JPS6282973A - β−リポ蛋白質の吸着材および吸着装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■．発明の背景 ［技術分野］ 本発明はβ−リボ蛋白質の新規な吸着材および該吸着材
を利用したβ−リボ蛋白質の吸着装置に関するものであ
る。

β−リボ蛋白質はヒト血漿蛋白質の約５〜７％を占め、
高齢化して血液中のコレステリンが増加するとともに増
え、動脈硬化の原因となることが知られている。また、
遺伝性疾患である家族性高コレステロール血症では正常
値の数倍のβ−リボ蛋白質問を示し、冠状動脈閉塞を起
こし易い。

そこで血液、血漿等の体液からβ−リボ蛋白質を特異的
に吸着除去することによって上記疾患の進行を防止し、
症状を軽減せしめ、さらには治療を早めることが期待さ
れている。本発明の吸着材および吸着装置はこのような
療法に有効に使用されるものである。

［先行技術およびその問題点］ 従来、このような目的に供しうる吸着材としては、ヘパ
リン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアル
ロン酸、アルギン酸などの多糖類（ポリアニオン）を担
体に固定したものが多数報告されている。例えば、無機
多孔体、セルロースまたはポリビニルアルコール−酢酸
ビニル共重合体からなる担体に上記のポリアニオンを固
定した低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）吸着材が特開昭５９
−１５６４３１号公報、同５９−１９３１３５号公報、
同５９−１９６７３８号公報、同５９−１９７２５５号
公報および同５９−２０（３０４５ｊ；公報に開示され
ている。しかしながらこれら従来の吸着材はいずれも吸
着能や吸着選択性が十分Ｃはなく、より優れたβ−リボ
蛋白吸着材の出現が望まれていた。

■８発明の目的 本発明は、上記従来吸着材の問題点に鑑み、β−リボ蛋
白質を高活性にかつより特異的に吸着することができる
吸着材および吸着装置を提供することを目的とする。

さらに本発明は、安定な吸着能を保持し、安全上があり
滅菌操作も簡単に行うことができ、体液浄化あるいは再
生用に適した吸着材および吸着装Ｙを提供することを目
的とする。

本発明の吸着材および吸者装ＵはＦ記の目的を達成する
ために、次の構成からなる。

（１）不溶性担体に負電荷を’４４する置換基を持つ化
合物を固定してなることを特徴とりるβ−リボ蛋白質の
吸着材。

（２）負電荷を有する買換基を持つ化合物がスルホン［
ｉおよび（または）カルボキシル 化合物である第１項記載のβ−リボ蛋白質の吸着材。

（３）負電荷を有する置換基を持つ化合物が芳香族環を
有している第１項または第２項に記載のβ−リボ蛋白質
の吸着材。

（４）負電荷を有する置換基を持つ化合物がスルホンＭ
基およびカルボキシル基を持つベンゼン系芳香族化合物
２である第３項記載のβ−リボ蛋白質の吸着材。

（５）負電荷を有する＠換基を持つ化合物が４−スルホ
サリチル酸である第４項記載のβ−リボ蛋白質の吸着材
。

（６）流体の導出入口を有する容冨内に、不溶性担体に
負電荷を有する置換基を持つ化合物を固定してなるβ−
リボ蛋白質の吸着材が収容されていることを特徴とする
β−リボ蛋白質の吸？′Ｉ装置。

（７）上記容器はｇ製氷が充填され、オートクレーブ滅
菌されている第６項記載のβ−リボ蛋白質の吸Ｆｉ装７
１。

■．発明の詳細な説明 本発明で対象とする被吸着物質は、β−リボ蛋白質であ
り、さらに詳しくは、電気泳動法で血清中脂質を分離し
た場合に観察されるα１，α２およびβ−グロブリン画
分のうら、β−グロブリン画分に含まれる低密度リボ蛋
白質（　Ｌ　Ｄ　Ｌ　）および超低密度リボ蛋白質（Ｖ
ＬＤＬ）である。ＬＤｌ−とＶＬＤＬはコレステロール
とトリグリセリドを多く含有し、動脈硬化の原因となる
。

本発明で吸着剤（リガンド）として使用する負電荷を有
する置換基を有する化合物とは、不溶性担体に固定した
場合、生理的ｐｌ＋領域（中性（例えば、血液、体液）
〕で表面ボテンシｐルが負の値を示す化合物をいう。負
電荷を有する買換基を持つ化合物（以下、負荷電化合物
という）は分子中にスルホン酸基および（または）カル
ボキシル基を有する低分子有機化合物、特に、芳香族環
を有する低分子右は化合物が好ましい。低分子有様化合
物であれば、装置に組立だ後のオー１−クレープ滅菌が
特に容易であり、好ましい。芳香族環を何する低分子有
様化合物としては、ベンゼン、ナフタレン、フェナント
レン等のベンゼン系芳香族環、ジベンゾフラン、フロメ
ン、ベンゾフラン等の含酸素芳香族環、チアナフテン、
チアントレン等の含イオウ芳香族環、フェナントレン、
キノリン、アクリジン等の含窒素６　Ｃ１環、インドー
ル、カルバゾール等の含窒素５員環等があげられる。特
に好ましい化合物は、ベンゼン系芳香族環にスルホン１
１およびカルボキシル基を導入した化合物である。例え
ば安息香酸、トルイル酸、サリチル酸、フタル酸、ベン
ゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンジスル
ホン酸があり、特に好ましくは、スルホンＭ　Ｐ、Ｓと
カルボキシル基の両者を有するスルホンサリチル酸であ
る。

本発明において不溶性担体は、親木性担体、疎水性担体
のいずれも使用できる。

不溶性担体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状
等いずれの公知の形状も用いうるが、血液、血漿の通液
性、吸着剤調’１１時の取扱い簡便性などの点から、粒
子状担体が特に好ましく用いられる。

粒子状担体としては、平均粒径０．０５−から５間の範
囲にあることが好ましい。平均粒径はＪＩＳ−２−８８
０１に規定されるフルイを用いて分級した俊、各級の上
限粒径と下限粒径の中間値を各級の粒径とし、その重量
平均として平均粒径を弾出づ゛る。

また、粒子形状は細胞に損傷を与えにくいことやクダケ
、カケが生じにくい点から球形が好ましいが、特に限定
されるものではない。

使い得る粒子状担体としては、アガロース系、デキスト
ラン系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリビ
ニルアルコール系、ポリビニルピロリドン系、ポリアク
リロニトリル系、スヂレンージビニルベンゼン共重合体
系、ポリスブレン系、アクリル酸エステル系、メタクリ
ル酸エステル系、ガラス系、アルミナ系、チタン系、活
性炭系、セラミックス系などの１０体であるが、特に多
孔性重合体粒子、多孔質ガラス、シリカゲル、多孔質シ
リカーアルミナが良好な結果を与える。重合体組成は、
ポリアミド系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ビニ
ル化合物の重合体等、多孔性構造をとり得る公知の重合
体を用いることができる。また、通常、固定化酵素、ア
フイニティクロマトグラフィーに用いられる公知の担体
は、特別の限定なく使用することができる。

該多孔質の中では機械的強度、化学的不活性、表面積、
操作性などの点から特に球状のシリカゲルが好ましい。

本発明に用いられる多孔体粒子は、その表面に負荷電化
合物を固定化しうるちのであり、平均孔径２００人ない
し１５０００人、よりりＹましくは８００人ないし３０
００人の範囲にあるものである。

該多孔性構造は、平均孔径２００人ないし１５０００人
の範囲にあるのが好ましいが、平均孔径が小さずぎる場
合には、吸着される物質の量は少なく、大きすぎる場合
には、多孔体粒子の強度が低下し、かつ表面積が減少す
るため実用的ではない。

平均孔径の測定は、水銀圧入式ポロシメーターによった
。この方法は多孔体に水銀を圧入してゆき、侵入した水
銀量から気孔迅を、圧入に要する圧力から孔径を求める
方法である。

負荷電化合物を不溶性担体の表面に固定する方法は、共
存結合、イオン結合、物理吸着、包埋あるいは担体表面
への沈殿不溶化等あらゆる公知の方法を用いることがで
きるが、結合物の溶出性よりみて、共有結合により、固
定、不溶化して用いることが好ましい。

負荷電化合物を不溶性担体の表面に共有結合する為には
、両者の官能基に応じて、種々の方法が用いられる。例
えば、臭化シアン活性化法、カルボジイミド試薬／ｉど
を用いる縮合：Ｘ薬法、酸アジド誘導体法、ジアゾ沫、
アルキル化法、ジアルデヒドやヒスエポキシド、ジイソ
シアネートなどを用いる担体架橋法、γ−グリシドキシ
１０ピルトリメトキシシラン（以下ＧＯＰＴＳと略記す
る）やβ−（３，４−１ボキシシクロヘキシル）エヂル
トリメトキシシランなどを用いるシランカップリング剤
活性化法などが使用される。また必要に応じて、不溶性
担体とリガンドどの間に任意の長さの分子（スベーリー
）を導入して使用することもできる。

特に好ましい固定化方法は、水ｆｌｌＪを有する不溶性
担体と容易に共有結合し、さらにアミノ基、水ＭＷ、チ
オール基、カルボキシルＬｔ、などの活性水素を有する
官能基をもった負荷電物質と温和な条件下で安定な共有
結合を形成するシランカップリング剤のＧＯＰＴＳを用
いる方法である。

本発明で好適に用いられる負荷電化合物のスルホン酸基
および（あるいは）カルボキシル基は、β−リボ蛋白質
の正荷電と静電的相互作用を生じ、芳香族環はβ−リボ
蛋白質の疎水性基と疎水性相互作用を生じて引ぎ合う。

また、多孔性担体とカップリング剤に存在する水酸基や
末端水素はβ−リボ蛋白質と水素結合で引き合う。この
ように、β−リボ蛋白質と吸着剤との吸着においては、
主作用として静電的相互作用力、副作用どして疎水性相
互作用力及び水素結合力が働いて、好ましい結果が得ら
れるものと解釈できる。

吸着材の表面荷電量は以下に述べる流動電位測定法、電
位差滴定（ＤＩ滴定）法または色素吸着法によって測定
される。

〔流動電位測定法〕

吸着材を充填した細管中に液体を強制的に通過させると
液体の運動方向に電位差が生じる。

ｔｌｃｌｍｈｏｌｔｚ−３ｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉの式
により電気二重層のずり而における電位、すなわちぜ−
タ電位が弾出でき、表面電位の近似値が得られる。

（電位差滴定法〕 適当なアルカリ溶液を用いて電位差滴定を行なうことに
より、吸着材の界面静電位が求まる。

〔色素吸着法〕

カチオン性色素液に吸着材を浸してリンス後、色素吸着
Ｍを求め１表面荷電量度を算出する（Ｈａｒｏｕｄａｓ
、　Ｎ、Ｇ、、　Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ、、　４
９．４１７（１９７５））。

本発明の吸着材は、体液と接触させで不要物質をバッチ
方式で吸着除去しても」：いが、より好ましくは、以下
に述べる吸着装置に使用するのがよい。

本発明のβ−リボ蛋白質吸着装置は、上述の吸着材を、
体液の導出入口を備えた容器内に充填保持させてなるも
のである。

次に添付図面を参照しつつ本発明の装置について説明す
る。

第１図は本発明装置の一例を示す断面図である。

本装置は両端に入口４および出口５を有する容器１とそ
の内部に収容された吸着材２と入口４および出口５に上
記吸着材２を挾んで設けられたフィルター３．３′から
なる。フィルター３．３′は吸着材の破片等が体液に入
り体内に流れ込むのを防ぐために設けられている。

容器１の材質は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタ
クリレート等が使用できるが、オー１〜クレープ滅菌が
可能なポリプロピレンやポリカーボネート−等が特に好
ましい。また、容器本体の吸着材層と出入口部との間に
、体液は通過するが、吸着材は通過しない網目を持つフ
ィルターを備えているものが好ましい。この材質は生理
学的に不活性で強度の高いｂのであれば良いが、特にポ
リエステル製、ポリアミド製のものが好ましく使用され
る。体液は、体液導入口４より導入され、吸着材２で処
理された後、体液導出口５から導出される。吸着材はフ
ィルター３．３′により容器内に保持されている。

本発明の吸着装置は、使用の便宜のため、蒸留水や生理
食塩水等の精製水で充填され、オートクレーブ滅菌され
て製品とするのが望ましい。

第２図は、本発明の吸着装置を用いて血液浄化治療を行
う場合の１例を示す概略図である。血液は白液導入口６
より尋人され、ポンプ７を通って血漿分離装置８へ供給
され、白球と血漿に分離される。分離された血漿はポン
プ７′を通って、吸着容器１に供給され、吸着処理され
た後に血漿・血球註合装置９で血球と混合されて白液導
出口１０より導出される。

本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大路次の二
通りの方法がある。１つには、体内から取り出した血液
を遠心分離機もしくはＩＩＱ型あるいは中空糸型面漿分
ｔｒｉｌｌ器を使用して、血漿成分と而球成分とに分離
したのち、面漿成分を該装置に通過させ、浄化した後、
血球成分と合わせて体内に戻す方法であり、他の１つは
体内から取り出した血液を直接該装置に通過させ、浄化
する方法である。

体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるい
は設備の設置状況に応じて、連続的に通液してもよいし
、また断続的に通液使用してもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

実施例 水酸化カリウムを用いてｐ１１８に調整した２、６Ｗハ
％ＧＯＰＴＳ水溶液２００ａｅに、平均孔径２３６１人
（粒子径範囲７４〜１４９　μ７１１．表面積２５ｍ２
／’Ｊ、富士デヴイソン化学製）の球状シリカゲル７０
Ｊを混合し、アスピレータ−（東京理化器械製Ａ−２８
型）で脱気した後、ブラッドミキサ−（萱垣医理科工Ｔ
、製Ｂ　Ｍ　−１０１型）を使用して２０分間撹拌した
。次に、数分間静置して液層をデカンテーションし、ｉ
ｇ潤状態のシリカゲルをステンレス製バットに移した後
、　１５０℃Ａ−ブン（Ｉｎ葉材製Ｐ（Ｓ）−２１２型
）で１時間加熱反応させた。こうして（ｑられた活性化
シリカゲル４０（Ｊを、蒸留水と９８１０−０．２Ｍ炭
酸バッファーとの混液（２＋３）に溶解した１　Ｗハ％
ベクヂン、ｌ　　ｗ／ｖ％ゼラチン、あるいは２　Ｗ／
Ｖ％スルホサリチル酸の溶液と混合し、アスピレータ−
で脱気した。そして１　ｖハ％ピリジンと１　■へ％ト
リーｎ−ブチルアミンを触媒として添加した後、８０℃
水溶液で３時間加温し、更にブラッドミ゛１＝リ−を使
用して室温下で一晩撹拌し、反応させた。次に、蒸留水
で洗浄した後、酢酸でｐＨ８に調整した１Ｍエタノール
アミン水溶液１００　ｍを加え、ブラッドミキサーを使
用して室温下で一晩撹拌し、未反応のエポキシ基をブロ
ッキングした。そして、ゼラチンを結合させたシリカゲ
ルは、５Ｍ塩酸グアニジン水溶液１００ｄに浸し、水酸
化カリウムでρＩＩを８に調整しながら無水コハク酸４
．９５　ｇを徐々に加え、ゼラチンのアミノ基をスクシ
ニル化した。このスクシニル化ゼラヂンあるいはペクチ
ン、スルホサリチル酸を結合したシリカゲルは、蒸留水
、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ４−０，０２Ｍ酢
酸バッファー、ｐＨ１０−０，２Ｍ炭酸バッファーで繰
り返し洗浄した後、１０５℃真空乾燥器で３時間乾燥し
た。以上により、負荷電化合物であるスルホサリチル酸
を固定した吸着（４（実施例）および、ペクチンを固定
した吸着材（対照１）、スクシニル化ゼラブンを固定し
た吸着材（対照２）を得た。そして、上記実施例及び対
照１．２ざらに何も固定しない未処狸シリカゲル（対照
３）をガラス製試験管（テルモ製うルボ、１５．５ｍｍ
φｘ　１００ｍｍ＞に１３ずつ秤取して、吸着実験に供
した。

吸着実験は次のように操作した。上記吸着材の入った試
験管に　１３７ｍＭ塩化ナトリウムおよび２．６ｍＭ塩
化カリウムを含むｒｉｌ＋　７．２−８　ＴｌｉＬＭリ
ン酸バッファー（ＰＢＳ）を３ｄ添加し、アスピレータ
−で脱気した後、正常人血清３　ｍ（ｌを加え、ブラッ
ドミキサーを用いて撹拌しながら、３７℃オーブンで９
０分間インキュベートした。そして、容量ｆｉ１．５　
ｔｎＱのチルＥ’にディスポーザブルシリンジを利用し
て作製した。ミニカラムに、この試験管内容物を移し、
流出液を集め、流出液中のβ−リボ蛋白質濃度とＨＤＬ
−コレステロール′ｅ４度を、各々β−リボ蛋白質−テ
ストワコー、ＨＪ　Ｄ　Ｌ−コレステＣ１−ルーテスト
ワコーの臨床検査用キットを用いて測定した。吸石率は
、吸着材を用いないで同様に操作して得た流出液の濃度
で、上記測定値を除すことにより口出した。

結果を表１に示した。表１より、スルホサリチル酸を結
合さけた吸着材が、ＨＤＬ−コレステロールに比べてβ
−リボ蛋白質を選択的かつ高率に吸着除去することは明
らかである。

■２発明の効果 本発明のβ−リボ蛋白質の吸着材は、体液中の右害物質
であるβ−リボ蛋白質を高率かつ選１）（的に吸着除去
でき、体液を浄化、再生する一般的な用法に適用可能で
あり、高脂血症、家族性高コレスプロール血症などの治
療に有効である。

また、本発明のβ−リボ蛋白質の吸着材は、治療用とし
て用いられるにとどまらず、β−リボ蛋白質の分離、精
製用およびこの検査用材料としても有効に利用できる。

さらに、本発明の吸着装置は、体液中の有害物質を容易
に除去できるとともに、滅菌操作も容易かつ確実に行う
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の吸着Ｖ：を冒の一例を示Ｊ断面図で
ある。 第２図は、本発明の吸着装置を用いて血液浄化治療を行
う場合の１例を示す概略図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）不溶性担体に負電荷を有する置換基を持つ化合物
   を固定してなることを特徴とするβ−リボ蛋白質の吸着
   材。
2. （２）負電荷を有する置換基を持つ化合物がスルホン酸
   基および（または）カルボキシル基を持つ化合物である
   特許請求の範囲第１項記載のβ−リボ蛋白質の吸着材。
3. （３）負電荷を有する置換基を持つ化合物が芳香族環を
   有している特許請求の範囲第１項または第２項に記載の
   β−リボ蛋白質の吸着材。
4. （４）負電荷を有する置換基を持つ化合物がスルホン酸
   基およびカルボキシル基を持つベンゼン系芳香族化合物
   である特許請求の範囲第３項記載のβ−リボ蛋白質の吸
   着材。
5. （５）負電荷を有する置換基を持つ化合物が４−スルホ
   サリチル酸である特許請求の範囲第４項記載のβ−リボ
   蛋白質の吸着材。
6. （６）流体の導出入口を有する容器内に、不溶性担体に
   負電荷を有する置換基を持つ化合物を固定してなるβ−
   リボ蛋白質の吸着材が収容されていることを特徴とする
   β−リボ蛋白質の吸着装置。
7. （７）上記容器は精製水が充填され、オートクレーブ滅
   菌されている特許請求の範囲第６項記載のβ−リボ蛋白
   質の吸着装置。