JPS63105683A - 高度不飽和脂肪酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡと略す）
、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略す）などの高
度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと略す）を脂肪酸成分
として含有する天然油脂（例えば、魚油、鯨油、微生物
由来の油脂）からＰＵＦＡを選択的に分離する方法に関
するものである。

〔従来の技術〕

ＥＰＡ、　ＤＨＡには血小板の凝集抑制作用があり、脳
血栓や心筋梗塞等の＠検器系疾患の予防薬としての可能
性がＤｙａｒｂｅｒｇ博士らによる研究によって示唆さ
れている。またＥＰＡには血液中のコレステロールを低
下させる働きがあり、その活性は現在脱コレステロール
剤として用いられているリノール酸の約４倍と言われて
いる。以上のようにＰＬＩＦＡはその薬理作用が注目さ
れている。

従来のＰＵＦＡの分離方法としては、グリセリドをメタ
ノールやエタノール等の低級アルコールのエステルに変
換した後蒸留し、さらに尿素包接処理により濃縮分離を
行う方法（例えば特開昭５８−８０３７号）、逆相クロ
マトグラフィーを用いて濃縮分離を行う方法（例えば特
開昭５８−８８３３９号、特開昭５８−１０９４４４号
）などが提案されている。

一方、魚油をキャンディダ・シリンドラッセから得られ
たリパーゼにより加水分解してＰＵＦＡをグリセリド側
に濃縮し、これを遊離脂肪酸（以下、ＦＦＡと略す）か
ら分離する方法が提案されている（特開昭５８−１６５
７９６号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところでＰＵＦＡはその構造上、光、熱、酸素などに対
し極めて不安定で酸化されやすく、過酸化脂質を生成し
やすい。過酸化脂質は人体に悪影響を及ぼし、下痢、嘔
吐、発熱や、最悪の場合列に至ることもある。従ってＰ
ＵＦＡを処理する際には常温、常圧、中性条件下での反
応が望ましい。

しかるに、従来のエステル交換法による分離方法では、
ＰＵＦＡを低級なアルコールのエステルに変換した後に
分離濃縮が行われているため、エステル化の過程におい
て熱、触媒、アルカリ等によってＰＵＦＡが酸化、変性
などを起こす可能性が非常に高い。

また逆相クロマトグラフィーを用いて濃縮分離する方法
は、大量の充填剤および溶剤を１用する必要があるとと
もに処理効率が悪く、大量の処理に適しない。

さらに、従来のＰＵＦＡを含有する油脂への酵素的加水
分解の応用としてのリパーゼを用いる方法は、ＰＵＦＡ
を含むグリセリドがリパーゼにより加水分解されにくい
性質を利用するもので、炭素数１８以下の通常の脂肪酸
部分をリパーゼにより分解して脂肪酸とし、ＰＵＦＡを
未分解のままグリセリドとしてＦＦＡから分離する方法
であるが、ＰＵＦＡの分離効率が低く、高濃度に分離で
きないという問題点があった。

本発明は上記問題点を解決するためのもので、不安定な
ＰＵＦＡを変性させることなく、効率よく高濃度に分離
することが可能なＰＵＦＡの分離方法を提案することを
目的としている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、高度不飽和脂肪酸を脂肪酸成分として含有す
る天然油脂をリパーゼで分解した後、遠心液々分配クロ
マトグラフィーで分画し、高度不飽和脂肪酸の遊離脂肪
酸およびモノグリセリドを含む両分を分取することを特
徴とする高度不飽和脂肪酸の分離方法である。

本発明ではＰＵＦＡを低級アルコールのエステルに変換
することなく、リパーゼを用いた部分加水分解により各
種グリセリドおよびＦＦＡの混合物として、遠心液々分
配クロマトグラフィーによって分画し、ＰＵＦＡのＦＦ
Ａおよびモノグリセリドを含む両分を分取することによ
りＰＵＦＡを分離する。

本発明においてＰＵＦＡとしては、炭素数１８〜２４、
二重結合の数３〜６の長鎖ＰＵＦＡがあり、その例とし
ては前記ＥＰＡ、　ＤＨＡのほかにγ−リルン酸、アラ
キドン酸などがあげられる。本発明における原料油脂は
これらのＰＵＦＡを脂肪酸成分として含有する天然油脂
であり、魚油、鯨油、月見草種子油、松実油、微生物由
来の油脂などがあげられる。

本発明で用いられるリパーゼはムコール属、クロモバク
テリウム属、シュードモナス属およびアスペルギルス属
に属するリパーゼ生産菌から得られたものが好ましい。

上記のリパーゼ生産菌としては、例えばムコール・ミニ
ハイ、クロモバクテリウム・ビスコスム、シュードモナ
ス・フルオレッセンス、アスペルギルス・ニガーなどが
あげられる。このうち一部のリパーゼ、例えばムコール
・ミニハイから得られたリパーゼにより油脂を完全にＦ
ＦＡにまで分解するのは困難であるが、モノグリセリド
までの分解は可能である。

原料油脂をリパーゼで分解するには、その活性を発現さ
せるために水が必要であり、その量は天然油脂に対し３
０〜７０重景％、好ましくは５０重量％程度が適当であ
る。またリパーゼの使用量は通常天然油脂１ｇあたり１
０〜１００００ユニツト、好ましくは１００〜５００ユ
ニツト程度が適当である。

分解の方法は上記原料油脂、リパーゼおよび水を混合し
、酵素分解に適した温和な温度、圧力で中性条件下に撹
拌し、２４〜７２時間反応させることができる。

この反応において、原料油脂はリパーゼにより加水分解
され、ＰＵＦＡはトリグリセリドからジグリセリド、モ
ノグリセリドを経てＦＦＡに分解するが、ＰＩＪＦＡは
グリセリンのβ位に結合しているため、モノグリセリド
にもＰＩＪＦＡが多量に存在している。一方、遠心液々
分配クロマトグラフィーによれば、ＰＵＦＡのＦＦＡお
よびモノグリセリドをトリグリセリド、ジグリセリド、
ならびに他の脂肪酸のＦＦＡおよびモノグリセリドから
選択的に分離することが可能であるから、リパーゼによ
るＰＵＦＡの分解は完全にＦＦＡにまで進行する必要は
なく、モノグリセリドまで分解されていれば、効率よ＜
　ＰＵＦＡを分離することができる。

こうしてリパーゼにより原料油脂を分解して生成するＰ
ＵＦＡおよび他の脂肪酸のトリ、ジ、モノグリセリドお
よびＦＦＡの混合物を遠心液々分配クロマトグラフィー
により分画を行い、ＰＵＦＡのモノグリセリドおよびＦ
ＦＡを含む画分を分取してＰＵＦＡを分離する。

遠心液々分配クロマトグラフィーは特開昭５９−６２３
１２号に開示されているもので、２層分離液のうち一方
を固定相として遠心力により保持しつつ、他方を移動相
として連続的に固定相内を通過させて、移動相内に注入
された試料を連続的に分画する向流分配クロマトグラフ
ィーである。

本発明では比重および極性が異なり、２相に分離する２
種の溶媒の一方を固定相、他方を移動相とし、遠心加速
度の作用により固定相中を移動相を移動させ、試料中の
各成分を分配係数の差を利用して多段分配平衡によりク
ロマトグラフィー的に分画する。この方法では、試料中
の極性の高い成分が順次極性の高い溶媒に分配され、ま
た極性の低い成分が順次極性の低い溶媒に分配される６
図面は本発明で用いられる遠心液々分配クロマトグラフ
ィーの系統図であり、その原理は以下の通りである。

＝７− 遠心機ローターＲ上に多数の分配管Ｃ（５００〜４００
（１）が遠心加速度ｇの方向と平行に配列され、相互に
直列に導管Ｔで接続されている。導管Ｔの両端は遠心機
回転軸の両端に設置された回転送液ジヨイントＪ７、Ｊ
７に接続されている。回転送液ジヨイントＪ、、Ｊ２は
４方バルブｖ３．６方バルブ（試料インジェクター）ｖ
２、定流量ポンプＰおよび４方ロータリーバルブｖ１を
介して固定相ＳＰ、移動相ＨＰ、洗浄液ｗＳの容器に接
続され、また４方バルブ■１、フローセルモニターＭお
よび３方ロータリーバルブｖ４を介してフラクションコ
レクターＦおよび廃液ＶＴの容器に接続している。ＳＬ
はサンプリングループ、ＲＣはレコーダーである。

この装置を用いた遠心液々分配クロマトグラフィーは次
のような手順で行われる。比重および極性が異なり、２
相に分離する任意の溶媒を混合、静置後、重液相、軽液
相にそれぞれ分離し容器に貯える。いずれか一方の液相
（図面では重液相）を固定相ｓｐとして分配管Ｃに充填
した後、ローターＲを回転させ、一定の遠心加速度ｇを
与えつつ、他方の液相（図面では軽液相）を移動相聞と
して回転軸一端の回転送液ジヨイントＪ１を通して連続
的に送液する。移動相ＭＰは遠心加速度ｇの作用により
固定相中ＳＰ中を微細な液滴となって分配管Ｃを順次通
過し、回転軸他端の回転送液ジヨイントＪ２より連続的
に流出する。遠心機外部に設置されたサンプリングルー
プＳＬより、送液初期の一定量の移動相ＭＰ中に導入さ
れた試料成分は上記過程中に遠心液々分配クロマトグラ
フィーによりそれぞれ目的成分に分離され、その後必要
に応じてフラクションコレクターＦで分画される。

固定相ＳＰとして極性の高い重液例えばアセトニトリル
エタノール／水（９０：　ＩＯＶ／Ｖ）混合溶媒等を使
用し、移動相聞として極性の低い軽液例えばｎ−ヘキサ
ン等を使用する場合、試料中の極性が低いものまたは鎖
長の長いものから順次移動相とともに流出する。一方固
定相の流入側から極性が高いものまたは鎖長の短いもの
が順次残留することになるので、移動相の送液を反転し
て固定相を流入側から押出すと、極性が高いものまたは
鎖長の短いものが順次流出する。

こうして流出する移動相中には主としてトリグリセリド
、ジグリセリド、お゛よび不飽和度の低い脂肪酸のＦＦ
Ａが含まれ、反転により最初に流出する固定相中には鎖
長の短いＦＦＡおよびモノグリセリドが含まれ、続いて
流出する固定相中には鎖長が長く不飽和度の高い、ＦＦ
Ａおよびモノグリセリドが含まれる。従って最後の固定
相画分を分取すると、ＰＵＦＡを高回収率で分離するこ
とができる。

〔発明の効果〕

以上の通り本発明によれば、天然油脂をリパーゼで分解
した後、遠心液々分配クロマトグラフィーでＰＵＦＡの
ＦＦＡおよびモノグリセリドを含む両分を分取するよう
にしたので、不安定なＰＵＦＡを変性させることなく分
離することができ、またＰＬＩＦＡを完全にＦＦＡに分
解させることなく、ＦＦＡおよびモノグリセリドの形で
分離できるため、ＰＵＦＡを効率よく分離することがで
きる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により説明する。各例中％は重量
％を示す。

実施例１ 魚油１０ｇおよび精製水４＋Ｊを５０ｍρ容量のスクリ
ュー管に入れ、ムコール・ミニハイから得た酵素１００
ユニツトを精製水に溶かして加え、５０”Ｃの恒温槽中
で毎分５００回転の速度で回転撹拌して、約４８時間反
応を行った。分解物を第１図の構成を有する遠心液々分
配クロマトグラフｃＰｃモデルＬＬＮ（三鬼エンヂニア
リング■製）を用いて次の条件でクロマトグラフィーに
よる分画を行った。

分配液としてｎ−ヘキサンおよびアセトニトリルを混合
後静置して分離した重液を固定相として８５０ｍｆｌ充
填し、軽液を移動相とした。試料として上記魚油分解物
１０ｇを５０ｍＱとなるように移動相に溶解した溶液を
注入し、その後移動相１５００ｍ１２を注入して分画を
行った。このときの回転数は１０００ｒｐｒｎ、送液速
度は１０ｎ＋＋Ｑ／分、操作温度は２０℃である。

上記により溶出した移動相（軽液）　１５００＋ｎＩｌ
を濃縮して画分１とし、送液方向を反転して最初に溶出
した固定相（重液）　１００ｍ＋Ｑを濃縮して画分２と
し、その後溶出した固定相８０抛Ｑを濃縮して画分３と
した。

画分１、画分２、画分３をそれぞれメタノール／クロロ
ホルム系溶剤で溶剤抽出した後、メタノールでエステル
を合成し、ガスクロマトグラフィーにより下記測定条件
で組成分析を行った。その結果を原料油脂中からのＥＰ
Ａ、　ＤＨＡの回収率として表１に示した。

なお画分１にはトリグリセリド、ジグリセリド、不飽和
度の低い脂肪酸のＦＦＡが主に含まれ、画分２には鎖長
の短いＦＦＡおよびモノグリセリドが主に含まれ、画分
３にはＰＵＦＡのＦＦＡおよびモノグリセリドが主に含
まれていた。また日本油化学協会制定の基準油脂分析試
験法による過酸化物価はほとんど変化がみられなかった
。

ガスクロマトグラフィーの測定条件 カラム：キャビラリークロマトグラム サーモン３０００Ａ　（島津製作所製）、（φ０．２４
ｍｍＸ５０ｍ） 注入口、検出器温度：２５０℃ カラム温度：　Ｈｅ　；　２５ｋＰａ、　Ａｉｒ　；　
３０ｋＰａ、　Ｈ，；　３０ｋＰａ検出器：　ＦＩＤ 実施例２ 実施例１と同様の条件でクロモバクテリウム・ビスコス
ムより得られたリパーゼを用いて反応および分画を行っ
た。その結果を表１に示した。

実施例３ 実施例１の条件でシュードモナス・フルオレッセンスよ
り得られたリパーゼを用いて反応および分画を行った。

その結果を表１に示した。

表１ 以上の結果より、画分３を分取することにより、ＰＵＦ
Ａを高収率で分離できることがわかる。

【図面の簡単な説明】

図面は遠心液々分配クロマトグラフィーの系統図であり
、ＳＰは固定相、ＭＰは移動相、ｔｙｓは洗浄液、■、
は４方ロータリーバルブ、■２は６方バルブ、Ｖ３は４
方バルブ、■４は３方ロータリーバルブ、ＳＬはサンプ
リングループ、Ｐは定流量ポンプ、Ｊ、、Ｊ２は回転送
液ジヨイント、Ｒはローター、Ｃは分配管、Ｔは導管、
Ｍはフローセルモニター、ＲＣはレコーダー、Ｆはフラ
クションコレクターである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）高度不飽和脂肪酸を脂肪酸成分として含有する天
   然油脂をリパーゼで分解した後、遠心液々分配クロマト
   グラフィーで分画し、高度不飽和脂肪酸の遊離脂肪酸お
   よびモノグリセリドを含む画分を分取することを特徴と
   する高度不飽和脂肪酸の分離方法。
2. （２）高度不飽和脂肪酸が炭素数１８〜２４、二重結合
   の数３〜６のものである特許請求の範囲第１項記載の分
   離方法。
3. （３）リパーゼがムコール属、クロモバクテリウム属、
   シュードモナス属、またはアスペルギルス属に属するリ
   パーゼ生産菌により生産されたものである特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の分離方法。
4. （４）遠心液々分配クロマトグラフィーが２相分離液の
   うち一方を固定相として遠心力により保持しつつ、他方
   を移動相として連続的に固定相内を通過させて、移動相
   内に注入された試料を連続的に分画するものである特許
   請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の分離
   方法。