｌａｎ）　Ｄ、Ｊ、、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８５．２２９．１３５８−１３
６５）。これはライノウィルスとエンテロウィルスとの
間の密な関係を示す、それにも拘らず、２種のヒトライ
ノウィルスがポリオウィルスに対するよりも相互により
大きな類似性をもつものと期待したであろう。しかしな
がら、この事実はいくつがの遺伝子においてＨＲＶ２と
ＨＲＶ１４との間の相同がポリオウィルスとの相同より
も少しも大きくないことを意味する。これら２つのライ
ノウィルス間の類似性が比較的低いことの一つの可能な
解釈はＨＲＶ２とＨＲＶ１４とが異る細胞受容体に結合
し、かくして特定の群の基本型を構成するという事実で
ある。従って、ＨＲＶ１４と同じ受容体と結合する他の
ライノウィルスも配列の点でＨＲＶ１４に対して高い配
列類似性を示すはずである。

このため、ヒトライノウィルス株８９　（ＨＲＶ８９）
は、ＨＲＶ１４と同じ受容体群に属する〔アブラハム（
Ａｂｒａｈａａ＋）　Ｇ、およびコロン　（Ｃｏｌｏｎ
ｎｏ）Ｒ，Ｊ。

上記文献、１９８４）が、これが配列研究のために選ば
れた。

ウィルス性出発物質を得るため、ＨｅＬａ細胞を適当な
感染培地中でＨＲＶ８９により感染サセ、最適生育条件
下で数時間インキヱベートした。

このウィルスは細胞および培地両者から得ることができ
る。

ウィルス精製工程でウィルス処方物が得られ、そのタン
パクパターンは例えば第１図に示されるものである。

このウィルスＲＮＡは、例えばフェノール抽出によって
ウィルス調製物から得られ、精製された。

これは次いで逆転写酵素およびプライマーとしてのオリ
ゴｄＴによってｃＤＮＡに転写された。得られたＲＮＡ
／ｃＤＮＡハイブリッドはホモポリマー的に伸長され、
適当なプラスミド例えばｐＢＲ３２２に挿入された。

ＲＮＡの逆転写法の利用は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリ
ッドのプラスミド中への組込みおよびバクテリアの形質
転換につき文献に十分に記載されている〔キタムラ（Ｋ
ｉｔａｍｕｒａ）　Ｎ、およびライマー（Ｗｉｍｍｅｒ
）　Ｅｏ、プロシーディンゲス　オブ　ナショナル　ア
カデミ−オブ　サイエンス　ニーニスニー　（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　　１９
８０．７７．３１９６−３２００；ネルマン（Ｎｅｌｓ
ｏｎ）Ｔ。

およびブルトラグ（Ｉｌｒｕｔｌａｇ）　Ｄｌ、メソッ
ド　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９７９．６８．４ｌ−５０ｉ
ザイン（Ｚａｉｎ）Ｓ、Ｈサムブロック（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ）　Ｊ、　；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　Ｊ、Ｊ
、　　；’ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）　Ｉｔｓ、　；フリ
ート（Ｆｒｉｅｄ）　Ｍ、およびダン（Ｄｕｎｎ）　Ａ
、、セル（Ｃｅｌｌ）　、１９７９、土工、８５１−８
６１ｉ口イコドフリー（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ）　
Ｒ，およびウー（−Ｕ）Ｒ１、メソッド　イン　エンザ
イモロジ−（Ｍｅ　ｔｈｏｄｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、１９８０．６５．４２−６２；キタムラ（Ｋｉｔ
ａｍｕｒａ）Ｎ、、セムラー（Ｓｅｍｌｅｒ）Ｂ、Ｌ、
　；ロスバーブ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）　Ｐ、Ｇ、　；ラ
ルセン（Ｌａｒｓｅｎ）Ｇ、Ｒ，ｉアドラー（Ａｄｌｅ
ｒ）　Ｃ，Ｊ、　　Ｈドルナー（Ｄｏｒｎｅｒ）　Ａ、
Ｊ、　ｉエミニ（Ｅｍｉｎｉ）　Ｅ、＾、；ハネカク（
Ｈａｎｅｃａｋ）　Ｒ，；リー（Ｌｅｅ）　Ｊ、Ｌ、　
　；ファンデアウェルフ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ）
　Ｓ、　；アンダーソン（八ｎｄｅｒｓｏｎ）　Ｃ６Ｗ
、　；およびウイマニ＜Ｗｉｍｍｅｒ）Ｅ、　；ネイチ
−１−−（Ｎａｔｕｒｅ）　　（ロンドン）、１９８１
．２９１．５４７−５５３；ファンデアウエルフＳ、；
ブレジェジエール（Ｂｒｅｇｅｇｅｒｅ）’Ｆ、　　；
コペツカ（Ｋｏｐｅｃｋａ）　Ｈ，、キタムラＮ、；ロ
スバーグＰ、Ｇ、　；クリルスキー（Ｋｏｕｒｉｌｓｋ
ｅ）　Ｐ、　　；ライマーＥ、およびジラール（Ｇｉｒ
ａｒｄ）　Ｍ、　：プロシーデインダスオブ　ナショナ
ル　アカデミ−オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ｌ５Ａ）　、ｉ　９８
１、ユニ、５９８３−５９８７；ナモト（Ｎａｓ＋ｏｔ
ｏ）＾、；オマタ（抛ａｔａ）　Ｔ、　　ｉ　）ヨダ（
Ｔｏｙｏｄａ）　Ｈｏ、クゲ（Ｋｕｇｅ）　Ｓ、　；ホ
シエ（ｌｌｏｓｉｅ）　ｔｌ、　　；カタオカ（Ｋａｔ
ａｏｋａ）　Ｙ、　　；ゲンバ（Ｇｅｎｂａ）　Ａ、　
　ｉナカノ（Ｎａｋａｎｏ）　Ｙ、およびイムラ（Ｉｍ
ｕｒａ）　Ｎ、、　Ｉｂ１ｄ　％１９８２．７９．５７
９３−５７９７　；スタンウェイ（Ｓｔａｎｗａｙ）　
Ｇ、　、カン（Ｃａｎｎ）　Ａ、Ｊ、　；ホプトマン（
Ｈａｕｐｔｍａｎｎ）　Ｒ，；ヒユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ
）　Ｐ、、クラーゲ（Ｃ１ａｒｋｅ）　Ｌ、Ｄ、、マウ
ントフォルト（Ｍｏｕｎ’ｔｆｏｌｄ）　Ｒ，Ｃ，、マ
イナー（Ｍｉｎｏｒ）　Ｐ、Ｄ、、シールド（Ｓｃｈｉ
ｌｄ）　Ｇ、Ｃ０、およびアルモンド（Ａｌｍａｎｄ）
　Ｊ、Ｗ、、ヌクレイツク　アシッド　リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｅ、）　１９８３　、土
工、５６２９−５６４３　；スカーノ（Ｓｋｅｒｎ）　
Ｔ、ゾンマーグルーバ（Ｓｏｍｍｅｒｇｒｕｂｅｒ）　
Ｗ、、ブラース（Ｂｌａａｓ）　Ｄ、　　；グレンドラ
−（Ｇｒｕｅｎｄｌｅｒ）　Ｐ、　　；フラウンドルフ
ｙ−（Ｆｒａｕｎｄｏｒｆｅｒ）　Ｆ、　　；ピーラ−
（Ｐｉｅｌｅｒ）　Ｃ，？フォギー（Ｆｏｇｙ）　１．
およびケラヘラ−（Ｋｕｅｃｈｌｅｒ）　Ｂ、、１ｂｉ
ｄ、　　１９８５）。

適当な宿主生物、例えばエシェリヒア　コリ（Ｅ、　　
ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１の形質転換後、プラスミドＤ
ＮＡを“プラスミド最小調製法（ｍｉｎｔ　−ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｏｎ）″を利用して単離し、組換えＤＮＡの
サイズを決定した。このため、該組換えＤＮＡは制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩを用いて切断し、フラグメン
トを電気泳動で分離し、公知のｌａｍｂｄａ−Ｈｉｕｄ
ｌｌ［マーカーＤＮＡと比較した。

ＤＮＡを更にクローニングするため、組換えｐＢＲ３２
２クローンのＰｓｔＩ消化により得たＤＮＡフラグメン
トを精製し、適当なベクター、例えばプラスミドｐＵＣ
Ｑ中に組込んだ。次にこの組換えベクターを適当な宿主
、例えばイー、コリー（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　ＪＭ　１
０１に移した。組換えベクターによりうまく形質転換さ
れたサブクローンを収穫し、そのプラスミドＤＮＡを単
離、精製した。

長さの異なる３種のブライマーフラグメント〔５４ヌク
レオチド（フラグメントＡ）、１２２ヌクレオチド（フ
ラグメントＢ）および１３９ヌクレオチド（フラグメン
トＣ））を３つのサブクローンから単離し、精製した。

加えて、２０ヌクレオチドの長さの合成プライマー（Ｄ
）を使用した。この相補的な一本鎖ＤＮＡによって、３
２Ｐで標識したＨＲＶ８９の逆転写体を調製した。

組換えＤＮＡ中のＨＲＶ８９配列を検出するため、この
プラスミドＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、電気泳動で分析
した。このＤＮＡフラグメントはゲルからニトロセルロ
ースフィルター上に移され、固定された。これらのＤＮ
Ａ担持フィルタを放射能標１１ｔＨＲＶ８９−ｃＤＮＡ
とハイブリッド化し、次いでこのフィルタを捨てた。こ
のようにして得たＨＲＶ８９−ＲＮＡに相補的な組換え
ＤＮＡ７ラグメントから、制限部位をマツピングおよび
配列決定した。クローンが得られ、これらはＨＲＶ８９
のゲノムを表した。

ＨＲＶ８９ゲノムの配列は第４図に示した。これは組換
えＤＮＡの配列決定から得られたＤＮＡとして示されて
いる。配列決定のために、２１のクローン（第３図）お
よび補足の５つのクローンを用いた。この配列は７１５
２のヌクレオチドを含み、３′−末端のポリ−Ａを含ま
ない。これは一つの読取り枠を含み、該枠は２１６４個
のアミノ酸に相当する長さをもつポリタンパクをコード
する。この読取り枠は６１９位のＡＵＧで開始し、ポリ
−Ａの開始前の４２個のヌクレオチドの停止コドンＵＡ
Ａで終端する。

５′−末端配列はクローン！ｌｈ５および１０から得ら
れ、フラグメントＤはプライマーとして使用された（第
３図参照）、ＰｓｔＩによって開裂することにより、一
定の長さのフラグメントが得られる。配列決定により、
これら２つのクローンともにオリゴ−Ｇに掻く近接した
配列ＴＴＡＡＡＡＣを含んでいることがわかった。これ
はプラスミド中の組込み部位に由来するものである。こ
のことから、これらクローンがＨＲＶ８９ゲノムの５′
−末端を構成していることが結論付けられる。この配列
は３つの型のポリオウィルスの初めのヌクレオチドに相
当する。３つのポリオウィルスとはコクサラキーウィル
スＢｌ（ヒユーレット（Ｈｅｗｌｅｔｔ）　Ｍ、Ｊ、　
　；およびフロアキーヴイッツ（Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃ
ｚ）　Ｒ，Ｚ、　、プロシーデインダス　オブ　ナショ
ナル　アカデミ−オプ　サイエンスニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）
、１９８０．７７．３０３−３０７；スタンウェイ（Ｓ
ｔａｎｗａｙ）　Ｇ、　　；カン（Ｃａｎｎ）　Ａ、Ｊ
、　；　ハオブトマン（ｌｌａｕｐｔｍａｎｎ）　Ｒ，
；ヒユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ）　Ｐ、　；クラーク（Ｃ１
ａｒｋｅ）　Ｌ、Ｄ、　；マウントホルト（Ｍｏｕｎｔ
ｆｏｒｌｄ）　Ｒ，Ｃ，；マイナー（Ｍｉｎｏｒ）　Ｐ
、Ｄ、　　；シールド（Ｓｃｈｉｌｄ）　Ｇ、Ｃ，およ
びアルモンド（Ａｌｍｏｎｄ）　Ｊ、１１．、同上、１
９８３）　、ＨＲＶ２〔スカーノ（Ｓｋｅｒｎ）　Ｔ、
　　；ゾンマーグルーバ（ＳｏＩｌｌｓ＋ｅｒｇｒｕｂ
ｅｒ）　Ｗ、　；フ゛ラース（Ｂｌａａｓ）　Ｄ、　　
；グルエントラ−（Ｇｒｕｅｎｄｌｅｒ）　Ｐ、；フラ
ウンドルファー（Ｆｒａｕｎｄｏｒｆｅｒ）　Ｆ、　　
：ピーラー（Ｐｉｅｌｅｒ）Ｃ，；フォギー（Ｆｏｇｙ
）　１．およびケヘラー（にｕｅｃｈ　１ｅｒ）Ｅｏ、
同上、１９８５）、ａよびＨＲＶＩ　４　Ｃ７，、タフ
ウェイ　（Ｓｔａｒｖａｙ）　Ｇ、　　；ヒユーズ（Ｈ
ｕｇｈｅｓ）Ｐ、Ｊ、；マウントフォルト（Ｍｏｕｎｔ
ｆｏｒｄ）　Ｒ，Ｃ，；マイナー（Ｍｉｎｏｒ）　Ｐ、
Ｄ、　　；およびアルモンド（Ａｌｍｏｎｄ）Ｊ、讐１
、同上、１９８４）。

５′−末端と長い読取り枠の開始部との間の６１８ヌク
レオチドを分析することにより多数の比較することによ
り、何等かのインサートがあることを考慮して、７９％
もの著しく高い相同性があることがわかり、一方ＨＲＶ
１４との相同性は６７％であり、かつタイプｌのポリオ
ウィルスとの相同性は６２％である。この相同はいくつ
かの領域で特別大きくなっている。全体で、交互に位置
する１７個またはそれ以上の同等なヌクレオチドをもつ
９種の異るブロックがＨＲＶ８９およびＨＲＶ２ゲノム
の５′−末端領域に存在している。

アミノ酸配列の比較により、相同領域もさポリタンパク
をコードする領域中で連続していることがわかる（第５
図）。ＨＲＶ８９とＨＲＶ２との間に顕著な相同性があ
り、一方驚くべきことに予想とは逆にＨＲＶＩ４との相
同性が低いことに特に注目すべきである。強く保護され
た部分は被覆タンパクと非構造タンパク（Ｐ２Ａ−Ｐ３
Ｄ）の領域両者を含む。第１８図は、例えばＨＲＶ　２
の部分配列とＨＲＶ８９の部分配列との配列の比較を示
し、これはＰ３ＡおよびＰ３Ｂ　（ＶＰｇ）の遺伝子領
域からのものである。アミノ酸配列における実質的な相
同は容易に明らかになる。独立に生ずる異るアミノ酸が
存在する点においてさえ、一般に化学的に極めて近接し
た関係にあるアミノ酸により置換され、アルギニン（Ｒ
）はリジン（Ｋ）により、バリン（Ｖ）はイソロイシン
（１）により、ロイシン（Ｌ）はイソロイシン（１）に
よりというように置換される。Ｐ３Ａ（！：Ｐ３Ｂ（Ｖ
　Ｐ　ｇ）との間の開裂部位は完全に保存される。

これは相同性から容易に理解できる。他方、小さな領域
（ＨＲＶ２中のヌクレオチド５０１８と５０２９との間
の配列に相当）中に明確な分散があり、これはＰ３Ａの
対応する領域にアミノ酸配列の分散を生ずる。この発見
の重要性は今のところ不明である。現時点ではＰ３Ａの
機能については未知である。従って、ＨＲＶ２のサブタ
イプが存在し、この例において示したよりも大きな、こ
の領域におけるＨＲＶ８９との相同性をもつかどうかを
決定することはできない。このことは、ＨＲＶ８９がＨ
ＲＶ１４と同じ受容体群に属するにも拘らず、ＨＲＶ２
との類似性が大きいことを明確に示すものである。従っ
て、配列を基にして、ＨＲＶ２とＨＲＶ８９とは、ＨＲ
Ｖ１４およびポリオウィルスとは明確に区別される共通
の群をなす。この事実は、ヒトライノウィルスが実際に
、これまでにＨＲＶ２とＨＲＶ　１４との間の相同の比
較から推定されたよりも一層相互に高い類似性をもつこ
とを意味するものと思われる。かくして、ライノウィル
スおよびエンテロウィルスがピコルナウィルス科の同じ
属に属するとの示唆は問題であると思われる〔スタンウ
ェイ　（Ｓｔａｎｗａｙ）　Ｇ、　　；ヒユーズ（Ｈｕ
ｇｈｅｓ）Ｐ、Ｊ、　；マウントフォルト（Ｍｏｕｎｔ
ｆｏｒｄ）　Ｒ，Ｃ，；マイナー（Ｍｔｎｏｒ）　Ｐ、
Ｄ、　　：およびアルモンド（Ａｌｍａｎｄ）　Ｊ、Ｗ
、、上記文献、１９８４）。

ウィルスタンパクはタンパク分解開裂によりポリタンパ
クから得られる。開裂部位を決定するために、ウィルス
被覆タンパクを単離し、かっＮ−末端アミノ酸配列を決
定した（第６図参照）。このように、ウィルス被覆タン
パク内の開裂部位を明確にするばかりでなく、ヌクレオ
チド配列から導かれる読取り枠を確認した。ヌクレオチ
ド配列からのアミノ酸配列と比較することにより、ＶＰ
４／ＶＰ２開裂がグルタミンとセリンとの間で起こり、
ＶＰ２／ＶＰ３開裂がグルタミンとグリシンとの間で生
じ、かつＶＰ３／ＶＰＩ開裂がグルタミンとアスパラギ
ンとの間で生じることは明白である。これらの開裂部位
はＨＲＶ２と全く同じであるがＨＲＶ１４とは異ってい
る〔スタンウェイ　（Ｓｔａｎｗａｙ）　Ｇ、　　；ヒ
ユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ）Ｐ、Ｊ、　；マウントフォルト
（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ）　Ｒ，Ｃ，；マイナー（Ｍｉｎ
ｏｒ）　Ｐ、Ｄ、；およびアルモンド（Ａｌｍａｎｄ）
Ｊ、Ｗ、、上記文献、１９８４）。

本発明はＨＲＶ８９のウィルスＲＮＡの情報を含むＤＮ
Ａの作製を可能とする。

しかしながら、本発明は特異的にウィルスタンパクをコ
ードするゲノム配列のみでなく、例えば変異、分解、転
位または付加によって得られる変異種にも関連する。こ
れら例示のものとの比較により縮重である各配列が含ま
れる。厳格な条件下で図示した配列またはその一部とハ
イブリッド化される配列は、例えば８５％以上、好まし
くは９０％以上の相同性を選択する条件下、およびウィ
ルス活性スペクトルをもつタンパクをコード化するよう
な条件下で、含まれる。このハイブリッド化は６５℃に
て、６ＸＳＳＣ１５Ｘデンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’
　ｓ）溶液１０．１％ＳＤＳ中で実施する。

厳格さの程度は洗浄工程で決まる。かくして、約８５％
以上の相同でＤＮＡ配列を選択するために、適した条件
は０．２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ／６５℃であり、約
９０％以上の相同でＤＮＡ配列の選択のために適した条
件は０，１ｘＳＳＣ１０，０１％ＳＤＳ／６５℃である
。

図示の如く、このＤＮＡを適当なプラスミドベクター中
に全部あるいはそのフラグメントとして挿入して、適当
な宿主生物の形質転換後にＤＮＡを増殖もしくはタンパ
ク自体の表現を達成できる。

これら操作に適した適当な宿主、ベクターおよび条件は
既に当業者には周知である。同様に、多数の研究が発表
され、そこには遺伝子操作によるバクテリア中での外来
タンパクの合成が記載されている〔例えばハリス（ｌｌ
ａｒｒｉｓ）　Ｔ、Ｊ、Ｒ，の「ジエネテインクエンジ
ニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ１複製ｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ）　Ｊウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）　Ｒ
。

！、１９８３、↓、アカデミツクブレス刊、ロンドン、
１２７ｆｆ参照）。このため、外来ＤＮＡはプラスミド
の適当なバクテリア制御領域（プロモータ、リボゾーム
結合部位）の近傍に導入され、該プラスミドはこの情報
を（たいてい融合タンパクとして）高収率で表現するこ
とを可能とする。

かくして、対応するタンパクが得られる。ピコルナウィ
ルスの分野では、バクテリア内にウィルス遺伝子を表現
させることについて記載した多数の刊行物がある（ケラ
パー（Ｋｉ７ｐｐｅｒ）　Ｈ，；ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ
）　Ｗ、　Ｈケルツ（Ｋｕｒｚ）　Ｃ，；フォルス（Ｆ
ｏｒｓｓ）　Ｓ、　　；シェーク−（Ｓｃｈａｌｌｅｒ
）　Ｈｏ；フランツエル（Ｆｒａｎｚｅｌ）　Ｒ，；シ
ュトロマイアー（ＳＬｒｏｈｓａｉｅｒ）　Ｋ、　；マ
ルカート（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）０．　；ツァスラフス
キー（Ｚａｓｌａｕｓｋｙ）　Ｖ、Ｇ、　　；およびホ
フシュナイダ（Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）　Ｐ、Ｈ，
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）ロンドン、１９８１．２
８９．５５５−５５９；クライト（に１ｅｉｄ）　Ｄ、
Ｇ、　　；ヤンスラ（Ｙａｎｓｕｒａ）　Ｄ、　　；ス
モール（Ｓｍａｌｌ）　Ｂ、；ダルベフコ（Ｄａｒｂｅ
ｎｋｏ）　Ｄ、　；ムーア（Ｍｏｏｒｅ）　Ｄ、Ｍ、　
　；グラブマン（Ｇｒｕｂｍａｎ）　Ｍ、Ｊ、　　；マ
フカーチャー（Ｍｃｋｅｒｃｈｅｒ）　Ｐ、Ｄ、　　；
モルガン（Ｍｏｒｇａｎ）　Ｄ、Ｏ，、ロバートソン（
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）　Ｂ、Ｉｌ　　；およびバクラフ
　ハ（Ｂａｃｈｒａｃｈ）　Ｉｌ、Ｌ、、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８１．２１４．１１２５−１１
２９；ワイコウスキー（Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ）　Ｃ，；
ファンデアウエルフ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ）　Ｓ
、　；シッフアート（Ｓｉｆｆｅｒｔ）０．　：フレニ
ック（Ｃｒａｉｎｉｃ）　Ｒｏ：ブルノ（Ｂｒｕｎｅａ
ｕ）Ｐ。

およびジラール（Ｇｉｒａｒｌ）　Ｍ、、イーエムビー
オージャーナル（ＥＩＩＢＯＪ、）、１９８３、土工、
２０１９−２０２４；クランプ（Ｋｌｕｍｐ）　Ｗ、　
　；マルカート（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）　０．およびホ
フシュナイダ（ｌｌｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）　Ｐ、Ｈ
，；ブロシーデインダス　オブ　ナショナル　アカデミ
−オブ　サイエンスニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、１９８４．８
１．３３５１−３３５５；ハネカフ（Ｈａｎｅｃａｋ）
　Ｒ，；セムラー（Ｓｅｍｌｅｒ）　Ｂ、Ｌ、　；アリ
ガ（Ａｒｉｇａ）　ｔｌ、　　；アンダーマン（Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎ）Ｃ，Ｗ、　Ｈ＆ウイマー（Ｗｉｓｅｅｒ）
　Ｅ、　；セル（Ｃｅｌｌ）　、１９８４．３７．１０
６３−１０７３；スカーノ（Ｓｋｅｒｎ）Ｔ、　；ゾン
マーグルーバ（Ｓｏｓ＋ｓｅｒｇｒｕｂｅｒ）　Ｗ、　
；プラース（Ｂｌａａｓ）口、；グレンドラ−（Ｇｒｕ
ｅｎｄｌｅｒ）　Ｐ、　　；フロインドルファー（Ｐｒ
ａｕｎｄｏｒｆｅｒ）　Ｆ、　　；ピーラ−（Ｐｉｅｌ
ｅｒ）　Ｃ０：フォギー（Ｆｏｇｙ）　１．およびケヘ
ラー（Ｋｕｅｃｈｌｅｒ）　Ｅ、、同上、１９８５；シ
ュトレーベル（Ｓｔｒｅｂｅｌ）　Ｋ、　　；ベック（
Ｂｅｃｋ）　Ｅ、　ｉシュトロマイヤー（Ｓｔｏｂｍａ
ｉｅｒ）　Ｋ、　＆シェーラー（Ｓｃｈａｌｌｅｒ）　
Ｈ，、ジャーナル　オブ　バイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、）、１９８５．５７，９８３−９９１　：トヨダ
（Ｔｏｙｏｄａ）　Ｈ，等、同上文献、１９８６）。

原核生物、例えばＬ延に１２株２９４ （ＡＴＣＣＮ１３１　４４６）は特に表現に好ましい。

他の適当な株はＥ、　　９旦Ｘ１１７７６（ＡＴＣＣＮ
１３１５３７）である。上記株とは別に、ＬｃｏｌｉＷ
３１１０　Ｆ−、λ−、プロトドローフ、（ＡＴＣＣ阻
２７３２５）、バチルス属菌株、例えばバチルス　ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）およ
び他のエンテロバクテリアセアエ、例えば土（Ｓｅｒｒ
ａｔｔａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および種々のシェ
ードモナス属菌も使用できる。

一般に、宿主細胞と相容性の種からのレプリコンおよび
制御配列を含むプラスミドベクターはこれら宿主と共に
使用できる。このベクターは通常複製部位と共に認識配
列をもち、後者は形質転換細胞を表現型として選択でき
る。例えば、Ｌユニは通常ｐＢＲ３２２即ちＰエ　ユ丈
種起源のプラスミドによって形質転換される〔ポリバー
（Ｂｏｌｉｖａｒ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、１９７
７．２．９５〕。

ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性をコードする遺伝子を含み、従って形質転換細胞の同
定用の簡単な手段を与える。このｐＢＲ３２２プラスミ
ドまたは他のプラスミドは、更にそれ自体プロモータを
含み、あるいはそれ自体のタンパクの表現のために該微
生物が利用することのできるプロモータを含むように変
異されなければならない、このプロモータは組換えＤＮ
Ａの調製に最も頻繁に利用されるが、β−ラクタマーゼ
（ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモータ系〔チ
ャン（Ｃｈａｎｇ）等、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）
、１９７８．２７５．６１５；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒ
ａ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９７７．１
９８．１０５６；ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）等、同、
１９７９．２８１．５４４〕およびトリプトファン（ｔ
ｒｐ）プロモータ系〔ゲーデル等、ヌクレイツク　アシ
ッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、）　、１９８０、主、４０５７　；欧州特許出願−Ａ
−０，０３６，７７６号〕を含む。最も一般的に使用さ
れているプロモータがあるが、他の微生物も開発され、
かつ利用されている。本発明によるゲノム配列は、例え
ばλ−バクテリオファージ（ＰＬ　）の左側のプロモー
タの制御下で使用できる。このプロモータは特に強力で
あり、かつ制御可能であることが知られているプロモー
タの一つである。制御はλ−リプレッサーにより可能で
あり、該リプレッサーの隣接制限切断部位は既知である
。

この遺伝子の感温性対立遺伝子はウィルスＤＮＡ−配列
を含むベクター内に挿入できる。温度を４２℃に上げる
と、このリプレッサーは不活化され、該プロモータはそ
の最大濃度まで表現される。

このような条件下で生成されるｍＲＮＡの全体は、新た
な合成ＲＮＡ中に約１０％のＰ、プロモータ起源のもの
を含む細胞を得るのに十分であるべきである。

こうして、クローンバンクを確立でき、その中には機能
的ウィルスＤＮＡ配列が、λ−ＰＬプロモータから変動
する距離におけるリポゾーム結合部位の近傍におかれる
。これらのクローンは次いで検査され、最大収率をもつ
ものが選択される。

ウィルスＤＮＡ配列の表現並びに翻訳は他の制御系の制
御下で行うこともでき、該制御系は未翻訳形において該
器官に対して相同とみなし得る。

従って、例えばラクトース−依存性Ｅ、：２１Ｊからの
染色体ＤＮＡはラクトースまたは１ａｃ−オペロンを含
み、これはβ−ガラクトシターゼ酵素を分泌することに
よりラクトースの分解を可能とする。

Ｉ！ａｃ−制御要素はλ−バクテリオファージーｐｌ　
ａｃ　５から得ることができ、これはム　ユニに感染す
る。このファージの１ａｃ−オペロンは形質導入により
同じバクテリア種から得ることができる。

本発明の方法で使える制御系は、生物に固有のプラスミ
ドＤＮＡから得られる。このｉ！ａｃ−プロモーターオ
ペレータ系はＩ　ＰＴＧにより誘導される。

他のプロモーターオペレータ系あるいはその部分を使用
して同様に良好な効果を得ることができる０例えば、ア
ラビノースオペレータ、コリシンＥ１−オペレータ、ガ
ラクトースオペレータ、アルカリホスファターゼオペレ
ータ、」■−オペレータ、キシロース−Ａオペレータ、
」匹−プロモータなどである。

この遺伝子は好ましくは表現プラスミドｐＥＲ１０３（
Ｅ、ラスルードゥウォーキン（Ｒａｓｔｌ　−Ｄｗｏｒ
ｋｉｎ）等、ジータ（Ｇｅｎｅ）　、１９８３．２１．
２３７−２４８：欧州特許出願第８３１１２８１２．９
参照：寄託ＤＳＭ２７７３　１９８３年１２月２０日）
あるいはこれから誘導されたプラスミド、例えばｐＲＨ
ｌｏｏ　（第７図）内で表現できる。これらベクターは
すべて調節要素を含み、該要素はクローン化遺伝子の高
い表現率を導（。

本発明は、ヒトライノウィルスタイプ２および８９の全
ＤＮＡの、該ＤＮＡの一部およびこれらＤＮＡのフラグ
メントの種々の組合せ、適当なプラスミドベクタへの組
込み、プラスミドベクタ自体、これにより形質転換され
る宿主生物、並びに関連タンパクの合成、該タンパク自
体、およびその利用を包含する。

既に述べたように、いわゆる表現ベクターは通常遺伝子
操作によって、宿主生物内でのタンパクの調製のために
使用される。これら表現ベクターはいわゆる調節配列を
含み、これは非対応ＤＮＡの最適転写および翻訳に応答
できる。これら調節配列は強力なプロモータ、好ましく
は調節可能なプロモータを含み、かつ該プロモータの転
写の方向に制限酵素に対する１以上の特異的な切断部位
を含み、該サイトは該プロモータから適当な距離におか
れている。

いくつかの表現ベクターは、出発コドン（開始コドン）
が上記プロモータの下流域における最初の特異的切断部
位の前におかれるように構成される。出発コドンのない
ベクターを用いた場合、表現すべきＤＮＡにはまず出発
コドンを与え、次いで挿入する。更に、ベクター内で表
現すべきＤＮＡはいわゆる停止コドンを伴わなければな
らない、構造遺伝子をもつ表現ベクターの作成において
重要な点は、この構造遺伝子が出発コドンをもつ相に挿
入されなければならないことである。

非対応ＤＮＡは公知の方法で表現ベクター中に挿入でき
る。ある極めてまれな場合にはＤＮＡの開始は表現ベク
ターの特異的切断部位と同じ認識部位をもち、多くの場
合、該切断部位を相容性とする必要がある。これは、例
えば−末鎖の突出末端を完全なものとするか、あるいは
消化し、あるいは適当なリンカ−を付加することにより
達成される。選んだ表現ベクターが出発コドンをもたな
い場合、リンカ−と同時に出発コドンを付加することが
できる。これらすべての操作において、非対応ＤＮＡが
出発コドンをもつ相からはじまっていることを認識する
ことが重要である。

本発明の問題はベクターｐＲＨ１００およびＨＲＶ２ま
たはＨＲＶ８９のＤＮＡもしくはＤＮＡフラグメントに
対する該プラスミドから導かれた表現プラスミドを使用
することにより、特に有利に解決できる。このベクター
はｐＢＲ３２２から導かれたもので、本質的構造特性と
して±ｉエヱ　ヱｔｌｙ−に−＋７’：Ａ　（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のトリプトファン
プロモータを含み、これはタンパク合成を開始するため
に有効なシグナル配列を構成し、かつ３−β−インドー
ルアクリル酸（＝ＩＡＡ：ｔｒｐ−オペロンの誘発体）
により活性化できる。このｔｒｐ−プロモータの背後に
は合成リボゾーム結合サイトおよび出発コドンＡＴＧが
ある。該出発コドンの直後には５ａｃｌ切断部位がある
（第８図参照）。本発明の目的にとって、この切断部位
の一本鎖末端は一本鎖特異的ヌクレアーゼにより除去さ
れる。このように変性されたプラスミドがＤＮＡまたは
そのフラグメント（プラントエンド）、例えばＨＲＶ２
−ｃＤＮＡのプラントエンドＸｈｏ１１フラグメント９
６９／１（第９図）によって接合された場合、表現プラ
スミドが形成され、これによって該プラスミド形質転換
された宿主細胞、例えば原核生物または真核生物系内で
融合部なしにタンパクが生成される。この種のタンパク
の表現は融合タンパクと比較して、表現タンパクがその
元の構造をもち、かつこのタンパクを免疫または酵素テ
ストにかけることを可能とするという利点をもつ。

ＨＲＶ２およびＨＲＶ８９の完全なりＮＡ配列を知るこ
とにより、本発明によれば各所定のＤＮＡフラグメント
を適当な表現プラスミド、例えば表現プラスミドｐＲＨ
１００中に記載した方法で挿入し、ＤＮＡを表現するこ
とを可能とする。

ただし、該フラグメントは調節配列から正しい距離にあ
り、しかも開始コドンＡＴＧに対する正確な読み枠中に
あることが必要である。該所定のフラグメントは完全な
化学的オリゴヌクレオチド合成あるいは欧州特許出願０
１９２１７５あるいは独国公開特許３６２８６５８．３
に従ってプラスミドをフラグメント化することにより生
成し得る。

これら２つの方法を組合せることも可能である。

こうして、例えば第９図に示したＤＮＡ分子、即ちプラ
スミドｐＨＲＶ２−９６９からのＤＮＡは、制限酵素Ｂ
ａ１ＩおよびＢｓ５ＨＩＩにより９３０および１５８１
の位置で二重消化することによりフラグメントとするこ
とができる。次に、成熟ＶＰ２を表現するためには、２
つのオリゴヌクレオチドフラグメントが必要であり、こ
れらは第９図から、８１８〜９３１および１５８２〜１
６００　＋ＴＡＧのヌクレオチドを表す。これらのオリ
ゴヌクレオチドは公知の方法、例えばアプライドバイオ
システムモデル３８１Ａ　　ＤＮＡシンセサイザー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３
８１Ａ　ＤＮＡ５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて調製
できる。これらフラグメントを結合しく第１２図）、プ
ラスミドｐＲＨ１００の“プラント”５ａｃｌ切断部位
に挿入した後に、表現プラスミドｐＲＨ９６９／２が得
られ、これは成熟ＶＰ２　（第１５図）の表現に適して
いる。

既に上記した如く、この方法はＨＲＶ２またはＨＲＶ８
９の他のウィルスタンパクにも適用できる。

ＨＲＶ８９のＤＮＡにおける３つのＨｉｎｄｎｌ切断部
位を用イテ、ＨＲＶ８９０２２５１〜４７０３のヌクレ
オチドを含む表現プラスミドを得ることができる。これ
を行うためには、完全なウィルスタンパク領域をコード
するＤＮＡ分子を旧ｎｄ［［で切断し、単離し、約３８
６０ｂｐの長さのフラグメントＨ−Ｈを精製し、次いで
５ｐｈｘで切断する。

必要ならば、ヌクレオチド２２７３−４７０３を表すフ
ラグメントＳ−Ｈの一端または両端にリンカ−を付加す
る。このリンカ−により、該フラグメントは正しい読取
り枠における適当な線形化された表現ベクター中に挿入
される。

リンカ−の選択は該表現ベクター内の利用可能な制限サ
イトに依存する。ＡＴＣなどの出発コドンおよびＴＡＡ
などの停止コドンを、例えば表現すべきＤＮＡ配列をも
つ相内に含むリンカ−を使用することが特に有利である
。但し、これは、既に表現ベクタまたは表現すべき配列
がこれらコドンをもっていない場合である。

適当な表現ベクターは、例えばカタログ陳２７−４９３
５−０１としてファーマシア （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社から入手できるベクターｐＫ
Ｋ２３３−２　（４６０２ｂｐ）（フラン（＾ｍａｎｎ
）　Ｅ。

およびブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）Ｊ、、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、１９．８５、エエ、１８３−１９０）である
。

このベクターをＮｃｏＩおよび旧ｎｄＩ［Ｉにより２重
に消化し、大きい方のフラグメントを単離し、精製する
。このフラグメン）Ｓ−Ｈを線状化されたベクター中に
挿入し得るものとするためには、これは以下の式のＮｃ
ｏ　ｌ−３ｐｈ　Ｉ　’）ンカーをもっていなければな
らない。

ＣＡＴＧＧＴＧＴ’ＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＴＧ
ＣＡＣＡＣＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡに のリンカ−が与えられたフラグメントＳ−Ｈは線状ベク
ターと接合される。この操作に必要とされる試薬は当業
者には公知であり、公知の様式で使用される。

かくして得られる表現プラスミドｐＫＫ８９／２Ａ（第
１６図）はＩ　ＰＴＣ誘導により調節でき、かつ肛　ユ
ニ例えば株ＪＭ１０５の第１７図に示した成熟タンパク
（ベクターからの追加のアミノ酸）の表現を可能とする
。このタンパクは、位置（調節領域から最適距離はなれ
た位置）　５４５のＭｅｔに対するＡＴＧがリボゾーム
により開始されるものとして利用される場合に、表現さ
れる。しかしながら、５４８の位置におけるＭｅｔに対
するＡＴＧを出発シグナルとして使用することも可能で
あり、これはアミノ酸３つ分短いタンパクを与えるであ
ろう。

原核生物の他、酵母培養物などの真核微生物を最も一般
的に使用されている真核生物であるが、多数の他の種を
得ることも一般的である。サツカロマイセス中での表現
のためには、例えばプラスミドＹＴｐ’Ｍスティンコー
ム（Ｓｔ　ｉｎｃｈｃｏｍｂ）　等、ネイチャー　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）、１９７９．２８２．３９；キングズマン
（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９７
９、ユ、１４１；チニンパー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）等
、同、１９８０．１０．１５７〕およびプラスミドＹＥ
ｐ１３（バッハ（Ｂｗａｃｈ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）
　、１９７９．８．１２１−１３３３が有利に利用され
る。プラスミドＹＲｐ７は酵素変異株中の選択し得るマ
ーカーであるＴＲＰＩ遺伝子を含み、該変異株はトリプ
トファンを含まない培地中で生育できない（例えば、Ａ
ＴＣＣＮα４４０７６　”）。

酵母宿主ゲノムの特徴としてＴＲｐｌ欠陥の存在は、ト
リプトファンなしに培養した場合の形質転換の検出の有
効な手助けとなる。この情況はプラスミドＹＥｐ　１３
についても良くイ以ている。これは酵母遺伝子ＬＥＵ２
を含み、これはＬＥＵ−２−マイナス変異株を補足する
のに使用できる。

酵母ベクターに適したプロモータ配列はＡＤＨＩの５′
−フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）　’ｎＭ域〔アメ
ラ−（Ａｓ＋ｎ＋ｅｒｅｒ）　Ｇ、　、メソッズ　オブ
　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙ
＋＋＋ｏｌｏｇｙ）、　１９８３　。

１０１．１９２−２０１）、３−ホスホクリセレートー
キナーゼ〔ヒッツェマン（Ｉｌｉｔｚｅｎ＋ａｎ）等、
ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー　（
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、）　、１９８０．２
５５．２０７３）あるいは他の糖分解酵素〔カヮサキ（
Ｋａｗａｓａｋｉ）　＆フレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ
）　、バイオケミカル＆バイオフィジカル　リサーチ　
コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）、１９８２．１０８．
１１０７〜１１１２）、例えばエノラーゼ、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフニートデヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラ
ーゼおよびグルコキナーゼを含む。

適当な表現プラスミドを形成することにより、これら遺
伝子に関連する停止配列は、該表現ベクターの表現すべ
き配列の３′−末端に挿入することができ、これにより
ポリアデニル化およびｍＲＮＡの停止が保証される。

育成条件により転写が調節されるという利点をもつ他の
プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ−２０）イ
ンチトクロームＣ１アシツドホスフアターゼ、窒素代謝
と関連した分解酵素、上記のグリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよ
びガラクトースの処理に対して応答性の酵素のプロモー
タ領域である。酵母接合型の座例えば遺伝子ＢＡＲＩ、
ＭＥＩ、５ＴＥ２．５ＴＥ３および５ＴＥ５によって調
節されるプロモータは、変異株を用いて、温度制御系で
使用できる〔ライン（Ｒｈｉｎｓ）　Ｐｈ、Ｄ。

セーシス（Ｔｈｅｓｉｓ）　、オレゴン州立大、オイゲ
ンオレゴン（１９７９）；ヘルツビッツ＆オーシマ（ｔ
ｌｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　ａｎｄ　Ｏｓｈｉｍａ）、酵母
サッカロマイセ玉属の分子生物学（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　
５ａｃｃｈａｒｏａ＋　ｃｅｓ　）パート■、１９８１
．１８１−２０９、コルトスプリングハーバ−ラボラト
リ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）　）　＊これらの変異株は酵母の静
止接合型カセットの表現に影響を及ぼす。結果として、
間接的接合型依存プロモータとして作用する。しかし、
一般には酵母と相容性のプロモータ、複製源および停止
配列を含む任意のプラスミドベクターが適している。

微生物に加えて、多細胞生物の培養も宿主生物として適
している。たとえを推動物、無を推動物のいずれから得
たものであっても、理論上は、これら培養物のいずれも
使用できる。しかし、最も興味あるのはを推動物細胞で
あり、培地中でのを推動物細胞の増殖（細胞培養）が最
近の日常的な方法となってきている〔ティッシュ−カル
チャー（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）　、アカデミ
ツクプレス、クルーズ＆バターソン編（Ｋｒｕｓｅ　＆
　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、１９７３］。この種の有用な
宿主セルラインの例はＶＥＲＯおよび）ＩｅＬａｉＢ胞
、ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＷＩ３８、ＢＨ
Ｋ、ＣＯ３−７およびＭＤＣＫセルラインを含む。これ
ら細胞に対する表現ベクターは、一般に（必要ならば）
複製サイト、表現すべき遺伝子の前に位置するプロモー
タを、任意の必要なリポソーム結合サイト、ＲＮＡ切り
継ぎサイト、ポリアデニル化サイト、および転写停止配
列と共に含む。

哺乳動物細胞を用いる場合、表現ベクターにおける制御
機能がしばしばウィルス性物質から得られる。例えば、
通常使用されるプロモータはポリオーマ、アデノウィル
ス２および特にシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）か
ら導かれる。ＳＶ４０の初期並びに後期プロモータは特
に有用である。

というのは、これら両者はＳＶ４０のウィルス複製サイ
トをも含むフラグメントとして該ウィルスから容易に得
ることができるからである〔フィアース（Ｆｉｅｒｓ）
等、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、１９７８．２７
３．１１３）　、また、５Ｖ４０（７）小さなあるいは
大きなフラグメントを用いることもできる。

但し、これらは約２５０ｂｐ相当の長さの配列を含み、
これは１ｌｉｎｄｌｎ切断サイトからウィルス複製サイ
トにおける８ｇｌｌ切断サイトまで伸びている。

更に、一般に所定の遺伝子配列に結合している制御配列
またはプロモータを使用することも可能であり、望まし
い。但し、これらの制御配列は宿主細胞系と相容性でな
ければならない。

複製サイトには外因性サイト、例えばＳＶ４０または他
のウィルス源（例えばポリオーマ、アデノ、ｖＳｖなど
）を組込むために対応するベクター構造を与えることが
できる。また、これには宿主細胞の染色体複製機構を与
えることも可能である。このベクターが宿主細胞の染色
体中に組込まれた場合、後者の大きさは通常十分となる
。

ベクターによる該細胞の形質転換は多数の方法で実施で
きる。例えば、カルシウムを使用して、細胞をマグネシ
ウムで洗浄し、カルシウム中に懸濁された細胞にＤＮＡ
を加えるか、あるいは該細胞をＤＮＡおよび燐酸カルシ
ウムとの共沈にかけることにより実施できる。後の遺伝
子表現において、これら細胞は形質転換された細胞を選
択する培地に移される。

宿主の形質転換後、遺伝子の表現および発酵または細胞
培養はタンパクが表現される条件下で行われ、生成物は
通常公知の分離のためのクロマトグラフ法で抽出され、
かくしてリーダーおよびテーリング配列をもつあるいは
これらのないウィルスタンパクを含む物質が得られる。

このタンパクはＮ−末端（プレータンパク）においてリ
ーダー配列により表現され得、該Ｎ−末端はいくつかの
宿主細胞では除去され得る。さもなくば、リーダーポリ
ペプチド（存在する場合）は脱離して、成熟タンパクを
与えなければならない。また、この成熟タンパクは微生
物中で直接生成できる。この例において、酵母接合フェ
ロモンＭＦ−α−１のプレカーサ配列が、融合タンパク
の正しい成熟および生育培地あるいは細胞周辺腔中への
生成物の沈殿を確保するために使用できる０機能性また
は成熟タンパクに対するこのＤＮＡ配列は予想された切
断サイトにおいてＭＦ−α−１と結合できる。

バクテリアまたは真核生物細胞内で関連タンパクを調製
するための本発明によるＤＮＡの使用とは別に、ヌクレ
オチド配列からのアミノ酸配列、即ちその全体または部
分を、例えば自動ペプチド合成装置〔例えば、ベックマ
ン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モデル９９０〕により合成的に得
るために使用することも可能である。

これらのオリゴペプチドは、次いで遺伝子操作により生
成されたタンパクと同様に、完全なウィルスに対する免
疫応答を刺激するために、あるいは細胞受容体と結合も
しくはこれを遮断するのに使用できる。オリゴペプチド
をポリオウィルスに対する免疫応答性を刺激するために
用いる研究は公開されている〔エミニ（Ｅｍｉｎｉ）　
Ｅ、’Ａ、　　；ジャメスン（Ｊａｍｅｓｏｎ）　Ｂ、
Ａ、　＆ライマー（Ｗｉｍｍｏｒ）　Ｅ、、ネイチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｅ）　、ロンドン、１９８３．３０．６
９９−７０３）。また、同様な研究がフットウィルス（
ｆｏｏｔ　ｕｉｒｕｓ）およびマウスウィルス（ｍｏｕ
ｔｈ　ｕｔｒｕｓ）につき実施されている〔ビフトル（
Ｂｉｔｔｌｅ）等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、
ｏンドン、１９８２．２９８．３０−３３；バフ（Ｐｆ
ａｆｆ）等、ＥＭＢＯＪ、　、１９８２０）上、８６９
−８７４〕。また、本発明はＨＲＶ８９タンパクのオリ
ゴおよびポリペプチド成分を包含し、これらは合成の結
果としであるいは所定の用途、例えばワクチンのために
他のオリゴまたはポリペプチドと結合される。

本発明は更に、モノクローナル抗体およびその製造にも
関連し、抗体は構造的および非構造的ウィルスタンパク
（天然および変性型の）に対するものである。モノクロ
ーナル抗体とＨＲＶＩ４に対する細胞受容体との結合お
よびその遮断はコロン　（Ｃｏｌｏｎｎｏ）等により既
に開示されている〔欧州特許出願第０１６９１４６号〕
。

抗体が特異的に抗原と結合する特性は体外での定量的お
よび定性的決定（免疫検定）および抗原の精製（イムノ
アフィニティークロマトグラフィー）において実用化で
きる。免疫化した動物の血清は通常多数の異る抗体を含
み、これらは異るアフィニティーで異る結合サイトにお
いて同一の抗原と反応する。また、該血清は他の抗原に
対する抗体をも含んでいる。しかし、抗原の決定および
精製に有効に抗体を使用するには高い特異性と再現性が
必要となる。

これらの要件を満たす同質抗体はケーラー＆ミルシュタ
イン（Ｋ５ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によ
って開示されたハイブリドーマ法により手に入る。原理
的にはこの方法は抗体−分泌Ｂ−リンパ細胞、例えば免
疫性を付与した動物の肺臓からの細胞を腫瘍細胞と融合
することからなる。形成されたハイブリドーマ細胞は分
裂による永久的な複製能力と、均一な型の抗体を形成、
分泌する能力とを合せもつ。非融合腫瘍細胞が死滅する
選択培地中で培養することにより、ハイブリドーマ細胞
は増殖し、かつ適当な操作によってクローン、即ち単一
のハイブリドーマ細胞由来の、かつ遺伝的に同等な細胞
集団を得ることが可能となる。次いで、これら細胞によ
り生産されたモノクローナル抗体を単離する。

本発明はライノウィルス株ＨＲＶ２およびＨＲＶ８９に
対するモノクローナル抗体、このような抗体を産生ずる
ハイブリドーマ細胞、その調製法および利用に関する。

また、本発明によるウィルスタンパクに対するモノクロ
ーナル抗体、これらを産生ずるハイブリドーマ細胞およ
びこれらの調製法並びにその利用にも関連する。ハイブ
リドーマセルラインおよび上記ウィルスタンパクまたは
その一部と特異的に反応する、これらにより分泌される
モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗−Ｈ
ＲＶ２および抗−ＨＲＶ８９抗体の調製法は、マウスを
ライノウィルスまたはそのウィルスタンパクで免疫し、
このようにして免疫性を付与した動物からのＢ−’Ｊン
パ細胞をミエローマ細胞と融合し、得られるハイブリド
ーマ細胞をクローニングし、次いでインビトロで培養す
るか、あるいはマウス内に注入して、抗体を培養物から
単離することを特徴とする。

本発明は、更にイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーカラムおよびこれら抗体を含むイムノアッセイ用テス
トキットにも関する。

本発明の方法を用いて、マウス（例えばＢａｒｂ／Ｃマ
ウス）を公知の方法で免疫する。好ましい態様では、ラ
イノウィルスを毎週大雑把に注射するか、あるいぼ数週
間、例えば５〜１２週間に及ぶ長い周期で注射し、十分
な数の抗体産生Ｂ−ＩＪンパ細胞を形成する。

免疫化したマウスから、Ｂ−リンパ細胞含有生物、例え
ば牌細胞を取出し、変異の結果選択培地中では生育しな
いであろうミエローマ細胞と融合する。これらミエロー
マ細胞は公知であり、かつ、例えばＸ６３−Ａｇ３、Ｘ
　６３−Ａｇ８．６．５．３、ＭＰＣ−１１、ＮＳｌ−
Ａｇ４／１、ＭＯＰＣ−２１ＮＳ／１、ＭＳ−１（ＡＴ
ＣＣＴｌ８１８）または５Ｐ２１０などであり得る。好
ましい態様では、免疫マウスの牌細胞をセルラインＮＳ
−１（ＡＴＣＣＴｌ８１８　）のミエローマ細胞と融合
する。

この融合は、Ｂ−リンパ細胞とミエローマ細胞とを、細
胞融合剤、例えばポリエチレングリコール、センダイウ
ィルス、塩化カルシウムまたはりゾレシチンを加えて混
合する公知の方法を利用して実施できる。融合は、例え
ば１０００〜４０００の分子量を有するポリエチレング
リコールの存在下で行うことが好ましい。融合後、得ら
れるハイブリッドを、ハイポキサンチン、アミノプテリ
ンおよびチミジンを補充した選択培地（ＨＡＴ培地）中
にて公知の方法で培養する。非融合ミエローマ細胞はこ
の培地中で生育できず、死滅する。正常リンパ細胞も同
様である。

ハイブリドーマ培養物からの上澄を公知法に従って、例
えばラジオイムノアッセイまたは凝集により特異的抗体
の含量を調べることができる。上記方法により、ライノ
ウィルスに特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞
が得られることがわかった。所定の特異性をもつ抗体を
産生ずるハイブリドーマ細胞は、クローニングにより、
融合の結果得られた様々なハイブリドーマ細胞の混合物
から選択される。この培養は単一の生長細胞から出発す
る、限界希釈法と呼ばれる公知の方法からなる。

大量生産のためには、所定の特異性をもつ抗体を産生ず
るハイブリドーマ細胞クローンを、公知の培地中でのイ
ンビトロで、あるいは複製のためにマウス内に注射して
培養する。好ましい態様では、ハイブリドーマ細胞をブ
リスタンで前処理したマウス内に注入し、腹水を採取し
、硫酸アンモニウム溶液で腹水から沈殿させることによ
り分離する。本発明によるモノクローナル抗体、例えば
抗体８Ｆ５はライノウィルスタンパクに対するものであ
り、治療の目的で使用できる。

ライノウィルスに対する、かつこれらハイブリドーマ細
胞により得られた抗体はイムノ−アフィニティークロマ
トグラフィーカラムの調製のための公知の方法において
使用できる。本発明の好ましい態様において、適した担
体物質（バッファー溶液に懸濁されている）は抗体溶液
と組合せられ、あらゆる未結合画分は洗い流され、該担
体の空サイトは遮断される。ハイブリドーマ細胞によっ
て得られた特異的抗体はテストキットの作製のために公
知の方法で使用される。これらテストキットは様々な方
法、例えばラジオイムノアンセイ、ラテックス凝集、ド
ツトテスト、競争またはサンドインチラジオイムノアッ
セイ、酵素免疫検定、免疫螢光または免疫化学酵素テス
トに基くものであってよい。これらのキットは、通常の
様々な起源の抗体に加えて、酵素または螢光担体との抗
体複合体（例えば■Ｉｚｓなどの放射性同位体で標識し
たＨＲＶ２またはＨＲＶ８９、あるいは例えばセイヨウ
ワサビパーオキシダーゼ、あるいはアルカリホスファタ
ーゼなどの酵素との複合体を含む）、また酵素基質、適
当なバッフブー、ゲル、ラテックス、ポリスチレンある
いは他の充填剤および担体を含むことができる。

本発明の更なる特徴は以下の実施例に記載されるが、こ
れらは本発明の態様であり、本発明を制限するものでは
ない。

本発明の範囲内において、タンパク（ポリペプチド）に
関して特性および／または生物活性について述べた場合
、問題としているタンパク（ポリペプチド）が生物学的
テストにおいて免疫応答を刺激するかおよび／またはラ
イノウィルスに対する細胞受容体とのある種の反応に関
与していることを意味している０本発明は特に以下の点
に関連する。

ライノウィルス株ＨＲＶ８９の少なくとも一つのウィル
スタンパクをコードするＤＮＡ分子；−ライノウィルス
株ＨＲＶ８９のウィルスＲＮＡの全ウィルスＲＮＡまた
はその一部に対応するもの； 一部４）ＬｔスタンバクＶＰＩ、ＶＦ６、ＶＦ６、ＶＦ
６、Ｐ２Ａ、Ｐ２ＢＳ　Ｐ３Ｃ，Ｐ３Ａ。

Ｐ３ＢおよびＰ３Ｃからなるウィルスタンパクをコード
するもの； 一任意の所定の組合せで上記タンパクの少なくとも２つ
が結合したウィルスタンパクをコードするもの； −あるいは個々のウィルスタンパク自体をコードするＤ
ＮＡ分子。

本発明はまた上記ＤＮＡの縮重型（同義型）および対立
遺伝子をコードするＤＮＡ分子にも関連する。

部分的にまたは完全に第４図に示した配列に対応するＤ
ＮＡ分子が好ましい。

本発明は更に８５％以上の相同性を与えるような厳密な
条件下で特定のＤＮＡ分子の一つあるいはこれら分子の
同義体とハイブリッド化されるライノウィルス株ＨＲＶ
８９の少な（とも１つのウィルスタンパクをコードする
ＤＮＡ分子にも関する。この本発明によるＤＮＡ分子は
適当な表現担体、例えば微生物、好ましくは原核生物、
真核生物または哺乳動物細胞中で複製され得るプラスミ
ドに組込むことができる。本発明は、また本発明のタン
パクの少なくとも１つをコードするＤＮＡ分子に関する
。更に、本発明は本発明のウィルスタンパクをコードす
る遺伝情報を含む形質転換された宿主器官、好ましくは
原核生物、真核生物または哺乳動物細胞ライン、特にム
　ユニに関する。

この遺伝情報は問題とする宿主器官内で複製できる担体
中に含まれることが好ましい。

本発明は、また表現プラスミド、例えばｐＲＨ９６９／
１、ｐＲＨ９６９／２０）およびｐＫＫ８９／２Ａに関
し、これらはインサートしてポリペプチドのＤＮＡを含
み、該ポリペプチドはライノウィルス株ＨＲＶ２または
ＨＲＶ８９のウィルスタンパクの少なくとも一つの生物
的学な活性をもち、特にＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ
６、Ｐ２Ａ。

Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ｃ，Ｐ３Ａ、Ｐ３ＢまたはＰ３Ｃに対する
アミノ酸配列、好ましくは第４図または第１４図による
アミノ酸配列またはその一部をもつポリペプチド、また
、ライノウィルス株ＨＲＶ２またはＨＲＶ８９のウィル
スタンパクの少なくと゛も一つに完全にまたは部分的に
対応するポリペプチド、任意の所定の組合せおよび順序
で該ウィルスタンパクの少なくとも２つを結合状態で含
むポリペプチド、および第４図または第１４図に示した
アミノ酸配列あるいはその一部を由来とするかおよび／
またはライノウィルス株ＨＲＶ２またはＨＲＶ８９に対
する細胞受容体に結合したおよび／または該受容体を遮
断するポリペプチドおよび対応するポリペプチドを含む
。

本発明は、またライノウィルス株Ｉ（ＲＶ８９のウィル
スタンパクの少なくとも一つの生物学的活性を有しおよ
び／または上記ＤＮＡ分子の一つによりコード化される
ポリペプチド、特にＶＰＩ、ＶＦ６、ＶＦ６、ＶＦ６、
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ。

Ｐ２Ｃ，Ｐ３Ａ、Ｐ３ＢまたはＰ３Ｃのアミノ酸配列、
好ましくは第４図に示したアミノ酸配列またはその一部
を有するポリペプチドにも関連する。

ライノウィルス株ＨＲＶ８９のウィルスタンパクの少な
くとも一つの全体またはその一部に対応するポリペプチ
ド、任意の所定の組合せおよび順序で上記ウィルスタン
パクの少なくとも２つを結合状態で含むポリペプチドお
よび第４図に示されたアミノ酸配列またはその一部由来
のポリペプチドおよび／またはライノウィルス株Ｆ（Ｒ
Ｖ８９に対する細胞受容体に結合したおよび／またはこ
れら細胞受容体を遮断するポリペプチドも本発明の目的
である。

本発明によるＤＮＡ分子は、ライノウィルス株ＨＲＶ８
９のウィルスＲＮＡを単離し、これに対する補体ＤＮＡ
を作製し、ウィルスＣＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを適
当な複製可能なベクター内に組込み、このベクターで適
当な宿主器官を形質転換することにより、あるいは該Ｃ
ＤＮＡの一部または全体を酵素分解し、場合により化学
的ＤＮＡ合成によって適当なリンカ−と結合反応するこ
とにより、あるいは酵素および化学反応の組合せにより
調製される。

本発明によるポリペプチドは、適当な宿主器官、好まし
くは原核生物、真核生物または哺乳動物細胞、特にＥ、
二重を、本発明のウィルスポリペプチドをコードする本
発明の遺伝情報により形質転換し、次いで該情報を表現
し、本発明によるウィルスポリペプチドを単離すること
により得られる。

本発明によるポリペプチドは治療、例えば免疫系を刺激
するために、ライノウィルス株ＨＲＶ８９に対する細胞
受容体に結合および／またはこれを遮蔽し、およびモノ
クローナル抗体またはポリクローニング抗血清を製造す
るために利用できる。

本発明のポリペプチドは薬理組成物として使用すること
もでき、該組成物は製薬上不活性な賦形剤または担体と
共に、本発明のポリペプチドの少なくとも一つを有効量
で含有する。

本発明は、更にハイブリッドセルラインにも関し、該セ
ルラインはＨＲＶ２０）ＨＲＶ８９またはそのウィルス
タンパクの一部で免疫することにより得られ、また該ハ
イブリッドから得られる抗体および該抗体の利用、例え
ば治療または診断のためにあるいはこれらに結合するタ
ンパクの精製のために利用することにも関連する。

絡豆■脱皿 ＡＢＴＳ　：　２，２　’−アジノージ（３−エチルベ
ンズチアゾリンスルホネート） ＡＭＰ’　　：アンピシリン耐性 ＢＣＩＰ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
ホスフェート ＢＭＥ　　：β−メルカプトエタノールＢＰＢ　　：ブ
ロモフェノールブルー ＢＳＡ　　：牛血清アルブミン ｃｃｃプラスミド：“円形の共有結合で閉じた”プラス
ミド ＤＥ−８１−ペーパー：ジエチルアミノエチルセルロー
スペーパー ＤＭＥＭ：ドゥルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良イーグ
ル培地 ｄＮＴＰｓ：４種のデオキシトリホスフェート全ての等
モル溶液 ＤＴＴ　　ニジチオスレイトール ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＦＣ３：仔ウシ血清 ｇ　：　　アース促進 ＨＡＴ−培地：ハイポキサンチンチミジン培地ＨＩ　Ｆ
ｅ２　：熱不活化仔ウシ血清 ＨＲＶ２または１４：ヒトライノウィルスタイプ２また
は４ ＩＡＡ　　：β−インドールアクリル酸ｋｂ；　　　キ
ロ塩基 ｋｄ：　　　キロダルトン クルノー（酵素）：ＤＮＡポリメラーゼ■のりルノーフ
ラグメント Ｌ　Ｂ培地：１％のミルクカゼイン（バタトトリブトン
）のパンクレアチン消化物、 ０、５％の酵母抽出液および１％の ＮａＣ１を蒸留水中に含むルリアベク タニ（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）培地をオートクレ
ーブ中で１２０℃で２０分加熱 した培地 Ｍ：　　　１１当たり問題とする物質を１モル含む水性
溶液 ＭＥＭ　　：最小必須培地 ｍＭ：　　　１７！当たり問題とする物質１ミリモル含
有する水性溶液 ｍｌ：　　ミリリットル ＮＢＴ　　：ニトロブルーテトラドリウムｎに　　　ナ
ノメータ ＯＤ　ｈ。。：６００ローでの光学密度ＰＢＳ　　：１
複製当たり１３７ミリモルのＮａＣｌ　。

２．７ミリモルのＫＣｌ、８ミリモル のＮａｇ　ＨＰ　Ｏａ　、１．５ミリモルのＫ　ＨｔＰ
　Ｏａ　、０．５ミリモルのＭｇＣＩｌ、・６ＨｔＯお
よび１ミリモルのＣａＣ１ｚを含み、ｐ）１７．４の水
性バッファー ＰＢＳ　ｄｅｆ　　：　Ｐ、Ｂ　Ｓと同じ、但しＣａお
よびＭｇ塩を含まず。

ＰＥＧ　　：ポリエチレングリコール ＰＦＵ　　：“プラーク形成単位” ｒＡＴＰ：リボＡＴＰ ＲＰＭＩ培地：ロスウェル　バーク　メモリアル　イン
スチチュート（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉ
ａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）培地ＳＤＳ　　ニドデシル
硫酸ナトリウム ＴＥ　　　：ｌｊ！当たり１０ミリモルのトリスＨＣｊ
！　（ｐＨ７，４）および１ミリモルＥＤＴＡを含む水
性ノぐフファー混合 物 Ｔ、−ＰＮＫ：Ｔ、−ポリヌクレオチドキナーゼ Ｔｒｉｓ　　：　）リスヒドロキシメチルアミノメタン
ＴＷＥＥＮ２０　：ポリオキシエチレン（２０）ソルビ
タンモノラウレート Ｕ　：　　単位 μＣ１：　　マイクロキューリー Ｍｇ　：　マイクロダラム μｌ　：　マイクロリットル μＭ　　：　　Ｉｌ当たり問題とする物質１マイクロモ
ル含む水性溶液 ＶＰＩ、２．３．４：ウィルス被覆タンパクＶＰＩ、２
．３．４ ＶＰ○　：被覆タンパクＶＰ２およびＶＦ６のウィルス
先駆体タンパク ＸＣ：　キシレンシアツール 実施例Ｉ　　ＨＲＶ８９の調製 ＨｅＬａ細胞〔株ＨｅＬａ−オハイオ（ＨｅＬａ−Ｏｈ
　ｉｏ）、０３−１４７、フローラボラトリーズ（ｐｌ
ｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、イングランド（Ｅ
ｎｇｌａｎｄ）　）を３７℃にて懸濁培養した。この懸
濁培地〔トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）　等、プロシーデイ
ンダス　オブ　ソサイアティー　オブ　イクスベリメン
タル　バイオロジー＆メディｘｙ　（Ｐｒｏｃ、　Ｓａ
ｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、）、１９７０．１３３．６２−６５　；ストッ
）　（Ｓｔｏｔｔ）等、ジャーナル　オブ　ジェネティ
ック　バイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）　
、ｌ　９７０、ヱ、１５−２４１はショクリック（Ｊｏ
ｋｌｉｋ）によるＭＥＭの懸濁培養用としての改良（ギ
ブコ（Ｇｉｂｃｏ）　０７２−１３００）物と７％の馬
血清〔セロメッド（Ｓｅｒｏｍｅｄ）　０１３５　）と
を含んでいた。接種密度は５〜ｌ０ＸＩＯ’細胞／ｍｌ
であり、容量は５００ｍｆであった。細胞密度１×１０
’　／ｍｌで、懸濁物を無菌条件下で３００ｇにて１０
分間遠心した。上澄を捨て、細胞を感染培地（ＭＥＭを
懸濁培養用にショクリック改良した、２％の馬血清と２
ｍＭのＭｇＣ１２２を含むもの）１００ｍｊｉ中に再懸
濁した。注意して、２０ｍｆのピペットにより数回吸い
上げて、細胞を該感染培地に均一に分布させた。次いで
、これを５００ｍ１にした。細胞懸濁液を３４℃にし、
ＨＲＶ８９（２度プラーク精製したもの）により細胞光
たり０．１ウイルスの倍率で感染した。ＨＲＶ８９株は
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣＶ
Ｒ−１１９９＞から得た。この使用した株はＨＲＶ８９
　（ＡＴＣＣカタｔｌグＮａＡＴＣＣＶＲ−１１９９Ａ
ｓ／ＣＰ）に対する抗血清により中和した。使用したコ
ントロール血清はＨＲＶ　２（カタログ患ＡＴＣＣＶＲ
−１１１２Ａｓ／ＣＰ）に対する抗血清であり、これは
中和を示さなかった。３４℃にて６０時間後ウィルスを
収穫した。

ウィルスは細胞および細胞断片両方から得られ、また培
地からも得られた。このため、培地を感染細胞および細
胞断片から分離した。分離は１５００　ｇにて１０分間
の遠心により行なった。ペレットを＝７０℃にて凍結し
た。

懸濁培養物１２１からの細胞ペレットを併合し、４０ｍ
Ａの７Ｍバッファ　−（２０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ／　ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）　、ＺｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ）中に再懸
濁し、１５分間氷上におき、次いでダウンス（Ｄｏｕｎ
ｃｅ）ホモジナイザーで破砕し、混合物を６０００ｇに
て３０分間遠心した。ペレットをもう一度１０＋＋１の
７Ｍバッファーで洗浄した。２つの上澄を併合し１１０
，０００ｇにて３時間遠心して、ウィルスをペレット化
した。このウィルスペレットを、次ぎにＩｏｎ／！のＫ
ＴＭＰバッファー（５０１１１ＭのＫＣｊ！、５０ｍＭ
のＴｒｉｓ／ＨＣｊ！　−（ｐＨ７，５）　、５＋ｌ１
ＭのＭｇＣｆ　、、２ｍＭのメルカプトエタノール、１
ｍＭのプロマイシン、０．５ｍＭのＧＴＰ）に取り、１
５０ｍｃｇのＤＮアーゼ１　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社
、リボヌクレアーゼを含まない）を加えた後、氷上で１
時間インキュベートした。

このウィルスを、４℃にて濃度７％のポリエチレングリ
コール（メルク社、ＰＥＧ６０００）および４５０＋ａ
ＭのＮａＣｌと共に攪拌することにより感染培地から沈
殿させた〔コーラント（Ｋｏｒａｎｔ）Ｂ、Ｄ、等、パ
イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、１９７２０）±工
、７ｌ−８６）。低温で４時間維持した後、ウィルスを
１５００ｇにて３０分間遠心し、ペレットを７５ｍｃｇ
のＤＮアーゼ■を含む１０ｍ６のＫＴＭＰバッファーに
再懸濁し、この混合物を氷上で１時間インキュベートし
、次いで一７０℃で凍結した。

この細胞および培地から得たウィルスを併合し、３７℃
で５分間インキュベートし、冷ＴＥバッフｙ−（１０＋
Ｍ　　Ｔｒｉｓ／Ｈ（１（ｐＨ−７，４）　、Ｉｎ＋Ｍ
ＥＤＴＡＩを加えて冷却し、次いで水浴中で５分間超音
波処理した。

次に、６０００ｇで３０分間遠心した。、７％のＰＥＧ
６０００および４５０＋ｗＭのＮａＣｌを含むＴＥバフ
ファー９２０ｍ１を上澄に加え、これを注意しながら４
℃にて４時間攪拌し、得られた沈殿を６０００ｇにて３
０分間ベレット化した。このペレットを１００ｏ＋ｊ！
の７Ｍバッファーにとり、ウィルスをＰＥＧ６０００お
よびＮａＣｊ！を加えて上記の如く沈殿させ、次いでペ
レット化した。このペレットを４０ｔａｌの７Ｍバッフ
ァーに再懸濁し、この懸濁液を６０００ｇで３０分間遠
心し、ウィルスを１１０．０００ｇで３時間ベレット化
した。このペレットをｌ　ｍｌの７Ｍバッファーに溶解
し、５０μｇのＤＮアーゼＴを加えた後４℃で１時間イ
ンキュベートし、次いで１μｇのＴＥバッファーを加え
た。更に精製するために、ウィルス懸濁液を蔗糖の濃度
勾配（１０〜３０％Ｗ／Ｗ　；ＴＥバッファー中）下で
、４℃、１１０，０００ｇの下で４時間遠心した。ウィ
ルス含有画分を２６０ｒＩＩ１１での吸収により決定し
、７Ｍバッファーで希釈して蔗糖の最終濃度を１０％と
した。次に、８５．０００ｇにて８時間遠心した。得ら
れたウィルスペレットを１　ｍＡの７Ｍバッファーにと
り、−７０℃で保存した。ウィルス処方物の純度を調べ
るために、０．１％のＳＤＳの存在下で、１２．５％ポ
リアクリルアミドゲル上で空気泳動を行った〔ラエムリ
　（Ｌａｅｍｎ＋１ｉ）　Ｕ、に、　、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）　、ロンドン、１９７０，２７７．６８０
−６８５）。次いで、タンパクハンドをクーマシーブリ
リアントブルーで染色した。　）［ＲＶ８９の処方物の
タンパクパターンの典型的な像を第１図に示した。

実施例２　　ｃＤＮＡ−ＲＮＡノ１イブリッドのクロー
ニング ｏＨＲＶ８’９処方物からのＲＮＡ抽出ウィつＬｔスを
ｌ　ｍｆ！のＮＴＥＳバッフｙ−Ｃ１００ｍＭのＮａｆ
Ｊ、　　１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｊ２　　（ｐＨ９）
　、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ：］に懸濁し
、フェノールで抽出した。相分離を避けるためにクロロ
ホルムを加えた。２０μβの５ＭＮａＣ！および２０μ
βの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）を水性相に加え
、ウィルスＲＮＡを等容量のエタノールで２度沈殿させ
た。

ウィルスＲＮＡの５′−末端に共有結合しているＶＰｇ
を除くために、次いでこのＲＮＡをＮＴＢＳバッファー
中で、１ｍｇ／ｍｌのブロテイナーゼＫ（メルク社）に
より３７℃にて１５分間消化した。

リボヌクレアーゼによる汚染を回避するため、プロテイ
ナーゼにの母液（５０ｍｇ／　ｍｆ）を予め３７℃で１
５分間インキュベートした。ブロテイナーゼＫによる消
化後、該溶液をフェノール／クロロホルムで上記の如く
抽出し、エタノールを加えてＲＮＡを沈殿させた。次に
ＲＮＡの少量を、ＳＤＳ　１％を含むＴＡＢバッファー
（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、４０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／
Ｈ１ｌ　　（ｐＨ８，２）、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で２
％アガロースゲル上での電気泳動により分離した。エチ
ジウムプロミドで染色後、完全なＨＲＶ８９−ＲＮＡの
バンドを可視化した（第２図）。そのバンドの下部の弱
い拡散バンドはＲＮＡのわずかな分解を示す。

０プライマーとしてのオリゴ−ｄＴによるＨＲＶ８９−
ＲＮＡの逆転写 ４　ｕ　ｇ（７）ＨＲＶ　８９−ＲＮＡを１０μ！のＨ
３Ｃに溶解し、５μＥのｌ０ＸＲＴ−バッファー〔ＩＸ
ＲＴバッファー＝１００ｍＭのＫＣｊ２，１０＋ａＭの
ＭｇＣｊ！ｚ　、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ８
，３＞）、５μｇのオリゴ−ａＴ（１２−１８）（アル
マ−シアＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐｈａｎｍａｃｉａ
　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ）　）　、１０　
＃Ｃ３［α”Ｐ）　−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／　ｍｓ
＋ｏｊ！　；アマ−ジャム　インターナシラナル（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）　、イン
グランド（Ｅｎｇｌａｎｄ））および２０ｎｗ＋ｏｌの
ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰＳｄＴＴＰＳｄＣＴＰを加え、この全体を、全
容量５０μｌで、４２℃にて２時間インキニベートした
。２５０ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐ１１８）を２μβ加えた
後、フェノール／クロロホルムで抽出し、水性層をバイ
オゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ　３．０　　（またはセフ
ァデックｘ　（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２５）を詰
めたカラムにパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットで
通した。溶離にはＴＥバッファーを用いた。この生成し
たｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをこのようにして過剰
の〔α３２ｐ″ｌ　ｄｃＴＰから分離し、３Ｍの酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５，６）１／１０容量部およびエタノー
ル２容量部を加えた後沈殿させた。

ｏＨＲＶ８９　　ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドのホモ
ポリマー伸長（テーリング） ＨＲＶ８９　　ＲＮＡ−ＣＤＮＡバイブ’Ｊッ）’（７
）伸長を、ロイコードフリーおよびウー［：Ｒｏｙｃｈ
ｏｕｄｈｕｒｙ　ａｎｄ　　ＩＡｕ　（上記文献、１９
８０　：ｌの方法に従って行った。このＨＲＶ８９　　
ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを、５０μβのＴＴバッ
ファー（２００ｍＭのカリウムカコジレート、２５ｍＭ
のＴｒｉｓ／　ＨＣｊ’　（ｐＨ６、９）　、０．５　
ｍＭのＭｎ（Ｊｇ、２ｍＭのジチオスレイトール〕中で
、２５Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（フブルマー
シ１　Ｐ−Ｌ　　バイオケミカルズ）を含む２％ｍｏｆ
の（ｃｔ３２Ｐ３　ｄ　ＣＴＰ　（５Ｃｉ／ｍｍｏＪ）
の存在下で、３７℃にて５分間インキュベートした〔デ
ン（Ｄｅｎｇ）　Ｇ、Ｒ，＆ウー（Ｗｕ）　Ｒｏ、メソ
ッズ　オブ　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ。

Ｅｎｚｙ＋＊ｏ１．）　、１９８３．１００−Ｂ、９６
−１１６〕。２μｌの０．２５ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８）
を加えた後、フェノール／クロロホルムで抽出し、次に
反応混合物を上記のようにバイオゲルＰ３０上でクロマ
トグラフィーにかけ、エタノールでオリゴ−ｄＣ−担持
ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを沈殿させた。

０オリゴ−ｄＣ−担持ＨＲＶ８９ＲＮＡ−ＣＤＮＡハイ
ブリッドのプラスミドｐＢＲ３２２中への組込み（“ア
ニーリング）およびエシェリヒヱ　’：１　’）　（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）　ＨＢ　１０１の
形質転換 オリゴ−ｄＣ−担持ＲＮＡ−ＣＤＮＡハイブリラドを、
１００ＩＪＩｌのＮＴＥバッファー〔１００ｍＭ　　　
ＮａＣ１、１０ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！　　（ｐ
Ｈ７，６）　　、　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に加え、これ
をｐＢＲ３２２プラスミド〔予めＰｓｔ［で切断し、オ
リゴ−ｄＧ残基で重合した：ベテスダ　リサーチ　ラボ
ラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）と混合し、まず６５℃で
５分間、次いで４２℃で２時間加熱し、周囲温度まで徐
々に一夜かけて冷却し、４℃で保存した。

細胞の形質転換のために、株ＨＢ　１０１　（０３Ｍ１
６０７）を５０ＩｌｌのＬＢ培地（１０ｇのトリプトン
、５ｇの酵母抽出液、ＬｏｇのＮａＣｌを１β中に含む
）中で培養した〔マンデル（Ｍａｎｄｅｌ）Ｈｌ等、ジ
ャーナル　オプ　モレキュラー　バイオロジー（Ｊ９Ｍ
ｏ１．　Ｖｌｏｌ、）、１９７０．５３．１５９−１６
２）、形質転換に適した細胞（コンピーテント細胞）を
得るため、バクテリアをペレット化し、これを２５ｍｊ
のＴＲバッファー（１５０＋＊ＭのＫＣｊ！、５０−Ｍ
のＣａＣｆｆ１ｌ　、１ｗ＋ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ　（
ｐＨ７）　、３ｎ＋ＭのＭｇＣ１ｔ）中にとり、氷上に
３０分間保ち、再度遠心し、もう１度２ＩＩｌｌのＴＲ
バッファーに懸濁し、氷上で１時間保持した。挿入され
たＨＲＶ８９　　ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを含む
ｐＢＲ３２２を含有するこの混合物は１００μβを２０
０μｌの細胞懸濁液に加え、また５μｌのＩＭ　　Ｃａ
Ｃ１，を加え、得られた混合物を０℃で１時間、次いで
４２℃で９０秒インキュベートした０次に、２ｍｌのＬ
Ｂ培地を加え、得られる混合物を３７℃で１５分インキ
エベートした。この細胞懸濁物を、１０ｇｇ／ｍｌｌの
テトラサイタリン（シグマ社）を含むＬＢ−アガープレ
ート（ＬＢ培地中１．５％アガー）に適用し、次いで一
夜インキエベートした。テトラサイタリン耐性クローン
をアンピシリンアガープレート（１００μｇのアンピシ
リン／ｌｌｌ１；シグマ社）上でアンピシリン感受性を
調べた。

Ｏ複製ＤＮＡ分子の特徴付けおよび単離テトラサイクリ
ン耐性かつアンピシリン感受性のバクテリアのクローン
を５　ｔａｌｌのＬＢ培地（１０ｇｇテトラサイタリン
／＋＋１）中で一夜培養し、プラスミドＤＮＡを“プラ
スミド最小調製法（ｍｉｎｔ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）　”　［バーンボイム（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ）　Ｈ，Ｃ，等、ヌクレイツク　アシッズ　
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　
％　１９７９　Ｓ７．１１９５−１２０４）を用いて単
離し、複製ＤＮＡのサイズを、制限酵素Ｐｓｔｌによる
消化によって測定した。このプラスミドＤＮＡを５０＋
ＭのＮａＣｌを含む、２５ａｌｌのＲＥバッファー〔６
μｌＭのＭｇＣ１ｚ　、１　（１＋＋ＭのＴｒｉｓ／　
ＨＣ複製　　（ｐＨ７，５）、６ｍＭのメルカプトエタ
ノール〕中で、２Ｕの制限酵素Ｐｓｔｌ　　（ベテスダ
　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｉｌｌｅｔｈｅｓｄａ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）お
よび５μｇのりボヌクレアーゼＡの存在下で、３７℃に
て２時間インキエベートした。次いで、このプローブを
１．４％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。

挿入部のサイズはエチジウムプロミドで染色し、λ−旧
ｎｄｌｌｌマーカーＤＮＡと比較することにより決定で
きた。このサイズは３００〜３．３００ｂｐであった。

大量のＤＮＡ挿入部を単離するために、プラスミドを上
記のように、テトラサイクリン耐性かつアンピシリン感
受性のバクテリアクローンの２００ｒｓｌ培養物から得
、Ｐｓｔｌで消化した。？ｊ！！！！　Ｄ　Ｎ　Ａフラ
グメントは分離用アガロースゲルで上記のようにして分
離した。バンドを切断し、ＤＮＡを０．０５ＸＴＢＥバ
ツフアー（ＩＸＴＢＥバッファ＝　１００ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ／ボレート（ｐｌ（＝８．３）　、２ｍＭＢＤＴＡ
）中で電気溶出し、エタノールで沈殿させた。

ｏ　　ｐＵ０９ベクターによるＬ　ユニ菌株ＪＭＩＯＩ
細胞沖でのサブクローニング プラスミドｐＵＣ９（ビエイザ（Ｖｉｅｉｓａ）　Ｊ、
等、ジータ（Ｇｅｎｅ）　、１９８２．１主、２５９−
２６８　）はアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２由来の複製開始領域、およびＥ、ユニのｆａｃ
Ｚ遺伝子の一部を含む。いくつかの制限サイトを含む小
さなりＮＡフラグメント１ａｃＺｅ５域にあり、結果と
して、これらの切断サイトの一つにおけるＤＮＡのクロ
ーニングがｆａｃＺ遺伝子領域を遮断する。

ＤＮＡ挿入部を含むコロニーは、従ってＸ−Ｇａｌ（Ｘ
−Ｇａ１＝５−ブロモ−４−クロロ・−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトシド；ベテスダ　リサーチ　ラボラ
トリーズ）インディケータプレート上に白色コロニーと
して現れ、一方挿入部をもたないものは極立った青色で
ある〔リュッタ−（Ｒｆｆｔｈｅｒ）　Ｕ、、モレキュ
ラー　ジーヌ＆ジェネティック（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｅｔ、）　、１９８０．１７８．４７５−４７８
）。ｐＵＣＱ中のＤＮＡ挿入部をサブクローニングする
ため、複製ｐＢＲ３２２クローン（約７μｇ）をＰｓｔ
ｌで消化し、アガロースゲル（１，２％〜１．４％）上
で分離した後、ＤＮＡインサートをベクターＤＮＡから
分離した。

このＤＮＡを、上記のように電気溶出およびエタノール
沈殿によりゲルから回収した。単離したＤＮＡインサー
トを、０．４μｇのｐＵＣ９ベクター（Ｐｓｔｌで切断
し、バクテリアアルカリホスファターゼで前処理した）
を含む２０μｌのＲＥバッファー中で、１ａ＋Ｍ　　Ａ
ＴＰおよび３ＵのＴａ−リガーゼ（ベテスダ　リサーチ
　ラボラトリーズ）の存在下で、１５℃にて１時間イン
キエベートし、４℃で保存した〔ビエイザ（−Ｖｉｅｉ
ｓａ）　Ｊ８等、上記文献、１９８２）、同時に、形質
転換に対してコンピーテントなｈ　２℃菌株ＪＭＩ　Ｏ
１細胞〔ニューイングランド　バイオラブズ（Ｎｅｗ　
ｆ！ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）　）を、上記の方法
で調製した。２００．ｃｒＪの該コンピーテント細胞懸
濁液を２０μＥのｐＵＣ９リガーゼ反応−混合物と混合
し、得られた混合物を０℃で１時間インキエベートした
。

熱シラツク（４２℃で９０秒）を与えた後、この細胞を
、１０μｌの２００ｍＭイソプロピルチオガラクトシド
（シグマ社）、２０ｍｇのＸ−Ｇａ１を１■ｌのジメチ
ルホルムアミド中に溶かした液５０μｌおよび１　ｖｇ
ｌｌのＬＢ培地と混合し、得られた混合物を３７℃にて
１時間インキエベートした。この細胞懸濁物の２００μ
ｌバツチをアンピシリンＬＢ−アガープレート（１００
μｇ／＋ｗｚ）上に移し、インキュベータ中で３７℃に
て一夜インキエベートした。正の形質転換体を白色コロ
ニーとして同定し、これを“プラスミド最小調製法”を
用いてＤＮＡインサートにつき調べた。

０複製ＤＮＡのインサートをもつｐＵＣ９プラスミドの
調製 ｐＵＣ９で形質転換され、かつＤＮＡインサートを含む
、生成されたＥ、　　：２１ＪＪＭ１０１のサブクロー
ンを２００ｍ１のＬＢ培地（１００μｇのアンピシリン
／ｌａｇを含む）中で培養し、このプラスミドＤＮＡを
単離した〔バーンボイム（Ｂｔｒｎｂｏｉｎ＋）　Ｈ，
Ｃ，等、上記文献、１９７９）、次いでこのプラスミド
ＤＮＡを１００μｌのＴＥバッファー中に溶かし、この
溶液をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）−１０００
カラム（ＩＸ２０ｃｍ）上でＴＥバッファーでクロマト
グラフィー処理した。

精製プラスミドを含む両分を吸収により特定し、次いで
併合し、凍結乾燥した。このプラスミドを５００μｌの
ＴＥバッファーにとり、６５℃で５分間インキュベート
し、再度フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈殿させた。

０プラスミドｐＨＲＶ８９−１００．ｐＨＲＶ８９−１
３６、ｐＨＲＶ８９−１９３からのおよび合成法による
プライマーフラグメントの製造対応するＤＮＡインサー
トを含むクローン１００．１３６および１９３をｐＵｃ
９にサブクローンし、２００ｍ１のＩ、Ｂ培地（１００
μｇのアンピシリン／ＩＩＩｔを含む）中で培養し、こ
のプラスミドを上記のように単離した。クローン１００
からのプライマーフラグメント（５４ヌクレオチド）を
、制限酵素ＮｃｏｌおよびＰｖｕ■で消化することによ
り得たくこのプライマーフラグメントは第３図において
フラグメントＡとして命名されている）。

このため、クローン１００からの精製プラスミド２００
μｇを、３０ＵのＮｃｏｌ　　にューイングランドバイ
オラブズ）を含む５０ｎ＋ＭのＮａＣｌの存在下で２０
０μｌのＲＥ培地中で、３７℃にて１５時間インキュベ
ートした。反応終了後、エタノールで沈殿させ、切断プ
ラスミドを、２０ＵのＰｖｕＩ［にューイングランド゛
バイオラブズ）を含む５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で１
００μｍ！のＲＥバッファー中で３７℃にて１５時間イ
ンキュベートした。制限酵素による消化パターンは１．
４％アガロースゲル上での電気泳動により調べた。Ｎｃ
ｏｌ／ＰｖｕＩ［フラグメントを１００μβのＯＧ？容
液（１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）　、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ。

０．０１％オレンジＧ）にとり、このＤＮＡを予備１５
％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアク
１ノルアミド＝１１１、ゲル厚１．２ｍｍ）上で、ｌ　
ｘＴＢＥバッファー中で分離した。５４ｂｐＮｃｏ　Ｉ
　／　ＰｖｕＩＩフラグメントを、エチジウムプロミド
で染色した後切断し、フラグメントを０．５×ＴＢＥバ
ツフアー中で電気溶出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿さ
せた。次に、このＤＮＡフラグメントを、２００Ｕのバ
クテリアアルカリホスファターゼ（ベテスダ　リサーチ
　ラボラトリーズ）を含む、ｐＨ８の１００ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ／　ＨＣＩ　　５０　ｕ　１中で、６５℃にて１
時間インキュベートした。反応後、ｐＨ８の０．５　Ｍ
　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　２．５μｌを加え、水性相をフェノ
ール／クロロホルムで２度抽出し、ＤＮＡをエタノール
で沈殿させた。このＤＮＡを水に溶解し、２０μＣｉ　
　γ−（”Ｐ）−ＡＴＰ〔比活性５０００Ｃｉ／　ｍｍ
ｏ　ｌ　Ｈアマ−ジャム　インターナショナル（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）　）および
５Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア　Ｐ−
Ｌ　　ラボラトリーズ）を含む５０μβのにバッファー
（１０ｍＭのＭｇＣｆｆｚ、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ
１（ｐＨ８）　、５ｎ＋Ｍジチオエリスリトール〕中に
て、３７℃で３０分インキュベートした。次いで、この
３ｔＰでラベルされたフラグメントを沈殿させ、１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび０．０１％のキシレンシアノ−ルーブロ
モフェノールブルーを含む３０％ジメチルスルホキシド
３０μβ中に取出した。

この溶液を９０℃で２分インキュベートし、水中で冷し
、ＴＢＥバッファー中にて１５％ポリアクリルアミドゲ
ル（アクリルアミド／ビスアクリルアミド−５９：１ニ
ゲル厚１．２ｍｍ）に適用し、２種のＤＮＡ鎖を電気泳
動（２００Ｖにて１５時間）により分離した。オートラ
ジオグラフィーを利用して、これら２つの鎖を確認し、
切断し、電気溶出した。ＨＲＶ８９−ＲＮＡとハイブリ
ッド化した鎖を１ドツト−プロット（ｄａｔ−ｂｌｏｔ
）　　”試験により決定した。ここで、寸法２×２ｃｆ
ｌＩの２種のニトロセルロースストリップ〔シュライヒ
ャー＆ジュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｉ
ｉｌｌ　）　、Ｂ　Ａ　８５．０．４５μｍ）をＨ，Ｏ
で湿潤させ、一度２０×ＳＳＣ（Ｉ　Ｘ５ＳＣ＝　１５
０１１１Ｍ　　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリウム
、ｐＨ７，４）で洗い、風乾した。

約１μｇのＨＲＶ８９−ＲＮＡをドツトとして各ストリ
ップに適用し、次いで乾燥し、８０℃で２時間インキュ
ベートした。次に、このストリップを２ＸＳＳＣで湿潤
させ、１１１ＩｌのＨバッファー（４００ｍＭ　Ｎａ（
１，４９ｍＭ　Ｐ　Ｉ　ＦＥＳ　（ｐＨ６，４）、１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ、８０％ホルムアミド）中で、４μｇの
変性鮭精子ＤＮＡ　（シグマ社、１００℃で２分インキ
ュベートし、０℃に冷却）と共にプラスチックフィルム
中で、４２℃にて１時間−緒にインキュベートした。次
いで、この２つのニトロセルロースストリップを別々に
夫々０，５ｎ１（７）Ｈバッファー、４μｇの変性鮭精
子ＤＮＡおよび１アリコートの単離鎖（２００００ｃｐ
ｍ）と共にプラスチックフィルムで密封し、４２℃で一
夜ハイブリッド化した。このインキュベーション後、フ
ィルタを５０℃で１０分２ＸＳＳＣで２度洗浄し、０、
　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで２度、０．１％ＳＯ５で５０℃
にて３０分洗浄し、放射能を測定した。

ＨＲＶ８９−１３６およびＨＲＶ８９−１９３からのプ
ライマーフラグメントをこのようにして単離した。ｐＨ
ＲＶ８９−１３６からのフラグメント（第３図にフラグ
メントＢとして示した）はＤｒａＩと１ｌｉｎｄｌＩ［
制限サイト間にあり　（１２２ヌクレオチド）、これら
制限酵素での消化により得られる。フラグメントＣはｐ
ＨＲＶ８９−１９３から単離され、１３９ヌクレオチド
に対応する長さをもち、２つのＲｓａＩ制限酵素間にあ
る（第３図）。

鎖の分離およびハイブリッド化を上記のように実施した
。プライマーＤは化学的に、アブライドバイオシステム
ズ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓａｐｐ
ａｒａｔｕｓ）を用いて、確立された方法により合成し
た。

０ブライマーフラグメントを用いたＨＲＶ８９−ＲＮＡ
の逆転写 上記のように、クローン１００　（フラグメントＡ）、
１３６（フラグメントＢ）および１９３（フラグメン）
Ｃ）から単離または化学的に合成した、ＨＲＶ８９−Ｒ
ＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡの５ｐａＩ０１を水性溶液
からエタノールにより０．２５ｐｍｏ　！ｔのＨＲＶ８
９−ＲＮＡと共に沈殿させた。

この沈殿を２０μｌのＩ］バッファーにとり、キャピラ
ーに結合し、７２℃で１０分インキュベートし、５０℃
とし、徐々に３５℃に冷し、次いで氷上に置いた。次い
で、この溶液を１００μｌのＲＴバッファー中で、１４
０Ｕの逆転写酵素〔アングリアン　バイオテクノロジー
　コーポレーションケンブリッジ（Ａｎｇｌｉａｎ　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ、＋Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ））　、８　Ｕのリボヌクレアーゼインヒビタ（ＲＮ
ａｓｉｎ、ベテスダ　リサーチ　ラボラトリーズ）、０
．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ　Ｔ
Ｔ　Ｐ、　３０　ｐＣｔの〔α”Ｐ）ｄＣＴＰおよび５
ｍＭのジチオエリスリトールの存在下で、４２℃にて２
時間インキュベートした。得られた逆転写体は上記のよ
うに処理した。

０複製ＤＮＡに戯けるＨＲＶ８９配列の検出および制限
マツピング 複製体からのプラスミドＤＮＡを３ｍｌの培養物カラ単
離した〔ハーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　ｆｌ、Ｃ
。

等、上記文献、１９７９］。このＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔＩと共にインキュベートし、このプローブを１．４％
アガロースゲル上での電気泳動により分析した。このゲ
ルをエチジウムプロミドで染色した。次に、このＤＮＡ
を該ゲルからニトロセルロースフィルタに移し〔サウザ
ン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ε０Ｍ。

ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー（Ｊ、
　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、）、１９７５．９８．５０３−
５１７）、８０℃で２時間インキュベートすることによ
りニトロセルロース上に固定した。このフィルターを、
５０％のホルムアミド、１×デンハーツ溶液〔デンハ−
７（［）ｅｎｈａｒｄｔ）　Ｄ、Ｔ９、バイオケミカル
　バイオフィジカル　リサーチ　コミニニケーシＢンズ
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ
ｍｍ、）、１９６６．２３．６４１−６４６）、９００
ｍＭのＮａＣｊ！、　５０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ
７，４）　、５１１ＭのＥＤＴＡ中で、ε０Ｍｇ７ｍｌ
の変性サーモン精子ＤＮＡと共に、プラスチックバッグ
内で４２℃にて２時間予備−インキユベートした。上記
のように放射性ＨＲＶ８９−ｃＤＮＡを調製した。但し
、この反応混合物は５０μＣｉの〔α”Ｐ）ｄＣＴＰを
含ンテイた。こ（７）ｃＤＮＡ−ＨＲＶ８９−ＲＮＡハ
イブリッドを１００℃で９０秒加熱して変性した。ハイ
ブリッド化のため、このフィルタを上記のように放射性
ＨＲＶ８９−ｃＤＮＡと共に４２℃で１８時間インキュ
ベートした。次いで、２ｘＳＳＣで２度、および０．１
％ＳＤＳ中で２度５０℃にて３０分間洗浄し、風乾し、
−７０℃にした〔コダック　（Ｋｏｄａｋ）　Ｘ　Ａ　
Ｒ−５、増感フィルムで８〜４０時間〕時間対性バンド
の存在はＨＲＶ８９−ＲＮＡに相補的な複製ＤＮＡの存
在を示した。

マツピングのため、ＤＮＡインサートを製造業者の指定
あるインキエベーション条件にて、制限酵素にューイン
グランドバイオラブズおよびベテスダ　リサーチ　ラボ
ラトリーズ）を用いて消化した。制限マツピングの結果
は第３図に示す。

プラスミドｐＨＲＶ８９−８０およびｐＨＲＶ８９−８
２は、末端転写酵素反応により生ずる鎖延長を由来とす
るオリゴ−Ｃに近接するＡ残基の長い配列を含み、これ
はＨＲＶ８９−ＲＮＡの３′−末端ポ’Ｊ−Ａの一部を
形成する。他のプラスミドは個々の制限酵素の特異的開
裂サイトによってｐＨＲＶ８９−８０およびｐＨＲＶ８
９−８２に相対的に配置された。５００ｂｐ以下のＤＮ
Ａインサートは制限酵素マツピングによる分析は行わな
かったが、即座にサブクローン化し、ｐＵＳ９で配列決
定した（実施例３参照）。残りのクローンの同定は、グ
ルンシュタインとホグネスの方法（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ
　Ｍ、＆　Ｈｏｇｎｅｓｓ　Ｄ、Ｓ、　　、プロシーデ
インダス　オブ　ナショナル　アカデミ−オブサイエン
スユーエスｘ−−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、１９７５、■、３９６１−３９６
５）を用いて、′ニック翻訳（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ）″プローブにより予めマツピングされてい
るＤＮＡインサートを用いたコロニーハイブリッド化に
より達成された。

ｓｚｐで標識したＤＮＡプローブを６二ツク翻訳キツト
”　〔アマ−ジャム　インターナショナル、イングラン
ドにより製作；アマ−ジャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）キッ
トｌｋ５０００）によって得た。

ただし、〔α−”Ｐ）　ｄ　ＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／
ｍｌ１ｏ　ｌ　）を用い、製造業者の指示に従った。標
識ＤＮＡをパスツールピペット中のバイオゲルＰ３０を
用いＴＥバッファーにより分離した。排除体積に対応す
る画分を併合し、１００℃で２分間加熱し、即座に氷水
中にいれた。上記の如くハイブリッド化を行った。５０
ｍｊ！の培養物を、正のハイブリッド化シグナルを示す
コロニーから調製（１０μｇ　７ｍ　ｌのテトラサイタ
リンと共にＬＢ培地中で一夜）した。このＤＮＡインサ
ートをＰｓｔｌでプラスミドＤＮＡから分離した０次い
で、これらインサートを、種々の制限酵素で消化しおよ
び配列決定により特徴付けした。このようにしてクロー
ンが得られ、これはＨＲＶ８９のゲノムを示す。

実施例３　旦凡人聚剋人定 ＨＲＶ８９のｃＤＮＡクローンをマクサムおよびギルバ
ードの方法（Ｍａｘａ−八、　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ　Ｗ
、、メソッズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ。

複製ｎｚｙｍｏ１．）、１９８０．６５，４９９−５６
０３の改良法あるいはサンガー等のＭ１３一連鎖停止法
（Ｍ　１３−ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍ
ｅｔｈｏｄ）（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、等、プロシーディン
ゲス　オプ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス
　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　、１９７７．１土、５４６３−
５４６７）を利用して配列決定した。

マクサムおよびギルバートに従って配列決定するため、
ＤＮＡインサートを上記のようにｐｕｃ　９でサブクロ
ーニングし、コンピーテントＥ、１１ＪＪＭＩＯＩ細胞
をこれによって形質転換した。正の形質転換体を白色コ
ロニーとして分離し、ＬＢ培地（１００μｇ／ｒｓｌｌ
のアンピシリンを含む）内で培養した。１０〜２０／Ｊ
ｇｃ）ＤＮＡを１００μｌ中で一夜、制限酵素と共に標
準的な反応条件下で消化した。この酵素はプラスミド中
に、例えばｐＵＣ９のポリリンカー領域に開裂サイトを
もつ、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ａｃｃ　Ｉ　、
１ｌｉｎｄｎｒなどである。次いで制限フラグメントを
脱ホスホリル化した。制限酵素による消化のため、５μ
ｌの２Ｍ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（ｐ）１８）および１０
０Ｕのバクテリアアルカリホスファターゼ（ベテスダリ
サーチ　ラボラトリーズ）を加え、６５℃で３時間イン
キュベートした。２０ｍＭまでＥＤＴＡを加えた後、こ
の混合物をフェノール／クロロホルムで２度抽出し、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈殿させた。次に、このＤＮＡを５
０ｔｔｌの５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ／！　　（ｐＨ
８）　、１　（ｌｅＭ　　ＭｇＣｊ！ｘ　、５ｏ＋Ｍジ
チオエリスリトールを含む液中で、２５μＣｉの〔Ｔ−
”Ｐ）ＡＴＰ　（５００（７Ｃｉ／　ｖａｍｏＩＨアマ
−ジャム　インターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａａ＋Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）　）および４ＵのＴ４−ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ファルマーシア　Ｐ−Ｌ　　
バイオケミカルズ）と共に３７℃にて３０分インキュベ
ートし、標識ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。

一つの鎖中の３！Ｐで標識された複製ＤＮＡを、他の制
限酵素を用いて、上記のようにアガロースゲル（１，２
〜１．４％）中で電気泳動し、次いで電気溶出し、エタ
ノール沈殿によって得た。該酵素はｐＵＣ９のポリリン
カー領域中で開裂を行う。

Ｏマクサムおよびギルバートの方法の改良法によるＤＮ
Ａ配列決定 この配列決定反応はマクサムおよびギルバートによる以
下のような改良により実施した（上記文献、１９８０）
。

−キャリヤーＤＮＡを添加しなかった。

−ＤＮＡ溶液を以下のアリコートに分割した。

グアニン（Ｇ）特異的反応７．５μｌ；グアニンおよび
アデニン（Ｇ／Ａ）特異的反応１０μＩｔ：シトシンお
よびチミン（Ｃ／Ｔ）特異的反応１０μｌ；シトシン（
Ｃ）特異的反応６μｌ。

−２５μｌの９６％蟻酸を（Ｇ／Ａ）−反応混合物に添
加した。これは次いで１９℃にて４．２５分インキュベ
ートされた。反応停止のために２００μｌのヒドラジン
停止溶液および７５０μｌの９６％エタノールを加えた
。

この（Ｇ／Ａ）−反応を次いで他の３つの反応と同じよ
うに処理した。

−ヒドラジンの代りに、ヒドラジニウムヒドロキシド（
メルク社）を、（Ｃ／Ｔ）および（Ｃ）−反応で使用し
た０反応時間は７．５分であった。

−ピペリジン反応は９５℃で３０分インキエベートした
。凍結乾燥後、フラグメントを３〜２０μｌのバフファ
ー（８０％脱イオンホルムアミド、Ｉ　ＸＴＢＥ、０．
０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレ
ンシアツール）中で、９５℃にて９０秒加熱し、急速に
０℃まで冷した。

配列決定のため、６％ポリアクリルアミドゲル（４０ｃ
ｍＸ　２０ｃｍＸ　Ｏ，４ｍｍ）を８ＭウレアおよびＩ
　ＸＴＢＥと共に用いた。これはプローブの適用前に５
０Ｗで１時間電気泳動に付された。１μβ〜３μｌの各
反応混合物をこのゲルに適用した。

通常、２回のゲルへの充填を異る時間で実施した。

最初の反応混合物のゲル通過はブロモフェノールブルー
マーカーがゲルの末端に達するまで行い、２度目の通過
はキシレンシアツールマーカーがゲルの末端に達するま
で続けた。

このゲルを次いで１０％酢酸および１０％メタノール（
約２１り中で２０分固定し、３ＭＭ−濾紙に移し、８０
℃にてゲル乾燥器上で乾燥した。

次いで、このゲルを増重フィルムなしに、ＸＡＲ−５ス
クリーン〔コダックＣＫｏｄａｋ）社〕を用いて一７０
℃とした（約１８〜３６時間）。

ＯＭ１３配列決定 １０００ｂｐ以上に相当する長さのＤＮＡインサートを
ショットガン法〔グイニンガー （Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ）　Ｐ、Ｌ、　、、アナリティ力
ル　バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ
＋、）　、１９８３．１２９．２１６−２２３）により
配列決定した。

複製クローンを適当な制限酵素で消化し、ＤＮＡインサ
ートを上記のように、予備アガロースゲル（１，２〜１
．４％）上で分割し、次いで電気溶出し、エタノール沈
殿することにより単離した。

このＤＮＡインサートを、１ｍＭのＡＴＰおよび３Ｕの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラブズ）
の存在下で、２０μｌのＲＥバッファー中にて１４℃で
１５５時間インキュベートた。環化ＤＮＡをＴＥバッフ
ァー（ＩＯＩＩＭのＴｒｉｓ／Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ７，５
）　、１ｍＭのＥＤＴＡ）で最終体積５００μｌとなる
まで希釈し、氷で冷却しつつ超音波処理しく４×５秒最
高エネルギー、ＭＳＥ超音波出力装置）、エタノールで
沈殿させた。

得られたＤＮＡフラグメントの末端を２０μｌのＲＥバ
ッファー中で１４℃にて２時間インキュベートした。該
バッファーは５０ｇＭの各ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ並びに２Ｕのクレ
ノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〔ベーリンガー　マ
ンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
）を含んでいた。アガロースゲル（１，４％）上での分
離後、４００〜９００ｂｐに相当する長さのＤＮＡフラ
グメントを電気溶出およびエタノール沈殿により回収し
た。これらのＤＮＡフラグメントをＭ１３ｍｐ９ベクタ
ー（これは制限酵素Ｓ　ｍａ’Ｉで線状化されたもの）
に挿入し、１ｍＭのＡＴＰおよびＩＵのＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼの存在下でバクテリアアルカリホスファターゼで
処理した（インサート二ベクター＝５　：　１）　、該
処理は１５℃で１５時間行った。

形質転換に対してコンピーテントなＥ、　　！菌株ＪＭ
Ｉ　０１細胞をリガーゼ反応からの混合物と共に０℃に
て少な（とも２時間インキュベートした。４２℃で９０
秒間の熱シヨツク後、この細胞を４０μｌの１００ｍ　
ＭＩＰＴＯ，４０μｌの２％Ｘ−Ｇａｇを含むＤＭＦ溶
液および溶融し、４２℃に調節された３　ｍｊ２の上部
アガー（１β中に１０ｇのトリプトン、８ｇのＮａＣｊ
、８ｇのアガー）と混合し、次いでわずかに予熱したＨ
プレート（ＩＩｔ中１０ｇのトリプトン、８ｇのＮａＣ
１，１２ｇのアガー）に適用した。上記アガーを硬化し
た後、該プレートを３７℃で一夜インキユベートした。

一本鎖ファージＤＮＡを単離すべく、無色プラークラ１
．５ＩＩＩｌノ希ＭＥ、　　ＪＪ　Ｍ　１０１培養物（
１００ｍｌの２ＸＴＹ培地（１１中、１６ｇのトリプト
ン、１０ｇの酵母抽出液、５ｇのＮａＣβ）に希釈した
１ｍβの静止培養物〕を含む試験管に移した。３７℃で
の６時間のインキュベーション後、このバクテリアを遠
心により取出し、ファージを、周囲温度で１５分間かけ
て２０％ＰＥＧ３０００と２．５Ｍ　　ＮａＣ１を含む
溶液２００ｕＪを加えて上澄から沈殿させた。この沈殿
をペレット化し、上澄全体を除去した。このペレットを
１００μｌのＴＥバッファーに溶解し、上記のよせた。

各−零１４　Ｄ　Ｎ　Ａの寸法を、野生形のファージＤ
ＮＡに対して、０．８％アガロースゲル上で電気泳動す
ることにより決定した。この配列決定は連鎖停止法〔サ
ンゴ（Ｓａｎｇｅｒ）　Ｆ、等、上記文献、１９７７）
により変更なしに行った。

０配列決定データの解析 配列決定データをサイバー（Ｃｙｂｅｒ）　１７　Ｑコ
ンピュータで解析した。使用したプログラムはスタテン
（Ｓｔａｄｅｎ）プログラム（Ｓｔａｄｅｎ　Ｒ，、ヌ
クレイツク　アシソズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓ、）　、１９８０Ｓ８．３６７３−３６
９４）およびイソメの改良プログラム（Ｉｓｏｎｏ　Ｋ
、、同上、１９８２０）上皇、８５−８９）であった。

このウィルスタンパクはポリタンパクのタンパク分解開
裂により得られる。これら開裂サイトを同定するため、
ウィルス被覆タンパクを単離し、Ｎ−末端アミノ酸配列
を決定した。このために、ＨＲＶ２　２ｍｇからのタン
パクを１２．５％ポリアクリルアミドゲル〔ラエムリ　
（Ｌａｅｍｍｌｆ）　Ｕ、に、、上記文献、１９７０）
上で電気泳動により分離した。このゲルをｐＨ７，４の
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／　Ｈ（ｌの飽和クーマシーブリ
リアントブルー溶液で染色し、タンパクバンドを切取っ
た。各タンパクをｌ５ＣＯｉ出装置内で５０Ｖにて１６
時間電気溶出した。Ｎ−末端アミノ酸をＡＢ−４７０Ａ
タンパク配列決定装置〔アプライド　バイオシステムズ
　インコーホレーテッド　フォスタシティー、カルホル
ニア、ニーニスニー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅ＋ｓｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）を用いて
決定した。配列決定のため、２μｍｏ１のＶＰＩおよび
ＶＦ６並びにｌｎｍｏｆｆのＶＦ６を用いた。こうして
得たアミノ酸をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー
）により分析した。個々のタンパクのＮ−末端配列を第
６図に示した。

実施例５　　　ブースミド　ＲＨｌｏｏのノすべての酵
素反応は製造業者に指定された条件下で行った。

７μｇのプラスミドｐＥＲ１０３（エバ　ドウォーキン
ーラスル（Ｏｖａ　Ｄｗａｒｋｉｎ−Ｒａｓｔｌ）等、
ジータ（Ｇｅｎｅ）　、１９８３．２１．２３７−２４
８　；欧州特許出願Ａ−０１５５６１３号〕を制限エン
ドヌクレアーゼ１ｌｉｎｄｎｌにより５０μｌの反応媒
質中で線状化した。３７℃で１時間インキエベートした
後、５０μｌの２ＸＣＩＰバツフアーを加えた（２ＸＣ
ＩＰバツフｙ　−＝　２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　（ｐ）１
９．２）　、０．２ｍＭ　　ＥＤＴＡ）、２Ｕの牛腸ア
ルカリホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）を加えて、５′−末
端ホスフェート残基を除去し、インキュベーションを４
５℃で３０分行った。この反応を４μｌの０．５Ｍ　　
ＥＤＴＡ溶液および１０μ２のＩＭＴｒｉｓ　（ｐＨ８
，０）溶液を加えて停止させた。フェノールで２度、お
よびフェノール／クロロホルムで一度抽出することによ
りタンパクを取出した。このＤＮＡは、ｐｏｓ、ｓの０
．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液および２５０μｌのエ
タノールを加えた後水性相から沈殿させた。このＤＮＡ
沈殿を遠心し、７０％エタノール溶液で一度洗浄しζ。

このＤＮＡを乾燥し、このベレットをＴＥバッファー〔
１０ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ　　（ｐＨ８，０）　　、　１
ｍＭ　　　ＥＤＴＡ）　　２　０　　ｐ　　ｌ中に溶解
した。

合成により調製したオリゴスクレオチドｄ　（ＡＧＣＴ
ＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣ，ＣＴ）およびｄ　（ＣＡＴＣＴ
ＴＴＡ）の１Ｍｇバッチを、１０μｌの反応液中で、１
０ＵのＴ４−ＰＮＫおよび１＋ＭのｒＡＴＰを添加して
ホスホリル化した。この反応は３７℃で行い、４５分続
けた。これは７０℃で１０分加熱することにより停止し
た。

プラスミド溶液の５μｌバツチとホスホリル化オリゴペ
プチドとを一緒に混合し、７０℃で５分加熱した。次い
で、この溶液を０℃に冷却し、２μｌの１０ｘリガーゼ
バツフアー（５００ｍＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，５）　、
１００ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　、２００ｍＭＤＴＴ、１ｍ
Ｍ　　ｒＡＴＰ、５００μｇ／ｍ１のＢＳＡ）　、２μ
ｌの水およびＩＯＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えた。

この反応を４０時間続け、４℃で実施した。これは７０
℃で１０分加熱して停止した。

このリガーゼ反応液の２μｌをＩＯＵの制限エンドヌク
レアーゼ５ａｃＩにューイングランドバイオラブズ）に
より、全体で３０μβの溶液として、３７℃で３時間消
化した。７０℃で１０分加熱してこの反応を停止した。

この反応混合物５μβを、全体で３０μＥとして、ＩＯ
ＵのＴ４−ＰＮＫを加えて、１４℃にて１６時間結合を
行った。

２００μｇのコンピーテントＥ、　　：］ｌ、Ｉ）（Ｂ
ＩＯＩをこのリガーゼ反応液１０μｌと一緒にした。こ
のバクテリアは氷上に４５分維持し、次いでＤＮＡの取
込みを行わせるために４２℃とで２分加熱した。このバ
クテリア懸濁液を次に再度０℃で１０分インキュベート
した。最後に、形質転換したバクテリアを５０μｇ／ｍ
１のアンピシリンを含むＬＢアガー上に展開させた。

形成したバクテリアコロニーのうち１２を任意に選び、
微量スケールでこれらからプラスミドを単離した〔バー
ンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　Ｈ，Ｇ、等、ヌクレイ
ツク　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲ
ｅｓ、）　、１９７９、？、１５１３−１５２３）　、
得られたＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｃｌで切
断し、ＤＮＡをアガロースゲル（１％；ＩＸＴＢＥバッ
ファー）上で分割した。約４４００ｂｐに対応する長さ
の線状分子としてのＤＮＡの移動により、５ａｃｌ認識
サイトがプラスミド内に挿入されたことが確認された。

これらプラスミドの一つを任意に選んだ。再度Ｌ　ユＩ
ＪＨＢＩＯＩを対応する最小調製法で、このＤＮＡによ
り形質転換した。得られた［転換バクテリアの中の一つ
のコロニーを選び大規模に培養した。これら単離された
プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩで切断し、このＤＮＡを１％アガロースゲル
上で分析し、小さなフラグメントを該ゲルから電気溶出
により単離した。約４６ｏｂｐに相当する長さのＥｃｏ
ＲＩ　−Ｂａａ＋ＨＩ　　ＤＮＡフラグメントはサンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、、１９７７．７４．５４６３−５４６７）に従
って配列決定した。かくして分析したプラスミドはｐＲ
Ｈｌｏｏと命名した（第７図）。

例えば、第９図に示したＤＮＡ、即ちベクター例えばｐ
ＵＣ９においてインサートとして存在する、欧州特許出
願筒Ａ−１９２１７５号に従って得ることのできるＨＲ
Ｖ２ゲノムのフラグメントから出発して、このＤＮＡイ
ンサートを制限酵素１１ｉｎｄｌＩ［（バイオラブズ）
およびＥｃｏＲＩ（ベーリンガー　マンハイム）によっ
て、１００μｌのＥｃｏ−旧ｎｄバッフｙ　　（７，５
ｍＭ　　Ｍｇ（Ｊ！、、７５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１（ｐ
Ｈ７，５）　、５０ｍＭ　　Ｎａ（１）中で、１５Ｕの
ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄＩ［ｒを用いて３７℃で１５時
時間型消化することにより切断した。このインサートＤ
ＮＡを線状化ベクターから、１％アガロースゲル上で分
離した。このため、１００μｌを１１μｌの１０×アガ
ロースゲル“担持バッファー″　（１，１％ブロモフェ
ノールブルー、０．１％キシレンシアツール、３５％フ
ィコール、０．５％５ＤＳ）と併合した。ｐ　ＨＲＶ　
２−９６９のＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄｌｌ［フラグメン
ト（約１．１　ｋｂ）を、ＤＥ８１濾紙〔）７−／トマ
ン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）　）を用いてアガロースゲルか
ら単離した〔ドウレフツエン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）　Ｇ、
　Ｍ、等、アナリティカル　バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１９８１．１１２．２
９５−２９８）。アガロースゲル上のＤＮＡフラグメン
トを分離した後、スロットを単離すべきＤＮＡの前後で
切断し、ＤＥ８１紙のストリップをこれらスロットに挿
入した。電気泳動を続け（ゲルをバッファーで覆っては
ならない）、フロント部のＤＥ８１ストリップに所定の
ＤＮＡフラグメントを完全に結合させた。後方のＤＥ８
１ストリップにより大きなりＮＡフラグメントによる汚
染を防止した。結合ＤＮＡフラグメントを有するＤＥ８
１濾紙を１，５ｍｊ２のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ）試験管に入れ（該管においては、底部に流出口
をもち、ポリアロマ−ウールがその上に置かれている）
、５分間５００μｌの洗浄バッフｙ　　　（０，２ｍＭ
　　ＮａＣ１，２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／Ｈ（Ｊ（ｐＨ８
，０）　、ＩＭ　　ＥＤＴＡ）で２度洗い、この洗浄液
を簡単な遠心（約１秒）により、下方におかれた第２の
エソペンドルフ容器にとった。次に結合ＤＮＡを上記の
ように２度洗浄し、次いで２００１１１の溶出バッフｙ
−（１ｍＭ　　ＮａＣ４！。

２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ１７，５）　、１
ｎ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ）中で１５分間インキエベートして
、該ＤＮＡをＥＤ８１濾祇（エチジウムプロミドは吸着
されたままである）から溶出した。４００μｌの溶出液
をエソペンドルフ遠心機（１５０００ｇ）で１０分遠心
して、濾紙のくず全部を除いた。上澄を新たなエッペン
ドルフ容器に注意して移し、８００μｌの９６％エタノ
ールを加え、混合物を一２０℃（約２時間）で沈殿させ
、７０％エタノールで２度洗浄し、乾燥し、５０　ｐ　
ｌ　（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ８）　、１
０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ）のバッファー中で３７℃にて２
時間に亘りＩＯＵのＸｈｏＩＩ　（ベーリンガー）によ
り切断した。

制限酵素を不活性化するため、この混合物を７０℃にて
２分インキュベートし、次いで徐々に周囲温度まで冷却
した。これらの５０μｌに、６μｌの１０×タルノーバ
ツフアー（６６０１１１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｊ２　（ｐＨ
７，５）　、６６ｍＭ　　ＭｇＣ複製ｚ　、３ａ＋Ｍｄ
ＮＴＰｓ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍｇ／　ｍｌのＢＳ
Ａ）　、２μｌのクルノー酵素（４Ｕ／ｍ１；アマ−ジ
ャム）および２μｌのＨ，Ｏを加え、この混合物を２２
℃で３０分インキュベートした。

この反応を２μＥの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡの添加により
停止させ、水性相を同一容量のフェノール／ＣＨＣｊ！
ｓ／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一度、
同一容量のＣＨＣＪ３で一度抽出し、次いで７μ！の１
０×アガロースゲル含をバッファーを加えた。１０９２
ｂｐ相当の長さのＸｈｏｌＩフラグメントを得られたオ
リゴヌクレオチドから分離するために、“プラントエン
ド”構造をもつフラグメント（９６９／１）をＤＥ８１
濾祇を用いて１％アガロースゲルから単離した。使用し
た表現ベクター即ちｐＲＨｌｏｏは本質的にｐＢＲ３２
２誘導体であり、その変性は１２３ｂｐ相当の長さのフ
ラグメントが塩基４３６２１０（ｐＢＲ３２２のＢｃｏ
ＲＩサイト）および２９　（ｐＢＲ３２２の旧ｎｄｌ［
ｒサイト）との間に挿入されていることであり、このフ
ラグメントは皇うチア　マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のトリプトファンプロモー
タ領域、合成リボゾーム結合サイトおよび開始コドン＾
ＴＧ（第８図参照）を有する。

表現プラスミドｐＲＨ９６９／１の形成は第１０図に図
式的に示されている。約１０μｇの表現ベクタｐＲＨ１
００を、１００Ｕの５ａｃＩ（バイオラボ）により、２
００μｍ　（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ７，５
）　、６ｍＭ　ＢＭＢ、　６ｍＭ　ＭｇＣ複製ｚ　）中
で３７℃にて一夜消化した。このプラスミドＤＮＡをエ
タノールにより通常の方法で沈殿させ、洗浄し、乾燥し
、２００＃Ｉｌ　（２００ｍＭ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　
　ＺｎＣ１ｔ　、３０ｍＭのｐＨ４，７５の酢酸ナトリ
ウム、５％グリセロールを含む）中にとり、１５０Ｕの
ヤエナリヌクレアーゼで処理した。この混合物をまず２
つの１００μ２バツチに分け、一つのバッチを１４℃で
２時間インキュベートし、一方もう一つのバッチを３７
℃で３０分インキュベートした。この反応を５μｌの０
．５Ｍ　　ＥＤＴＡを加えて停止させ、フェノール／Ｃ
ＨＣｌ、／イソアミルアルコール（２５：２４：１）ま
たはＣＨ（Ｊ３で抽出し、２つの混合物を合せた。この
線状化プラスミドを、常法により酢酸ナトリウムおよび
エタノールで沈殿させ、次いで洗浄し、乾燥させた。こ
のＤＮＡを次に１００μｌの液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣ１（ｐＨ８）　）中で、４０Ｕのアルカリホス
ファターゼ（ベーリンガーマンハイム）と共に、３７℃
で１時間インキュベートした。ＥＤＴＡを２０ｍＭまで
加えた後、常法で、フェノール／ＣＨＣ１ｘ／イソアミ
ルアルコール（２５：２４：１）で２度およびＣＨＣｌ
２で２度抽出し、このＤＮＡをエタノールで沈殿させた
。

連結のため、各混合物の約５０〜１７５ｎｇのｐ　ＲＨ
１００（ＳａｃＩで線状化し、ヤエナリヌクレアーゼお
よびアルカリホスファターゼで処理）および約１〜２μ
ｇのサブクローンｐＨＲＶ２−９６９　（クレノーによ
り処理）のＸｈｏ■フラグメントをエタノールで沈殿さ
せ、乾燥し、新たに調製した１０μｌの１×リガーゼバ
ツフアー〔５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ７，５
）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１’ｚ、２０ｍＭ　　ＤＴＴ
、０．１ｍＭ　　ｒＡＴＰおよび５０μｇ／ｍｌのＢＳ
Ａ）に取った。連結をＩＵの７４−リガーゼ（ベーリン
ガーマンハイム）で、１４℃にて７０時間行った。形質
転換用コンピーテント細胞を得るため、マンデルおよび
ヒガの方法の改良を用いた（Ｍａｎｄｅｌ、　Ｍ、　＆
　Ｈｉｇａ　Ａ、、ジャーナル　オプ　モレキュラー　
バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、１９７０．５３．１５９−１６２）、Ｅ
。

二菌株ＨＢＩＯＩの“−夜培養物”の０．５ｍｌを５０
ｍｊ！のＬＥ培地（Ｌｏｇ／Ｊのトリプトン、５ｇ／ｌ
の酵母抽出液、＊Ｏｇ／ｌのＮａＣｌ　）中に接種し、
約０．４のＯＤ、。。となるまで培養し、次いで５にお
よび４℃で５分間ペレット化した。

次に、このバクテリアを（氷冷した）０．ＩＭＭｇＣｊ
！ｚ　２５　ｍｊ！中に注意して再懸濁し、５分間氷上
におき、５におよび４℃にて５分間、再遠心した。この
ペレットを水冷した０、　１　Ｍ　　ＣａＣ１。

２０ｍ１中に再懸濁し、４時間氷上におき、５におよび
４℃で５分間遠心した。この細胞を１×保存バッフｙ−
（０，ＩＭ　　ＣａＣｌ２／グリセロール＝４／１％　
ｖ／ｖ）２．５　ｔａｌ中にとり、２０分間氷上におき
、１００μβのアリコートに分割し、液体窒素中でショ
ック凍結（ｓｋｏｃｋ−ｆｒｏｚｅｎ）　Ｌ／・−８０
℃で保存した。５μｌの上記連結混合物を１００μｌの
コンピーテント細胞懸濁液に加え、氷上で解凍し、この
細胞を氷上で１時間および４２℃で２分インキエベート
し、最後に５分間氷上においた。この細胞を薄く適用す
る前に、９００μｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１０分
間インキュベートし、該細胞懸濁液の２００μｌをＬＢ
アガープレート（１００ｍｇ／　ｊ！のアンピシリンを
含むＬＢ培地中の１．５％アガー〕に適用し、−夜イン
キユベートした。全体で３５／のＡｍｐｒクローンを単
離し、そこからプラスミドＤＮＡを、“プラスミド最小
調製法（Ｐｌａｓｍｉｄ　ｍ１ｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔ
ｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）″〔バーンボイム（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ）等、上記文献〕により単離した。このプラ
スミドＤＮＡの旧ｎｄｎＩ消化により、Ｘｈｏｎフラグ
メントの寸法に対応するインサートをもつ８種のクロー
ンを検出できた。この形成においてプラントエンド連結
は両端で必要であり、従って理論的には挿入に対して２
つの可能な配向かあり、制限分析を実施した。３．５Ｕ
のＢａｌ　Ｅ／　１００ｎｇのプラスミドＤＮＡによる
１　０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）　
、１０１１ＭＭｇＣ１ｚおよび１０ｎ＋Ｍ　　ＢＭＥ中
での消化および２５ｍＭ　　ＮａＣｊ２．６ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　　ＭｇＣ
１ｚ　、２　ＯｍＭ　　ＢＭＥ中での８ＵＢｓｓＨＩＩ
　／　１００ｎｇプラスミドＤＮＡによる（５０℃で２
時間）および１５０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、６ＭＭ　　Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣ１（ｐＨ７，５）　　、６＋Ｍ　　ＭｇＣ
１’ｚ　、２ｈＭ　　ＢＭＥ中での２０　ＵＢａｍＨＩ
／　１００ｎｇプラスミドＤＮＡによる（３７℃で２時
間）二重消化によって、６種のクローン（Ｎｏｓ、　　
１５６．１６５．２８９．３０１．３０７および３１９
）が正確なインサート配向をもつものとして同定され、
２種のクローン（Ｎｏｓ、　　１および２２４）が逆の
インサート配向をもつと同定された。９６９のＸｈｏＩ
Ｉフラグメントが出発コドンＡＴＧと一致しているか否
かをチェックするために、非コード化およびコード化部
分間の領域の塩基配列を、１クマ一配列プライマーを用
いてＣＣＣ−プラスミドにつき直接決定した。この配列
プライマーはＴｒｐプロモータ領域の非コード化部の初
めの１７塩基に対して相補的である（第８図参照）。

これを実施するために、プラスミドＤＮＡを上記のクロ
ーンから、“最小調製法”を用いて得、１００μｌのＴ
Ｅバッファーに加え、１００μｌの５Ｍ　　ＬｉＣ１を
混合し、０℃で５分間インキュベートした。エッペンド
ルフ遠心１（１５０００ｇ、４℃で５分）遠心した後、
上澄を４００μ！の９６％エタノールと合せ、再度周囲
温度で２分遠心し、ペレットを７０％エタノールで一度
洗浄し、乾燥させた。このプラスミドＤＮＡを次に１１
μｌのＨｚ　Ｏに溶かし、５μｌの水性プラスミド溶液
のバッチを５μｌの１×変性溶液〔２６７１のＮａＯＨ
，０，２６７ｍＭのＥＤＴＡ）と混合した。

周囲温度で１５分インキヱベートした後、１μｌの１ク
マ一配列プライマおよび２μｌの２ＭＣＨ，Ｃ００ＮＨ
，（ｐ）１４．５）を加え（５０ｎｇ／μｉり、この混
合物を周囲温度で５分間インキエベートした。７５μｌ
の９６％エタノールを加え、−７０℃（１５分）で沈殿
した後、この沈殿を１５０００ｇで５分間ベレット化し
、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、このプライマー
とハイブリッド化したプラスミドＤＮＡを８．５μβの
Ｈｚ　Ｏにとった。これらのうち８．５μβに１μｌの
１０×結合バッフｙ−（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＡ
！（ｐＨ８）　、５０ｍＭ　　Ｍｇ０１ｚ　）　、３μ
ｌの３５Ｓ−ＡＴ　Ｐ　（１０００Ｃｉ／　ｍｍｏｊ２
　；アマ−ジャム）および１μｌのクレノー酵素（４Ｕ
／μｉ；バイオラボ）を加えた。配列決定工程の残りは
サンガー等の連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、等、プロ
シーデイングズ　オブ　ナショナル　アカデミ−オブ　
サイエンスニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、１９７７、旦、５４．６３−５４６７）を利
用して行った。クローン３０７および３１９からの表現
プラスミドｐＲＨ９６９／１においてインサートはＡＴ
Ｇと一致していることがわかった。

／１の表現 Ｌ　２ｉ中のプラスミドでコード化されたタンパクの表
現を検出するため、マキシー細胞系（ｍａｘｉ−ｃｅｌ
ｌ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いた。これはサンカーにより開
発された（Ｓａｎｃａｒ＾１等、ジャーナルオブ　バク
テリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１９７
９．１３７．６９２−６９３）。このＬユニマキシー細
胞株Ｃ３Ｒ６０３（ＣＧＳ（：　５８３０　　；Ｆ−、
ｔｈｒ−１、ＬｅｕＢ６、　ｐｒｏＡ２０）　ｐｈｒ−
１゜ｒｅｃＡｌ、　ａｒｇＥ３、　ｔｈｉ　−１、ｕｖ
ｒＡ　６　、ａｌａ−１４、／ａｃＹ１、ｇａｌＫ２０
）ｘｙ’−５、ｎ＋ｔｆ　−１、ｇｙｒＡ　９８　　（
ｎａｇ　Ａ　９８）　　、　ｒｐｓ３１、　ｔｓｘ−３
３、λ−１ｓｕｐＥ４４）はＵＶ照射によりＤＮＡに生
じた欠損を治す機構をもたない。

実験のため、放射線量を最適なものとして、しばしば染
色体に影響を与えるが、細胞当たり数個のコピーで存在
する比較的小さなプラスミドＤＮＡが殆ど損傷なしに残
されるようにする。損傷を受けた染色体ＤＮＡは細胞に
より分解され、一方ＵＶ照射により影響を受けなかった
プラスミドは複製され続け、残りのＤＮＡの主要部を構
成する。すべての未損傷複製細胞を抗生物質のＤ−サイ
クロセリンで殺し、かつ内在ｍＲＮＡが使用し尽くされ
た後、残りの細胞では、プラスミドにコード化された遺
伝子のみが転写されかつ翻訳される。このバクテリアを
硫酸塩を含まない培地に移した後、形成されたタンパク
は放射性標識され、この結果３５Ｓ−メチオニンの組込
みにより検知される。

Ｌ　ユニ菌株Ｃ３Ｒ６０３細胞を、上記のように、（９
６９／１の逆配向をもつ）クローン３０７および３１９
または２２４からの適当な表現プラスミドｐＲＨ９６９
／１で形質転換した。この形質転換細胞をトリプトフア
ンを含まない表現培地１５ｍｊ’中で３７℃にて、６０
０ｎｍでの光学密度が０．５〜０．７となるまで培養し
た。この使用した表現培地は以下の通りである（量は培
地１１当たりの値）。

ａ）１０ｇの（ＮＨ４）！ＨＰＯ４，３，５ｇのＫｕｚ
ｐＯ，および０．５ｇのＮａＣＩｆを５００ｍ／の水に
溶解し、この溶液をＮａＯＨでｐＨ７，３にし、次いで
８００ｍ１にした。

ｂ）２１ｇのカサミノ酸（酸加水分解された、ビタミン
を含まないもの；メルク社）を１００ｍ１ｔの水に溶解
した。

ｃ）５０ｍｌの２０％グルコース溶液。

ｄ）１ｍｆのＩＭ　　Ｍｇ５Ｏ，。

ｅ）１ｍｊ！の０．１Ｍ　　ＣａＣ１，。

ｆ）　　１ｍｇのチアミン−ＨＣｌと２０ｍｇのし−シ
スティンを１　ｍｌの水に溶解した。

これらのオートクレーブ処理し、無菌濾過した溶液を使
用する直前に混合し・１０１００Ｏ！とし・１００ｍｇ
／ｊ！のアンピシリンを加えた。１０ｍ２の収担したバ
クテリア培養物を開放型１３．５ｃｍのベトリ皿に移し
、わずかに回転させつつ５０ｃｍの距離から５秒間、Ｕ
Ｖ殺菌ランプ（１５Ｗ）で照射し、更に３７℃でインキ
ュベートした。この培養物を１００μｇ／ｎｉｌのＤ−
サイクロセリン（ｐＨ８の５０１燐酸バツフアー中の新
たな１００×濃厚溶液）と混合し、振盪器上で３７℃に
て１４〜１６時間インキュベートした。このバクテリア
を遠心（周囲温度５にで５分）により収穫し、５ｍｌの
バージエイ　（ｔｌｅｒｓｈｅｙ）塩溶液で２度洗浄し
、２０μｇ／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸（＝
ＩＡＡ；）リプトファンオペロンのインデューサ）を含
む５　ｍｌのバージエイ培地中に懸濁し、３７℃で１時
間振盪した。

Ｏバージエイ塩溶液（１１当り）： ５．４　ｇＮａｃｌ　　　　　１５ｍｇＣａＣ１ｚ・２
　ＨｚＯ８７ｍｇＫ　ＨｚＰ　Ｏａ　　　３．０　ｇ　
ＫＣｌ０．２ｇＭｇ（１２・　６Ｈ２０ １２，１ｇ　　Ｔｒｉｓ＋ＨＣｊ２　　（ｐＨ７，４）
１、１　ｇ　Ｎ　ＨａＣＩＩ　　　　　０．２ｍｇＦｅ
Ｃｌ３　・６　ＨｚＯＯバージエイ培地（バージエイ塩
溶液１００＋ｊ！につき）： ２０）Ｏｎｌの２０％グルコース １．０ｍｊ！の２％プロリン ０．５ｎ１１の２％スレオニン １．０＋ｗＩｌの２％アルギニン １．０ｍｊ！の１％ロイシン ０．１ｍｊ！の０．１％チアミン−ＨＣｊ２約１５　μ
Ｃｉ／　ｍｌの３８３−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｆ
ｆ１ｌＩＩｏ１；アマ−ジャム）を各培養物に加え、次
いでこれら培養物を３７℃で更にＡ時間インキュベート
した。次にこの細胞を遠心（周囲温度５にで５分）によ
り収穫し、２００μｌのＳＤＳ試料バッフｙ−（１０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣＪ　　（ｐＨ７，４）、１２５ｍ
Ｍ　　ＢＭＥ、２％ＳＤＳ、１０％スクロース、０．０
５％ブロモフェノールブルー〕中で溶菌した。この試料
を９５℃で５分間インキュベートし、１５０００ｇで２
分遠心した。上澄を過剰のタンパクにつき調べた。ＳＤ
Ｓ試料バッファー中の細胞溶解上澄２０〜６０μｌを１
０％５ＤＳ−含有ポリアクリルアミドゲル上で大きさに
応じて分離した〔ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　Ｕ、に
、　、ネイチャー（ｌｌａｔｕｒｅ）、１９７０．２７
７．６８０−６８６）。

この厚さ１．５　ｍｍのゲルは長さ約１０ｃｍの１０％
分離ゲルと長さ３ｃｍの３％捕集ゲルからなっていた。

電気泳動を捕集ゲル中で約３Ｗ（一定）で、１２Ｗ（一
定）で分離ゲル中で全体として４．５時間実施した。Ｂ
ＳＡ　（６６ｋｄ）　、オボアルブミン（４５ｋｄ）　
、ペプシン（３４，７ｋｄ）、β−ラクトグロブリン（
１８，４ｋｄ）およびリゾチーム（１１，３ｋｄ）から
なるタンパク混合物についても分離を行い、サイズマー
カーとした。マーカータンパクのゲルレーンを電気泳動
後、残りのゲルから切取り、染色液（５０％メタノール
、１０％酢酸、０．１％クーマシーブリリアントブルー
０２５０）中で３０分インキュベートし、脱染色溶液（
５％メタノーノベ１０％酢酸）中で１夜振盪し、グリセ
リン浴（７％酢酸、２％グリセリン）に３０分おき、フ
ァツトフッ３ＭＭ濾紙上で６０℃にて約１．５時間ゲル
乾燥器で乾燥したく第１１図レーンＭ参照）。

細胞溶解物のタンパクはウェスターン方で電気移動（Ｅ
ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｕｓｆｅｒ　）によってゲルから
ニトロセルロースフィルタ〔シェライヒャー＆ジュール
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕ’ｌｌ　）
　、Ｂ　Ａ　８５　；　０．４５μ〕に移した〔バーネ
ット　（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）　Ｗ、Ｎ１、アナリティ力
ル　バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　　１９８１．１１２．１９５−
２０３］。

この移動は移動バッフｙ−［：２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ、
　　１５ＱｍＭグリシン、２０％メタノールｐ、ａ、　
；　ｐＨ８，８：］内で、０．１％のエンピゲン〔εｍ
ｐｉｇｅｎ　　；マルションイタリアーナ（Ｍａｒｃｈ
ｏｎ　Ｉｔａｌｉａｎａ）　Ｓ、Ｐ、Ａ、　］の存在下
で、バイオラドタンパクプロット装置で５時間、６０Ｖ
で行った〔マンドレル（Ｍａｎｄｒｅｌｌ）Ｒ，巳。

等、ジャーナル　オブ　イムノロジカル　メソッズ（Ｊ
、　ＩｍｍｕｎｏｌｌＭｅｔｈ、）、１９８４．６７．
１−１１〕。

排他的にこのプラスミドでコード化されたタンパクの表
現は、３５Ｓ−メチオニンの組込みにより検出された。

第１１図は、コダックＸ−オマット（Ｘ−Ｏｍａｔ）　
Ｓ　　Ｘ−線フィルム上で曝露後、“ウェスタンプロッ
ト”のオートラジオグラム（レーン８２　　Ｂ３）を示
すものである。レーンＢ２（ウェスタンプロットのレー
ンＡ２に対応）およびレーンＢ４（レーンＡ４に対応）
は表現されたインサート９６９／１の２つのシグナルお
よびアンピシリン耐性に対するプラスミド遺伝子により
コードされたβ−ラクタマーゼのシグナルを示し、一方
逆配向インサー）　９６９／１をもつレーンＢ３（レー
ンＡ３に対応）は４０ｋｄにシグナルをもたないが、β
−ラクタマーゼに対するシグナルをもつ。数個の終結コ
ドンが逆配向でコードされた領域の開始部に存在すると
いう事実のために、タンパクはまったく表現されない。

実施例８　モノクローナル抗体の生成および単離使用し
た溶液および培地の説明： ｏｌｏｏｘ　　アミノプテリン １．８ｍｇのアミノプテリンを、ＩＭのＮａＯＨを加え
て、５０＋ｍｌの水に溶解し、次いで１００ｍｆｆに補
充したく暗所にて一２０ｔで保存）。

０１００ｘ　　ＯＰＩミックス ７．５ｇの修酸および２．５ｇのピルベートを４５０ｍ
１の水に溶かし、１０００Ｕのインシュリン（数ｍＩ２
の０．１Ｍ　　ＨＣｊ！に溶かしたもの）を加える。こ
の混合物に水を補充して５００ｍＩ！とする。

ｏｌｏｏｘ　　ＨＴミックス ０、６８０５　ｇ（Ｄハンポキサンチンを２００ｍｆｆ
の水に溶かし、ＮａＯＨでｐＨ１０に調節した液を、２
００ｍＪの水性チミジン溶液（０，１９３７ｇ；２００
ｍ１中）と合せ、補充して５００ｍＡ＋とした。

ｏ　　ＨＴ培地 ５００ｍ１ドウルベコ改良イーグル培地ＣＤｕｌｂｅｃ
ｃｏ’Ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉ
ｕｍ　；　ＤＭＥＭ　：　　フローラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、高グルコース〕 ６ｍｊｉ！：２００ｍＭ　　Ｌ−グルタミン６ｍｊ！：
１００ｘ　　ＨＴミックス ６ｍｌ：１００ｘ　　ＯＰＩミックス ５０　ｍｌ　：ＨＩＦＣ８（熱不活化子牛血清）０．６
ｍｊ！ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）（５０
ｍｇ／ｍｆ） ｏ　　ＨＡＴ培地 １００ｍｊ２：ＨＴ培地 １ｍ１１００ｘ　　アミノプテリン ｏ　　ＡＢＴＳ溶液 １００ｍｇ／ｎｕの２，２′−アジノジ−（３−エチル
ベンゾチアゾリンスルホネート）の水性溶液 　　ＰＢＳ １３７ｍＭ　　ＮａＣｌ ２．７ｍＭ　　ＫＣｌ ｇｍＭ　　Ｎａ２８　Ｐ　０４ １．５ｍＭ　　Ｋ８２Ｐ０゜ ０、５ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　・６　Ｈ３Ｃ１ｍＭ　　Ｃ
ａＣｊ！ｚ・　２Ｈ２゜ ｏ　　　ＰＢＳ　　　ｄｅｆ　　： ＰＢＳと同じであるが、Ｃａ塩およびＭｇ塩を含まない
。

ｏ　　ＰＢＳ洗浄液 ０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０を含むＰＢＳ
ｄｅｆゆ ｏ　　２０％ＦＫＳ　　ＤＭＥＭ ４４５ｍＡ　　ドゥルベコ改良イーグル培地（フローラ
ボラトリーズ） ５０　ｍｌ　　ＨＩＦＣ３（熱不活化子牛血清）５１１
１１ヘニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ
／　ｍｌ） ＯＲＰＭＩ　　ｃｏｍｐｌ。

５００１ｌｉｌ　　ＲＰＭＩ　１６４０培地（フローラ
ボラトリーズ；Ｎｒ、１２−１２− ５４）５０　Ｆｅ２ ５ｍｊ！　　２００＋ｗＭ　　Ｌ−グルタミン５　ｍｌ
　　ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，’ＯＯＯ
Ｕ／　ｎ＋ｊｌり ｏ　　ＰＥＧ−４０００溶液 ２０ｇのＰＥＧを２８＊Ｊ２のＰＢＳ　　ｄｅｆに溶解
し、水浴中でＰＥＧが溶解するまで（約３０分）インキ
ュベートする。

ＯＲＰＭＩ洗浄溶液 ５００　ｍｌ　　ＲＰＭ１１６４０培地５　ｍ１２　　
ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／　
＋ＩＩｎり ５ｍｌ　２００ｍＭ　　Ｌ−グルタミンｏ　　ＨＡＴ胸
腺細胞培地 無菌条件下で取出した、可能ならば結合組織のない状態
の、３〜４月令のＢａ　１　ｂ−ｃマウスの胸腺を篩に
移し、この篩を無菌注射器プランジャーにより通過させ
（ゆっくり円形運動し、約１分間該篩を円状に回す）、
ＲＰＭＩ洗浄液２Ｓｎｌ中の細胞懸濁物を３００ｇで、
周囲温度にて、１０分遠心する。上澄をパスツールピペ
ットで吸取ることにより除き、ペレットを２０１１Ｉｆ
（７）ＲＰＭＩ　　ｃｏｍｐＪ、に再懸濁し、更に約５
Ｘ１０”細胞／１Ｉ１１となるまで希釈する。

この胸腺細胞含有培地を小さな培養フラスコ中で、ＣＯ
！インキュベータ内で３７℃にて保存する（約１４日間
維持できる）。ＨＡＴ胸腺細胞培地を得るため、これら
細胞を遠心により除き、上記のようにＲＰＭＩ洗浄溶液
中で洗い、再度遠心し、細胞をＨＡＴ培地に取出す。

完全フロインドアジュバントに乳化した精製ＨＲＶ２　
５〜１０．ｃｇｇを２〜３月令のＢａ　１　ｂ−ｃマウ
スに腹腔内に注入した。同じ量のＨＲＶ　２（不完全な
フロインドアジュバントに乳化）を２７．４９．１００
．１１７および１１８日後に後投与した。最後の接種か
ら１日後に肺臓を取出し、この細胞をミエローマ細胞、
例えばＮＳ−１（ＡＴＣＣＴ　Ｉ　Ｂ　１　Ｂ　）と融
合した。これは実質的にガルフレ等の方法に従った（Ｇ
ａｌｆｒｅ　Ｇ、等、メソッズインエンザイモｔｌｌジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１９８１
、ユニ、３−４６）。

無菌条件下で取出した肺臓をペトリ皿におき、約５　ｍ
ｌのＲＰＭＩ洗浄溶液で洗った。この肺臓を５　ｍｌの
ＲＰＭＩ洗浄溶液中で粉砕し、注射器プランジャーを用
いて篩を通過させた（ゆっくり円を描くように動かした
）。最後に、この細胞懸濁液を氷上に放置して、あらゆ
る細胞の塊状物および結合組織片を沈殿させた。微細状
態で懸濁した細胞をピペットで吸取り、５０１ｍ１の丸
底遠沈管に移し、新たに調製したＲＰＭＩ洗浄溶液を補
充して５０ｎ＋１とし、周囲温度にて、３００ｇで５分
間遠心した。上澄を除去し、ペレットを５Ｉｌｌｌの溶
菌バッファー（１５５１１１ＭのＮＨｔＣｌ、　１０１
１ＭのＫＨＣＯ２および１ｍＭのＥＤＴＡを含む；ｐ１
７．２）中に懸濁させ、０℃で２分インキエベートした
。この懸濁液をＲＰＭＩ洗浄溶液の補充により５０ｍｊ
！とじ、パスツールピペットを用いて注意深く攪拌した
。任意の脂質−含有化合物および脂肪はピペットに付着
するので、このようにして容易に除去できた。この懸濁
液を周囲温度にて、３００ｇで５分間再度遠心した。得
られたペレットを１０ｍｊ！のＲＰＭＩ洗浄溶液に再懸
濁し、約５Ｘ１０？個のマウスミエローマ細胞、例えば
ＮＳ−１（４つの７５＊Ｊ組織培養フラスコからの５０
％融合性）と混合した。これら細胞を、まず５０＋ｓｌ
のＲＰＭＩ洗浄溶液で３度洗浄し、３００ｇにて遠心（
周囲温度で５分）して全ての血清を除いた。肺細胞およ
びミエローマ細胞の混合物を５０＊ＪのＲＰＭＩ洗浄溶
液に懸濁し、上記のように遠心した。上澄を注意して完
全に除き、得られたペレットを即座に３７℃にて温度調
節したＰＥＧ４０００溶液と混合し、試験管を２分間、
ペレットとＰＥＧ４０００とが混合されるまで台の縁部
に注意深く当てた〔“砂状の稠度（ｇｒｉｔｔｙｃｏｎ
ｓｉｓｔｅｎｃｙ）”〕。次に、この混合物をゆっくり
振盪しながら３７℃で２分間インキュベートし、直後に
２０＋１１のＲＰＭＩ洗浄溶液を滴添した。

この際各液滴が容器壁土を別々に流下するようにした。

更に、３０ＩＩＩｌのＲＰＭＩ洗浄液を注意深く加えた
。ａ＋胞を遠心（３００ｇで周囲温度下で５分）した後
、上澄を吸取って除き、得られたペレットを、パスツー
ルピペットを用いて１０ｎ／！のＨＡＴ胸腺細胞培地中
に注意して再懸濁させた。

この懸濁液をマイクロタイタープレート（プレート当た
り９６ウエル）中にＱ、１ｍｌのアリコートとして分取
し、５％ＣＯ□中３７°Ｃでインキュベートした（プレ
ートはインキュベータ内で動かす必要はない）。３日後
に約０．１ｍｊ２のＨＡＴ培地を添加した。更に３日後
、０．０５ｍＡのＨＡＴ培地を加えた。融合開始後１０
日目に、該培地の７０％を除き、０．２ｍｌのＨＴ培地
を加えた。融合後１２日目に、プレートを顕微鏡観察し
、ＥＬＩＳＡおよび中和テストのために培地を採取し、
約０．３ｍＪの２０％ＦＣ３−ＤＭＥＭを各ウェルに加
えた。正のハイブリッドを上記の２つのテストにより選
び、これらハイブリッドを１；３〜１：１０に分離し、
即ちウェルの内容物をマイクロタイタブレートの３〜１
０ウエルに分配させた。

育成後、ハイブリッドを再度テストし、最大力価を示す
ものを選択した。これらハイブリッドを終点希釈（ｅｎ
ｄ　ｐｏｉｎｔ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）により２度クロー
ニングした。一方、顕微鏡を用いてハイブリッド細胞が
単一細胞由来のものか否か確認した。クローニングを胸
腺細胞および２０％ＦＣ３の存在下で行った。各クロー
ンを７５ｃｎｉ細胞培養フラスコ中で５０％集密度まで
成長させた。この種の細胞組織培養フラスコからの細胞
を、１０日前にブリスタン（０，５ｍｊ２）を腹腔内注
射して前処理したマウスに注射した。腹水を腹腔壁から
２〜６週後に採取した。

ＥＬ　Ｔ　ＳＡ マイクロタイタブレートの各ウェルにつき、炭酸バッフ
ｙ　−（１５ｍＭ　　ＮａｚＳＯｉ　／　３５ｍＭＮａ
ＨＣＯ３）中のウィルス希釈液（１〜２μｇ／ｍｌのＨ
ＲＶ　２　）の５０ｔｔｌｌを周囲温度にて一夜インキ
ユベートした。１００μ＃のＰＢＳｄｅｆ。

を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによ
り飽和とした。このＰＢＳｄｅｆは１％のＢＳＡを含む
。このマイクロタイタブレートを空にし、ウェルを５０
μｌのハイブリッド上澄で満たした。負のコントロール
として、純粋なＨＡＴ培地を用いた。次いで３７℃にて
１時間インキュベートし、プレートを再び空にし、ＰＢ
Ｓ洗浄溶液（ＰＢＳ　ｄｅｆ、　＋ｏ、ｏ　５％ツイー
ン２０）で３回洗浄した。次いで、ＰＢＳｄｅｆ、　　
（＋１％ＢＳ＾および２％ツイーン２０）中のパーオキ
シダーゼ複合抗血清（ＲＡＭ＝“兎抗マウス”）の１１
５００希釈物５０μβを各ウェルに与えた。インキュベ
ーション（３７℃にて１時間）後、ウェルを上記のよう
にＰＢＳ洗浄溶液で５回洗浄した。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡテストを発現させるために、５０μβの
発現溶液（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）、　（１ｍ　ｌの５０
ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４）　、１０μｉのＡＢ
ＴＳ溶液および５μｌの３０％過酸化水素）を各ウェル
に加えた。正の結果は緑に発色することで示される。

主租土囚上 ハイブリドーマコロニーからの細胞培養上澄を、以下の
ようなミクロ中和により、ウィルス−中和抗体の存在に
つきテストした。即ち、５０ｔｔｌのハイブリドーマ上
澄を各ウェルに与え、５％Ｃｏｔ中で、５０μ＃ＭＥＭ
　（最小必須培地；フローラボラトリーズ）と共に３４
℃で１時間インキュベートした。このＭＥＭは１００Ｏ
ＰＦＵ　　ＨＲＶ２．３０ｍＭ　　ＨｇＣ１ｚ　、およ
び２％のＨＩ　Ｆｅ２を含んでいた。次に、３　Ｘ　１
０’　ＨｅＬａ細胞（株：ＨｅＬａ−０ｈｉｏ　；　０
３−１４７　；フローラボラトリーズ）を各ウェルに加
え、プレートを５％ＣＯ２中で３４℃にて４８８時間イ
ンキュベート、２０％エタノールの０．１％クリスタル
バイオレットを８液で染色した。完全な細胞層をもつウ
ェルが正とみなされた。上記条件下で、腹水の１／１０
００希釈において、５％中和が検出できた。天然の）Ｉ
ＲＶ２に対するモノクローナル抗体の群からモノクロー
ナル抗体が選ばれ、これは中和特性をもつこととは別に
その抗原の、即ちウィルスカプシドタンパクＶＰ２の変
性形に結合することが、ウェスタン法によって証明でき
た（第１１図）。このような抗体は８Ｆ５と命名された
。このモノクローナル抗体を用いることにより、ＨＲＶ
２を中和でき、あるいはウェスタンプロットにおいてＶ
Ｆ６を含む表現生成物を検出できるばかりでなく、加え
てこの抗体は、例えばＶＰｌについてポリオウィルス系
で立証された〔ワイコウスキー（Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ）
　Ｃ，等、上記文献、１９８３’ｌようにＶＦ６におけ
るＨＲＶ２の免疫源サイトをより−Ｊｌ明確に特徴付け
るためにも利用できる。

上記特性をもつモノクロナル抗体、例えば８Ｆ５は、ク
ローン３０７および３１９からのｐＲＨ９６９／１とい
う表現タンパクの抗原性をテストするために使われた。

既に述べたように、この抗体は固有の状態にあるものば
かりでなく、その変性状態にあるＶＦ６（および結果と
して９６９／Ｌ）を認識するという、表現の研究にとっ
て有利な特性をもっている。

この種のモノクローナル抗体はまれであり、これまでは
ポリオウィルス系〔ワイコウスキー（Ｗｙｃｈｏｗｓｋ
ｉ）　Ｃ，等、上記文献、１９８３）においてのみ見出
されているにすぎない。結合したタンパクをもつフィル
タを、“阻止溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ
）　　″即ちＰＢＳ　（１３７ｓＭ　　ＮａＣ１，２，
７ｍＭ　　ＫＣＩ、８ｍＭ　　Ｎａ、ＨＰ　Ｏａ　、１
．５ｍＭＫＨｚＰＯａ　、０．５ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　
　’　６Ｈ２０，１ｍＭＣａＣ（ｌｔ　　・２　ＨｚＯ
（１％ＢＳＡ含有）、１％ツイーン２０および１０％の
熱不活化子牛血清（ＨＩＦＣ３））５０　ｍβ中で周囲
温度下で一夜浴につけた。次いで、これを４　ｍｌの阻
止溶液中で抗体８Ｆ５（阻止溶液で１／２００に希釈し
たマウス腹水上澄）と共に３時間インキュベートシた。

ここでフィルタは家庭用フィルムで密封した状態でイン
キユベートした（シーソー機構上に固定）。次にこのフ
ィルタを流水で十分に洗い（約２０分）、１％のツイー
ン２０を含むＰＢＳ５０１Ｉ１１で１５分間、３回洗浄
した。最終工程で、このフィルタを５０１１１１の阻止
溶液中でアルカリホスファターゼ複合抗マウスＩｇ　Ｇ
　（阻止溶液で約１／３０００に希釈）と共に周囲温度
で３時間インキュベートした。このフィルタを再度流水
で十分に洗い、上記のように１％のツイーン２０を含む
ＰＢＳ５０ｍｌで３回洗浄した。染料、ニトロブルーテ
トラゾリウム（ＮＢＴ：１６５μｇ／ｍｆ）および５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（
ＢＣｒＰ：８２．５μｇ／ｍｆ）の存在下で、１０ｍｊ
！のホスファターゼバッフｙ　　　（１００ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ／Ｈ１ｄ！　　（ｐＨ９，５）、１００ｍＭ　　
ＮａＣ＆、５ｍＭ　　ＭｇＣＩｔｚ　）中で染色を行っ
た。このアルカリホスファターゼ−複合抗マウスＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）および染料ＮＢＴおよびＢＣＩＰを、プロメ
ガバイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）製の
プロトプロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏｔ）　Ｔ　Ｂ系から
取出した。この染色反応は約５分後に流水下で洗浄する
ことで停止させた。第１１図はマキシ細胞系Ｃ５Ｒ６０
３における９　６９／１の表現の結果を示す。

レーンＡ１〜Ａ４はＮＢＴおよびＢＣＩＰで染色後のウ
ェスターンプロット実験を示し、レーンＡ１において、
変性ＨＲＶ２粒子（ＨＲＶ２（７）約５０ｎｇ）をもコ
ントロールとして分割した。第１１図から理解されるよ
うに、モノクローナル抗体８Ｆ５は選択的にＶＦ６　（
２８，７ｋｄ）と反応し、識別が非常に困難な高分子量
または低分子量バンドがｖｐｏ　＜被覆タンパクのプリ
カーサ）またはＶＦ６のタンパク分解による分解生成物
を表す。レーンＡ２およびＡ４において、プラスミドｐ
ＲＨ９６９／１　　（クローン３０７および３１９由来
のもの）で形質転換されたＨ、ニア１Ｊ菌株Ｃ３Ｒ６０
３の細胞溶解物が分割された。両レーンにおいて、ウェ
スターンプロットの染色後、約４０ｋｄ（４０，２ｋｄ
）のバンドとして表現生成物９６９／ｌの所定の特異的
シグナルが検出できた。負のコントロールとして、レー
ンＡ３では、クローン２２４からのプラスミドで形質転
換されたＬ　２ｉ菌株Ｃ３Ｒ６０３細胞の溶解物が分析
された。上記の如く、このプラスミドはインサート９６
９／１の逆配向をもつ。特異的抗原性の付随的な損失お
よび複数の終結コドンが逆にコードされた領域の開始点
に存在するという事実のために、レーンＡ３のウェスタ
ーンプロットからはシグナルが得られない。

レーンＭはマーカータンパク（上記参照）のクーマーシ
ーブルー染色を示す。レーンＢ２〜Ｂ４はレーンＡ２〜
Ａ４のオートラジオグラフを示す（正確には上記実施例
２参照）。

実質的にワイコウスキ（Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ）等の方法
に従って、第９図からのＸｈｏＩＩフラグメントを含む
表現プラスミド、例えばプラスミドｐＲＨ９６９／１は
単−のＢｓ５ＨＩ［切断サイトで線状化され、エンドヌ
クレアーゼＢａ１−３１で２．４．６．８および１０分
処理された。このように短かくされた線状プラスミドを
再環化し、ム　ユニ細胞中で形質転換した。この表現さ
れたタンパクを、次にモノクローナル抗体８Ｆ５を結合
する能力につきテストした。結合可能なタンパクを表現
したプラスミドの配列と、結合不可能なタンパクを表現
したプラスミドの配列とを比較することより、モノクロ
ーナル抗体８Ｆ５に対するＶＰＺ上のＨＲＶ２の免疫源
サイトが、ＨＲＶ２のヌクレオチド１２７４〜１３０９
によりコードされるアミノ酸の間に存在することが決定
できた（第９図および第１３図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＤＳの存在下で、１２．５％ポリアクリル
アミドゲル上でのＨＲＶ８９の被覆タンパクの電気泳動
による分離を示す図であり、ｖｐ４は見られない。とい
うのは、フロントと共にゲルから移動してしまうためで
ある。 第２図はＳＤＳの存在下での１．２％アガロースゲル上
でのＩ（ＲＶ８９−ＲＮＡの電気泳動を示す図である。 リボゾームＲＮＡマーカーの位置は右側に示されている
。 第３図はＨＲＶ８９ゲノムの制限マツプである。 配列決定に用いた２１の重複クローンが示されている。 いくつかの制限酵素の特異的切断サイトが示しである。 矢印（Ａ−Ｄ）は逆転写用プライマーとして用いられる
制限フラグメントを表す。 第４図はクローン化ＨＲＶ８９ゲノムの配列とそこから
得られたアミノ酸配列を示すものである。 ポリタンパクの開裂サイトは矢印で示しである。 黒い矢印Ｎ）は実験的に求められた開裂サイトであり、
白抜き矢印（８）は他のピコルナウィルスとの相同に基
き予想したポリタンパク中の開裂サイトを示すものであ
る。 第５図はＨＲＶ８９、ＨＲＶ２０）ＨＲＶ１４およびポ
リオウィルスタイプ１間の各遺伝子のアミノ酸配列中の
相同（％）を比較したものである。 第６図はＨＲＶ８９の被覆タンパクのＮ−末端アミノ酸
配列である。 第７図は表現プラスミドｐＲＨ１００の作製計画である
。 第８図はトリプトファンプロモータ／オペレータ領域、
合成リボゾーム結合サイト（ＲＢ　Ｓ）および表現ベク
ターｐＲＨ１００の開示コドンを表す。表現プラスミド
ｐＲＨ９６９／１の配列決定に使用するブライマー（１
７ヌー）をも与えである。下部の小文字および番号はｐ
ＢＲ３２２の配列を示し、大文字はｐＢＲ３２２ヌクレ
オチドの番号１と２９との間に挿入された配列を示す。 第９図はヌクレオチド番号７００と２０００との間のＨ
ＲＶ２−ｃＤＮＡの配列部分を示し、短く太い矢印はＶ
Ｆ６の配列を表し、細い矢印はこの部分の最も重要な期
限サイトを示す。 第１０図は表現プラスミドｐＲＨ９６９／１の作製計画
を示す（ＮＣＲ−非コード領域、未翻訳領域ＨｔｒｐＰ
１０−トリプトファンプロモーターオペレータ領域）。 第１１図はマキシ細胞系Ｃ３Ｒ６０３における９６９／
１の表現の結果を示し、レーンＡ１〜Ａ４はＮＢＴおよ
びＢｌｊＰで染色した後のウェスタン法による実験を示
し、レーンＡＩにおいて、変性ＨＲＶ２粒子（約５０ｎ
ｇ　　ＨＲＶ２）もコントロールとして分割された。レ
ーンＡ２およびＡ４において、プラスミドｐＲＨ９６９
／１（クローン３０７および３１９から得た）により形
質転換したＰエ　ユニ菌株Ｃ３Ｒ６０３細胞の細胞溶解
物が解析された。レーンＡ３では、Ｌ　エ丑」−菌株Ｃ
３Ｒ６０３細胞の細胞溶解物が負のコントロールとして
解析された。これら細胞はクローン２２４（９６９／１
の挿入の送配向）からのプラスミドで形質転換された。 レーンＭはクーマシープル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂ
ｌｕｅ）で染色されたマーカータンパクを示し、レーン
Ｂ２〜Ｂ４はレーンＡ２〜Ａ４のオートラジオグラフを
示す。 第１２図はプラスミドｐＲＨ９６９／１の挿入を示す。 第１３図はウィルス被覆タンパクＶＰＺ上の８Ｆ５の結
合サイトを示す。上部ラインの番号１〜２６１はＶＰ２
のアミノ酸配列を示し、一方下部ラインの番号はＨＲＶ
２のＤＮＡ配列を示す。 該結合領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列が示され、そこ
では各欠失（変異）が正確に与えられている。 第１４図はユクローン化ＨＲＶ２ゲノムの配列およびこ
れを由来とするアミノ酸配列を示す、ポリタンパクにお
ける開裂サイトは矢印で示されている。中実矢印は実験
で求めた開裂サイトを示し、一方中抜き矢印は他のピコ
ルナウィルスとの相同を基に予想した該ポリタンパクの
開裂サイトを示す。 第１５図は表現プラスミドｐＲＨ９６９／２の作製計画
を示す。 第１６図は表現プラスミドｐＫＫ８９／２Ａの作製計画
を示す。 第１７図はｐＫＫ８９／２Ａにより表現されたポリペプ
チドである。 第１８図は、ＨＲＶ２およびＨＲＶ８９のＰ３Ａおよび
Ｐ３Ｂ　（ＶＰｇ）に対する遺伝子のアミノ酸およびヌ
クレオチド配列の比較である。白抜き矢印は他のビコリ
ナウイルスとの比較から推定した予悲開裂サイトを示す
。 第１９図はＨＲＶ２とＨＲＶ８９との５′未翻訳領域の
ヌクレオチド配列の比較である。 第２０図はＨＲＶ２とＨＲＶ８９との、ウィルスタンパ
ク領域におけるアミノ酸配列の比較である。 −ｃ４ｃ’。 伸 【　　　　　　　　　− の　　ψ レー　　レー　　し−−一　　へ　　（’Ｎ　　　（’
Ｎ　　　ｒ＋ＩＩＪＩ　　　Ｌｌ　　　−”＞＞＞〉Ｑ
４Ｑ４　　山　山　〉　ｂ　贅〉 〉 一〇Ｅ−４ 〉−一 菌　　　　　−− 一　　　　　　〇 〉　　　　　　〃 ζ　　　　　　０ Ｕつ　　　　　　　ロ　　　０　　−　　　α〕Ｑ４　
Ｑｓ　− ２：　　　　　ψ　　　　　０ ＋１ −Ｆ＋ＱＱ− ０発　明　者　　ディーチル　ブラース　　オースシュ ド発明者　　　エルンシュト　キュエ　　オースシュド
−２３−６ ０発明者　　　リエルカ　フラツセル　　オースシュド ｏ発　明　者　　マンフレット　ツオー　　オースルン
　　　　　　　　　ニドラ ドリア国　アー１０９０　　ウィーン　リヒテンシュタ
イトラーセ　１１９ トリア国　アー１１９０　　ウィーン　ゲルゲンガツセ
ドリア国　アー１０２０　　ウィーン　オーベル　ドナ
ウラーセ　５ ドリア国　アー１１４０　　ウィーン　マウェルバッハ
シーセ　４６　　アー５ ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. （１）ライノウィルス株ＨＲＶ８９のウィルスＲＮＡの
   一部または全体に対応するＤＮＡ分子あるいはその縮重
   型。
2. （２）ライノウィルス株ＨＲＶ８９のウィルスタンパク
   の少なくとも１つまたはその一部の特性をもち、第４図
   に示したアミノ酸配列１〜２１６４をもつウィルスタン
   パク、その一部またはその対立遺伝子をコードするＤＮ
   Ａ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ分子およびその縮
   重型。
3. （３）ウィルスタンパクＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ
   ４、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ２Ｃ、Ｐ３Ａ、Ｐ３ＢまたはＰ
   ３Ｃ、その一部またはその対立遺伝子をコードするＤＮ
   Ａ配列を含み、ライノウィルス株ＨＲＶ８９のウィルス
   タンパクの少なくとも一つまたはこれらの一部の特性を
   もつことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項または
   第（２）項に記載のＤＮＡ分子およびその縮重型。
4. （４）上記ウィルスタンパクの少なくとも２つが、任意
   の所定の組合せで一緒に結合したことを特徴とする特許
   請求の範囲第（３）項記載のＤＮＡ分子およびその縮重
   型。
5. （５）上記特許請求の範囲のいずれか１項のＤＮＡ分子
   と、８５％以上の相同性を検出することを可能とする厳
   密な条件下でハイブリッド化し、かつライノウィルス株
   ＨＲＶ８９のウィルスタンパクの少なくとも１つまたは
   その一部の特性を有するウィルスタンパクをコードする
   ことを特徴とするＤＮＡ分子。
6. （６）特許請求の範囲第（１）項〜第（５）項のいずれ
   か１項に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする複製
   クローニングベクター。
7. （７）第４図または第１４図に示したアミノ酸配列をも
   つウィルスタンパクまたはその一部もしくはその対立遺
   伝子をコードし、ライノウィルス株ＨＲＶ８９またはＨ
   ＲＶ２のウィルスタンパクの少なくとも一つまたはその
   一部の特性をもつＤＮＡ配列およびその縮重型を、形質
   転換された宿主生物または細胞培養物中で表現すること
   のできる複製可能な表現ベクター。
8. （８）該ＤＮＡ配列が特許請求の範囲第（１）項〜第（
   ５）項のいずれかにおいて記載した配列に対応すること
   を特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の複製可能
   な表現ベクター。
9. （９）ベクターｐＫＫ８９／２Ａである特許請求の範囲
   第（７）項記載の複製可能な表現ベクター。
10. （１０）ベクターｐＲＨ９６９／１またはｐＲＨ９６９
    ／２である特許請求の範囲第（７）項記載の複製可能な
    表現ベクター。
11. （１１）ＤＮＡ配列によりコードされ、第４図または第
    １４図に示された、アミノ酸配列をもつウィルスタンパ
    ク、対立遺伝子またはライノウィルス株ＨＲＶ８９また
    はＨＲＶ２のウィルスタンパクの一部を表現し得ること
    を特徴とする形質転換された宿主生物または細胞培養物
    。
12. （１２）上記ＤＮＡ配列が特許請求の範囲第（１）項〜
    第（５）項に記載したものの一つに対応することを特徴
    とする特許請求の範囲第（１１）項記載の形質転換され
    た宿主生物または細胞培養物。
13. （１３）上記ＤＮＡ配列が特許請求の範囲第（７）項〜
    第（１０）項のいずれか１項に記載の複製可能な表現ベ
    クター中に含まれることを特徴とする特許請求の範囲第
    （１１）項記載の形質転換された宿主生物または細胞培
    養物。
14. （１４）￥Ｅ．コリ￥である特許請求の範囲第（１１）
    、（１２）または（１３）項に記載の形質転換された宿
    主生物。
15. （１５）特許請求の範囲第（１）〜（５）項のいずれか
    １項に記載のＤＮＡ分子または特許請求の範囲第（７）
    〜（１０）項のいずれか１項に記載の複製可能な表現ベ
    クター中に含まれるＤＮＡ配列によってコードされ、か
    つ第４図または第１４図に示されたウィルスタンパクの
    少なくとも一つの特性をもつことを特徴とするポリペプ
    チド。
16. （１６）アミノ酸配列１〜２１６４について第４図に示
    したウィルスタンパクの少なくとも一つまたはその一部
    もしくは対立遺伝子に対応し、かつ他のタンパクを含ま
    ないことを特徴とするポリペプチド。
17. （１７）ウィルスタンパクＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、Ｖ
    Ｐ４、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ２Ｃ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂまたは
    Ｐ３Ｃもしくはこれらの一部のアミノ酸配列を含み、か
    つ他のタンパクを含まないことを特徴とするポリペプチ
    ド。
18. （１８）上記ウィルスタンパクの少なくとも２つが任意
    の所定の組合せで一緒に結合されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第（１７）項記載のポリペプチド。
19. （１９）第４図に示したアミノ酸配列１〜２１６４ある
    いはその一部を有するポリペプチドの誘導体であり、ラ
    イノウィルス株ＨＲＶ８９のウィルスタンパクの少なく
    とも一つあるいはその一部の特徴を有することを特徴と
    するポリペプチド。
20. （２０）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載のポリペプチドの調製法であって、適当
    な宿主生物または適当な細胞培養物、好ましくは特許請
    求の範囲第（１１）〜（１４）項のいずれか１項に記載
    の宿主生物または細胞培養物を、特許請求の範囲第（１
    ５）〜（１９）項のいずれか１項に記載のポリペプチド
    をコードする遺伝情報、好ましくは特許請求の範囲第（
    ７）〜（１０）項のいずれか１項に記載の複製可能なベ
    クターに含まれる遺伝情報で形質転換し、かくして形質
    転換した宿主生物または細胞培養物に適当な条件下で培
    養し、表現されたポリペプチドを単離および精製するこ
    とを特徴とする上記方法。
21. （２１）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載のポリペプチドの一つに対するモノクロ
    ーナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリッドセ
    ルライン。
22. （２２）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載のポリペプチドの作用を完全にまたは部
    分的に特異的に中和するか、あるいはこれらポリペプチ
    ドの一つに特異的に結合することを特徴とするモノクロ
    ーナル抗体。
23. （２３）抗原の中和特性をもつと共に、該抗原の変性形
    に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
24. （２４）特許請求の範囲第（２２）または（２３）項に
    記載のモノクローナル抗体の、特許請求の範囲第（１５
    ）〜（１９）項のいずれか１項に記載のポリペプチドの
    一つを定量的および／または定性的に測定するための利
    用。
25. （２５）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載のポリペプチドの一つを精製するための
    、特許請求の範囲第（２２）または（２３）項記載のモ
    ノクローナル抗体の利用。
26. （２６）治療のための、特許請求の範囲第（２２）また
    は（２３）項記載のモノクローナル抗体の利用。
27. （２７）特許請求の範囲第（２２）または（２３）項記
    載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする特許請
    求の範囲第（１５）〜（１９）項のいずれか１項に記載
    のポリペプチド測定用テストキット。
28. （２８）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載のポリペプチドの一つで宿主動物を免疫
    し、該宿主動物のＢ−リンパ細胞をミエローマ細胞と融
    合し、特許請求の範囲第（２２）または（２３）項に記
    載のモノクローナル抗体を分泌するハイブリットセルラ
    インをサブクローニングし、かつ生体内または試験管内
    で培養することを特徴とする該モノクローナル抗体の調
    製方法。
29. （２９）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載のポリペプチドの治療のための利用。
30. （３０）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいず
    れか１項に記載の一つのポリペプチドの、ライノウィル
    ス感染症の治療のための利用。
31. （３１）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項記載の
    ポリペプチドの一つの、ライノウィルス感染症の予防の
    ための利用。
32. （３２）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項に記載
    のポリペプチドの一つの、免疫系刺激のための利用。
33. （３３）特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項記載の
    ポリペプチドの一つの、ライノウィルス株ＨＲＶ８９の
    細胞受容体への結合および／またはその遮断のための利
    用。
34. （３４）製薬上不活性な賦形剤および／または担体に加
    えて、特許請求の範囲第（１５）〜（１９）項のいずれ
    か１項記載のポリペプチドの少なくとも一つを有効量で
    含むことを特徴とする、上記ポリペプチドを使用するの
    に適した特許請求の範囲第（２９）〜（３３）項のいず
    れか１項記載の薬理組成物。