JPS63185388A - メチル資化微生物での増殖のためのハイブリドプラスミドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヨーロッパ公開特許出願節０．０９８，９６７号には、
外来ＤＮＡを発現する偏性メチル資化菌（ｏｂｌｉｇａ
ｔｅ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉ
ａ）の製造方法および、この目的に見合うプラスミドと
宿主生物についての記載がある。これには、メチル資化
菌に接合によって交互に移入させることができる組換体
プラスミド（ハイブリドプラスミド）の作製のため、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ベクターに結合させた偏性メチル
資化菌のプラスミドが必要である。

しかしながら、偏性メチル資化菌の適切なプラスミドの
ひとつである、メチロモナス・クラーラ（Ｍｅｔｈｙｌ
ｏｍｏｎａｓ　ｃｌａｒａ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　２３９７株
のｐＢＥ３は分子量１０ＭＤで比較的大きい。より便利
な操作のため、このプラスミドを分断することが望まし
い。これは、しかし困難であることがわかった。なぜな
らば、このプラスミドは６塩基配列を認識する殆んどの
酵素に対して、全く切断部位をもたないか、又はごくわ
ずかしか持たないからである（ヨーロッパ公開特許出願
節０．０９８，９６７号）。

しかし、おどろいたことには、このプラスミドｐＢＥ３
は、８塩基配列を認識する制限酵素ＮｏｔＩによって少
くとも９個のフラグメントに切断され得る。Ｍ、ｃｌａ
ｒａに於る増殖のための必要かつ十分な情報は、これら
ＮｏｔＩフラグメントのうち、一番大きなフラグメント
上に存在することを示すことができた。このフラグメン
トは、ＮｏｔＩ切断部位を同様に有するベクターに取り
込ませるか、又は、他の酵素で消化することによって特
定のハイブリドプラスミドから得ることができるように
、まずこのフラグメントを修飾して、それから適当な切
断部位を有するベクターに取り込ませるか、いずれかを
実施することができる。

本発明はかくして以下のことに関するものである。

１、　　メチロモナスψクラーラに於る増殖に必要なｐ
ＢＥ３のフラグメントを有するハイブリドプラスミド。

２゜　　ｐＢＥ３のプラスミドフラグメントを、選択マ
ーカーを有するプラスミドと連結することからなる、第
１項に規定されたハイブリドプラスミドの製造方法。

３、　　メチル資化菌用ベクター構成のための、第１項
に規定されたハイブリドプラスミドの使用。

本発明は、特にその好ましい具体化例に於て、この後詳
細に記述され、さらに請求項に於て定義されている。

ＮｏｔＩ切断部位を有するハイブリドプラスミドを形成
する好ましい方法は、ＮｏｔＩ切断部位を有するＥｃｏ
ＲＩフラグメント、好ましくは、プラスミドｐＢＥ３の
四番目に大きいＥｃｏＲＩフラグメントを、選択マーカ
ーを有するプラスミドのＥｃｏＲＩ切断部位にクローニ
ングすることである。

選択マーカーを有する好ましい出発プラスミドは、ｐＢ
Ｒ３２２であり、これは、ＮｏｔＩ切断部位を含まない
。この方法ではｐＲＭプラスミドが得られるが、好まし
い具体化例ではｐＲＭ４が得られる。

ＮｏｔＩで切断したｐＢＥ３をｐＲＭプラスミド、特に
ｐＲＭ４、に連結し、受容宿主菌、例えばＥ、ｃｏｌｉ
を形質転換した後、各種のＮｏｔＩフラグメントを有す
るハイブリドプラスミドを含む菌を、選別により見つけ
ることができる。

これらプラスミドを接合系に組み入れ、これらを例えば
Ｅ、ｃｏｌｉからＭ、ｃｌａｒａへ、好ましくは、ヨー
ロッパ公開特許出願節 ０．０９ｇ、９６７号に記載されたような系で移入すれ
ば、ＮｏｔＩフラグメントのいずれが増殖のための完全
な情報を含んでいるかを確定することができる。いずれ
の場合に於ても、それは最も大きなフラグメントである
。該当するハイブリドプラスミドをｐＲＭ−Ｎｏｔｏｒ
ｉとよび、さらに好ましいハイブリドプラスミドをｐＲ
Ｍ４−Ｎｏｔｏｒｉと呼ぶ。

好ましいハイブリドプラスミドｐＲＭ４−Ｎｏｔｏｒｉ
を用いる操作手順は、本発明のこの後の記載で述べられ
ている。しかしながら、他のｐＲＭ−Ｎｏ　ｔ　ｏ　ｒ
　ｉプラスミドを同様に用いることもできる。この目的
のために用いる適切な条件は、簡単な予備試験で決定す
ることができる。

さらに大きさを減少させるために、プラスミドｐＲＭ４
−Ｎｏｔｏｒｉを、制限酵素ＰｖｕＩで処理する。ｐＲ
Ｍ４−Ｎｏｔｏｒｉは２つのＰｖｕｌ切断部位を含み、
そのうちのひとつはこのプラスミドのｐＢＲ３２２部分
に在り、他はｐＢＥ３部分にあって、しかも増殖に必要
なＮｏｔＩフラグメントの外側に存在する。かくしてプ
ラスミドｐＲＭ４−Ｎｏ　ｔ　ｏ　ｒ　ｉをＰｖｕＩで
消化すれば、２つのフラグメントを生じ、このうちの大
きい方が、機能しうるテトラサイクリン耐性遺伝子と共
に、Ｍ、ｃｌａｒａ及びＥ。

ｃｏｌｉでの増殖に必要なすべての機能を含んでいる。

続いてこの制限混合物をリガーゼで処理すれば、２つの
Ｐｖｕ　Ｉフラグメントのうちの大きい方から得られる
プラスミドｐｓＥ１を生じる。

このプラスミドは接合系の助けをかりて、メチロモナス
・クラーラのようなメチル資化菌に移すことができて、
このプラスミドはまたこの微生物中で、非選別条件下に
於てすら何世代にもわたって安定である。

ｐｓＥｌやポリリンカーを有するプラスミド、例えばｐ
Ｕｃ１２の助けをかりて、複製起点を担うＮｏｔＩフラ
グメント末端を修飾することができる。これは、複製起
点を担うｐＢＥ３フラグメントが、もはやＮｏｔＩ切断
部位によって境を接するのではなく、他の制限部位の組
合せによって境界を接するような修飾方法である。複製
起点を担うＮｏｔＩフラグメントの両端に合成した短い
ＤＮＡ配列を付加することによって、又ＮｏｔＩフラグ
メントをｐＵｃ１２に存在するポリリンカー以外のポリ
リンカー配列に結合させることによって、このＮｏｔＩ
フラグメントを修飾することもできる。このような方法
で作製されるハイブリドプラスミド、例えばｐＵｃ１２
−Ｎｏ　ｔ　ｏ　ｒ　ｉ。

は複製起点を担うｐＢＥ３フラグメントが種々の制限酵
素で生じることを可能にし、さらにメチル資化菌、特に
メチロモナス・クラーラ、で増殖しうる他のすべての望
ましいプラスミドに移すことを可能にするものである。

プラスミドｐＢＥ３の複製起点を担うすべての望ましい
ハイブリドプラスミドを、ヨーロッパ公開特許出願節０
．０９８，９６７号に記載された系によって、Ｍ、ｃｌ
ａｒａに移入させるためには、相当するプラスミド上に
存在する“可動性の基”　　（”ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｍ
ｏｂｉｌｉｚａｂｉｌｉｔｙ、　ｂｏｍ”）と呼ばれる
ＤＮＡ配列が必要である。このＤＮＡ配列は、例えばプ
ラスミドｐＢＲ３２２にも、又見出すことができる。そ
の位置は実際に知られており、プラスミドｐＢＲ３２２
の二番目に大きいＨａ　ｅｍフラグメントに割当てるこ
とができる。このプラスミドを上に述べたような方法で
処理して、適当なハイブリドプラスミドから種々の制限
酵素で“ｂｏｍ”を得ることができるようにすることが
できる。

このように構築された“複製起点”　ＤＮＡ配列又は“
ｂｏｍ”ＤＮＡ配列の助けをかりて、メチル資化菌、特
にメチロモナス・クラーラ、にすべでの望ましい発現プ
ラスミドを移入し、これらに於て安定した増殖がおこる
ように、これら発現プラスミドを改変することができる
。この目的のために、まず第一に、複製起点ＤＮＡ断片
を、例えばプラスミドｐＵｃ１２−Ｎｏｔｏｒｉから適
切な制限酵素の組合せにより抜き取り、発現ベクターに
結合させる。もし適切なメチル資化菌への移入に必要な
りｏｍ部位が発現ベクターに存在しない場合には、第二
段階では、ｂｏｍ部位を担うＤＮＡ断片を、例えばプラ
スミドｐＵＣ１２−ｂｏｍから適当な制限酵素の組合せ
によって抜き取り、上と同様にして発現ベクターに移す
。この方法によって、すべての望ましい遺伝子産物をコ
ードすることができ、メチル資化菌にこれを移入し、さ
らに発酵により該当する遺伝子産物を得ることが可能で
ある。

この方法で、例えば芳香族トランスアミナーゼ遺伝子を
メチロモナス・クラーラに導入することができる。これ
は例えばベクターｐＢＲ３２２に由来するプラスミドｐ
１ＭＳ４００４から出発する。このプラスミドｐ１ＭＳ
４００４には、Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２の全ＤＮＡから得られる４、５ｋｂ
大のＣ１ａＩフラグメントが、ｐＢＲ３２２の唯一のＣ
１ａＩ切断部位にクローニングされている。この４．５
ｋｂの大きさのＣ１ａＩフラグメントは、Ｅ、ｃｏｌｉ
　　Ｋ１２からの芳香族トランスアミナーゼのためのｔ
ｙｒＢ遺伝子を担っている。この遺伝子はこの４．５ｋ
ｂ領域全体にわたって広がっていないで、Ｃ１ａＩ切断
部位とＨｉｎｄｌＩＩ切断部位によって限定されたＤＮ
Ａ断片内に位置している。そこで、もしプラスミドｐＩ
ＭＳ４００４をＨｉｎｄ■で切断すると、４．５ｋｂの
大きさのＣ１ａＩフラグメント上のＨｉｎｄｍ切断部位
と、ｐＢＲ３２２部分に位置しているＨｉｎｄＩＩＩ切
断部位は、大きいＨｉｎｄ■フラグメントの再環状化に
より、ｔｙｒＢ遺伝子を損うことなく欠失フラグメント
を生ずる。生じたプラスミドはただひとつのＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断部位とただひとつの５ａｌＩ切断部位を含み、
両者はこのプラスミドのｐＢＲ３２２部分に存在する。

このプラスミドはｐＢＲ３２２から由来するので、メチ
ル資化菌への移入に必要なりｏｍ配列、機能しかつ良好
に発現するｔｙｒＢ遺伝子および選別に用いることので
きるアンピシリン耐性遺伝子をもつ。しかしながら、こ
のプラスミドにはメチル資化菌での増殖を可能にするＤ
ＮＡ配列が存在しない。このＤＮＡ配列を挿入するため
に、このプラスミドを制限酵素Ｈｉｎｄ■と５ａｌＩで
完全に消化し、プラスミドｐＵｃ１２−Ｎｏ　ｔ　ｏ　
ｒ　ｉも同様に消化する。これによりメチル資化菌のた
めの複製起点を担うＤＮＡ配列をｐＵＣ１２−Ｎｏ　ｔ
　ｏ　ｒ　ｉから抜き取ることができる。さらにプラス
ミドｐＵｃ１２−Ｎｏｔｏｒｉから生じるＨｉｎｄｍ／
５ａｌｌフラグメントが再び出発ベクターに連結するの
を防ぐために、このプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩでも
消化する。この所望の遺伝子をプラスミドに連結して、
ヨーロッパ公開特許出願に記載された接合系に適用し、
偏性メチル資化菌株、Ｍ、Ｃ１ａｒａに移入する。選別
クローンを最少溶菌し、分離プラスミドを制限酵素で消
化して、受容菌株、Ｍ、ｃｌａｒａ中で安定に存続して
いる移入ＤＮＡが当該内にそのままの形で挿入されてい
ることを確認することができる。

本発明は後記した例によってさらに説明されている。

（例） 例の付録として、制限地図が添付されており、これらは
、プラスミドｐＲＭ４およびｐＲＭ４−Ｎｏｔｏｒｉ（
第１図）、プラスミドｐＳＥ１およびｐＵＣ１２−Ｎｏ
ｔｏｒｉ　　（第２図）を示している。本発明に必要な
切断部位のみが示されており、表示された大きさはＭＤ
である。

１、ｐＲＭ４−ＮｏｔｏｒｉとｐｓＥｌの構築制限酵素
ＮｏｔＩでプラスミドｐＲＭ４を完全に消化した。エン
ドヌクレアーゼＮｏｔＩをフェノール処理で除き、ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄、
真空中で乾燥後、酵素、アルカリホスファターゼ（ＣＩ
　Ｐ）に対して最適となるようにベーリンガーマンハイ
ム（Ｂｏｅｈｒｊｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）が記
載する緩衝液の適量に溶解した。アルカリホスファター
ゼの１０単位を添加し、３７℃で３０分インキュベーシ
ョン（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）　Ｌ、フェノール処理に
より、反応混合物から当該酵素を除去し、さらにＤＮＡ
の精製は上記のように行なった。ＤＮＡは最終的に、Ｔ
Ｅ緩衝液に再浮遊させた。

Ｍ、ｃｌａｒａのプラスミドｐＢＥ３を完全に酵素Ｎｏ
ｔＩで消化したところ、少くとも９つの種々の大きさの
切断フラグメントが生じた。

消化の完全さは、反応混合物の適量をアガロースゲルに
取ってしらべた。消化の後、フェノール処理で酵素を除
去し、上記のようにＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液に再浮
遊させた。

ＮｏｔＴで消化したｐＲＭ４とｐＢＥ３の種々の混合物
を、モル比２：１又は１：１又は１：５に調製した。酵
素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにとって最適な溶液を作製するた
めに製造元のニューイングランドバイオラブ（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）が規定するように
、緩衝液を生成混合物に添加した。

酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ調製液（バイオラブ（Ｂｉｏ
ｌａｂｓ　）　、４００　Ｕ／　ｔｔΩ）の１．、ｃｚ
　４７を、この混合物に添加し、１４〜１６℃で少くと
も１４時間インキュベーションした。この混合物の全容
積は５０ｇｇであった。

インキュベーションの後、１０ｇｇのりガーゼ混合物を
ピペットで取り出して、滅菌したエッペンドルフ（Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ　）反応管中てＥ、ｃｏｌｉＨＢ１０１
株の受容細胞浮遊液１００μｇを添加した。細菌を外来
ＤＮＡを取り込む受容細胞とするためには、周知の方法
が採られた。形質転換はニーエンら（Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ
　ａｌ　）の方法で行なった（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、６９．２１１０−２１１４．１
９７２）。

アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性コロニーは、
適切な選別栄養培地で分離し、Ｌブロース（１２６ハク
トトリプトン、０．５％酵母抽出物、０、　５９６Ｎ　
ａ　Ｃ１）で培養し、それから最少溶菌で耐性コロニー
のプラスミドの内容をしらべた。

酵素ＮｏｔＩてプラスミドを消化し、アガロースゲル電
気泳動を行なって、ｐＢＥ３のＮｏｔＩフラグメントが
ｐＲＭ４に取り込まれていることを示すことができた。

ｐＢＥ３のＮｏｔＩフラグメント１．３および４を、す
でに記載した方法でプラスミドｐＲＭ４にクローニング
することができた。生じたプラスミドを、ヨーロッパ公
開特許出願第 ０．０９ｇ、９７６号明細書の例１０に記載された接合
系に於て使用し、Ｅ、ｃｏｌｉからＭ。

ｃｌａｒａへのこれらプラスミドの移入について検討し
た。ｐＲＭ４にクローニングされたｐＢＥ３のＮｏｔＩ
フラグメントを含むプラスミドだけがテトラサイクリン
およびアンピシリン耐性Ｍ。

ｃｌａｒａコロニーを生じることが確認された。

相当するプラスミドが最少溶菌によって、これらクロー
ンから検出された。このプラスミドをｐＲＭ４−Ｎｏｔ
ｏｒｉと呼んだ。

ｐＲＭ４−Ｎｏｔｏｒｉを完全に酵素Ｐｖｕ　Ｉで切断
し、反応混合物を、６５℃まで加熱した。

この混合物の１０ｇｇを、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにと
って最適であると製造元によって推奨された溶液となる
ように、水と緩衝液で希釈し、全容量を１００μｇとす
る。これに１μｇのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラブ、
４００Ｕ／μ、ｌ？）を添加し、混合物を１６℃で１６
時間インキュベーションした。続いてＥ、ｃｏｌｉ　　
Ｈ８１０１株の受容細胞を、このリガーゼ混合物の適量
で形質転換し、テトラ→ノ゛イクリン耐性コロニーを適
切な選別用平板で（２０ｇｇ　／　ｍｌのテトラサイク
リン含有しブロス）選別した。５０ケのテトラサイクリ
ン耐性コロニーをアンピシリン平板（５０μｇ／ｍｌア
ンピシリン含有しブロス）に釣り上げた。表現型がＴｃ
　　Ａｐ　　である５ケのコロニーから、最少溶菌でプ
ラスミドＤＮＡを分離し、検討した。金側に於て、分離
プラスミドは、プラスミドｐＲＭ４−Ｎｏ　ｔ　ｏ　ｒ
　ｉの大きいＰｖｕ　Ｉフラグメントのみから成ってい
た。このハイブリドプラスミドをｐｓＥｌと呼んだ。こ
のプラスミドｐｓＥ１を、すでに記載された接合系に於
て使用し、プラスミドを持たないメチル資化菌株Ｍ。

ｃｌａｒａ　　ＡＴＣＣ３１２２６に移入した。生じた
テトラサイクリン耐性Ｍ、ｃｌａｒａクローンはすべて
予想したプラスミドｐｓＥ１を、そのままの形で含んで
いた。非選別条件下で、１００代以上継代しても、この
プラスミドの減少は認められなかった。

２、ｐＵｃ１２−Ｎｏｔｏｒｉの構築 プラスミドｐｓＥ１を完全に酵素ＮｏｔＩて消化し、生
じた突出端を、製造元のベーリンガーマンハイム（Ｂｏ
ｃｈｒｉｎｇｃｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）の推奨する緩
衝液で、同じく製造元が記載したような条件下で、酵素
ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）で処
理して充填して平滑端とした。ＤＮＡポリメラーゼＩを
フェノール処理で除去し、エタノール沈澱でＤＮＡを精
製し、このフラグメント混合物を新たに制限酵素５ａｌ
Ｉで消化した。酵素５ａｌＩは、ｐＢＥ３のＮｏｔＩフ
ラグメントを切断しないが、ベクターｐｓＥ１のテトラ
サイクリン耐性遺伝子を内部で切断する。

このように前処理したＤＮＡを、酵素Ｘｂａｌで完全に
消化し、フレノウポリメラーゼで充填したｐＵＣＤＮＡ
と混合し、例１で述べたように連結を実施した。Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　　Ｈ８１０１株の受容細胞を形質転換し、アン
ピシリン耐性コロニーを選別した。このコロニーをＬブ
ロス培養液で培養し、最少溶菌で、プラスミドの内容を
しらべた。アガロースゲル電気泳動でしらべた時、プラ
スミドｐＵｃ１２と比べて大きさが増大したプラスミド
ＤＮＡについては、ＥＣ０ＲＩで消化して、その性状を
詳細に検討した。これによって、充填ＸｂａＩ切断部位
にクローニングしたＭ。

ｃｌａｒａのプラスミドｐＢＥ３の充填ＮｏｔＩフラグ
メントを有するプラスミドｐＵｃ１２を持つクローンを
識別することができた。このフラグメントの挿入の方向
については、可能な二種の方向のうち、いずれの方向の
ものも分離された。これらのプラスミドから、Ｍ、ｃｌ
ａｒａでの増殖に必要なプラスミドｐＢＥ３領域を大量
に分離することができ、制限酵素Ｓｓ　ｔ　Ｉ、Ｓｍａ
　Ｔ。

ＢａｍＨＴ及び５ａｉｌ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄ■の
組合せによって、このｐＢＥ３領域を分離することがで
きる。

３、ｐＵｃ１２−ｂｏｍの構築 市販のプラスミドｐＵｃ１２を酵素ＸｂａＩて−１９一 完全に消化し、生じた突出端を酵素ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ　（フレノウフラグメント）を用いて充填した。プラ
スミドｐＢＲ３２２を、酵素Ｈａ　ｅＩ［で完全に消化
し、これにより平滑端を有する２２ケのフラグメントを
生じた。アガロースゲル電気泳動で、これらフラグメン
トの最も大きい物を互いに分離することができた。フラ
グメントが互いに分離したか否かは、ＤＮＡフラグメン
トがアガロースゲルに含まれる染色剤臭化エチジウムの
螢光によって検出され得るので、電気泳動中にアガロー
スゲルをＵＶ光の下で時折検査することによって識るこ
とかできた。

フラグメントが互いに十分に分離した時、ｐＢＲ３２２
の２番目に大きいＨａ　ｅＩＩＩフラグメントを含むア
ガロースの薄片を外科用メスでゲルから切り出し、透析
チューブに移した。緩衝液（８９ｍｍｏｌ／、Ｑ　）リ
ス、８９ｍｍｏｌ／４２ホウ酸、２、　５ｍｍｏｌ／ｉ
ｔ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，２）　）を切り出したゲル薄
片が完全におおわれるまで透析チューブに導入し、さら
にこの透析チューブを電気法−２０＝ 動槽に固定して、導入したのと同じ緩衝液で電気溶出（
ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）　した。溶出は１００
ｖで少くとも１２時間行なった。陰極と陽極を入れかえ
て、さらに５分間溶出を行った。透析チューブから緩衝
液をプラスチック容器に移した。全てのＤＮＡがアガロ
ースゲル薄片から溶出したことを確認するために、ゲル
をＵＶ光の下でしらべた。

フェノールで少くとも２回、緩衝液を処理し、得られた
水相を合わせてから、エタノール沈澱を行なった。生成
物を少くとも３回、７０２６エタノールで洗浄した。こ
のＤＮＡを真空中で乾燥し、適当な容量のＴＥ緩衝液に
とり、そのうちの適量を、上で述べたように調製したｐ
Ｕｃ１２　　ＤＮＡと混合し連結した。形質転換したＥ
、ｃｏｌｉクローンを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
含有しブロス平板で選別し、最少溶菌によってこれらク
ローンから分離したプラスミドＤＮＡを、アガロースゲ
ル電気泳動によって、大きさの増加について検べた。

この方法によってｐＢＲ３２２からのｂｏｍＤＮＡ配列
がクローニングされたクローンでいずれの方向のものも
識別することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＲＭ４およびｐＲＭ４−Ｎｏｔ
ｏｒｉの制限地図を示す説明図である。 第２図は、プラスミドｐＳＥ　−１およびｐＵＣ１２−
Ｎｏｔｒｉの制限地図を示す説明図である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、メチロモナス・クラーラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａ
   ｓｃｌａｒａ）での増殖に必要なｐＢＥ３フラグメント
   を有するハイブリドプラスミド。 ２、ｐＢＥ３をＮｏｔ I で完全消化し、 ２．３ＭＤの最大フラグメントを分離することによって
   得られうる、プラスミドｐＢＥ３の複製起点を有するＤ
   ＮＡ断片。 ３、ｐＢＥ３フラングメントが２．３ＭＤのＮｏｔ I
   フラグメントである、特許請求の範囲第１項記載のハイ
   ブリドプラスミド。 ４、選別マーカーをもつプラスミドを含む、特許請求の
   範囲第１項又は第３項記載のハイブリドプラスミド。 ５、ｐＢＲ３２２を含む、特許請求の範囲第４項記載の
   ハイブリドプラスミド。 ６、当該プラスミドがｐＲＭプラスミドを含む、特許請
   求の範囲第５項記載のハイブリドプラスミド。 ７、当該プラスミドがｐＲＭ４を含む、特許請求の範囲
   第６項記載のハイブリドプラスミド。 ８、Ｐｖｕ I によって完全消化し、４．８２ＭＤの最
   大フラグメントを閉環することにより得られる、特許請
   求の範囲第７項記載のハイブリドプラスミド。 ９、当該ｐＢＥ３プラスミドフラグメントを選別マーカ
   ーを有するプラスミドと結合させることからなる、特許
   請求の範囲第１項又は第３項記載のｐＢＥ３フラグメン
   トを有するハイブリドプラスミドの製造法。 １０、ＰＲＭ４に当該ｐＢＥ３プラスミドフラグメント
   が連結される、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、生成ハイブリドプラスミドｐＲＭ４ Ｎｏｔｏｒｉを完全にＰｖｕ I で消化し、該制限混合
   物をリガーゼで処理して、消化により生成した４．８２
   ＭＤの最大フラグメントをプラスミドとして分離する、
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、メチル資化菌（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ　
   ｂａｃ−ｔｅｒｉａ）のための発現プラスミドの構築の
   ための、メチロモナス・クラーラでの増殖に必要なｐＢ
   Ｅ３フラグメントを有するハイブリドプラスミドの使用
   。 １３、メチロモナス・クラーラのための発現プラスミド
   の構築のための、特許請求の範囲第１２項記載のハイブ
   リドプラスミドの使用。 １４、メチロモナス・クラーラに於る芳香族トランスア
   ミナーゼのための発現プラスミドの構築のための、特許
   請求の範囲第１３項記載のハイブリドプラスミドの使用
   。