JPS63141599A - 新規な測定試薬 - Google Patents
新規な測定試薬Info
- Publication number
- JPS63141599A JPS63141599A JP28824586A JP28824586A JPS63141599A JP S63141599 A JPS63141599 A JP S63141599A JP 28824586 A JP28824586 A JP 28824586A JP 28824586 A JP28824586 A JP 28824586A JP S63141599 A JPS63141599 A JP S63141599A
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- JP
- Japan
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- peptidoglycan
- reagent
- solution
- insect
- component
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ペプチドグリカンに特異的に反応する成分を
含んで成る試薬及びそれを用いたペプチドクリカンの定
量方法に関する。
含んで成る試薬及びそれを用いたペプチドクリカンの定
量方法に関する。
ペプチドクリカン（以下、ＰＧと略称する。）は一般細
菌類の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポＩＪ−ｔ−で、
一般的にはＮ−アセチルまたはＮ−グリコリルムラミン
酸とＤ−アミノ酸を含むことを特徴としている。ＰＧは
発熱性、肝臓腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増
大作用、アジュバント活性（免疫機能の増強効果）等多
くの生物活性を有しておシ、医学、薬学、微生物学等の
分野で盛んに研究されているにもかかわらず、その特異
的な定量法はいまのところ見出されていない。
菌類の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポＩＪ−ｔ−で、
一般的にはＮ−アセチルまたはＮ−グリコリルムラミン
酸とＤ−アミノ酸を含むことを特徴としている。ＰＧは
発熱性、肝臓腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増
大作用、アジュバント活性（免疫機能の増強効果）等多
くの生物活性を有しておシ、医学、薬学、微生物学等の
分野で盛んに研究されているにもかかわらず、その特異
的な定量法はいまのところ見出されていない。
一方、本発明者らの一部らは、蚕から得られた体液が、
エンドトキシンとは反応しないが、ＰＧまたはβ−１，
３−グルカン（以下、β−Ｇと略称する。）と反応し、
それにより少なくとも３種の酵素、即ち、Ｎ−α−ベン
ゾイル−し−アルギニンエチルエステル分解酵素（以下
、ＢＡＥＥａ、、と略称する。）、ブローフェノールオ
キシダーゼ活性化酵素（以下、ＰＰＡＥと略称する。）
及びフェノールオキシダーゼ（以下、ＰＯと略称する。
エンドトキシンとは反応しないが、ＰＧまたはβ−１，
３−グルカン（以下、β−Ｇと略称する。）と反応し、
それにより少なくとも３種の酵素、即ち、Ｎ−α−ベン
ゾイル−し−アルギニンエチルエステル分解酵素（以下
、ＢＡＥＥａ、、と略称する。）、ブローフェノールオ
キシダーゼ活性化酵素（以下、ＰＰＡＥと略称する。）
及びフェノールオキシダーゼ（以下、ＰＯと略称する。
）が活性化されることを先に見出した（ Ｉｎ５ｅｃｔ
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 １６ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 １６ 。
５３９〜ｓ４５．１９８６）が、特異性に問題があるた
め、これをＰＣの定量に応用する迄には到らなかった。
め、これをＰＣの定量に応用する迄には到らなかった。
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、ＰＧ
に特異的に反応する成分全台んで成る°試薬とそれを用
いたＰＧの定量方法を提供することを目的とする。
に特異的に反応する成分全台んで成る°試薬とそれを用
いたＰＧの定量方法を提供することを目的とする。
本発明は、昆虫の体液から得られる、ベプチＰグリカン
に特異的に反応する成分を含んで成る試薬及び該試薬を
用いることを特徴とするペゾチドグリカンの定量方法の
発明である。
に特異的に反応する成分を含んで成る試薬及び該試薬を
用いることを特徴とするペゾチドグリカンの定量方法の
発明である。
即ち、本発明者らは昆虫の体液からＰＣと特異的に反応
して酵素活性を発現する物質をとり出すべく鋭意研究を
重ねた結果、これの分離精製に成功し、これをＰＧを含
む検体と反応させ、発現するＢＡＥＥａ、ｅ、 ＰＰＡ
Ｅ 、 ＰＯ等の酵素活性を測定することによシ、或は
、これらの酵素活性の発現時間を測定することにより、
ＰＣの定量が可能となることを見出し本発明を完成する
に到った。
して酵素活性を発現する物質をとり出すべく鋭意研究を
重ねた結果、これの分離精製に成功し、これをＰＧを含
む検体と反応させ、発現するＢＡＥＥａ、ｅ、 ＰＰＡ
Ｅ 、 ＰＯ等の酵素活性を測定することによシ、或は
、これらの酵素活性の発現時間を測定することにより、
ＰＣの定量が可能となることを見出し本発明を完成する
に到った。
本発明に用いることのできる体液の得られる昆虫として
は、特に制限はないが、なるべく大型のもので飼育方法
の確立しているものが望ましく、例えば、タバコスズメ
ガ、カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ、イエバエ等
の双翅類、トノサマバッタ、エンマコオロギ等の直翅類
、センツキカミキリ等の甲虫類等が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
は、特に制限はないが、なるべく大型のもので飼育方法
の確立しているものが望ましく、例えば、タバコスズメ
ガ、カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ、イエバエ等
の双翅類、トノサマバッタ、エンマコオロギ等の直翅類
、センツキカミキリ等の甲虫類等が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
体液としては、体腔から得られるヘモリンｌ？（ｈｅｍ
ｏｌｙｍｐｈ）が最も得られやすくより一般的である。
ｏｌｙｍｐｈ）が最も得られやすくより一般的である。
体液を得る方法としては、例えば、本発明者の一部らが
行った方法（Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ−、１１，
５７〜６５ 。
行った方法（Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ−、１１，
５７〜６５ 。
１９８１）がある。即ち、昆虫を氷上に置き動きを止め
た後、ドウキビ因子（サトウキビに含まれるグルコース
、アミノ酸などから成る高分子物質）を不純物として含
む蔗糖、またはドウキビ因子そのものを含む生理食塩水
を体腔に注射し、その後しばらく放置して、体腔よシヘ
モリンパを集める。
た後、ドウキビ因子（サトウキビに含まれるグルコース
、アミノ酸などから成る高分子物質）を不純物として含
む蔗糖、またはドウキビ因子そのものを含む生理食塩水
を体腔に注射し、その後しばらく放置して、体腔よシヘ
モリンパを集める。
集めた液を遠心分離器にかけ血球を除いた後透祈すれば
体液の血漿成分が得られる。
体液の血漿成分が得られる。
このようにして得られた血漿中には、エン−トキシンと
は反応しないがβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する物質（或は発現を誘引する物質）と、ＰＧと特異
的に反応して酵素活性を発現する物質（或は発現を誘引
する物質）と、β−Ｇ、ＰＣのいずれとも反応して酵素
活性を発現する物質（或は発現を誘引する物質）とが共
存しているので、このうちβ−Ｇと反応して酵素活性全
発現する（或は発現を誘引する）成分を除去すれば、こ
れをＰＧと特異的に反応する成分とすることができる。
は反応しないがβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する物質（或は発現を誘引する物質）と、ＰＧと特異
的に反応して酵素活性を発現する物質（或は発現を誘引
する物質）と、β−Ｇ、ＰＣのいずれとも反応して酵素
活性を発現する物質（或は発現を誘引する物質）とが共
存しているので、このうちβ−Ｇと反応して酵素活性全
発現する（或は発現を誘引する）成分を除去すれば、こ
れをＰＧと特異的に反応する成分とすることができる。
昆虫の血漿から、β−Ｇと反応して酵素活性を発現する
（或は発現を誘引する）成分を除去する方法としては、
グルテ過法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等、一般に生
化学の分野で用いられている分離精製法がいずれも挙げ
られるが、β−Ｇを結合させた担体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによりこれを行えば、極めて容
易に且つ効率よくこれを行うことができるので、特に好
ましい。以下、この方法について述べる。
（或は発現を誘引する）成分を除去する方法としては、
グルテ過法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等、一般に生
化学の分野で用いられている分離精製法がいずれも挙げ
られるが、β−Ｇを結合させた担体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによりこれを行えば、極めて容
易に且つ効率よくこれを行うことができるので、特に好
ましい。以下、この方法について述べる。
β−Ｇを結合させる担体としては、セルロース、アガロ
ース、デキストラン、ポリアクリルアミ−１多孔性ガラ
ス等、アフィニティークロマトグラフィーに於て通常用
いられている担体は、いずれも使用可能であるが、中で
もアガロースが特に好ましい。アガロース系担体の具体
的商品としては、セファロース（ファルマシア社）、バ
イオグルＡ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等があシ、デキストラ
ン系のものとしては、セファデックス（ファルマシア社
）、セファクリル（ファルマシア社）が、また、ポリア
クリルアミＰ系のものとしては、エンザフィックスＰ（
和光紬薬工業（株））、バイカケ９ルＰ（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ社）等が夫々市販されているが、これらに限定される
ものではない。これらの担体にβ−Ｇを結合させる為に
は担体を活性化させる必要があることは言うまでもない
。担体の活性化法は種々あり、特に限定されるものでは
ないが、例えば、工ビクロルヒｐ ＩＪンで活性化する
方法等が適当なものとして挙げることができる。
ース、デキストラン、ポリアクリルアミ−１多孔性ガラ
ス等、アフィニティークロマトグラフィーに於て通常用
いられている担体は、いずれも使用可能であるが、中で
もアガロースが特に好ましい。アガロース系担体の具体
的商品としては、セファロース（ファルマシア社）、バ
イオグルＡ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等があシ、デキストラ
ン系のものとしては、セファデックス（ファルマシア社
）、セファクリル（ファルマシア社）が、また、ポリア
クリルアミＰ系のものとしては、エンザフィックスＰ（
和光紬薬工業（株））、バイカケ９ルＰ（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ社）等が夫々市販されているが、これらに限定される
ものではない。これらの担体にβ−Ｇを結合させる為に
は担体を活性化させる必要があることは言うまでもない
。担体の活性化法は種々あり、特に限定されるものでは
ないが、例えば、工ビクロルヒｐ ＩＪンで活性化する
方法等が適当なものとして挙げることができる。
担体に結合させるβ−Ｇとしては、各種細菌類（例えば
、Ａｌ ｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ属、 Ｌａｍ１ｎａｒｉ
ａ属。
、Ａｌ ｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ属、 Ｌａｍ１ｎａｒｉ
ａ属。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等）、酵母類（例えば、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等）及びキノコ類（例え
ば、シイタケ、スエヒロタケ、カワラタケ等）の細胞壁
から得られる天然のそれでもよいし、藻類、例えば、褐
藻、ユーグレナ、ケイ藻等の貯蔵性多糖を用いてもよい
。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等）及びキノコ類（例え
ば、シイタケ、スエヒロタケ、カワラタケ等）の細胞壁
から得られる天然のそれでもよいし、藻類、例えば、褐
藻、ユーグレナ、ケイ藻等の貯蔵性多糖を用いてもよい
。
尚、β−Ｇを上記した如き担体に結合して用いる代りに
、例えばカーＰランの如く、それ自体不溶性の担体に加
工できる（例えばビーズ等として）ものについては、他
の担体に結合させることなく、それ自体を担体として用
いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことも勿
論可能である。このような目的に使用し得るカードラン
ビーズは、例えば特開昭５２−５０３５２号に記載の方
法に従って容易にこれを作製し得るので、そのようにし
て作製したものを用いることで足りる。
、例えばカーＰランの如く、それ自体不溶性の担体に加
工できる（例えばビーズ等として）ものについては、他
の担体に結合させることなく、それ自体を担体として用
いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことも勿
論可能である。このような目的に使用し得るカードラン
ビーズは、例えば特開昭５２−５０３５２号に記載の方
法に従って容易にこれを作製し得るので、そのようにし
て作製したものを用いることで足りる。
７フイニテイークロマトグラフイーをよす効果的に行う
には、予め血漿中にキレート剤等を添加して体液中に存
在するＣａ２＋、Ｍｇ２＋等２価の陽イオンの影響を除
いた状態にした後これを行うことが望ましい。この目的
で用いられるキレート剤としては、例えば、エチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ） 、エチレングリ
コールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ 、Ｎ、
Ｎ’ 、Ｎ’−四酢酸ナトリウム（ＥＧＴＡ）等が挙
げられるが、これらに限定されるものではない。キレー
ト剤の使用量は特に限定されるものではないが、通常、
血漿中の濃度が１ｍＭ〜１０ ｒｒ＋Ｍ程度になるよう
に用いられる。
には、予め血漿中にキレート剤等を添加して体液中に存
在するＣａ２＋、Ｍｇ２＋等２価の陽イオンの影響を除
いた状態にした後これを行うことが望ましい。この目的
で用いられるキレート剤としては、例えば、エチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ） 、エチレングリ
コールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ 、Ｎ、
Ｎ’ 、Ｎ’−四酢酸ナトリウム（ＥＧＴＡ）等が挙
げられるが、これらに限定されるものではない。キレー
ト剤の使用量は特に限定されるものではないが、通常、
血漿中の濃度が１ｍＭ〜１０ ｒｒ＋Ｍ程度になるよう
に用いられる。
アフィニティークロマトグラフィーの操作法自体は自体
公知のアフィニティークロマトグラフィーの操作法に従
ってこれを行えば足シる。
公知のアフィニティークロマトグラフィーの操作法に従
ってこれを行えば足シる。
このようにして、昆虫の血漿をβ−Ｇを結合させた担体
（若しくはβ−Ｇからなる担体）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーによシ処理すれば、ＰＣと特異的
に反応する成分が容易に得られるので、これを定量用試
薬として用いてＰＧの定量を行えばよい。
（若しくはβ−Ｇからなる担体）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーによシ処理すれば、ＰＣと特異的
に反応する成分が容易に得られるので、これを定量用試
薬として用いてＰＧの定量を行えばよい。
ＰＧの定量を行うには、ＰＧを含む検体と、上記ＰＧと
特異的に反応する成分からなる試薬（以下、ＰＧ試薬と
略称する。）とをよく混合して反応液とし、一定時間後
の反応液中の酵素活性、例えば、ＢＡＥＥａ、ｅ、ＰＰ
ＡＥ 、 ＰＯ等の活性を自体公知の測定方法に従って
測定し、予め、濃度既知のＰＧの標準液を用いて同様の
操作により作成した検量線からＰＧの定量を行ってもよ
いしく以下、拳法をエンド法と略称する。）、また、ｐ
ｏの活性化に要する時間が検体中のＰＧ＠度に依存する
現象を利用して、ＰＧ試薬と検体とを混合した後、ｐ。
特異的に反応する成分からなる試薬（以下、ＰＧ試薬と
略称する。）とをよく混合して反応液とし、一定時間後
の反応液中の酵素活性、例えば、ＢＡＥＥａ、ｅ、ＰＰ
ＡＥ 、 ＰＯ等の活性を自体公知の測定方法に従って
測定し、予め、濃度既知のＰＧの標準液を用いて同様の
操作により作成した検量線からＰＧの定量を行ってもよ
いしく以下、拳法をエンド法と略称する。）、また、ｐ
ｏの活性化に要する時間が検体中のＰＧ＠度に依存する
現象を利用して、ＰＧ試薬と検体とを混合した後、ｐ。
による反応生成物の量がある一定値となるまでの時間を
測定する方法（本発明者らが見出した方法。
測定する方法（本発明者らが見出した方法。
以下、タイム法と略称する。）によってこれを行っても
よい。
よい。
これらいずれの方法で行うにせよ、この定量を行う際に
は、先にＰＧに特異的に反応する成分を取り出す際に除
去した２価の金属イオン、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋
等を反応液中に改めて添加してやる必要がある。その濃
度としては、反応液中の最終濃度として、４ ｍＭ〜１
０ｍＭ程度が好ましく用いられる。
は、先にＰＧに特異的に反応する成分を取り出す際に除
去した２価の金属イオン、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋
等を反応液中に改めて添加してやる必要がある。その濃
度としては、反応液中の最終濃度として、４ ｍＭ〜１
０ｍＭ程度が好ましく用いられる。
酵素活性測定に必要な、基質、緩衝剤、共役酵素、補酵
素等、更には、要すれば、発色剤、酵素賦活剤、酵素や
色素の安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の
測定法として自体公知の方法に於て使用されるものは当
然のことながら本発明に於てもそれに準じて使用される
が、これらは予めＰＧ試薬中に溶解しておいてもよいし
、また、エンド法で行う場合には、別に酵素活性測定用
の拭清−を準備しておき、反応液の１部を採取しそれを
試料として改めて酵素活・性を測定してもよい。
素等、更には、要すれば、発色剤、酵素賦活剤、酵素や
色素の安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の
測定法として自体公知の方法に於て使用されるものは当
然のことながら本発明に於てもそれに準じて使用される
が、これらは予めＰＧ試薬中に溶解しておいてもよいし
、また、エンド法で行う場合には、別に酵素活性測定用
の拭清−を準備しておき、反応液の１部を採取しそれを
試料として改めて酵素活・性を測定してもよい。
これらの方法によりＰＧの定量を行う際、ＰＧを含む検
体とＰＧ試薬との反応温度は、反応が進行する温度であ
れば特に限定はされないが、通常、２０〜４０℃が好ま
しく用いられる。
体とＰＧ試薬との反応温度は、反応が進行する温度であ
れば特に限定はされないが、通常、２０〜４０℃が好ま
しく用いられる。
反応−は、測定する酵素の種類によって当然異ってくる
が、通常、ＰＨ６〜１０が好ましく用いられる。またこ
の反応ＰＨを維持する為、通常緩衝剤が用いられるが、
この緩衝剤としては反応に影響を与えないものであれば
種類及び使用濃度に特に制約はなく、例えば、リン酸塩
、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス緩衝液、グツズ（Ｇｏｏｄ
’ｓ）緩衝液等がいずれも挙げられる。
が、通常、ＰＨ６〜１０が好ましく用いられる。またこ
の反応ＰＨを維持する為、通常緩衝剤が用いられるが、
この緩衝剤としては反応に影響を与えないものであれば
種類及び使用濃度に特に制約はなく、例えば、リン酸塩
、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス緩衝液、グツズ（Ｇｏｏｄ
’ｓ）緩衝液等がいずれも挙げられる。
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に具体的に
説明するが、゛本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。
説明するが、゛本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。
参考例 １． 蚕血漿の調製法
戸田法（Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １１．５
７〜６５ 、１９８１ ）に従って以下のように行った
。
７〜６５ 、１９８１ ）に従って以下のように行った
。
第五的の蚕幼虫を氷上に１０分間置き動きを止めた後、
２０ｒｒＩＭのサトウキビから精製された蔗糖、または
６μ９／ｍｌのドウキビ因子を含む生理食塩水を蚕の体
重の半量分、蚕の第５及び第６腹部節の間よシ注射した
。注射した液が漏れないように細い糸で第５腹部節の前
で縛り、２０分室温放置後、第３腹部節の足を切ってヘ
モリンｄ’ （ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ） ｆ集めた。集め
たヘモリンパを１，５００Ｘｆ！で５分間、低温で遠心
し血球を除いた。上清約１００ｍを０、ＯＩＭ−）リス
−リンゴ酸緩衝液（０，１５ＭのＫＣｔを含有、ｐＨ６
，５）３１中で、２日間、低温下透析を行い目的の蚕血
漿とした。
２０ｒｒＩＭのサトウキビから精製された蔗糖、または
６μ９／ｍｌのドウキビ因子を含む生理食塩水を蚕の体
重の半量分、蚕の第５及び第６腹部節の間よシ注射した
。注射した液が漏れないように細い糸で第５腹部節の前
で縛り、２０分室温放置後、第３腹部節の足を切ってヘ
モリンｄ’ （ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ） ｆ集めた。集め
たヘモリンパを１，５００Ｘｆ！で５分間、低温で遠心
し血球を除いた。上清約１００ｍを０、ＯＩＭ−）リス
−リンゴ酸緩衝液（０，１５ＭのＫＣｔを含有、ｐＨ６
，５）３１中で、２日間、低温下透析を行い目的の蚕血
漿とした。
参考例 ２．ペプチドグリカンの調製
ミクロコツカス ルテウス（Ｗｃｒｏｃｏｃｃｕｓ １
ｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ４６９８の菌体を冷水１５０ｍＡ
！中に懸濁し、直径０．１ ｗｍのガラスピーズを０．
６．９７ｍ１添加したのち０℃で超音波処理を行って菌
体を破砕した。ガラスピーズを除去した後、２．２００
ｘｐで１０分間遠心分離して沈澱を除去し、さらに上清
を２０ρｏｏｘ ｙで４５分間遠心分離した。得られた
沈澱をＩＭ ＮａＣｔ溶液１溶液１５托 〜２０，０００Ｘ１１の分画を集め粗細胸壁標品とした
。
ｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ４６９８の菌体を冷水１５０ｍＡ
！中に懸濁し、直径０．１ ｗｍのガラスピーズを０．
６．９７ｍ１添加したのち０℃で超音波処理を行って菌
体を破砕した。ガラスピーズを除去した後、２．２００
ｘｐで１０分間遠心分離して沈澱を除去し、さらに上清
を２０ρｏｏｘ ｙで４５分間遠心分離した。得られた
沈澱をＩＭ ＮａＣｔ溶液１溶液１５托 〜２０，０００Ｘ１１の分画を集め粗細胸壁標品とした
。
得られた粗細胸壁標品ｆ ３ Ｑ ｍｌの水に懸濁し、
１００℃で２０分間加温したのち冷却し、２Ｍ酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５．９ ） １ ４ Ｑｍｌ
及びＲＮＡ分解酵素１０■を加え３７℃で３時間反応さ
せた。その後２０，０００）ｌで１時間遠心分離し、得
られた沈澱を５０ｍＭ）’Ｊスス−酸緩衝液（２０ｍＭ
ＭｇＣｔ２、１ｒｎＭＣａＣｔ２及び７ダのＤＮＢｇ６
１ （ Ｓｉｇｍａ社裂）を含む。ｐＨ ７． ５
）に懸濁し３７℃で３時間反応させた。その後、２０，
０００ｘＦで１時間遠心分離し、得られた沈澱を０．４
％Ｐデシル硫酸す） ＩＪウム溶液ｉｏｏｍＡ！に懸濁
して室温で１時間放置した。
１００℃で２０分間加温したのち冷却し、２Ｍ酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５．９ ） １ ４ Ｑｍｌ
及びＲＮＡ分解酵素１０■を加え３７℃で３時間反応さ
せた。その後２０，０００）ｌで１時間遠心分離し、得
られた沈澱を５０ｍＭ）’Ｊスス−酸緩衝液（２０ｍＭ
ＭｇＣｔ２、１ｒｎＭＣａＣｔ２及び７ダのＤＮＢｇ６
１ （ Ｓｉｇｍａ社裂）を含む。ｐＨ ７． ５
）に懸濁し３７℃で３時間反応させた。その後、２０，
０００ｘＦで１時間遠心分離し、得られた沈澱を０．４
％Ｐデシル硫酸す） ＩＪウム溶液ｉｏｏｍＡ！に懸濁
して室温で１時間放置した。
その後沈澱を蒸留水で６回洗浄し、凍結乾燥して精製細
胞壁標品とした。
胞壁標品とした。
得られた精製細胞壁標品を０．ＩＮ塩酸中に懸濁し６０
℃で２４時間放置後、２０，０ＯＯＸ．９で１時間遠心
分離し、得られた沈澱を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥
をしてペプチドグリカンを得た。
℃で２４時間放置後、２０，０ＯＯＸ．９で１時間遠心
分離し、得られた沈澱を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥
をしてペプチドグリカンを得た。
参考例３． カードランビーズカラムの調製カードラ
ン（和光紬薬工業（株）Ｍ）粉末９Ｉ！に純水２ ７
０ ｍｌを加え攪拌しスラリーを得た。これにＩ Ｎ
− ＮａＯＨ ３ ０ ｍｌを加えるとカードランは溶
解し、カードランの水酸化ナトリウム水溶液が得られた
。
ン（和光紬薬工業（株）Ｍ）粉末９Ｉ！に純水２ ７
０ ｍｌを加え攪拌しスラリーを得た。これにＩ Ｎ
− ＮａＯＨ ３ ０ ｍｌを加えるとカードランは溶
解し、カードランの水酸化ナトリウム水溶液が得られた
。
８１容のビーカーに、） ルｘ ｙ １．２ ０ ０ｎ
／！１界面活性剤エマレックスＨＣ−８０ ６ ＃
（ 日本エマルシコン製，ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油誘導体）を加え、スクリュー型攪拌翼にて８ ０
Ｏ ｒｐｍの速度で攪拌下に上記カードランの水酸化す
） ＩＪウム水溶液を室温にて滴下した。このようにし
て得られたカードラン分散液をトルエン２，０００ｍＡ
！および酢酸１，ＯＯＯｍＡ’からなる液に８ ０ Ｏ
ｒｐｍの速度で攪拌しながら加え、約１時間攪拌を続
けた。約８時間静置することにより生成したビーズは沈
澱した。
／！１界面活性剤エマレックスＨＣ−８０ ６ ＃
（ 日本エマルシコン製，ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油誘導体）を加え、スクリュー型攪拌翼にて８ ０
Ｏ ｒｐｍの速度で攪拌下に上記カードランの水酸化す
） ＩＪウム水溶液を室温にて滴下した。このようにし
て得られたカードラン分散液をトルエン２，０００ｍＡ
！および酢酸１，ＯＯＯｍＡ’からなる液に８ ０ Ｏ
ｒｐｍの速度で攪拌しながら加え、約１時間攪拌を続
けた。約８時間静置することにより生成したビーズは沈
澱した。
デカンテーシ日ンによって溶媒を除去し、得られた沈澱
を純水８１にて５回洗浄するとーは中性となシ、また有
機溶媒は完全に除去され、カードランビーズ２ ４ ０
ｍｌを得た。
を純水８１にて５回洗浄するとーは中性となシ、また有
機溶媒は完全に除去され、カードランビーズ２ ４ ０
ｍｌを得た。
これを分級し、５０〜１００μｍの粒径のもの（平均粒
径約８０μｒｒＬ）を０．０１Ｍ）リス−リンゴ酸緩衝
液（０，１５ＭＫＣｔ及び１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
径約８０μｒｒＬ）を０．０１Ｍ）リス−リンゴ酸緩衝
液（０，１５ＭＫＣｔ及び１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
ｐｉ（６．５）で平衡化し、カラム（ １．３ Ｘ ２
．３ｍ）に充填してカードランビーズカラムとした。
．３ｍ）に充填してカードランビーズカラムとした。
実施例 １４
（１） Ｐ Ｇ試薬の調製
参考例１で得られた蚕血漿５ ｍｌに０．ＯＩＭトＩＪ
スーリンゴ酸緩衝液（ １ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．
１ ５ Ｍ ＫＣ４含有、ｐＨ ６． ５。以下ＴＭＢ
と略称する。）２０ｒｎｌを加えてよく混合したものを
試料とし、参考例３により得られたカーＰランビーズカ
ラムで処理した。素通りの蛋白分画約２５ｍ１！を、２
２５ ｒｌＬｔの飽和硫酸アンモニウム溶液中へ滴下し
たのち、１晩攪拌した。
スーリンゴ酸緩衝液（ １ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．
１ ５ Ｍ ＫＣ４含有、ｐＨ ６． ５。以下ＴＭＢ
と略称する。）２０ｒｎｌを加えてよく混合したものを
試料とし、参考例３により得られたカーＰランビーズカ
ラムで処理した。素通りの蛋白分画約２５ｍ１！を、２
２５ ｒｌＬｔの飽和硫酸アンモニウム溶液中へ滴下し
たのち、１晩攪拌した。
遠心分離（１６，０ＯＯＸｆ１．２０分間）して沈澱を
集め、沈澱を４ ｒｎｔのＴＭＢに溶解し、ＴＭＢ ５
００ｒｎｌを外液として透析した。これを再び遠心分離
（１６，０００Ｘ、９，２０分間）し、上清をＴＭＢで
全量５ ｍｌとして、ＰＣ試薬とした。
集め、沈澱を４ ｒｎｔのＴＭＢに溶解し、ＴＭＢ ５
００ｒｎｌを外液として透析した。これを再び遠心分離
（１６，０００Ｘ、９，２０分間）し、上清をＴＭＢで
全量５ ｍｌとして、ＰＣ試薬とした。
（２） Ｐ Ｇ試薬及び蚕体液中の不活性酵素のデイモ
サン（β−１，３−グルカン）又はＰＣによる活性化度
の測定 （測定操作法） 参考例１で得られた蚕血漿又は（１）で得られたＰＧ試
薬２００ ｉｔｌに８０ ｍＭ ＣａＣｔ２溶液２０
μｌを添加し、更にｌ ｍｙ／ｍｌのザイモサン溶液あ
るいは１ ｍ９／ｍｌのに溶液（参考例２で得られたも
のを使用して調製した。）’ｉ２０μｌ加えてよく混合
し、２５℃で反応させた。所定の時間に所定骨の反応液
を採取し、ｐｏの活性化度あるいはＢＡＥＥａｓｅの活
性値を測定した。
サン（β−１，３−グルカン）又はＰＣによる活性化度
の測定 （測定操作法） 参考例１で得られた蚕血漿又は（１）で得られたＰＧ試
薬２００ ｉｔｌに８０ ｍＭ ＣａＣｔ２溶液２０
μｌを添加し、更にｌ ｍｙ／ｍｌのザイモサン溶液あ
るいは１ ｍ９／ｍｌのに溶液（参考例２で得られたも
のを使用して調製した。）’ｉ２０μｌ加えてよく混合
し、２５℃で反応させた。所定の時間に所定骨の反応液
を採取し、ｐｏの活性化度あるいはＢＡＥＥａｓｅの活
性値を測定した。
■ＰＯ活性化度の測定
基質溶液（４ｍＭ ４−メチルカテコール及び８ｍＭ４
−ヒドロキシプロリンエチルエステル含有０．１Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ６，０）１ｉＡ！に試料（前記反応液）
１０μｌを加え３０℃で１０分間反応させた後、生成す
るキノン色素の５２０ ｎｍの吸光度を測定してＰＯの
活性化度を求めた。
−ヒドロキシプロリンエチルエステル含有０．１Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ６，０）１ｉＡ！に試料（前記反応液）
１０μｌを加え３０℃で１０分間反応させた後、生成す
るキノン色素の５２０ ｎｍの吸光度を測定してＰＯの
活性化度を求めた。
第１図に各種試料を基質溶液と反応させたときの反応時
間による５ ２０ ｎｍに於ける吸光度の変化を示す。
間による５ ２０ ｎｍに於ける吸光度の変化を示す。
但し、−・−はザイモサンとＰＣ試薬とを、−ム一はＰ
ＧとＰＧ試薬とを、−〇−はデイモサンと蚕血漿とを、
また、−Δ−はＰＧと蚕血漿とを夫々反応させて得られ
た試料を用いたときの吸光度変化を夫々示す。
ＧとＰＧ試薬とを、−〇−はデイモサンと蚕血漿とを、
また、−Δ−はＰＧと蚕血漿とを夫々反応させて得られ
た試料を用いたときの吸光度変化を夫々示す。
■ＢＡＥＥａｓｅ活性の測定
予め２５℃に保温した基質溶液（２ｍＭ Ｎ−α−ベン
ゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル、１ ｍＭ Ｎ
ＡＤ にコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、０．
１■／ｍ７アルコールデヒドロケ０ナーゼ、０．２５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び０．２Ｍ
セミカルバジド含有、ｐＨ８，５、ａｔ２５ｔｌ：）１
ｉＡ！に試料３０μｌを加えてよく混合し、２５℃で反
応させて生ずるＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）の３４０ ｎｍの吸光度の増加を測
定した。
ゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル、１ ｍＭ Ｎ
ＡＤ にコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、０．
１■／ｍ７アルコールデヒドロケ０ナーゼ、０．２５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び０．２Ｍ
セミカルバジド含有、ｐＨ８，５、ａｔ２５ｔｌ：）１
ｉＡ！に試料３０μｌを加えてよく混合し、２５℃で反
応させて生ずるＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）の３４０ ｎｍの吸光度の増加を測
定した。
尚、ＢＡＥＥａ３ｅの１単位（Ｕ）は上記反応条件下で
１分間に１ｎｍｏｌのエタノールを生成する量とした。
１分間に１ｎｍｏｌのエタノールを生成する量とした。
結果を表１に示す。
表 １
これらの結果から明らかなように、蚕血漿中の酵素はデ
イモサン及びＰＧによって活性化されるが、ＰＧ試薬中
の酵素はＰＧによってのみ活性化され、デイモサ／によ
っては活性化されないことがわかる。
イモサン及びＰＧによって活性化されるが、ＰＧ試薬中
の酵素はＰＧによってのみ活性化され、デイモサ／によ
っては活性化されないことがわかる。
実施例 ２．ＰＧによる検量線の作成
（測定操作）
実施例１で得られたＰＣ試薬２ ｒｎｌに８０ｒｒＩＭ
Ｃａｃｔ２溶液２００ ｐｌを添加しよく混合した。こ
の１０μｅに所定濃度のＰＧ溶Ｗｉ、１０μｌを加え３
０℃で６０分間加温後、実施例１で用いたｐｏ活性測定
用基質溶液１ｍ７！を加え、更に３０℃で１０分間反応
させた後、５２０ｎｍの吸光度を測定した（測定値；Ｃ
５）。
Ｃａｃｔ２溶液２００ ｐｌを添加しよく混合した。こ
の１０μｅに所定濃度のＰＧ溶Ｗｉ、１０μｌを加え３
０℃で６０分間加温後、実施例１で用いたｐｏ活性測定
用基質溶液１ｍ７！を加え、更に３０℃で１０分間反応
させた後、５２０ｎｍの吸光度を測定した（測定値；Ｃ
５）。
ＰＧ浴溶液代りに精製水を用いて同様に操作して盲検値
（ＥＢ、）を得た。
（ＥＢ、）を得た。
（結 果）
第２図に、ＰＧ濃度と（Ｅ！ｌ −ＥＢ４１）値の関係
を横軸、縦軸共に対数軸を用いて示した。
を横軸、縦軸共に対数軸を用いて示した。
この結果から明らかな如く、良好な直線性が得られた。
実施例 ３．ＰＧによる検量線の作成
（測定操作）
実施例１で得られたＰＧ試薬２ｍｌに８０ ｍＭ Ｃａ
Ｃ４２００μｌを添加しよく混合した。この７０μｌに
、０．１Ｍリン酸緩衝液（２０艷ＩＬ−ドー・ぐ含有、
ｐＨ５，Ｑ ＞７０μｌ及び所定濃度のＰＧ溶液７０μ
ｌを加えてよく混合し、２５℃で、トキシノメーター（
和光紬薬工業（株）製）を用いて透過光量が１５％減少
するまでの時間（Δｔ）を測定した。
Ｃ４２００μｌを添加しよく混合した。この７０μｌに
、０．１Ｍリン酸緩衝液（２０艷ＩＬ−ドー・ぐ含有、
ｐＨ５，Ｑ ＞７０μｌ及び所定濃度のＰＧ溶液７０μ
ｌを加えてよく混合し、２５℃で、トキシノメーター（
和光紬薬工業（株）製）を用いて透過光量が１５％減少
するまでの時間（Δｔ）を測定した。
（結 果）
第３図に、ΔｔとＰＧ濃度の関係を横軸、縦軸共に対数
軸を用いて示した。
軸を用いて示した。
この結果から明らかな如く、良好な直線性が得られた。
以上述べた如く、本発明はペプチドグリカンに特異的に
反応する成分を含んで成る試薬、及び該試薬を用いた、
ペプチドグリカンの定量方法を提供するものであり、本
発明の定量法を用いることにより、極めて容易に且つ精
度よくペプチドグリカンの定量を行うことができる点に
甚だ顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献すると
ころ大なるものである。
反応する成分を含んで成る試薬、及び該試薬を用いた、
ペプチドグリカンの定量方法を提供するものであり、本
発明の定量法を用いることにより、極めて容易に且つ精
度よくペプチドグリカンの定量を行うことができる点に
甚だ顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献すると
ころ大なるものである。
第１図は実施例１に於て得られた、各種試料と基質溶液
とを反応させたときの、反応時間による５ ２０ ｎｍ
に於ける吸光度の変化を示し、横軸の各時間＠）につい
て得られた５ ２０ ｎｍの吸光度を縦軸に沿ってプロ
ットした点を結んだものである。 但し、−・−は試料としてＰＣ試薬とデイモサンとの反
応液を、−ム−はＰＧ試薬とＰＧとの反応液を、−〇−
は蚕血漿とデイモサンとの反応液を、また、−Δ−は蚕
血漿とＰＧとの反応液を夫々用いた時の結果を示す。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
はＰＣ濃度（ｎ、！Ｆ ／ｎｌ）を、また、縦軸は５２
０ｎｍに於ける吸光度を夫々示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
はＰＧ濃度（ｎ＃ ／ｒｎｌ）を、また、縦軸は透過光
量が１５チ減少するまでの時間＠）を夫々示す。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第 １ 困 ｏ ６０ １２０明 Ｎｇ
（切 ％ ２Ｇ１
とを反応させたときの、反応時間による５ ２０ ｎｍ
に於ける吸光度の変化を示し、横軸の各時間＠）につい
て得られた５ ２０ ｎｍの吸光度を縦軸に沿ってプロ
ットした点を結んだものである。 但し、−・−は試料としてＰＣ試薬とデイモサンとの反
応液を、−ム−はＰＧ試薬とＰＧとの反応液を、−〇−
は蚕血漿とデイモサンとの反応液を、また、−Δ−は蚕
血漿とＰＧとの反応液を夫々用いた時の結果を示す。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
はＰＣ濃度（ｎ、！Ｆ ／ｎｌ）を、また、縦軸は５２
０ｎｍに於ける吸光度を夫々示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
はＰＧ濃度（ｎ＃ ／ｒｎｌ）を、また、縦軸は透過光
量が１５チ減少するまでの時間＠）を夫々示す。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第 １ 困 ｏ ６０ １２０明 Ｎｇ
（切 ％ ２Ｇ１
Claims (3)
- （１）昆虫の体液から得られる、ペプチドグリカンに特
異的に反応する成分を含んで成る試薬。 - （２）昆虫の体液から得られる、ペプチドグリカンに特
異的に反応する成分を含んで成る試薬と検体とを反応さ
せ、生ずる酵素活性を測定することによりペプチドクリ
カンの定量を行うことを特徴とするペプチドグリカンの
定量方法。 - （３）昆虫の体液から得られる、ペプチドグリカンに特
異的に反応する成分を含んで成る試薬と検体とを反応さ
せ、酵素活性の発現時間を測定することによりペプチド
グリカンの定量を行うことを特徴とするペプチドグリカ
ンの定量方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28824586A JPH07114707B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規な測定試薬 |
| ES87117621T ES2068180T3 (es) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reactivos para determinar peptidoglicano y beta-1,3-glucano. |
| AT87117621T ATE119204T1 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagenzien zur bestimmung von peptidoglykan und beta-1,3-glukan. |
| DE3751109T DE3751109T2 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan. |
| DE3752307T DE3752307T2 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten |
| EP87117621A EP0270039B1 (en) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagents for determining peptidoglycan and beta-1,3-glucan |
| EP94111388A EP0634656B1 (en) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Processes for collecting body fluid from insects |
| AT94111388T ATE188777T1 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Verfahren zum sammeln von insekten- körperflussigkeiten |
| US07/127,315 US4970152A (en) | 1986-12-03 | 1987-12-02 | Reagents for determining peptidoglycan and β-1,3-glucan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28824586A JPH07114707B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規な測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63141599A true JPS63141599A (ja) | 1988-06-14 |
| JPH07114707B2 JPH07114707B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=17727712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28824586A Expired - Fee Related JPH07114707B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規な測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114707B2 (ja) |
-
1986
- 1986-12-03 JP JP28824586A patent/JPH07114707B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07114707B2 (ja) | 1995-12-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |