JPS6274292A - 蛋白分解欠損イ−・コリ - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
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- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の分野
本発明はｈｔｐＲ＋遺伝子産生物の制御下でプロテアー
ゼによる分解のためｈｔｐＲ＋宿王によって安定に表現
されない外来ポリペプチドコーディング配列を安定に表
現する方法に関する。 発明の背景 （ｒｐｏ）（またはｈｉｎとしても公知である）ｈｔｐ
Ｒ遺伝子は熱シヨツクプロモーターからの転写を促進す
る３２キロダルトンのシグマ因子（σ３２）をコード付
けする３ＩＨｐＲ＋イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌり細胞を高
温に移すと少数の蛋白質の合成速度は増大する。温度シ
フトに対するこの生理学的応答は熱シヨツク応答として
仰られている。紫外光、アミノ酸飢餓、ナリジクス酸、
クメルマイシンおよびエタノールを包含する他の多くの
刺激はイー・コリにおいて熱シヨツク蛋白質（ｈｓｐ’
ｓ ）の合成を誘発するので、該応答はストレスに対す
る適応についての一般的な細胞メカニズムの一部であり
得る。少くとも１つのプロテアーゼ、 Ｉｏｎはｈｓ
ｐ。 であることが証明されている〔ボッら（Ｇｏｆｆ ｅｔ
ａｌ、入セル（Ｃｅｌｌ）、４１．５８７〜５９５（
１９８５）；ボッら（Ｇｏｌｆ ｅｔ ａｌＪ、プｏシ
ーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８１．６６４７〜６６５
１（１９８４，！ ；およびフィリップスら（Ｐｈ１ｌ
ｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル−オブ ／＜
タテリオロジ−（Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
、１５９（１）、２８３〜２８７（１９８４）３照〕。 イー・コリにおける熱シヨツク応答は高温へのシフト後
、個々の蛋白質の合成速度における変化を分析すること
によってまず明らかにされた。今日までにイー・コリに
よって産生される１７種の蛋白質が熱シヨツク蛋白質と
して特徴つけられてきた。高温へのシフトの直後、蛋白
質に応じて個々ノｈｓｐ″Ｓのイー・コリによる合成速
度は約５〜２０倍に増大する。増大する合成速度は５〜
１０分でピークに達し、次いで高温へのアップシフトの
３０分間後までに減少して低温での合成速度よりも幾分
大きな新しい定常状態の合成速度となる。 研究により、熱シヨツク蛋白質の増大した合成にはそれ
らのｍＲＮＡの合成速度の増大が伴うことが示されでい
る。すなわち、熱シヨツク応答の開始は少くとも一部で
は転写レベルにおいて調節されている。 不イドハルドら（Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ、
）、ジャーナル―オブ・ハクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、入］６８．５９７〜６０３ （］ ９８
３ ）（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔｌ入ヤマモ１ｊら（Ｙａｍ
ａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ、Ｊ、７’ ｒｙ ’ｙ −ｆ
イングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡＣａｄ、Ｓｃ
ｉ、 ）ＵＳＡ。 ７９．８６０〜８６４（１９８２）、ネイドハルドら（
Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ、）、パイｙ！−ケ
ミカル−７ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、）、３００ 、 ８
９４ 〜９ ０ ０ （１９８１） （Ｎｅｉｄｈ
ａｒｄｔ（ＩＪ、おヨヒバックマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ
）、マイクロバイオロジカル・レビューズ（Ｍｉｃｒ
ｃｂｉｏｌ、 ＲｅｖＪ、４７．１８０〜２３０（１９
８３）、はイー・コリ染色体上、約７６分におけるマツ
ピングのｈｔｐＲ遺伝子か熱シヨツク応答の調節に関与
していることを開示している。ヤマモリら（Ｙａｍａｍ
ｏｒｉ ｅｔ ａｌ、）、Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ［、お
よびクーパーら（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ、入モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティツクｘ （Ｍ
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、）、１３９、】６７〜
１７６（１９７５）はこの遺伝子が温度感受性（（リサ
プレッサーｔＲＮＡを含有する株中に担持されているア
ンバー突然変異ｈｔｐＲｌ ６５ （”ｎ１６５）によ
って規定されることを開示している。 この突然変異を含有する細胞は増殖について
ゼによる分解のためｈｔｐＲ＋宿王によって安定に表現
されない外来ポリペプチドコーディング配列を安定に表
現する方法に関する。 発明の背景 （ｒｐｏ）（またはｈｉｎとしても公知である）ｈｔｐ
Ｒ遺伝子は熱シヨツクプロモーターからの転写を促進す
る３２キロダルトンのシグマ因子（σ３２）をコード付
けする３ＩＨｐＲ＋イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌり細胞を高
温に移すと少数の蛋白質の合成速度は増大する。温度シ
フトに対するこの生理学的応答は熱シヨツク応答として
仰られている。紫外光、アミノ酸飢餓、ナリジクス酸、
クメルマイシンおよびエタノールを包含する他の多くの
刺激はイー・コリにおいて熱シヨツク蛋白質（ｈｓｐ’
ｓ ）の合成を誘発するので、該応答はストレスに対す
る適応についての一般的な細胞メカニズムの一部であり
得る。少くとも１つのプロテアーゼ、 Ｉｏｎはｈｓ
ｐ。 であることが証明されている〔ボッら（Ｇｏｆｆ ｅｔ
ａｌ、入セル（Ｃｅｌｌ）、４１．５８７〜５９５（
１９８５）；ボッら（Ｇｏｌｆ ｅｔ ａｌＪ、プｏシ
ーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８１．６６４７〜６６５
１（１９８４，！ ；およびフィリップスら（Ｐｈ１ｌ
ｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ、）、ジャーナル−オブ ／＜
タテリオロジ−（Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
、１５９（１）、２８３〜２８７（１９８４）３照〕。 イー・コリにおける熱シヨツク応答は高温へのシフト後
、個々の蛋白質の合成速度における変化を分析すること
によってまず明らかにされた。今日までにイー・コリに
よって産生される１７種の蛋白質が熱シヨツク蛋白質と
して特徴つけられてきた。高温へのシフトの直後、蛋白
質に応じて個々ノｈｓｐ″Ｓのイー・コリによる合成速
度は約５〜２０倍に増大する。増大する合成速度は５〜
１０分でピークに達し、次いで高温へのアップシフトの
３０分間後までに減少して低温での合成速度よりも幾分
大きな新しい定常状態の合成速度となる。 研究により、熱シヨツク蛋白質の増大した合成にはそれ
らのｍＲＮＡの合成速度の増大が伴うことが示されでい
る。すなわち、熱シヨツク応答の開始は少くとも一部で
は転写レベルにおいて調節されている。 不イドハルドら（Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ、
）、ジャーナル―オブ・ハクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、入］６８．５９７〜６０３ （］ ９８
３ ）（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔｌ入ヤマモ１ｊら（Ｙａｍ
ａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ、Ｊ、７’ ｒｙ ’ｙ −ｆ
イングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 ＡＣａｄ、Ｓｃ
ｉ、 ）ＵＳＡ。 ７９．８６０〜８６４（１９８２）、ネイドハルドら（
Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ、）、パイｙ！−ケ
ミカル−７ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、）、３００ 、 ８
９４ 〜９ ０ ０ （１９８１） （Ｎｅｉｄｈ
ａｒｄｔ（ＩＪ、おヨヒバックマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ
）、マイクロバイオロジカル・レビューズ（Ｍｉｃｒ
ｃｂｉｏｌ、 ＲｅｖＪ、４７．１８０〜２３０（１９
８３）、はイー・コリ染色体上、約７６分におけるマツ
ピングのｈｔｐＲ遺伝子か熱シヨツク応答の調節に関与
していることを開示している。ヤマモリら（Ｙａｍａｍ
ｏｒｉ ｅｔ ａｌ、）、Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ［、お
よびクーパーら（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ、入モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティツクｘ （Ｍ
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、）、１３９、】６７〜
１７６（１９７５）はこの遺伝子が温度感受性（（リサ
プレッサーｔＲＮＡを含有する株中に担持されているア
ンバー突然変異ｈｔｐＲｌ ６５ （”ｎ１６５）によ
って規定されることを開示している。 この突然変異を含有する細胞は増殖について
【Ｓであり
、温度のアップシフトに際しり、ｓｐ’ｓの合成全誘発
しない。その全てが同一のアミノ酸を挿入する種々の効
果を持つ一連のサプレッサーを用いてヤマモリら（Ｙａ
ｍａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ、 ）はｈｔｐＲ１６５突
然変異のサプレッションの効果は応答のピーク時におけ
るｈｓｐ″Ｓの合成速度および許容増殖温度の双方に関
連することを示した。ヤマモリらおよびクーパーら（Ｙ
ａｍａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ 、 ａｎｄ Ｃｏｏｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ 、）は全温度で機能する効果的なサプ
レッサーは熱シヨツク応答も・よび高感増殖を共に回復
することを示した。かくして、ｈｔｐＲ１６５突然変異
の効果的でないサプレッションは熱シヨツク応答を阻害
する。高温で５工細胞の死をもたらす。 イー、コリＲＮＡポ１１メラーゼポロ酵素の７ｏキσ７
０ ロダルト〉のシグマサブユニット（）は転写開始および
細胞増殖の維持を調節することにおいで重要な役割を果
たす。ｒＰＯＤ８ （Ｊ Ｏ（ｒｐｏＤ２８５）を包陰
するｒｐｏＤ、すなわちσ７０ をコード付けするイ
ー・コリ遺伝子におけるいくつかの突然変異は温度感受
性増殖表現型（【Ｓ）に導く。グロスマンら（Ｇｒｏｓ
ｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、） （セル（Ｃｅｌす、３２．
１５１〜１５９ｒ−１９８３）］はイー・コリｒｐｏＤ
遺伝子のｒｐｏＤ８００対立遺伝子によりコードｆすけ
されたＲＮＡポリメラーゼの突然変異体シグマサブユニ
ットは高温で急速に分解されることを開示している。ベ
イカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）［プロシーデ
イングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ％ｌユ、６７７９〜６７８３（１９８４）
）＋ （工、突然変異体シグマ蛋白質は４２℃でｈｔｐＲ狭に
おいて急速に分解されるが（４２℃でＴ］／２＝６分）
、それは４２℃で同遺伝子型ｈｔｐＲ 突然変異体株に
おいてかなり安定である（４２℃でＴ１／２＝６０分り
ことを開示している。ベイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ
ａｌ、）；工、また、ｈｔｐＲ突然変異体株における突
然変異体シグマの分解速度はｈｔｐＲ−株における野性
型シグマの分解速度と区別がつかないことを報告してい
る。さらに、ベイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）
は、また、３０℃における突然変異体シグマ蛋白質の分
解速度は同遺伝子型ｈｔｐｆ”株における（’Ｉ’ｌ／
２−２０分）よりもｈｔｐ Ｒ−突然変異体株における
方が著しくｌｊ＼さい（Ｔ１／２＝６０分）ことを報告
している。 ウェルプライら（′ｗｅｌｐＩｙＣｔａ１．）〔バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ。 Ｃｏｍｍｕｎ、） 、 ｇ ３．２２３〜２２７（−１
９８０）］は、ｅａｃＺＸ９Ｑ突然変異はイー・コリ
ｅａｃ Ｚ遺云子の３端部近くに位置するオーカー・ナ
ンセンス突然変異であることＥ！＋示している。ペイカ
ーら（Ｂａｋｅｒｅｔ ａｅ、）（ｆＮ掲）は、ｌａ
ｃＺＸｇ□によってコード付けされたほとんどの全長β
−ガラクトシダーゼポリペプチドは３０℃および４２℃
の両温度で１１ｔｐＲ＋株において不安定であるが（４
２℃でＴ １／２ ＝ ７分）％３０℃および４２℃の
両温度でｈｔｐＲ−突然変異体株においてかなり安定で
ある（４２℃でＴ １／２ ＝ ６０分〕ことを開示し
ている。 ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅＬ ａｌ、 ）ｊ工、Ｊた
。ｈｔｐＲ−突然変異体株におけるＩａｃＺＸ９０遺伝
子産生物の分解速度はｈｔｐＲ−突然変異体およびｈｔ
ｐＲ＠における野生型１ａｃ Ｚ遺伝子産生物の分解速
度と同一であることを開示している。 グＤ スフ ンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、
） （ジャーナル・オブ＋ハクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ 、） 。 １６１ （３）、９３９〜９４３（１９８５）］は、ｒ
ｐｏＤ８００（ｒｐｏＤ８２５）遺伝子産生物の蛋白分
解における同じ欠損かｈｔｐＲ１０７突然変異、ｈＬｐ
Ｒ１１］突然変異、１１すＲ】１２突然変異またはｈｔ
ｐＲｌ ｌ ３突然変異と、ｒｐｏｒ）ｓｏｏ遺伝子を
共に有するｈｔｐＲ（ｒｐｏＨ−）ＩｎＩＫｌ：っＴ示
ｇれることを開示している。、ｈｔｐＲ１１２突然変異
はｈｉｐ Ｒ（ｒｐｏＨ）遺伝子産生物のカルボキシル
末端からの７個のアミノ酸についてロイシンからトリプ
トファンへの変化をひき起こすミスセンス突然変異によ
って規定される。ｈｔｐＲｌ １２突然変異およびｒｐ
ｏＤ８００遺伝子を持ツ細胞も１ａｃＺＸ９Ｑ遺伝子産
生物の蛋白分解に欠損かあることか伸開している（グロ
スマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌす、前掲〕。 イー・コリにおけるＩｏｎ遺伝子の産生物、Ｌａ、ｈｓ
ｐは異常蛋白質の分解において重要な役割を果している
。異常蛋白質の存在かこの遺伝子の表現を刺激するか否
かを決定するのに、ボッら（Ｇｏｆｆｅｔ ａｌ、 ）
Ｃセル（Ｃｅｌｌ）、４１，５８７〜５９５（１９８
５）］は、Ｊａｎ−１ａｃ Ｚオペロン融合を用いてそ
の転写を調べ、（例えば、アルギニ゛・同族体、カナバ
ニンの一体化、プロマイシンでの不完全な蛋白質の産生
、またはストレプトマイシンでの転写エラーの誘発によ
り〕細胞が多ｌの異常ポリペプチドを合成した後、これ
らの細胞はＪａｎ−１ａｃＺ表現において２または３倍
の増加を示したことを開示している。ボッら（Ｇｏｆｆ
ｅｔ ａｌ、）は、また、単一のクローンした蛋白質
、例えばヒト組織ブラスミノーゲンアクチベーターの合
成はＩｏｎ Ｅ写において同様の増加をひき起したこと
、および異常蛋白質によるこのＩｏｎの誘発は熱シヨツ
ク調節遺伝子ｈｔｐＲを必要とし、ｈｔｐＲ−細胞では
見られなかったことを開示している。ボッら（Ｇｏｆｆ
ｅｔａｌ、）は、また、これらの種々の条件下で他の熱
シヨツク蛋白質も誘発されたことを開示しており、異常
細胞蛋白質の出現は細胞プロテアーゼ（またはプロテア
ーゼ類〕および他の熱シヨツク蛋白質についての多くの
不利な条件下で共通の信号であり得ると結論している。 予期せぬことに、グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅ
ｔａｌ、） （前掲少オよびペイカーら（Ｂａｋｅｒ
ｅｔ ａｌ、）（前掲〕の（ｈｔｐＲ変異体は、ｈｔｐ
Ｒ＋に制御されたプロテアーゼによる分解のためｈｔ
ｐＲ＋宿主において安定に表現されないポリペプチド配
列由来のイー・コリの表現を安定化できるという）矧見
は外来ポリペプチド配列に適用可能であり、すなわちｈ
ｔｐ Ｒ−突然変異体は、ｈｔｐＲ＋に制御されたプ＋ ロチアーゼによる分解のだめｈｔｐＲ宿主において安定
に表現されない非イー・コリ由来の（外来）ポリペプチ
ド配列の表現を安定化できるということを見出した。か
かる外来コーディング配列はイー・コリ以外の原核生物
、真核生物もしくは真核細胞、またはウィルス由来であ
り得る。 発明の要約 本発明は、（ａ）表現制御配列に作動的に連結したポリ
ペプチドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子で宿主
ｈｔｐＲ−突然変異体−細胞を形質転換し、次いで（ｂ
）該コーディング配列が表現されるような条件下で該形
質転換した宿主を適当な培地中で培＋ 養することを特徴とするｈｃｐＲａ伝子の制御下でプロ
テアーゼによる分解のためｈｔｐ−イー・コリ株におい
て安定に表現されない外来ポリペプチドコーディング配
列を安定に表現する方法に関する。 本発明は、また、（ａ）表現制御配列に作動的に連結し
たポリペプチドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子
で宿主ｈｔｐＲ＋細胞を形質転換し、（ｂ）ｈｔｐＲ＋
細胞の表現型をｈｔｐＲ突然変異体細胞暖化させ、次い
で（Ｃ）該コーディング配列が表現されるような条件下
で該ｈｔｐＲ−突然変異体細胞を適当な培地中で培餐す
ることを特徴とするｈｔｐＲ＋遺伝子の制御下でプロテ
アーゼによる分解のだめｈｔｐＲ＋株において安定に表
現されない外来ポリペプチドコーディング配列を安定に
表現する方法に関する。 本発明は、また、かかる方法のいずれかにより形質転換
したｈｔｐ Ｒ−突然変異体宿主に関する。 発明の詳細 な説明は、一般に、ｈｔｐＲ＋遺伝子の制御下で＋ プロテアーゼによる分解のため１ｌｔｐＲ株において安
定に表現されない外来ポリペプチドコーディング配列を
安定に表現する方法に関する。 「ｈｔｐＲ−突然変異体」なる語はｈｔｐ Ｒ遺伝子に
おいて突然変異を有するイー・コリ細胞を意味する。か
かるｈｔｐＲ−突然変異体はニラら（Ｙｕｒａ ｅｔ
ａｌ、）〔プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブーサイエンシズ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ
、 Ａｃａａ。 Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８１，６８０３〜６８０７（１９８
４）］により記載されたｈｔｐＲ−突然変異株の々口き
ｈ ｔ ｐ Ｒ””突然変異のサプレッサーを担持して
いないものであってもよい。かかるｈｔｐＲ−突然変異
体は好ましくは条件突然変異体である。例えば、もしｈ
ｔｐＲ１６５突然変異体として公知のイー・コリ細胞が
ｓｕｐＣｔｓとして公知の温度感受性サプレッサーも担
持しているならば、それはｈｔｐＲ条件突然変異体であ
る。ｓｕｐ Ｃでコード付けしたサプレッサーはｈｔｐ
Ｒ，ｌ ６５突然変異の効果的でないサプレッサーであ
り、 ｈｔｐＲｌ ６５細胞を高温で活性に保つよう
に作動する。ベイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌＪ、
プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ。 ５ｃｉＪＵＳＡ、８１，６７７９〜６７８３（１９８４
）２照。かかるｈｔｐＲ−突然変異体もまた好ましくは
ｈｔｐＲ−突然変異の偽相補が可能な遺伝子を担持する
ものである。例えば、ｈｔｐＲ］１２突然変異体として
公知のｈｔｐＲ−イー・コリ細胞もまたｒｐ。 Ｄ８００遺伝子を担持する。該ｒｐｏＤ８ＱＱ遺舒産生
物はｈｔｐＲ１１２細胞を低温または高温で活性に保つ
ように作動する。同様に、ｈｔｐＲ１０７、ｈｔｐＲｌ
ｌｌまたはｈｔｐＲｌ １３として公知のイー・コリｈ
ｔｐＲ−突然変異体もまた該ｒｐｏｓｏｏ遺伝子を担持
する。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、
）、シャーナル−オブ−／＜ クチ１１オラジー（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、）、１６１（３）、９３９
〜９４３ｔ１９８５）膠照。 「外来ポリペプチドコーディング配列」なる語は池の原
核生物、真核生物またはウィルスを包含するイー・コリ
以外のいずれの源由来のポリペプチドコーディング配列
も意味する。好ましいポリペプチドコーディング配列は
真核生物源、特に捕乳動物由来のもの、および補乳動物
細胞において表現するウィルスコーディング配列である
。好ましいポリペプチドコーディング配列はｈｔｐＲ十
株による分解を受は易い医薬的に重要なポリペプチドに
ついてコードするものである。「表現制御配列」なる語
はプロモーターまたは他の調節領域の如き外来ポリペプ
チドコーディング配列の表現に必要な配列を意味する。 「プロモーター」なる語はＲＮＡポリメラーゼの結合お
よび転写が起こるのｔ可能とする外来ポリペプチドコー
ディング配列より上流のいずれの領域も意味する。「調
節領域」なる語は外来ポリペプチドコーディング配列の
転写または翻訳を調節するいずれの領域も意味する。「
適当な培地」なる語は形質転換した宿主ｈｔｐＲ″″細
胞による外来ポリペプチドコーディング配列の表現を可
能とする培養培地を意味する。 「安定に表現された」なる語は注目する蛋白質が全細胞
蛋白質の０．１％を超えて、あるいはポリペ＋ プチドがｈｔｐＲイー・コリ宿主中で蓄積する量の少く
とも１０倍より大きなはで蓄積することを意味する。か
かる蛋白質の蓄積はローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ ｅｔ ａｌ、 ） （メンラス−エイｆ（モラ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ）、１０
１．１２３〜Ｊ ３８ （１９８３，））の３５５−Ｌ
−メチオニンパルス−チェイス法、ひき続いてのＳＤＳ
−Ｐａｇｅ （ポリアクリルアミドゲル電気泳動〕およ
びオートラジオグラフィー、あるいはＳ ＯＳ −Ｐａ
ｇｅおよびコーマシーブルー染色の如き常法によって測
定できる。蓄積のレベルはゲルの密度計による追跡によ
って測定される。 欠失突然変異以外の遺伝子における突然変異は漏出性、
すなわち遺伝子産生物の低レベルの表現に導くかも知れ
ないことはよく知られている。かくして、当業者ならば
ｈｔｐＲ７欠失突然変異体以外のｈｔｐＲ−突然変異体
はｈｔｐ Ｒ遺伝子産生物によって制御されるＩｏｎお
よび／または他の熱シヨツク遺伝子の低レベル活性化に
導く低レベルのｈｔｐＲ遺伝子産生物をなお産生ずるこ
とを予測するであろう。さらに、当業者ならば、ｈｔｐ
Ｒ遺伝子産生物が全（存在しない場合においてさえもｈ
ｔｐ Ｒ遺伝子産生物によって制御されるＩｏｎおよび
／または他の熱シヨツク遺伝子のプロモーターは該プロ
モーターによって決定される基礎レベルの転写のため熱
シヨツク遺伝子産生物のある低レベル産生になお導くこ
とを予期するであろう。しかしながら、ｈｔｐＲ突然変
異体によって産生きれるかかる低レベルのＪａｎおよび
／または他の熱シヨツク遺伝子蛋白質はｈｔｐＲで制御
されるプロテアーゼによる分解のだめｈｔｐＲ＋宿主に
おいて安定に表現されない外来ポリペプチドコーディン
グ配列の宿主ｈｔｐＲ−細胞における表現の安定化を阻
害しない。 かくして、本発明の方法はかかる遺伝子で形質転換した
ｈｔｐＲ＋イー・コリによって表現される外来遺伝子産
生物の急速な分解をひき起こすプロテアーゼの影響を排
することまたは実質的に排すること、およびｈｔｐＲ＋
で制御されるプロテアーゼによる分解のためｈｔｐＲ＋
宿主によって安定に表現されない組換え体遺伝子産生物
を過剰産生ずることにおいて有用である。 （ａ）ｈｌｐＲ−突然変異を効果的に抑制するかまたは
補足するコーディング配列を含有せず、（ｂ）表現制御
配列に作動的に連結した外来ポリペプチドコーディング
配列を含有し、および（Ｃ）形質転換したｈｔｐＲ−突
然変異体宿主によって染色体外で安定に維持され得るい
ずれのＤＮＡ分子も本発明の方法で使用できる。「ｈｔ
ｐＲ−突然変異を効果的に抑制するかまたは補足する」
なる語はｈｔｐＲ表堀。 すなわちｈｔｐＲ−細胞中で安定化された蛋白質の正常
な熱シヨツク応答および蛋白分解を回復することを意味
する。例えば、宿主ｈｔｐＲ−細胞がｈｔｐＲ１６５突
然変異体である場合、ＤＮＡフラグメントは５ｕｐＦ（
Ｓｕ［ノサプレッサーまたは無傷のｈｔｐ、Ｒ遺伝子を
含有してはならないしペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ
ａｌ、）、プａ シー ｆ （：／グズーオブ・ナショ
ナル・アカデミ−やオフ゛−サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） Ｕ Ｓ Ａ
、旦ユ、６７７９〜６７８３（１９８４）参照〕；また
は宿主り已ｐＲ細胞がｈｔｐＲ１０７、ｈｔｐＲｌ １
１． ）ｌ’Ｐ艮３３２またはｈｔｐＲｌ ］ ３突然
変異体である場合、該ブ広ミドは無傷のｈｔｐＲｉｆｉ
＠子を含有してはならない〔グロスマンら（Ｃｙｒｏｓ
ｓｍａｎ ｅｌ ａｌ、）、ジャーナル・オブψバク
オリオラジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ飄、）、Ｉ ｓ
Ｊ （３）、９３９〜９４３（１９８５）参照〕。好ま
しいＤＮＡ分子は、都合よくはｐＡｓ ｌまたはｐＫＣ
３０の如きイー・コリ発現ベクターとして有用であると
知られているＰｔベクターから由来するものである。ｐ
ＫＣ３０はシマタケら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａ
ｌＪ〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２（５８１９
）、１２８〜１３２（１９８１）〕によって記載されて
いる。 ｐＡＳＩはローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅ
ｔ ａｌ、、） 。 メンツズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏ＋ 、入１０］、１２３〜１３８（１９８３）に
よって記載されている。所望する外来ポリペプチドコー
ディング配列は常法によりその源から入手できおよび単
離できる。外来ポリペプチドコーディング配列は常法に
よりＤＮＡフラグメントに結紮でき、および表現制御配
列に作動的に連結できる。ｈｔｐＲ条件突然変異体宿主
は常法によりＤＮＡ分子で形質転換できる。別法として
、 ｈｔｐＲ”宿主は常法によりＤＮＡ分子で形質転換
し、次いでクーパーら（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ、
） （モＬ／キュラー−７７ド・ジェネラル・シエネｆ
イ”／ ９ ス（Ｍｏｌ 、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｃ
、λ］３９％１６７〜１７６（１９７５）１７）方法
により直接にｈｔｐＲ−突然変異を分離することによる
か、あるいはトベら（Ｔｏｂｅ ｅｔ ａｌ、） ［モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（
Ｍｏ Ｉ 。 Ｇｅｎ、 ＧｅｎｅｔＪ、１９５．１０〜］６（１９８
４，）］によって記載されている方法のような局所的突
然変異誘発による７口き常法によってｈｐｔＲ−条件突
然変異体表現型に変化させることができる。別法として
、ｈｔｐＲ１６５の如き十分に明らかにされているｈｔ
ｐＲ−突然変異はトランスポゾンの助けを借りてまたは
それ無しで接合または導入の９口き常法によって注目す
る細胞系に移動できる〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ入［イク
スペリメンツ・イン・モレキュラーφジエ不ティックス
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＧｅｎｅｔｉｃｓ月、コウルド・スプリングやハーバ
−（Ｃｏｉｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＩＩａｒｂｅｒ ）研
究所（１９７２）ｉシ）Ｌ／ ハビイら（５ｉｌｈａｖ
ｙ ｅｔ ａｌ、）、「イクスヘリメンツ・ウィズ・ジ
ーン・フユージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗ
ｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ） Ｊ、コラ
／Ｌ／ ｌ’ −スプリング、 バーバー （Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｒ ）研究所（１９８４）
＃照〕。最後に、形質転換したｈｔｐＲ７突然変異体宿
主は常法により外来ポリペプチドコーディング配列の表
現を可能とする適当な培地、すなわち栄養ブロス中で培
養する。 培養の条件はコーディング配列が表現される、すなわち
栄養物、温度、ｐＨおよび通気がコーディング配列の転
写および翻訳に都合よい条件に調整されるようにする。 かかる条件下で培養した後、通常の蛋白質分離および回
収法によりポリペプチドは回収できる。 （ｒｐｏＨまたはｈｉｎとしても公知の） ｈｔｐＲ遺
伝子は熱ショックを受けたプロモーターからの転写を促
進し、正常な熱シヨツク応答に必要である３２キロダル
トンのシグマ因子（σ ンをコード付けする〔グ０ ス
フ ンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ 、） 、セ
ル（Ｃｅ １す、３８，３８３〜３９０（１９８４，ｌ
ツ照］。ｈｔｐＲコーディング配列における少くとも１
回の突然変異によりｈｔｐＲ−遺伝子は野生型σ３２に
ついてコードしない。かくして、 ｈｔｐＲ株は正常
な熱シヨツク応答を行うことが不可能である。 かかる株はまたｈｔｐＲ＋宿主において安定に表現され
ない外来ポリペプチドコーディング配列の表現を安定化
できる。表現型的にはｈｔｐＲ−突然変異体でありかつ
ｈｔｐＲ突然変異を効果的に抑制するかまたは補足する
コーディング配列を含有しないいずれの株も本発明の方
法で使用できる。かかるｈｔｐＲ−突然変異体宿主は公
知である。好ましいｈｔｐＲ宿主はｈｔｐＲ１６５突然
変異トｓｕｐＣｔｓサ７’レッサーを共に含むもの〔例
えば、ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ 、）
、前掲参照コおよびｈｔｐＲ１０７、ｈｔｐＲＩ ］
］、ｈｔｐＲ］１２またはｈｔｐＲ１１３突然変異とｒ
ｐｏＤ８００遺伝子を共に含むもの〔グロスマンら（Ｇ
ｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・オブ
０バクテリオラジー（Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉｏｌＪ、１６
］（３）、９３９〜９４３（１９８５）８照〕を包含す
る。 イー・コリＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の７０キロダル
トンのシグマサブユニット（σ 〕は転写開始および細
胞増殖の維持を調節することにおいて重要な役割を果た
す。ｒｐｏ Ｄ、８すなわちｒ ｐ ｏＤｇＱＱ（ｒｐ
ｏＤ２８５）を包含するσ７０をコード付けするイー・
コリ４伝子における数回の突然変異は温度感受性増殖表
現型（（Ｓ）に導く。 グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、） （
セル（Ｃｅ Ｉ Ｉ ）、３２，１５１〜） ５９（］
９８３） 〕によって報告されているクロく、イー・
コＩＩ ｒｐｏＤ Ｊ伝子のｒｐｏＤｇＱＱ対立遺伝子
によってコード付けされたＲＮＡポリメラーゼの突然変
異体シグマサブユニットは高温で急速に分解される。ペ
イカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）［プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ、 ８］、６７７９〜６７８３（１９８４
〕〕 は、突然変異体シグマ量子 白質は４２℃でｈｔｐＲ突然変異株において急速に分解
されるが（４２℃でＴ］／２＝６分）、４２℃でｈｉｐ
Ｒ突然変異株においてはかなり安定である（４２℃でＴ
１／２ ＝ ６０分〕ことを開示している。 ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、ハエまたｈｔ
ｐＲ突然変異株における突然変異体シグマの分解速度は
１ｌｈｔ ｐＲ株における野生型シグマの分解速度と区
別できないことを報告している。さらに、ペイカーら（
Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌＪはまた３０℃での突然変異
体シグマ蛋白質の分解速度はｂｔｐＲ株における（Ｔ
ｌ／２＝ ２０分）よりもｈｔｐＲ突然変異株における
（Ｔｌ／２＝６０分）方が著しく小さいことを報告して
いる。 ウェルプライら（Ｗｅｌｐｌｙ ｅｔ ａｌ、） （ハ
イオケミカルーアンドーバイオフイジカルーリサーチー
コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 Ｒｅｓ。 ＣｏＩｎｒｎｘｎ、） 、 ９３，２２３〜２２７（１
９８０））によって報告されている妬く、１ａｃＺＸ９
Ｑ突然変異はイー、コ１Ｊｌａｃｚ遺伝子の３〜部近く
に位置するオーカー・ナンセンス突然変異である。ペイ
カーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌＪ（前掲〕は、１ａ
ｃＺＸ９０遺伝子によってコード付けされたほとんどの
全長β−ガラクトシダーゼポリペプチドは３０℃および
４２℃の同温度でｈｔｐＲ＋株において不安定であるが
（４２℃でＴｌ／２＝７分）、ｈｔｐＲ−突然変異株に
おいては３０℃および４２℃の同温度でかなり安定であ
る（４２℃でＴｌ／２＝６０分）ごとを開示している。 ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、ハエまたｈｔｐ
Ｒ−突然変異体株における１ａｃＺＸ９０遺伝子産生物
の分解速度はｈｔｐＲ−突然変異体およびｈｔｐＲ＋株
における野生型Ｍａｃ Ｚ遺伝子産生物の分解速度と同
一であることを開示している。 ｈｔｐＲ−突然変異体細胞によって表わされる蛋白分解
欠損はｈｔｐＲ１６５突然変異と５ｕｓＣサプレッサー
を有する株に限定されないことに注目するのは重要であ
る。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔａｌＪ［
ジャーナル・オブ・バクテリオシン−（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ） 、 ］ ６１（３）、９３
９〜９４３（１９８５）〕によって開示されている９口
く、ｒｐｏＤ８００ （ｒｐＯＤ２８５）遺伝子産生物
の蛋白分解における同一の欠１がｈｔｐＲ１０７突然変
異、ｈｔｐＲ１１１突然変異、ｈｔｐＲ１１２突然変異
またはＩｔ ｔ ｐλ１１３突然変異と、ｒｐｏＤ８０
０遺伝子を共に有するｈｔｐＲ（ｒｐｏＨ）細胞によっ
て示される。ｈｔｐＲ１１２突然変異はｈｔｐＲ（ｒｐ
ｏ Ｈ）遺伝子産生物のカルボキシル末端からの７個の
アミノ酸についてロイシンからトリプトファンへの変化
をひき起こすミスセンス突然変異によって明らかにされ
る。ｈｔｐＲ１１２突然変異とｒｐｏ８００遺伝子を有
する細胞はまた１ａｃＺＸ９０遺伝子産生物の蛋白分解
に欠陥があることが判明している（グロスマンら（Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、ハ前掲膠照）。 予期せぬことに、グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅ
ｔａｌ、）（前掲〕およびペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、）（＠褐）の知見（すなわち、ｈｔｐＲ−突
然変異体は＋ ｂｔｐＲで制御されるプロテアーゼによる分解のためｈ
ｔｐＲ＋宿主において安定に表現されないイー・コリ由
来のポリペプチド配列の表現を安定化できること〕は外
来ポリペプチド配列に適用でき、すなわちｈｔｐＲ−突
然変異体はｈｃｐＲ＋で制御される十 プロテアーゼによる分解のだめｈｔｐＲ宿王に宿主て安
定に表現されない非イー・コリ由来の（外来〕ポリペプ
チド配列の表現を安定化できることを見出した。 バタテリオファージλのｃｌｌ蛋白質は転写の陽性調節
蛋白質である。その表現を強力で調節可能なλファージ
プロモーターＰＬの制御下に置く方法でｃｎａ伝子をク
ローンしてプラスミドベクター、ｐＫＣ３０に入れた〔
シマタケら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅｅｔ ａｌＪ、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２（５８１９）、１２８〜
１３２（１９８１）参照〕。かかるベクターを形質転換
してλ溶源菌に入れて加熱誘発によって遺伝子表現を評
価した。ｃ［ｌ蛋白質の全構造遺伝子の異なる領域を網
羅する（■蛋白質の３０以上の点突然変異もまたクロー
ンしてｐＫＣ３０に入れ、形質転換して溶源菌に入れて
加熱誘発によつ十 で遺伝子表現を評価した。用いた溶源菌はｈｔｐＲまた
はｈｃｐＲ−’突然変異体のいずれかであった。驚くべ
きことに、これらの単一アミノ酸の変化のは＋ とんどはＩＩＥＰＲ細菌において高度に不安定なポリペ
プチドに導いた。すなわち、ｃ［突然変異体ボ十 リペプチドは野生型ｃ［蛋白質よりもｈｔｐＲ−細胞に
おいてかなり不安定であった。 ３５、Ｌ−メチオニンパルス−チェイスアッセイ〔ロー
ゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、
）、メソツズ・イン會エンザイモラジ−（Ｍｅｔｈ、
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌＯｇｙ）、 １０１．１２３〜３３
８ （１９８３）十 参照〕によって測定すると、ｂｔｐＲ株において野生型
ｃｆＪ蛋白質の半減期は２０分だったのに対し、ｃ■突
然変異体蛋白質のほとんどの半減期は３〜５′Ｊｆであ
った。ｃｆＪ突然変異体蛋白質の半減期の十 うち数個はｈｔｐＲ株においてさえ１分以下であった。 ＡＲ６７、ＣＡＧ４５５細胞系から細胞室てた溶原菌は
ｈｔｐＲ１６５突然変異とｓｕｐＣｔｓサプレッサーを
相持するものだが、ｈｃｐＲ−突然変異体である用いた
たた゛】つの株であった。ＡＲ６７はこれらの非常に不
安定な突然変異体ｃｌｌ蛋白質を安定化する顕著な効果
を示した。例えば、最も不安定な突然変異体０口蛋白質
、ＣＩＩ ３０８５の半減期はｈｔｐＲ＋細胞系に分け
る０、５分からＡ Ｒ６７（ｈｔｐＲ−突然変閏体ンに
おける少くとも２０分に延長された。事実、ＡＲ６７に
おいてアッセイを行った全ての突然変異体ｃ［蛋白質の
半減期は少くとも野生、Ｑ（口上白質と同一のレベルま
で増加した。同時に、ＡＲ５５、ＡＲ６７に対して同遺
伝子型であるかｈＬｐＲ−突然変異を含有しない（すな
わち、＋ ｈｔｐＲである）溶原菌はいずれの突然変異体０口蛋白
質も安定化できなかった。これらの結果は、（Ａ技６７
の如き）ｈｔｐＲ突然変異体細胞系十 が、その表現かｈｔｐＲ株において安定でない同族の突
然変霞体ｃ［蛋白前を安定化することを示ず。 ｈｔｐＲ十株におけるその表現と比較してＡＲ６７は野
生型ｃｌｌ蛋白質の表現の安定性に対する影響を持たな
いので、 ｈｔｐＲ−突然変異株の蛋白分解欠損はあ
る種の選択性を示す。しかし、野生型ＣＩ′Ｉ蛋＋ 白質はｈｔｐＲ株において容易には安定して表現されな
いが、ｈｔｐＲ＋株においては突然変異体ｃ４Ｊ蛋白質
よりも安定に表現される。かくして、選択性は、野生型
ｃｌｌ蛋白質の正常な分解はｈｔｐＲ遺伝子の制御下に
あるのではなくて代りに熱シヨツク応答に関与しない他
の蛋白分解欠損によって分解される（すなわち、 ｈｔ
ｐＲ遺伝子による調節下にはない）という事実によるも
のであり得る。 酵母Ｇ Ａ Ｌ ４ コーディング配列の全長翻訳およ
び数個の切Ｗ′ｒ翻訳をクローンしてベクター（ｐＡＳ
１ ）に入れ、その結果、ＧＡＬ４ 蛋白質の全長翻
訳ふ゛よび切断翻訳を共にコード付けする数個のクロー
ンを得た。全ての翻訳はｈｔｐＲ”ｉ、 ＡＲ６６，お
よび同遺伝子型ｈ Ｌ ｐＲ突然変異株、八に６８にお
いて表現された。ＡＲ５５宿主は全細胞蛋白質の０．１
％をＧえて蓄積しなかったので蛋白質はＡＲ５５宿主に
よって安定（で表現されなかった。ＡＲ６８形質転換体
のみが加熱誘発に際して蛋白質産生物の蓄積を示した。 かくして、ＡＲ５８に存在するｈｔｐＲ−突然変異はイ
ー・コリにおけるＧＡＬ４ ｉｌｌｌｌ圧子産生物積、
従って安定化に対して不可欠のものであった。 ヒトｃ−ｍｙｃ コーディング領域を全長ｃＤＮＡク
ローンから採取してイー・コリ１において外来遺伝子産
生物を十分に表現するように設計されたベクター、ｐＯ
Ｔ Ｓ に挿入した。３つの異なるｈｔｐＲ＋株、へ
５］５１、ＡＲ５５およびＡＲ５８をヒトｃ−ｍｙｃコ
ーディング領域を含有するｐＯＴｓベクターで形質転換
した。ｈｔｐＲ突然変異株、ＡＲ６８もまたｐＯＴｓ
−ｃ−ｍｙｃベクターで形質転換した。Ａ艮６６はＡＲ
６８のｈｔｐＲ＋同型ｊ伝子である。ｐＯＴｓ＋ −ｃ−ｍｙｃベクターで形質転換したｈｔｐＲ株はｃ−
ｍｙｃ産生物を表現したか、パルス標識したイー・コリ
抽出物の５ＤＳ−ゲル電気泳動によって示された如く、
蛋白質の分解か急速であって蓄積できず、かつゲルのコ
ーマシー染色によっては検出できなかった。かくして、
Ｃ−ｍＹｃ 産生物はｈｔｐＲ”宿主によって安定に
表現されなかった。他方、ｈｔｐＲ条件突然変異体形質
転換体は高レベルでｃ−ｍｙｃ蛋白質を蓄積し、１２０
分までの間４２℃の温度に暴露すると、ゲルのコーマシ
ーブルー染色は誘発産生物が２時間で全ｈｃｐＲ−条件
突然変異体蛋白質含有量の１０％を超えて蓄積したこと
を示した。 かくして、本発明の方法はｈｔｐＲ−１胞によって安定
に表現されないプロト腫瘍遺伝子産生物を表現するのに
用いることができる。かかるプロト腫瘍遺伝子産生物は
（１）細胞中のプロト腫瘍ｉｌ云チ産生物の検出に有用
な単クローン抗体の調製に、また（１１）入渠拮抗物質
および／または作用物質に対する標的として有用である
。 シャツ７ ンら（Ｓｈａｔｚ＋ｍｎ ｃｔ ａｌ、）
［「イクスペリメンタル伊マニプユレイションーオブ
豪ジーンψイクスブレショ：／ （Ｅｘｐｅ ｒ ｉｍ
ｅｎｔ ａ ＩＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｃ
ｎｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ） ＪＤ第２章、アカ
デミツク（Ａｃａｄｅｍｉｃ ）出版社、（１９８３）
〕、およびローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔ
ａｌ、） ［メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ、）、Ｉ ０１．１２３〜
１３８（１９８３）］の方法によってサルのメタロチオ
ネイン遺伝子とマウスのメタロチオネイン遺伝子をｐＡ
ｓｌに挿入した。得られたベクターをローゼンベルグら
（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｔ、 ） （前掲）
の方法により形質＋ 転換してｈｔｐＲ株［ＡＲ６８、Ｎ５１５１、ＡＫ１３
、Ｃ６００（λＣ１８６７）〕およびｈｔｐＲ突然変異
株（ＡＲ６７およびＡＲ６８）に入れた。（メチオニン
の代りにシスティンを用いた以外は前掲のローゼンベル
グら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅＥ ａｌＪの方法により
行った）遺伝子産生物のパルス標識はマウスおよびサル
のメタロチオネイン蛋白質がｈｔｐＲ＋ｔｐＲ＋おいて
良好に表現されたことを示したが、パルス・チェイス法
のデータはかかる蛋白質がｈｔｐＲ＋宿上中で宿営中不
安定であって２分またはそれ以下の半減期を有したこと
を明らかとした。これらの遺伝子産生物の蓄積はＡＲ６
７またはＡＲ６８（ｈｔｐＲ−条件突然変異株）におい
てそれらの合成を行うことによっては促進されなかった
。事実、ｈｔｐＲ株において表現されたマウスおよびサ
ルのメタロチオネイン遺伝子産生物の半減期はｈｔｐＲ
”株におけると同程度に短かいものであった。これらの
結果はマウスおよびサルのメタロチオネイン遺伝子産生
物の分解の原因であるプロテアーゼ（類〕がｈｔｐＲ遺
伝子の制御下にないことを示す。 実施例 以下の実施例において、本発明の好ましい具体例をさら
に詳しく開示する。これらの実施例は本発明の例示であ
って本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでは
ない。 実施ガニないし３の方法のさらに詳細な例はベイカーら
（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）、ｌｏシーティンクズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｃｌ、Ａｃａｄ、 ５ｃｉＪ Ｕ
Ｓ Ａ。 旦ユ、６７７９〜６７８３（１９８４，ｌにおいて見い
出すことができる。 実施例４の方法のさらに詳細な例はワットら（１Ａｈａ
ｔｔ ｅｔ ａｌ 、） 、モレキュラー・アンドΦセ
リュラー・ハイオラジ−（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＆
Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、）、５（３）、４４８〜４５６
（１９８５）において見い出すことができる。 実施例で言及されている全ての細菌株の遺伝子型と源を
以下の表Ａに示す。 表Ａ ｒｐｓＬ、ｍａｔ（ａｍ） Ｋ１６！Ｊ″Ｌ）ＳＣ１２２ｈｔｐＲ１６５ＣＡＧ４５
Ｊｂ） ５Ｃ１２２ｈｔｐａ１５５ＣＡＧ５１Ｃｆｃ
）ＳＣ１２２ｒｐｏＤ８００−Ｔｎ１０ＣＡＧ４８１（
ｃ）ＣＡＧ４５６ ｒｐＯＤ８００−ＴｎｌＯＣＡＧ
４８２ ＣＡＧ４８１φ８０ ＣＡＧ４８３ ＣＡＧ４８］φ８０５ｕｌｌｌ（Ｓｕｐ
Ｆ、）ＣＡＧ６０３（ｄ）ＳＣ１２２ｐｒｏＡ／Ｂ：：
Ｔｎ１ｇ／Ｆ’ｐｒｏＡＢ”、 １ａｃＺＸ９ＱＣＡＧ
（６０４（ｄ）ＣＡＧ４５６ ｐｒｏＡ／Ｂ： ：Ｔｎ
ｌＯ／Ｆ’ｐｒｏＡＢ”、 １ａｃＺＸ９ＱＣＡＧ５１
０７ ＣＡＧ６０４ ｐＦＮ９２ＡＲ６！５（ｅ）ＳＣ
１２２（λｃＩ８６７ ｋｉ巳」Ｉ）ｇａｌＥ： ：Ｔ
ｎｌＯＡＲ５メｅ） ＣＡＧ４５６（λｃ ■３６
７ ｋ ｉ １−Ｊｉｌ ） ｇａ ｌ Ｅ： ：Ｔｎ
ｌ ０ＡＲ６６（ｇ）Ｓ Ｃ１２２（λＣＩ８６７８ａ
ｍ５８−７１Δ［ｌすｇａｌＥ： ：Ｔｎｌ ０ＡＲ６
７ｇ）ＣａＣ２５６（λＣＩ８６７Ｂａｍ５Ｃｌ３６７
Ｂａ ）ｇａｌＥ： ：ＴｒＢ、□Ａ）Ｋ６８ Ｎ
９９（＋）（λＣｌ８６７ ｋｉｌ−」Ｉ）ｇａｌＥ：
：ＴｎｌＱＡＲＩ ３ Ｃ６０（Ｊｊ）（λｃ■３
６７ｋｉｌ−、９（１）ｇａｌＥ：：ＴｎｌＱＮ５１５
１ ５Ａ５０（ｆｋ）ｈ ｉｓ 、 ｉ ｌ ｖ△８
（λｃＩ８６７△Ｂａｍ ５８−７１△Ｈ１） ｇａｌ
ｋ アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍｏｌ。 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、入３３９％１６７〜１７６（３
９７５）中に記載されている。 （ｂ） ｔｎａ ＩＴ”Ｋ連結したｈｔｐＲ１６５突然
変異を形質導入してｍａｌ’ｒ−である５Ｃ１２２誘導
体中に入れることによってＣＡＧ４５６を調製した。 （ｃ）ＴｎｌＯは９０多までｒ ｐｏＤに連結している
〔グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、）、
セル（ＣｅＨ入３２％ １５１〜１５９Ｃ１９８３）９
照コ。 （ｄ）Ｆｌ！株Ｃ３Ｈ２１由来のものである〔ミラーら
（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、）％「イクスペＩノメ
ンツーインーモレキュラー・ジエ不テイツクス（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ Ｍｏ１ｅ、ｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ） Ｊ、：） ＋’７ ／レド嶋スプリン
グ、 バー バー （Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｍｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ ）研究所８照〕１゜ （ｅ）全て「イクスペリメンツ・ウィズ・ジーン・フユ
ージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇ
ｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ） Ｊ、’／ルハビイら（５ｉｌ
ｈａｖｙ ｅｔ ａｌ、）編、コウルド、スプリン
グ、ハーバ−（ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
） 研究所（］ ９８４ ）ノ方法ＶＣよってテト
ラサイクリン耐性について選択し、次いでλ溶原性につ
いてテストするＡＲＪ４（ｆ）からの欠陥および温度感
受性プロファージ（λＣ１ｆ３６７ｋｉｌ−△Ｈ１）の
ｌ）ｌ ｇａｌＥ：：ＴｎｌＯ共形性導入による由来の
ものである。 （ｆ）Ａｆ１４はＣ６００由来のものであって、ｇａｌ
Ｅ；： ＴｎｌＯＫよって両側を占められるλＣｌ８
６７ｋＮ−ΔＦ１１欠陥プロファージを含有する。 （ｇ）全て「イクスペリメンツ・ウィズ−ジーン・ヒュ
ージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ ） Ｊ、’／ルハビイら（Ｓ
ｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａＪ、）編、コウルド・スプリン
グ・ハーバ−（ＣｅＩｄＳｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ ）研究所（１９８４）の方法ｅζよってテトラサイ
クｌン耐性について選択し、次いでλ溶原性についでテ
ストするＡＲ１８（ｈ）からの欠陥および温度感受性プ
ロファージ（λｃ（８６７△ＢＡｔｎ△ＨＩ ）ノＰ
ｅｇａｌＥ： ：Ｔｎｌ ０共形質導入による由来のも
のである。特にｃｆｌ遺伝子を除去するさらなるプロフ
ァージ欠失（ΔＢａｍ５８−７１）の点でＡＲ５５およ
びＡＲ６８はＡＲ５５およびＡＲ６７と異なる。 （ｈ） Ａ艮１８はＮ５１５１由来のものであってλＣ
Ｅ８６７△Ｂａｍ△■ＩＩプｏ７７−ジに隣接するｇａ
ｌＥ＝：Ｔｎｌｏを担持する。 （ｉ）Ｎｃ＋９はレーデ／ｌ／ ヘ／Ｌ／グ（Ｌｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ ）、「マイクロバイオロジカル・ジエ不テ
イツクスーＩＯス・う／ムポジウム・オブ・ザ・ソサイ
エテイ・フォー・ジェネラルΦマイクロバイオラジ−（
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ −１０ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆ ’Ｔｈ
ｅ ５ｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍ
ｉｓｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）上ハイニスおよびクロウニス
（Ｈａｙｅｓ ａｎｄ Ｃ１ｏｖｅり編、ケンブリ
ッジ大学出版部、］１５〜１３１（１９６０）に記載さ
れている。 （ｊ）Ｃｓｏｏはアブレヤードら（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ
ｅｔ ａｌ、入ビ（１０ジー（Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ
）、２．５６５（１９５６）にｌ己ｍされている、 （ｋ） Ｓ Ａ ５ Ｕ Ｏはナカニシら（Ｎａｋａｎ
ｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ、）、−ｔｐル（Ｃｅ１ｌ八３
．３９〜４６ （１９７４）Ｋ４ｄｆ＆されている。 実施例１ ｈｔｐＲ−条件突然変異株は突然変異体イー・フリ蛋白
質の蛋白分解に欠陥かある。 Ａ、（ｒｐｏＤ８００シグマ対立遺伝子によってコード
付けされた〕突然変異体シグマの分解イー・コリＲＮＡ
ポリメラーゼホロ酵素の７０キロダルトンのシグマサブ
ユニット（σ７０）は転写開始と細胞増殖の維持におい
て重要な役割と果している。ｒｐｏＤ８υ０（ｒｐｏＤ
２８５）を包含するｒｐｏ Ｄ、すなわちσ７０ を
コード付はするイー・コリ遺伝子における数回の突然変
異は温度感受性増殖表現型（Ｔｓ）に導く。 ３０℃に訃ける指数増殖の間に株ｃＡＧｓ １０ （＋ ｈｔｐＲ、／ｒｐｏＤ ８００／ ｓｕｐＣｔｓ）とＣ
ＡＧ４８１（ｈｔｐＲ１６５／ｒｐｏＤ８００／％ｕＰ
Ｃ”）を３８−。 イシンと３０− リジンで１０分間ラベルした。過！Ｔ
ｉ１ｌ（＞２００１１ｇ／肩ｌ）の非放射性ロイシンお
よびリジンの添加後、培養物を４２℃にシフトし、定期
的にサンプリングを行った。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓ
ｍａｎ ｅＬ ａｔ、 ） Ｃセル（Ｃｅ口）、３２
．１５１〜１５９（１９８３）］ によって記載されて
いる如く、２Ｄゲル上のｒｐｏＤ８００でコード付けし
ｔシグマの含有量について試料を分析し７た。初期時間
（ｔｌｏ）をチェイスの添加の２分後にとったがシグマ
において２０００〜４０００ ｄｐｍの範囲内であった
。４２℃にて突、然変異体シグマ４２ｈｔｐＲ＋株にお
いて急速に分解されたが（Ｔｌ／２＝６分）、ｈｔｐＲ
１６５条件突然変異株においてはかなり安定であった（
Ｔｌ／２＞６０分〕。かくして、突然変異体シグマはｈ
ＬｐＲ−突然変異株において少くとも】０倍は安定化さ
れた。突然変異体シグマの分解速度はｈｔｐＲ突然変異
株における野生型シグマの分解速度と区別がつがなかっ
た。 ｒｐｏＤ８ＱＱ でコード付けしたシグマは野生型ｍ胞
においては低温でも分解されるので（グロスマンら（Ｇ
ｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、 ）、前掲参照）、３
０℃において同遺伝子型ｈｔｐＲ＋およびｈｔｐＲ−突
然変異体細胞におけるシグマ分解速度を比較した。突然
２異体シグマポリペプチドは３０℃でｈｔｐＲ”株にお
ける（ Ｔ ］／２ ＝ ２０分）よりもｈｔｐＲ−突
然変異株における（Ｔｌ／２＝６０分〕方がゆっくりと
分解された。 Ｂ、突然変異体β−ガラクトシダーゼの分解（×９０） Ｍ９グリセロール培地中で３０℃において指数的に増殖
する株ＣＡＧ６０３（ｈｔｐＲ”／ Ｆ’１ａｃＺＸ９
Ｑ／ｓｕｐＣｔｓ）およびＣＡＧ６０４ （ｈｔｐＲ］
６５／ Ｆ ｌａｃ ＺＸ９Ｑ／ｓｕｐ Ｃ）をイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｌｌ’Ｔ
Ｇ、）で誘発し、誘発の１０分後に４２℃にシフトした
。 ４２℃へのシフトの２０分後、 Ｓ−メチオニンで細
胞ｆ！−１，５分間ラベルし、過剰（＜２００μｇ／ｍ
ｌ）の非放射性メチオニンで旧跡し、定期的にサンプリ
ングを行った。試料を免疫沈降し、β−ガラクトシダー
ゼの含有量について分析した。初期時間（（＝Ｏ）をチ
ェイスの添加後２分にとり、β−ガラクトシダーゼにつ
いて５０００ ｄｐｍを表わす。 ４２℃ではＩａｃＺＸ９０ポリペブチドハｈｔｐＲ＋株
における（Ｔｌ／２＝７分〕よりもＣＡＧ６０４、ｈｔ
ｐＲ突然変異株における方がかなりゆっくり（Ｔ ］／
’２ ＞６０分〕分解された。かくしてＩａｃＺＸ９０
ポリペプチドはｈｃｐＲ突然変異株においては少くと
も８．５倍安定化された。野生型１ａｃＺ遺伝子産生物
の分解速度はｈ Ｌ Ｊ）艮−突然変異株におけるＩａ
ｃＺＸ９Ｑポリペプチドの分解速度と区別できなかった
。 Ｃ，ｈｔｐＲ１６５突然変異でのもの以外のｈｔｐＲ−
突然変異体株によるｒｐｏＤ８００遺伝子産生物および
１ａｃＺＸ９（Ｊ遺伝子産生物の分解ｈｔｌ爪−爪体突
然変異体細胞って示される蛋白分解欠１はｈｔｐＲ１６
５突然変異とｓｕｐＣｔｓ遺伝子をイ１する株に限定さ
れないことに注目するのは重要テアル。グロスマンら（
Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｉ 、 ） ｌ：ジャーナ
ル・Ａブ・バクテリオシン−（ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ 、）、１６１（３）、９３９〜９４３（１９８５Ｊ
］によって開示されている如く、ｒｐｏ Ｄ８００ （
ｒｐＯＤ２８５ ）遺伝子産生物の蛋白分解における同
一の欠１はｈｔｐＲ１０７％ｈｔｐＲ］１１、ｈｃｐＲ
１１２またはｈｔｐＲ１１３突然変異およびｒｐｏＤ８
００遺伝子を共に有するｈｔｐＲ”−（ｒｐｏＨ−）細
胞によって示される。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ
ｅｔ ａｌ、）は１ ｒ、： ｒｐａ Ｄ ８００遺
云子を担持するｈｔｐＲ］ ｌ ２ 突然変異体によ
って示されるＩａｃＺＸ９Ｑ遺伝子産生物の蛋白分解に
おいて同一の欠Ｊｌを観察した。ｈｔｐＲ１１２突然変
異は１１ｔ ｐＲ（ｒｐｏＨ）遺伝子産生物のカルボキ
シル末端からの７個のアミノ酸についてロイシンからト
リプトファンへの変化をひき起こすミスセンス突然変異
によって明らかにされる。 実施例２ ｈｔｐＲ座に対するｈｔｐ Ｒ条件突然変異株マツプの
分解欠１ マーカー救済実験によりｈｔｐＲ−突然変異株による蛋
白分解における欠１をマツピングした。不イド７、ルド
ら（Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ、 ）［’）ヤ−
−Ｊ−／ｌ／ −オブ・バクテリオシン−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌＪ 、１６８．５９７〜６０３（１９８３
）（Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ■） ］ Ｋヨってｔ己４
戊されているｐＦＮ ９２プラスミドはｈｔｐＲ構造遺
伝子のへ木端の約１２０ ｂｑ 上流から出定してその
３゛端部に近接するｈすＲ遺伝子内で終る細菌ＤＮＡの
セグメントを担持する〔ネイドハルトら（Ｎｅ１ｄｈａ
ｒｄｔ ｅｔ ａｔ 、 ） 、 ７ ン伊すビューー
ジエｆｉ、ティックス（Ａｎｎ、Ｒｅｖｉｅｗ、 Ｇｅ
ｎｅｔｉｃす、Ｊ８．２９５〜３２９（１９８４）；お
よびランデイックら（Ｌａｎｄｉｃｋ ｅｔ ａｌＪ、
セ／Ｉ／ （Ｃｅ１ｌ ）、３８゜１７５〜１８２（１
９８４）＃照〕。Ｉ）ＦＮ９２プラスミドはｈｃｐＲの
欠陥を補足しない。しかしなから、ｉ’Ｍｒｆｉ耐性で
あって正常な熱シヨツク応答を行うｈｔｐＲ＋ 組換え
体はＰＦＮ９２プラスミドによって形質転換された細胞
から回収できる［ＮｅｉｄｈａｒｄｔＩｇ照］。Ｎｅ１
ｄｈａｒｄｔ Ｉの方法によりｈｔｐＲ１６５条件突然
変異株をｐＦＮ９２で形質転換し、その温＋ 度耐性表現型に基づいてｈｔｐＲＭ！換体を選択した。 熱シヨツク応答を行いかつＩａｃＺＸ９０ポリペプチド
を分解するこれらの株（ｈｔｐＲｌ ６５条件突然変異
体、ｐＦＮ９２、非組換体；ｈｔｐＲ＋、ｐＦＮ９２、
組換体）の能力を比較した。非組換体株は熱シヨツク応
答およびＩａｃＺＸ９Ｑ ポリペプチドの分解に欠陥が
あるので、もとのｈＬｐＲ−突然変異株の特徴を保持し
ていた。対照的に、組換体法は共に十 ｈｔｐＲ株の特徴である熱シヨツク応答を行う能力およ
び１ａｃＺＸ９０ポリペブ千ドを分解する能力を十 同時に保持していた。ｈｔｐＲ組換体株はまたｒｐ。 Ｄ８００ でコード付けした突然変異体シグマを分解す
る能力を回復することも確定された。これらの実験によ
り、ｈｔｐＲ遺伝子における傷害に対する突然変異体原
核生物の遺伝子産生物の蛋白分解におけるｈｔ ｐＲ−
条件突然変異株の欠１を明確にマツピングできる。正常
な熱シヨツク応答および１ａｃＺＸ９ＱとｒｐｏＤ８ｏ
ｏ テ：ｌ −）’付ケシタ突然変異体シグマポリペプ
チドの分解は共にｈｔｐＲ＋対立遺伝子を必要とする。 実施例３ ＋ ｈｔｐＲ対立遺伝子についての株組換体（ｈｔｐＲ）お
よび非組換体（ｈｔｐＲ−）における熱シヨツク蛋白質
合成および蛋白質分解 実施例３に記載する実験は株ＣＡＧ５１０７（ｈｔｐＲ
突然変異体／ Ｆ’ｌａｃ ＺＸ９０ ｐＦＮ ９２
） オヨび株ＣＡＧ５１ ］ ０ （ｈｐｔＲ＋／／Ｆ
’１ａｃ）１，９０ ｐＦＮ９２ ）ＩＩＣ＋ ついて行った。ｈｐｔＲ株（ＣＡＧ５１］０）は４２＋
＋ ℃で
、温度のアップシフトに際しり、ｓｐ’ｓの合成全誘発
しない。その全てが同一のアミノ酸を挿入する種々の効
果を持つ一連のサプレッサーを用いてヤマモリら（Ｙａ
ｍａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ、 ）はｈｔｐＲ１６５突
然変異のサプレッションの効果は応答のピーク時におけ
るｈｓｐ″Ｓの合成速度および許容増殖温度の双方に関
連することを示した。ヤマモリらおよびクーパーら（Ｙ
ａｍａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ 、 ａｎｄ Ｃｏｏｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ 、）は全温度で機能する効果的なサプ
レッサーは熱シヨツク応答も・よび高感増殖を共に回復
することを示した。かくして、ｈｔｐＲ１６５突然変異
の効果的でないサプレッションは熱シヨツク応答を阻害
する。高温で５工細胞の死をもたらす。 イー、コリＲＮＡポ１１メラーゼポロ酵素の７ｏキσ７
０ ロダルト〉のシグマサブユニット（）は転写開始および
細胞増殖の維持を調節することにおいで重要な役割を果
たす。ｒＰＯＤ８ （Ｊ Ｏ（ｒｐｏＤ２８５）を包陰
するｒｐｏＤ、すなわちσ７０ をコード付けするイ
ー・コリ遺伝子におけるいくつかの突然変異は温度感受
性増殖表現型（【Ｓ）に導く。グロスマンら（Ｇｒｏｓ
ｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、） （セル（Ｃｅｌす、３２．
１５１〜１５９ｒ−１９８３）］はイー・コリｒｐｏＤ
遺伝子のｒｐｏＤ８００対立遺伝子によりコードｆすけ
されたＲＮＡポリメラーゼの突然変異体シグマサブユニ
ットは高温で急速に分解されることを開示している。ベ
イカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）［プロシーデ
イングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ％ｌユ、６７７９〜６７８３（１９８４）
）＋ （工、突然変異体シグマ蛋白質は４２℃でｈｔｐＲ狭に
おいて急速に分解されるが（４２℃でＴ］／２＝６分）
、それは４２℃で同遺伝子型ｈｔｐＲ 突然変異体株に
おいてかなり安定である（４２℃でＴ１／２＝６０分り
ことを開示している。ベイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ
ａｌ、）；工、また、ｈｔｐＲ突然変異体株における突
然変異体シグマの分解速度はｈｔｐＲ−株における野性
型シグマの分解速度と区別がつかないことを報告してい
る。さらに、ベイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）
は、また、３０℃における突然変異体シグマ蛋白質の分
解速度は同遺伝子型ｈｔｐｆ”株における（’Ｉ’ｌ／
２−２０分）よりもｈｔｐ Ｒ−突然変異体株における
方が著しくｌｊ＼さい（Ｔ１／２＝６０分）ことを報告
している。 ウェルプライら（′ｗｅｌｐＩｙＣｔａ１．）〔バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ。 Ｃｏｍｍｕｎ、） 、 ｇ ３．２２３〜２２７（−１
９８０）］は、ｅａｃＺＸ９Ｑ突然変異はイー・コリ
ｅａｃ Ｚ遺云子の３端部近くに位置するオーカー・ナ
ンセンス突然変異であることＥ！＋示している。ペイカ
ーら（Ｂａｋｅｒｅｔ ａｅ、）（ｆＮ掲）は、ｌａ
ｃＺＸｇ□によってコード付けされたほとんどの全長β
−ガラクトシダーゼポリペプチドは３０℃および４２℃
の両温度で１１ｔｐＲ＋株において不安定であるが（４
２℃でＴ １／２ ＝ ７分）％３０℃および４２℃の
両温度でｈｔｐＲ−突然変異体株においてかなり安定で
ある（４２℃でＴ １／２ ＝ ６０分〕ことを開示し
ている。 ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅＬ ａｌ、 ）ｊ工、Ｊた
。ｈｔｐＲ−突然変異体株におけるＩａｃＺＸ９０遺伝
子産生物の分解速度はｈｔｐＲ−突然変異体およびｈｔ
ｐＲ＠における野生型１ａｃ Ｚ遺伝子産生物の分解速
度と同一であることを開示している。 グＤ スフ ンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、
） （ジャーナル・オブ＋ハクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ 、） 。 １６１ （３）、９３９〜９４３（１９８５）］は、ｒ
ｐｏＤ８００（ｒｐｏＤ８２５）遺伝子産生物の蛋白分
解における同じ欠損かｈｔｐＲ１０７突然変異、ｈＬｐ
Ｒ１１］突然変異、１１すＲ】１２突然変異またはｈｔ
ｐＲｌ ｌ ３突然変異と、ｒｐｏｒ）ｓｏｏ遺伝子を
共に有するｈｔｐＲ（ｒｐｏＨ−）ＩｎＩＫｌ：っＴ示
ｇれることを開示している。、ｈｔｐＲ１１２突然変異
はｈｉｐ Ｒ（ｒｐｏＨ）遺伝子産生物のカルボキシル
末端からの７個のアミノ酸についてロイシンからトリプ
トファンへの変化をひき起こすミスセンス突然変異によ
って規定される。ｈｔｐＲｌ １２突然変異およびｒｐ
ｏＤ８００遺伝子を持ツ細胞も１ａｃＺＸ９Ｑ遺伝子産
生物の蛋白分解に欠損かあることか伸開している（グロ
スマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌす、前掲〕。 イー・コリにおけるＩｏｎ遺伝子の産生物、Ｌａ、ｈｓ
ｐは異常蛋白質の分解において重要な役割を果している
。異常蛋白質の存在かこの遺伝子の表現を刺激するか否
かを決定するのに、ボッら（Ｇｏｆｆｅｔ ａｌ、 ）
Ｃセル（Ｃｅｌｌ）、４１，５８７〜５９５（１９８
５）］は、Ｊａｎ−１ａｃ Ｚオペロン融合を用いてそ
の転写を調べ、（例えば、アルギニ゛・同族体、カナバ
ニンの一体化、プロマイシンでの不完全な蛋白質の産生
、またはストレプトマイシンでの転写エラーの誘発によ
り〕細胞が多ｌの異常ポリペプチドを合成した後、これ
らの細胞はＪａｎ−１ａｃＺ表現において２または３倍
の増加を示したことを開示している。ボッら（Ｇｏｆｆ
ｅｔ ａｌ、）は、また、単一のクローンした蛋白質
、例えばヒト組織ブラスミノーゲンアクチベーターの合
成はＩｏｎ Ｅ写において同様の増加をひき起したこと
、および異常蛋白質によるこのＩｏｎの誘発は熱シヨツ
ク調節遺伝子ｈｔｐＲを必要とし、ｈｔｐＲ−細胞では
見られなかったことを開示している。ボッら（Ｇｏｆｆ
ｅｔａｌ、）は、また、これらの種々の条件下で他の熱
シヨツク蛋白質も誘発されたことを開示しており、異常
細胞蛋白質の出現は細胞プロテアーゼ（またはプロテア
ーゼ類〕および他の熱シヨツク蛋白質についての多くの
不利な条件下で共通の信号であり得ると結論している。 予期せぬことに、グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅ
ｔａｌ、） （前掲少オよびペイカーら（Ｂａｋｅｒ
ｅｔ ａｌ、）（前掲〕の（ｈｔｐＲ変異体は、ｈｔｐ
Ｒ＋に制御されたプロテアーゼによる分解のためｈｔ
ｐＲ＋宿主において安定に表現されないポリペプチド配
列由来のイー・コリの表現を安定化できるという）矧見
は外来ポリペプチド配列に適用可能であり、すなわちｈ
ｔｐ Ｒ−突然変異体は、ｈｔｐＲ＋に制御されたプ＋ ロチアーゼによる分解のだめｈｔｐＲ宿主において安定
に表現されない非イー・コリ由来の（外来）ポリペプチ
ド配列の表現を安定化できるということを見出した。か
かる外来コーディング配列はイー・コリ以外の原核生物
、真核生物もしくは真核細胞、またはウィルス由来であ
り得る。 発明の要約 本発明は、（ａ）表現制御配列に作動的に連結したポリ
ペプチドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子で宿主
ｈｔｐＲ−突然変異体−細胞を形質転換し、次いで（ｂ
）該コーディング配列が表現されるような条件下で該形
質転換した宿主を適当な培地中で培＋ 養することを特徴とするｈｃｐＲａ伝子の制御下でプロ
テアーゼによる分解のためｈｔｐ−イー・コリ株におい
て安定に表現されない外来ポリペプチドコーディング配
列を安定に表現する方法に関する。 本発明は、また、（ａ）表現制御配列に作動的に連結し
たポリペプチドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子
で宿主ｈｔｐＲ＋細胞を形質転換し、（ｂ）ｈｔｐＲ＋
細胞の表現型をｈｔｐＲ突然変異体細胞暖化させ、次い
で（Ｃ）該コーディング配列が表現されるような条件下
で該ｈｔｐＲ−突然変異体細胞を適当な培地中で培餐す
ることを特徴とするｈｔｐＲ＋遺伝子の制御下でプロテ
アーゼによる分解のだめｈｔｐＲ＋株において安定に表
現されない外来ポリペプチドコーディング配列を安定に
表現する方法に関する。 本発明は、また、かかる方法のいずれかにより形質転換
したｈｔｐ Ｒ−突然変異体宿主に関する。 発明の詳細 な説明は、一般に、ｈｔｐＲ＋遺伝子の制御下で＋ プロテアーゼによる分解のため１ｌｔｐＲ株において安
定に表現されない外来ポリペプチドコーディング配列を
安定に表現する方法に関する。 「ｈｔｐＲ−突然変異体」なる語はｈｔｐ Ｒ遺伝子に
おいて突然変異を有するイー・コリ細胞を意味する。か
かるｈｔｐＲ−突然変異体はニラら（Ｙｕｒａ ｅｔ
ａｌ、）〔プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブーサイエンシズ（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ
、 Ａｃａａ。 Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８１，６８０３〜６８０７（１９８
４）］により記載されたｈｔｐＲ−突然変異株の々口き
ｈ ｔ ｐ Ｒ””突然変異のサプレッサーを担持して
いないものであってもよい。かかるｈｔｐＲ−突然変異
体は好ましくは条件突然変異体である。例えば、もしｈ
ｔｐＲ１６５突然変異体として公知のイー・コリ細胞が
ｓｕｐＣｔｓとして公知の温度感受性サプレッサーも担
持しているならば、それはｈｔｐＲ条件突然変異体であ
る。ｓｕｐ Ｃでコード付けしたサプレッサーはｈｔｐ
Ｒ，ｌ ６５突然変異の効果的でないサプレッサーであ
り、 ｈｔｐＲｌ ６５細胞を高温で活性に保つよう
に作動する。ベイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌＪ、
プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ。 ５ｃｉＪＵＳＡ、８１，６７７９〜６７８３（１９８４
）２照。かかるｈｔｐＲ−突然変異体もまた好ましくは
ｈｔｐＲ−突然変異の偽相補が可能な遺伝子を担持する
ものである。例えば、ｈｔｐＲ］１２突然変異体として
公知のｈｔｐＲ−イー・コリ細胞もまたｒｐ。 Ｄ８００遺伝子を担持する。該ｒｐｏＤ８ＱＱ遺舒産生
物はｈｔｐＲ１１２細胞を低温または高温で活性に保つ
ように作動する。同様に、ｈｔｐＲ１０７、ｈｔｐＲｌ
ｌｌまたはｈｔｐＲｌ １３として公知のイー・コリｈ
ｔｐＲ−突然変異体もまた該ｒｐｏｓｏｏ遺伝子を担持
する。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、
）、シャーナル−オブ−／＜ クチ１１オラジー（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、）、１６１（３）、９３９
〜９４３ｔ１９８５）膠照。 「外来ポリペプチドコーディング配列」なる語は池の原
核生物、真核生物またはウィルスを包含するイー・コリ
以外のいずれの源由来のポリペプチドコーディング配列
も意味する。好ましいポリペプチドコーディング配列は
真核生物源、特に捕乳動物由来のもの、および補乳動物
細胞において表現するウィルスコーディング配列である
。好ましいポリペプチドコーディング配列はｈｔｐＲ十
株による分解を受は易い医薬的に重要なポリペプチドに
ついてコードするものである。「表現制御配列」なる語
はプロモーターまたは他の調節領域の如き外来ポリペプ
チドコーディング配列の表現に必要な配列を意味する。 「プロモーター」なる語はＲＮＡポリメラーゼの結合お
よび転写が起こるのｔ可能とする外来ポリペプチドコー
ディング配列より上流のいずれの領域も意味する。「調
節領域」なる語は外来ポリペプチドコーディング配列の
転写または翻訳を調節するいずれの領域も意味する。「
適当な培地」なる語は形質転換した宿主ｈｔｐＲ″″細
胞による外来ポリペプチドコーディング配列の表現を可
能とする培養培地を意味する。 「安定に表現された」なる語は注目する蛋白質が全細胞
蛋白質の０．１％を超えて、あるいはポリペ＋ プチドがｈｔｐＲイー・コリ宿主中で蓄積する量の少く
とも１０倍より大きなはで蓄積することを意味する。か
かる蛋白質の蓄積はローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ ｅｔ ａｌ、 ） （メンラス−エイｆ（モラ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ）、１０
１．１２３〜Ｊ ３８ （１９８３，））の３５５−Ｌ
−メチオニンパルス−チェイス法、ひき続いてのＳＤＳ
−Ｐａｇｅ （ポリアクリルアミドゲル電気泳動〕およ
びオートラジオグラフィー、あるいはＳ ＯＳ −Ｐａ
ｇｅおよびコーマシーブルー染色の如き常法によって測
定できる。蓄積のレベルはゲルの密度計による追跡によ
って測定される。 欠失突然変異以外の遺伝子における突然変異は漏出性、
すなわち遺伝子産生物の低レベルの表現に導くかも知れ
ないことはよく知られている。かくして、当業者ならば
ｈｔｐＲ７欠失突然変異体以外のｈｔｐＲ−突然変異体
はｈｔｐ Ｒ遺伝子産生物によって制御されるＩｏｎお
よび／または他の熱シヨツク遺伝子の低レベル活性化に
導く低レベルのｈｔｐＲ遺伝子産生物をなお産生ずるこ
とを予測するであろう。さらに、当業者ならば、ｈｔｐ
Ｒ遺伝子産生物が全（存在しない場合においてさえもｈ
ｔｐ Ｒ遺伝子産生物によって制御されるＩｏｎおよび
／または他の熱シヨツク遺伝子のプロモーターは該プロ
モーターによって決定される基礎レベルの転写のため熱
シヨツク遺伝子産生物のある低レベル産生になお導くこ
とを予期するであろう。しかしながら、ｈｔｐＲ突然変
異体によって産生きれるかかる低レベルのＪａｎおよび
／または他の熱シヨツク遺伝子蛋白質はｈｔｐＲで制御
されるプロテアーゼによる分解のだめｈｔｐＲ＋宿主に
おいて安定に表現されない外来ポリペプチドコーディン
グ配列の宿主ｈｔｐＲ−細胞における表現の安定化を阻
害しない。 かくして、本発明の方法はかかる遺伝子で形質転換した
ｈｔｐＲ＋イー・コリによって表現される外来遺伝子産
生物の急速な分解をひき起こすプロテアーゼの影響を排
することまたは実質的に排すること、およびｈｔｐＲ＋
で制御されるプロテアーゼによる分解のためｈｔｐＲ＋
宿主によって安定に表現されない組換え体遺伝子産生物
を過剰産生ずることにおいて有用である。 （ａ）ｈｌｐＲ−突然変異を効果的に抑制するかまたは
補足するコーディング配列を含有せず、（ｂ）表現制御
配列に作動的に連結した外来ポリペプチドコーディング
配列を含有し、および（Ｃ）形質転換したｈｔｐＲ−突
然変異体宿主によって染色体外で安定に維持され得るい
ずれのＤＮＡ分子も本発明の方法で使用できる。「ｈｔ
ｐＲ−突然変異を効果的に抑制するかまたは補足する」
なる語はｈｔｐＲ表堀。 すなわちｈｔｐＲ−細胞中で安定化された蛋白質の正常
な熱シヨツク応答および蛋白分解を回復することを意味
する。例えば、宿主ｈｔｐＲ−細胞がｈｔｐＲ１６５突
然変異体である場合、ＤＮＡフラグメントは５ｕｐＦ（
Ｓｕ［ノサプレッサーまたは無傷のｈｔｐ、Ｒ遺伝子を
含有してはならないしペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ
ａｌ、）、プａ シー ｆ （：／グズーオブ・ナショ
ナル・アカデミ−やオフ゛−サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） Ｕ Ｓ Ａ
、旦ユ、６７７９〜６７８３（１９８４）参照〕；また
は宿主り已ｐＲ細胞がｈｔｐＲ１０７、ｈｔｐＲｌ １
１． ）ｌ’Ｐ艮３３２またはｈｔｐＲｌ ］ ３突然
変異体である場合、該ブ広ミドは無傷のｈｔｐＲｉｆｉ
＠子を含有してはならない〔グロスマンら（Ｃｙｒｏｓ
ｓｍａｎ ｅｌ ａｌ、）、ジャーナル・オブψバク
オリオラジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ飄、）、Ｉ ｓ
Ｊ （３）、９３９〜９４３（１９８５）参照〕。好ま
しいＤＮＡ分子は、都合よくはｐＡｓ ｌまたはｐＫＣ
３０の如きイー・コリ発現ベクターとして有用であると
知られているＰｔベクターから由来するものである。ｐ
ＫＣ３０はシマタケら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａ
ｌＪ〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２（５８１９
）、１２８〜１３２（１９８１）〕によって記載されて
いる。 ｐＡＳＩはローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅ
ｔ ａｌ、、） 。 メンツズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏ＋ 、入１０］、１２３〜１３８（１９８３）に
よって記載されている。所望する外来ポリペプチドコー
ディング配列は常法によりその源から入手できおよび単
離できる。外来ポリペプチドコーディング配列は常法に
よりＤＮＡフラグメントに結紮でき、および表現制御配
列に作動的に連結できる。ｈｔｐＲ条件突然変異体宿主
は常法によりＤＮＡ分子で形質転換できる。別法として
、 ｈｔｐＲ”宿主は常法によりＤＮＡ分子で形質転換
し、次いでクーパーら（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ、
） （モＬ／キュラー−７７ド・ジェネラル・シエネｆ
イ”／ ９ ス（Ｍｏｌ 、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｃ
、λ］３９％１６７〜１７６（１９７５）１７）方法
により直接にｈｔｐＲ−突然変異を分離することによる
か、あるいはトベら（Ｔｏｂｅ ｅｔ ａｌ、） ［モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（
Ｍｏ Ｉ 。 Ｇｅｎ、 ＧｅｎｅｔＪ、１９５．１０〜］６（１９８
４，）］によって記載されている方法のような局所的突
然変異誘発による７口き常法によってｈｐｔＲ−条件突
然変異体表現型に変化させることができる。別法として
、ｈｔｐＲ１６５の如き十分に明らかにされているｈｔ
ｐＲ−突然変異はトランスポゾンの助けを借りてまたは
それ無しで接合または導入の９口き常法によって注目す
る細胞系に移動できる〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ入［イク
スペリメンツ・イン・モレキュラーφジエ不ティックス
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＧｅｎｅｔｉｃｓ月、コウルド・スプリングやハーバ
−（Ｃｏｉｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＩＩａｒｂｅｒ ）研
究所（１９７２）ｉシ）Ｌ／ ハビイら（５ｉｌｈａｖ
ｙ ｅｔ ａｌ、）、「イクスヘリメンツ・ウィズ・ジ
ーン・フユージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗ
ｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ） Ｊ、コラ
／Ｌ／ ｌ’ −スプリング、 バーバー （Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｒ ）研究所（１９８４）
＃照〕。最後に、形質転換したｈｔｐＲ７突然変異体宿
主は常法により外来ポリペプチドコーディング配列の表
現を可能とする適当な培地、すなわち栄養ブロス中で培
養する。 培養の条件はコーディング配列が表現される、すなわち
栄養物、温度、ｐＨおよび通気がコーディング配列の転
写および翻訳に都合よい条件に調整されるようにする。 かかる条件下で培養した後、通常の蛋白質分離および回
収法によりポリペプチドは回収できる。 （ｒｐｏＨまたはｈｉｎとしても公知の） ｈｔｐＲ遺
伝子は熱ショックを受けたプロモーターからの転写を促
進し、正常な熱シヨツク応答に必要である３２キロダル
トンのシグマ因子（σ ンをコード付けする〔グ０ ス
フ ンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ 、） 、セ
ル（Ｃｅ １す、３８，３８３〜３９０（１９８４，ｌ
ツ照］。ｈｔｐＲコーディング配列における少くとも１
回の突然変異によりｈｔｐＲ−遺伝子は野生型σ３２に
ついてコードしない。かくして、 ｈｔｐＲ株は正常
な熱シヨツク応答を行うことが不可能である。 かかる株はまたｈｔｐＲ＋宿主において安定に表現され
ない外来ポリペプチドコーディング配列の表現を安定化
できる。表現型的にはｈｔｐＲ−突然変異体でありかつ
ｈｔｐＲ突然変異を効果的に抑制するかまたは補足する
コーディング配列を含有しないいずれの株も本発明の方
法で使用できる。かかるｈｔｐＲ−突然変異体宿主は公
知である。好ましいｈｔｐＲ宿主はｈｔｐＲ１６５突然
変異トｓｕｐＣｔｓサ７’レッサーを共に含むもの〔例
えば、ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ 、）
、前掲参照コおよびｈｔｐＲ１０７、ｈｔｐＲＩ ］
］、ｈｔｐＲ］１２またはｈｔｐＲ１１３突然変異とｒ
ｐｏＤ８００遺伝子を共に含むもの〔グロスマンら（Ｇ
ｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、 ）、ジャーナル・オブ
０バクテリオラジー（Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉｏｌＪ、１６
］（３）、９３９〜９４３（１９８５）８照〕を包含す
る。 イー・コリＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の７０キロダル
トンのシグマサブユニット（σ 〕は転写開始および細
胞増殖の維持を調節することにおいて重要な役割を果た
す。ｒｐｏ Ｄ、８すなわちｒ ｐ ｏＤｇＱＱ（ｒｐ
ｏＤ２８５）を包含するσ７０をコード付けするイー・
コリ４伝子における数回の突然変異は温度感受性増殖表
現型（（Ｓ）に導く。 グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、） （
セル（Ｃｅ Ｉ Ｉ ）、３２，１５１〜） ５９（］
９８３） 〕によって報告されているクロく、イー・
コＩＩ ｒｐｏＤ Ｊ伝子のｒｐｏＤｇＱＱ対立遺伝子
によってコード付けされたＲＮＡポリメラーゼの突然変
異体シグマサブユニットは高温で急速に分解される。ペ
イカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）［プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、）ＵＳＡ、 ８］、６７７９〜６７８３（１９８４
〕〕 は、突然変異体シグマ量子 白質は４２℃でｈｔｐＲ突然変異株において急速に分解
されるが（４２℃でＴ］／２＝６分）、４２℃でｈｉｐ
Ｒ突然変異株においてはかなり安定である（４２℃でＴ
１／２ ＝ ６０分〕ことを開示している。 ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、ハエまたｈｔ
ｐＲ突然変異株における突然変異体シグマの分解速度は
１ｌｈｔ ｐＲ株における野生型シグマの分解速度と区
別できないことを報告している。さらに、ペイカーら（
Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌＪはまた３０℃での突然変異
体シグマ蛋白質の分解速度はｂｔｐＲ株における（Ｔ
ｌ／２＝ ２０分）よりもｈｔｐＲ突然変異株における
（Ｔｌ／２＝６０分）方が著しく小さいことを報告して
いる。 ウェルプライら（Ｗｅｌｐｌｙ ｅｔ ａｌ、） （ハ
イオケミカルーアンドーバイオフイジカルーリサーチー
コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 Ｒｅｓ。 ＣｏＩｎｒｎｘｎ、） 、 ９３，２２３〜２２７（１
９８０））によって報告されている妬く、１ａｃＺＸ９
Ｑ突然変異はイー、コ１Ｊｌａｃｚ遺伝子の３〜部近く
に位置するオーカー・ナンセンス突然変異である。ペイ
カーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌＪ（前掲〕は、１ａ
ｃＺＸ９０遺伝子によってコード付けされたほとんどの
全長β−ガラクトシダーゼポリペプチドは３０℃および
４２℃の同温度でｈｔｐＲ＋株において不安定であるが
（４２℃でＴｌ／２＝７分）、ｈｔｐＲ−突然変異株に
おいては３０℃および４２℃の同温度でかなり安定であ
る（４２℃でＴｌ／２＝６０分）ごとを開示している。 ペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、ハエまたｈｔｐ
Ｒ−突然変異体株における１ａｃＺＸ９０遺伝子産生物
の分解速度はｈｔｐＲ−突然変異体およびｈｔｐＲ＋株
における野生型Ｍａｃ Ｚ遺伝子産生物の分解速度と同
一であることを開示している。 ｈｔｐＲ−突然変異体細胞によって表わされる蛋白分解
欠損はｈｔｐＲ１６５突然変異と５ｕｓＣサプレッサー
を有する株に限定されないことに注目するのは重要であ
る。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔａｌＪ［
ジャーナル・オブ・バクテリオシン−（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ） 、 ］ ６１（３）、９３
９〜９４３（１９８５）〕によって開示されている９口
く、ｒｐｏＤ８００ （ｒｐＯＤ２８５）遺伝子産生物
の蛋白分解における同一の欠１がｈｔｐＲ１０７突然変
異、ｈｔｐＲ１１１突然変異、ｈｔｐＲ１１２突然変異
またはＩｔ ｔ ｐλ１１３突然変異と、ｒｐｏＤ８０
０遺伝子を共に有するｈｔｐＲ（ｒｐｏＨ）細胞によっ
て示される。ｈｔｐＲ１１２突然変異はｈｔｐＲ（ｒｐ
ｏ Ｈ）遺伝子産生物のカルボキシル末端からの７個の
アミノ酸についてロイシンからトリプトファンへの変化
をひき起こすミスセンス突然変異によって明らかにされ
る。ｈｔｐＲ１１２突然変異とｒｐｏ８００遺伝子を有
する細胞はまた１ａｃＺＸ９０遺伝子産生物の蛋白分解
に欠陥があることが判明している（グロスマンら（Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、ハ前掲膠照）。 予期せぬことに、グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅ
ｔａｌ、）（前掲〕およびペイカーら（Ｂａｋｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、）（＠褐）の知見（すなわち、ｈｔｐＲ−突
然変異体は＋ ｂｔｐＲで制御されるプロテアーゼによる分解のためｈ
ｔｐＲ＋宿主において安定に表現されないイー・コリ由
来のポリペプチド配列の表現を安定化できること〕は外
来ポリペプチド配列に適用でき、すなわちｈｔｐＲ−突
然変異体はｈｃｐＲ＋で制御される十 プロテアーゼによる分解のだめｈｔｐＲ宿王に宿主て安
定に表現されない非イー・コリ由来の（外来〕ポリペプ
チド配列の表現を安定化できることを見出した。 バタテリオファージλのｃｌｌ蛋白質は転写の陽性調節
蛋白質である。その表現を強力で調節可能なλファージ
プロモーターＰＬの制御下に置く方法でｃｎａ伝子をク
ローンしてプラスミドベクター、ｐＫＣ３０に入れた〔
シマタケら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅｅｔ ａｌＪ、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９２（５８１９）、１２８〜
１３２（１９８１）参照〕。かかるベクターを形質転換
してλ溶源菌に入れて加熱誘発によって遺伝子表現を評
価した。ｃ［ｌ蛋白質の全構造遺伝子の異なる領域を網
羅する（■蛋白質の３０以上の点突然変異もまたクロー
ンしてｐＫＣ３０に入れ、形質転換して溶源菌に入れて
加熱誘発によつ十 で遺伝子表現を評価した。用いた溶源菌はｈｔｐＲまた
はｈｃｐＲ−’突然変異体のいずれかであった。驚くべ
きことに、これらの単一アミノ酸の変化のは＋ とんどはＩＩＥＰＲ細菌において高度に不安定なポリペ
プチドに導いた。すなわち、ｃ［突然変異体ボ十 リペプチドは野生型ｃ［蛋白質よりもｈｔｐＲ−細胞に
おいてかなり不安定であった。 ３５、Ｌ−メチオニンパルス−チェイスアッセイ〔ロー
ゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、
）、メソツズ・イン會エンザイモラジ−（Ｍｅｔｈ、
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌＯｇｙ）、 １０１．１２３〜３３
８ （１９８３）十 参照〕によって測定すると、ｂｔｐＲ株において野生型
ｃｆＪ蛋白質の半減期は２０分だったのに対し、ｃ■突
然変異体蛋白質のほとんどの半減期は３〜５′Ｊｆであ
った。ｃｆＪ突然変異体蛋白質の半減期の十 うち数個はｈｔｐＲ株においてさえ１分以下であった。 ＡＲ６７、ＣＡＧ４５５細胞系から細胞室てた溶原菌は
ｈｔｐＲ１６５突然変異とｓｕｐＣｔｓサプレッサーを
相持するものだが、ｈｃｐＲ−突然変異体である用いた
たた゛】つの株であった。ＡＲ６７はこれらの非常に不
安定な突然変異体ｃｌｌ蛋白質を安定化する顕著な効果
を示した。例えば、最も不安定な突然変異体０口蛋白質
、ＣＩＩ ３０８５の半減期はｈｔｐＲ＋細胞系に分け
る０、５分からＡ Ｒ６７（ｈｔｐＲ−突然変閏体ンに
おける少くとも２０分に延長された。事実、ＡＲ６７に
おいてアッセイを行った全ての突然変異体ｃ［蛋白質の
半減期は少くとも野生、Ｑ（口上白質と同一のレベルま
で増加した。同時に、ＡＲ５５、ＡＲ６７に対して同遺
伝子型であるかｈＬｐＲ−突然変異を含有しない（すな
わち、＋ ｈｔｐＲである）溶原菌はいずれの突然変異体０口蛋白
質も安定化できなかった。これらの結果は、（Ａ技６７
の如き）ｈｔｐＲ突然変異体細胞系十 が、その表現かｈｔｐＲ株において安定でない同族の突
然変霞体ｃ［蛋白前を安定化することを示ず。 ｈｔｐＲ十株におけるその表現と比較してＡＲ６７は野
生型ｃｌｌ蛋白質の表現の安定性に対する影響を持たな
いので、 ｈｔｐＲ−突然変異株の蛋白分解欠損はあ
る種の選択性を示す。しかし、野生型ＣＩ′Ｉ蛋＋ 白質はｈｔｐＲ株において容易には安定して表現されな
いが、ｈｔｐＲ＋株においては突然変異体ｃ４Ｊ蛋白質
よりも安定に表現される。かくして、選択性は、野生型
ｃｌｌ蛋白質の正常な分解はｈｔｐＲ遺伝子の制御下に
あるのではなくて代りに熱シヨツク応答に関与しない他
の蛋白分解欠損によって分解される（すなわち、 ｈｔ
ｐＲ遺伝子による調節下にはない）という事実によるも
のであり得る。 酵母Ｇ Ａ Ｌ ４ コーディング配列の全長翻訳およ
び数個の切Ｗ′ｒ翻訳をクローンしてベクター（ｐＡＳ
１ ）に入れ、その結果、ＧＡＬ４ 蛋白質の全長翻
訳ふ゛よび切断翻訳を共にコード付けする数個のクロー
ンを得た。全ての翻訳はｈｔｐＲ”ｉ、 ＡＲ６６，お
よび同遺伝子型ｈ Ｌ ｐＲ突然変異株、八に６８にお
いて表現された。ＡＲ５５宿主は全細胞蛋白質の０．１
％をＧえて蓄積しなかったので蛋白質はＡＲ５５宿主に
よって安定（で表現されなかった。ＡＲ６８形質転換体
のみが加熱誘発に際して蛋白質産生物の蓄積を示した。 かくして、ＡＲ５８に存在するｈｔｐＲ−突然変異はイ
ー・コリにおけるＧＡＬ４ ｉｌｌｌｌ圧子産生物積、
従って安定化に対して不可欠のものであった。 ヒトｃ−ｍｙｃ コーディング領域を全長ｃＤＮＡク
ローンから採取してイー・コリ１において外来遺伝子産
生物を十分に表現するように設計されたベクター、ｐＯ
Ｔ Ｓ に挿入した。３つの異なるｈｔｐＲ＋株、へ
５］５１、ＡＲ５５およびＡＲ５８をヒトｃ−ｍｙｃコ
ーディング領域を含有するｐＯＴｓベクターで形質転換
した。ｈｔｐＲ突然変異株、ＡＲ６８もまたｐＯＴｓ
−ｃ−ｍｙｃベクターで形質転換した。Ａ艮６６はＡＲ
６８のｈｔｐＲ＋同型ｊ伝子である。ｐＯＴｓ＋ −ｃ−ｍｙｃベクターで形質転換したｈｔｐＲ株はｃ−
ｍｙｃ産生物を表現したか、パルス標識したイー・コリ
抽出物の５ＤＳ−ゲル電気泳動によって示された如く、
蛋白質の分解か急速であって蓄積できず、かつゲルのコ
ーマシー染色によっては検出できなかった。かくして、
Ｃ−ｍＹｃ 産生物はｈｔｐＲ”宿主によって安定に
表現されなかった。他方、ｈｔｐＲ条件突然変異体形質
転換体は高レベルでｃ−ｍｙｃ蛋白質を蓄積し、１２０
分までの間４２℃の温度に暴露すると、ゲルのコーマシ
ーブルー染色は誘発産生物が２時間で全ｈｃｐＲ−条件
突然変異体蛋白質含有量の１０％を超えて蓄積したこと
を示した。 かくして、本発明の方法はｈｔｐＲ−１胞によって安定
に表現されないプロト腫瘍遺伝子産生物を表現するのに
用いることができる。かかるプロト腫瘍遺伝子産生物は
（１）細胞中のプロト腫瘍ｉｌ云チ産生物の検出に有用
な単クローン抗体の調製に、また（１１）入渠拮抗物質
および／または作用物質に対する標的として有用である
。 シャツ７ ンら（Ｓｈａｔｚ＋ｍｎ ｃｔ ａｌ、）
［「イクスペリメンタル伊マニプユレイションーオブ
豪ジーンψイクスブレショ：／ （Ｅｘｐｅ ｒ ｉｍ
ｅｎｔ ａ ＩＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｃ
ｎｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ） ＪＤ第２章、アカ
デミツク（Ａｃａｄｅｍｉｃ ）出版社、（１９８３）
〕、およびローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔ
ａｌ、） ［メソツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ、）、Ｉ ０１．１２３〜
１３８（１９８３）］の方法によってサルのメタロチオ
ネイン遺伝子とマウスのメタロチオネイン遺伝子をｐＡ
ｓｌに挿入した。得られたベクターをローゼンベルグら
（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｔ、 ） （前掲）
の方法により形質＋ 転換してｈｔｐＲ株［ＡＲ６８、Ｎ５１５１、ＡＫ１３
、Ｃ６００（λＣ１８６７）〕およびｈｔｐＲ突然変異
株（ＡＲ６７およびＡＲ６８）に入れた。（メチオニン
の代りにシスティンを用いた以外は前掲のローゼンベル
グら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅＥ ａｌＪの方法により
行った）遺伝子産生物のパルス標識はマウスおよびサル
のメタロチオネイン蛋白質がｈｔｐＲ＋ｔｐＲ＋おいて
良好に表現されたことを示したが、パルス・チェイス法
のデータはかかる蛋白質がｈｔｐＲ＋宿上中で宿営中不
安定であって２分またはそれ以下の半減期を有したこと
を明らかとした。これらの遺伝子産生物の蓄積はＡＲ６
７またはＡＲ６８（ｈｔｐＲ−条件突然変異株）におい
てそれらの合成を行うことによっては促進されなかった
。事実、ｈｔｐＲ株において表現されたマウスおよびサ
ルのメタロチオネイン遺伝子産生物の半減期はｈｔｐＲ
”株におけると同程度に短かいものであった。これらの
結果はマウスおよびサルのメタロチオネイン遺伝子産生
物の分解の原因であるプロテアーゼ（類〕がｈｔｐＲ遺
伝子の制御下にないことを示す。 実施例 以下の実施例において、本発明の好ましい具体例をさら
に詳しく開示する。これらの実施例は本発明の例示であ
って本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでは
ない。 実施ガニないし３の方法のさらに詳細な例はベイカーら
（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ、 ）、ｌｏシーティンクズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｃｌ、Ａｃａｄ、 ５ｃｉＪ Ｕ
Ｓ Ａ。 旦ユ、６７７９〜６７８３（１９８４，ｌにおいて見い
出すことができる。 実施例４の方法のさらに詳細な例はワットら（１Ａｈａ
ｔｔ ｅｔ ａｌ 、） 、モレキュラー・アンドΦセ
リュラー・ハイオラジ−（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＆
Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、）、５（３）、４４８〜４５６
（１９８５）において見い出すことができる。 実施例で言及されている全ての細菌株の遺伝子型と源を
以下の表Ａに示す。 表Ａ ｒｐｓＬ、ｍａｔ（ａｍ） Ｋ１６！Ｊ″Ｌ）ＳＣ１２２ｈｔｐＲ１６５ＣＡＧ４５
Ｊｂ） ５Ｃ１２２ｈｔｐａ１５５ＣＡＧ５１Ｃｆｃ
）ＳＣ１２２ｒｐｏＤ８００−Ｔｎ１０ＣＡＧ４８１（
ｃ）ＣＡＧ４５６ ｒｐＯＤ８００−ＴｎｌＯＣＡＧ
４８２ ＣＡＧ４８１φ８０ ＣＡＧ４８３ ＣＡＧ４８］φ８０５ｕｌｌｌ（Ｓｕｐ
Ｆ、）ＣＡＧ６０３（ｄ）ＳＣ１２２ｐｒｏＡ／Ｂ：：
Ｔｎ１ｇ／Ｆ’ｐｒｏＡＢ”、 １ａｃＺＸ９ＱＣＡＧ
（６０４（ｄ）ＣＡＧ４５６ ｐｒｏＡ／Ｂ： ：Ｔｎ
ｌＯ／Ｆ’ｐｒｏＡＢ”、 １ａｃＺＸ９ＱＣＡＧ５１
０７ ＣＡＧ６０４ ｐＦＮ９２ＡＲ６！５（ｅ）ＳＣ
１２２（λｃＩ８６７ ｋｉ巳」Ｉ）ｇａｌＥ： ：Ｔ
ｎｌＯＡＲ５メｅ） ＣＡＧ４５６（λｃ ■３６
７ ｋ ｉ １−Ｊｉｌ ） ｇａ ｌ Ｅ： ：Ｔｎ
ｌ ０ＡＲ６６（ｇ）Ｓ Ｃ１２２（λＣＩ８６７８ａ
ｍ５８−７１Δ［ｌすｇａｌＥ： ：Ｔｎｌ ０ＡＲ６
７ｇ）ＣａＣ２５６（λＣＩ８６７Ｂａｍ５Ｃｌ３６７
Ｂａ ）ｇａｌＥ： ：ＴｒＢ、□Ａ）Ｋ６８ Ｎ
９９（＋）（λＣｌ８６７ ｋｉｌ−」Ｉ）ｇａｌＥ：
：ＴｎｌＱＡＲＩ ３ Ｃ６０（Ｊｊ）（λｃ■３
６７ｋｉｌ−、９（１）ｇａｌＥ：：ＴｎｌＱＮ５１５
１ ５Ａ５０（ｆｋ）ｈ ｉｓ 、 ｉ ｌ ｖ△８
（λｃＩ８６７△Ｂａｍ ５８−７１△Ｈ１） ｇａｌ
ｋ アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍｏｌ。 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、入３３９％１６７〜１７６（３
９７５）中に記載されている。 （ｂ） ｔｎａ ＩＴ”Ｋ連結したｈｔｐＲ１６５突然
変異を形質導入してｍａｌ’ｒ−である５Ｃ１２２誘導
体中に入れることによってＣＡＧ４５６を調製した。 （ｃ）ＴｎｌＯは９０多までｒ ｐｏＤに連結している
〔グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、）、
セル（ＣｅＨ入３２％ １５１〜１５９Ｃ１９８３）９
照コ。 （ｄ）Ｆｌ！株Ｃ３Ｈ２１由来のものである〔ミラーら
（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、）％「イクスペＩノメ
ンツーインーモレキュラー・ジエ不テイツクス（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ Ｍｏ１ｅ、ｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ） Ｊ、：） ＋’７ ／レド嶋スプリン
グ、 バー バー （Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｍｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ ）研究所８照〕１゜ （ｅ）全て「イクスペリメンツ・ウィズ・ジーン・フユ
ージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇ
ｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ） Ｊ、’／ルハビイら（５ｉｌ
ｈａｖｙ ｅｔ ａｌ、）編、コウルド、スプリン
グ、ハーバ−（ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
） 研究所（］ ９８４ ）ノ方法ＶＣよってテト
ラサイクリン耐性について選択し、次いでλ溶原性につ
いてテストするＡＲＪ４（ｆ）からの欠陥および温度感
受性プロファージ（λＣ１ｆ３６７ｋｉｌ−△Ｈ１）の
ｌ）ｌ ｇａｌＥ：：ＴｎｌＯ共形性導入による由来の
ものである。 （ｆ）Ａｆ１４はＣ６００由来のものであって、ｇａｌ
Ｅ；： ＴｎｌＯＫよって両側を占められるλＣｌ８
６７ｋＮ−ΔＦ１１欠陥プロファージを含有する。 （ｇ）全て「イクスペリメンツ・ウィズ−ジーン・ヒュ
ージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ ） Ｊ、’／ルハビイら（Ｓ
ｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａＪ、）編、コウルド・スプリン
グ・ハーバ−（ＣｅＩｄＳｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ ）研究所（１９８４）の方法ｅζよってテトラサイ
クｌン耐性について選択し、次いでλ溶原性についでテ
ストするＡＲ１８（ｈ）からの欠陥および温度感受性プ
ロファージ（λｃ（８６７△ＢＡｔｎ△ＨＩ ）ノＰ
ｅｇａｌＥ： ：Ｔｎｌ ０共形質導入による由来のも
のである。特にｃｆｌ遺伝子を除去するさらなるプロフ
ァージ欠失（ΔＢａｍ５８−７１）の点でＡＲ５５およ
びＡＲ６８はＡＲ５５およびＡＲ６７と異なる。 （ｈ） Ａ艮１８はＮ５１５１由来のものであってλＣ
Ｅ８６７△Ｂａｍ△■ＩＩプｏ７７−ジに隣接するｇａ
ｌＥ＝：Ｔｎｌｏを担持する。 （ｉ）Ｎｃ＋９はレーデ／ｌ／ ヘ／Ｌ／グ（Ｌｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ ）、「マイクロバイオロジカル・ジエ不テ
イツクスーＩＯス・う／ムポジウム・オブ・ザ・ソサイ
エテイ・フォー・ジェネラルΦマイクロバイオラジ−（
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ −１０ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆ ’Ｔｈ
ｅ ５ｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍ
ｉｓｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）上ハイニスおよびクロウニス
（Ｈａｙｅｓ ａｎｄ Ｃ１ｏｖｅり編、ケンブリ
ッジ大学出版部、］１５〜１３１（１９６０）に記載さ
れている。 （ｊ）Ｃｓｏｏはアブレヤードら（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ
ｅｔ ａｌ、入ビ（１０ジー（Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ
）、２．５６５（１９５６）にｌ己ｍされている、 （ｋ） Ｓ Ａ ５ Ｕ Ｏはナカニシら（Ｎａｋａｎ
ｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ、）、−ｔｐル（Ｃｅ１ｌ八３
．３９〜４６ （１９７４）Ｋ４ｄｆ＆されている。 実施例１ ｈｔｐＲ−条件突然変異株は突然変異体イー・フリ蛋白
質の蛋白分解に欠陥かある。 Ａ、（ｒｐｏＤ８００シグマ対立遺伝子によってコード
付けされた〕突然変異体シグマの分解イー・コリＲＮＡ
ポリメラーゼホロ酵素の７０キロダルトンのシグマサブ
ユニット（σ７０）は転写開始と細胞増殖の維持におい
て重要な役割と果している。ｒｐｏＤ８υ０（ｒｐｏＤ
２８５）を包含するｒｐｏ Ｄ、すなわちσ７０ を
コード付はするイー・コリ遺伝子における数回の突然変
異は温度感受性増殖表現型（Ｔｓ）に導く。 ３０℃に訃ける指数増殖の間に株ｃＡＧｓ １０ （＋ ｈｔｐＲ、／ｒｐｏＤ ８００／ ｓｕｐＣｔｓ）とＣ
ＡＧ４８１（ｈｔｐＲ１６５／ｒｐｏＤ８００／％ｕＰ
Ｃ”）を３８−。 イシンと３０− リジンで１０分間ラベルした。過！Ｔ
ｉ１ｌ（＞２００１１ｇ／肩ｌ）の非放射性ロイシンお
よびリジンの添加後、培養物を４２℃にシフトし、定期
的にサンプリングを行った。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓ
ｍａｎ ｅＬ ａｔ、 ） Ｃセル（Ｃｅ口）、３２
．１５１〜１５９（１９８３）］ によって記載されて
いる如く、２Ｄゲル上のｒｐｏＤ８００でコード付けし
ｔシグマの含有量について試料を分析し７た。初期時間
（ｔｌｏ）をチェイスの添加の２分後にとったがシグマ
において２０００〜４０００ ｄｐｍの範囲内であった
。４２℃にて突、然変異体シグマ４２ｈｔｐＲ＋株にお
いて急速に分解されたが（Ｔｌ／２＝６分）、ｈｔｐＲ
１６５条件突然変異株においてはかなり安定であった（
Ｔｌ／２＞６０分〕。かくして、突然変異体シグマはｈ
ＬｐＲ−突然変異株において少くとも】０倍は安定化さ
れた。突然変異体シグマの分解速度はｈｔｐＲ突然変異
株における野生型シグマの分解速度と区別がつがなかっ
た。 ｒｐｏＤ８ＱＱ でコード付けしたシグマは野生型ｍ胞
においては低温でも分解されるので（グロスマンら（Ｇ
ｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、 ）、前掲参照）、３
０℃において同遺伝子型ｈｔｐＲ＋およびｈｔｐＲ−突
然変異体細胞におけるシグマ分解速度を比較した。突然
２異体シグマポリペプチドは３０℃でｈｔｐＲ”株にお
ける（ Ｔ ］／２ ＝ ２０分）よりもｈｔｐＲ−突
然変異株における（Ｔｌ／２＝６０分〕方がゆっくりと
分解された。 Ｂ、突然変異体β−ガラクトシダーゼの分解（×９０） Ｍ９グリセロール培地中で３０℃において指数的に増殖
する株ＣＡＧ６０３（ｈｔｐＲ”／ Ｆ’１ａｃＺＸ９
Ｑ／ｓｕｐＣｔｓ）およびＣＡＧ６０４ （ｈｔｐＲ］
６５／ Ｆ ｌａｃ ＺＸ９Ｑ／ｓｕｐ Ｃ）をイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｌｌ’Ｔ
Ｇ、）で誘発し、誘発の１０分後に４２℃にシフトした
。 ４２℃へのシフトの２０分後、 Ｓ−メチオニンで細
胞ｆ！−１，５分間ラベルし、過剰（＜２００μｇ／ｍ
ｌ）の非放射性メチオニンで旧跡し、定期的にサンプリ
ングを行った。試料を免疫沈降し、β−ガラクトシダー
ゼの含有量について分析した。初期時間（（＝Ｏ）をチ
ェイスの添加後２分にとり、β−ガラクトシダーゼにつ
いて５０００ ｄｐｍを表わす。 ４２℃ではＩａｃＺＸ９０ポリペブチドハｈｔｐＲ＋株
における（Ｔｌ／２＝７分〕よりもＣＡＧ６０４、ｈｔ
ｐＲ突然変異株における方がかなりゆっくり（Ｔ ］／
’２ ＞６０分〕分解された。かくしてＩａｃＺＸ９０
ポリペプチドはｈｃｐＲ突然変異株においては少くと
も８．５倍安定化された。野生型１ａｃＺ遺伝子産生物
の分解速度はｈ Ｌ Ｊ）艮−突然変異株におけるＩａ
ｃＺＸ９Ｑポリペプチドの分解速度と区別できなかった
。 Ｃ，ｈｔｐＲ１６５突然変異でのもの以外のｈｔｐＲ−
突然変異体株によるｒｐｏＤ８００遺伝子産生物および
１ａｃＺＸ９（Ｊ遺伝子産生物の分解ｈｔｌ爪−爪体突
然変異体細胞って示される蛋白分解欠１はｈｔｐＲ１６
５突然変異とｓｕｐＣｔｓ遺伝子をイ１する株に限定さ
れないことに注目するのは重要テアル。グロスマンら（
Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｉ 、 ） ｌ：ジャーナ
ル・Ａブ・バクテリオシン−（ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ 、）、１６１（３）、９３９〜９４３（１９８５Ｊ
］によって開示されている如く、ｒｐｏ Ｄ８００ （
ｒｐＯＤ２８５ ）遺伝子産生物の蛋白分解における同
一の欠１はｈｔｐＲ１０７％ｈｔｐＲ］１１、ｈｃｐＲ
１１２またはｈｔｐＲ１１３突然変異およびｒｐｏＤ８
００遺伝子を共に有するｈｔｐＲ”−（ｒｐｏＨ−）細
胞によって示される。グロスマンら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ
ｅｔ ａｌ、）は１ ｒ、： ｒｐａ Ｄ ８００遺
云子を担持するｈｔｐＲ］ ｌ ２ 突然変異体によ
って示されるＩａｃＺＸ９Ｑ遺伝子産生物の蛋白分解に
おいて同一の欠Ｊｌを観察した。ｈｔｐＲ１１２突然変
異は１１ｔ ｐＲ（ｒｐｏＨ）遺伝子産生物のカルボキ
シル末端からの７個のアミノ酸についてロイシンからト
リプトファンへの変化をひき起こすミスセンス突然変異
によって明らかにされる。 実施例２ ｈｔｐＲ座に対するｈｔｐ Ｒ条件突然変異株マツプの
分解欠１ マーカー救済実験によりｈｔｐＲ−突然変異株による蛋
白分解における欠１をマツピングした。不イド７、ルド
ら（Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ、 ）［’）ヤ−
−Ｊ−／ｌ／ −オブ・バクテリオシン−（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌＪ 、１６８．５９７〜６０３（１９８３
）（Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ ■） ］ Ｋヨってｔ己４
戊されているｐＦＮ ９２プラスミドはｈｔｐＲ構造遺
伝子のへ木端の約１２０ ｂｑ 上流から出定してその
３゛端部に近接するｈすＲ遺伝子内で終る細菌ＤＮＡの
セグメントを担持する〔ネイドハルトら（Ｎｅ１ｄｈａ
ｒｄｔ ｅｔ ａｔ 、 ） 、 ７ ン伊すビューー
ジエｆｉ、ティックス（Ａｎｎ、Ｒｅｖｉｅｗ、 Ｇｅ
ｎｅｔｉｃす、Ｊ８．２９５〜３２９（１９８４）；お
よびランデイックら（Ｌａｎｄｉｃｋ ｅｔ ａｌＪ、
セ／Ｉ／ （Ｃｅ１ｌ ）、３８゜１７５〜１８２（１
９８４）＃照〕。Ｉ）ＦＮ９２プラスミドはｈｃｐＲの
欠陥を補足しない。しかしなから、ｉ’Ｍｒｆｉ耐性で
あって正常な熱シヨツク応答を行うｈｔｐＲ＋ 組換え
体はＰＦＮ９２プラスミドによって形質転換された細胞
から回収できる［ＮｅｉｄｈａｒｄｔＩｇ照］。Ｎｅ１
ｄｈａｒｄｔ Ｉの方法によりｈｔｐＲ１６５条件突然
変異株をｐＦＮ９２で形質転換し、その温＋ 度耐性表現型に基づいてｈｔｐＲＭ！換体を選択した。 熱シヨツク応答を行いかつＩａｃＺＸ９０ポリペプチド
を分解するこれらの株（ｈｔｐＲｌ ６５条件突然変異
体、ｐＦＮ９２、非組換体；ｈｔｐＲ＋、ｐＦＮ９２、
組換体）の能力を比較した。非組換体株は熱シヨツク応
答およびＩａｃＺＸ９Ｑ ポリペプチドの分解に欠陥が
あるので、もとのｈＬｐＲ−突然変異株の特徴を保持し
ていた。対照的に、組換体法は共に十 ｈｔｐＲ株の特徴である熱シヨツク応答を行う能力およ
び１ａｃＺＸ９０ポリペブ千ドを分解する能力を十 同時に保持していた。ｈｔｐＲ組換体株はまたｒｐ。 Ｄ８００ でコード付けした突然変異体シグマを分解す
る能力を回復することも確定された。これらの実験によ
り、ｈｔｐＲ遺伝子における傷害に対する突然変異体原
核生物の遺伝子産生物の蛋白分解におけるｈｔ ｐＲ−
条件突然変異株の欠１を明確にマツピングできる。正常
な熱シヨツク応答および１ａｃＺＸ９ＱとｒｐｏＤ８ｏ
ｏ テ：ｌ −）’付ケシタ突然変異体シグマポリペプ
チドの分解は共にｈｔｐＲ＋対立遺伝子を必要とする。 実施例３ ＋ ｈｔｐＲ対立遺伝子についての株組換体（ｈｔｐＲ）お
よび非組換体（ｈｔｐＲ−）における熱シヨツク蛋白質
合成および蛋白質分解 実施例３に記載する実験は株ＣＡＧ５１０７（ｈｔｐＲ
突然変異体／ Ｆ’ｌａｃ ＺＸ９０ ｐＦＮ ９２
） オヨび株ＣＡＧ５１ ］ ０ （ｈｐｔＲ＋／／Ｆ
’１ａｃ）１，９０ ｐＦＮ９２ ）ＩＩＣ＋ ついて行った。ｈｐｔＲ株（ＣＡＧ５１］０）は４２＋
＋ ℃で
【Ｓ増殖を示すｈｐｔＲ組換体を産生ずる染色体中
のｐＦＮ９２およびｈｔｐＲ一対立遺伝子間の組換えの
結果によるｈｔｐＲ突然変異株（ＣＡＧ５１０７）由来
のものであった。ｐＦＮ９２でのＣＡＧ５１１０の形質
転換はＮｅ１ｄｈａｒｄｔ Ｉの方法によるその選択に
先立って行った。 Ａ、熱シヨツク応答の回復 株ＣＡＧ５１Ｃ＋７およびＣＡＧ５］１０を３０℃にて
、あるいは４２’Ｃへのシフトの５分後に３５５メチオ
ニンで２分間パルス標識し、次いで非放射性メチオニン
で１分間追跡した。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上
のＮＫ分解によって試料を熱シヨツク応答について分析
した。非組換体株（ＣＡＧ５１０７）におまるわずかな
熱シヨツク応答はｈｔｐＲ突然変異株、ＣＡＧ４５６に
おける熱シヨツク応答および他の研究者によってｈｔｐ
Ｒ−株から観察された熱シヨツク応答〔ヤマモリら（Ｙ
ａｍａｍｏｒｉ ｅＬ ａｌ、 ）、ピーエヌエイエス
（ＰＮＡ Ｓ ）、７９，８６０〜８６４（１９８２）
、およびティリーら（Ｔｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ、）、セ
ル（Ｃｅｌｌ）、３４，６４１〜６４６（１９８３）参
照〕と区別がつかなかった。組換体法（ＣＡＧ５１１０
）十 における熱シヨツク応答はｈｔｐＲ株ＳＣＩ ２２
における熱シヨツク応答と区別がつかなかった。 Ｂ、突然変異体β−ガラクトシダーゼ（Ｉ ａｃＺ Ｘ
９０ポリペプチド）の分解 ３０℃にてＭ９グリセロール培地中で指数的に増殖する
株ＣＡＧ５１０７およびＣＡＧ５１１０をＩＰＴＧで誘
発し、誘発の１０分後４２℃までシフトした。４２℃へ
のシフトの２０分後、 Ｓメチオニンで細胞を１．５
分間ラベルし、過剰の非放射性メチオニンで追跡し、定
期的にサンプリングを行った。β＋β°サブユニットの
フラクションとしてのβ−ガラクトシダーゼの含有はに
ついて一次元ゲル上で試料を分析した。初期時間（Ｌ＝
０）をチェイスの添加２分後にとったが、β−ガラクト
シダーゼにおいて５０００ ｄｐｍを示す。ｈｔｐＲ＋ 突然変異株はｈｔｐＲ株（Ｔ ］／２ ＝ ７分）より
もかなりゆっくりと（Ｔｌ／２＞６（３分）ＩａｃＺＸ
９０逍伝子産生物を分解した。 Ｃ，５ｕｐＦサプレツサー（Ｓｕ［ＩＩ）を有するおよ
び有さないｈｔｐＲ株における（ｒＰＯＤ８００ シ
グマ対立遺伝子によってコード付けされた）突然変異体
シグマの分解 ｓｕｐＣｔｓサプレッサーはｈｔｐＲ］６５突然変異の
効果的でないサプレッサーである。かくして、４２℃に
おいてかかるｈｔｐＲ突然変異体細胞において観察され
る蛋白分解における欠榎は４２℃における熱シヨツク応
答またはｈｔｐＲ合成のいずれかの欠損よりもむしろ３
０℃において合成されるｈｔｐＲ産生物のより低量によ
るものであり得る。前者の場合、ｈ、ｔｐＲ−突然変異
体細胞によって示される蛋白分解における欠１は３０℃
並びに４２℃で起こ＋ るはずである。同遺伝子型ｈｔｐＲおよびｈｔｐＲ突然
変異体細胞におけるｒｐｏＤ８００ でコード付けし
たシグマサブユニットの分解速度−ｐ３０℃で比較した
。と言うのは、ｒｐｏＤ８００ でコード付けしたシ
グマサブユニットは低温においてさえ野生型細胞におい
て分解されるからである。４２℃で蛋白分解を行うｈＬ
ｐＲ１５５条件突然変異体細胞の能力を回復する有効な
５ｕｐＦ（Ｓｕ［）サプレッサーの能力も調べた。 突然変異体シグマの分解を３種の株：株ＣＡＧ５ ］
０ （ｈｔｐＲｘ、ｒｐｏＤ８００ ）、株ＣＡＧ４８
３（ｈｔｐＲ］６５突然変異体、ｇ Ｑ ｐｓｕ［ｌ、
ｒｐｏＤ８００人および株ＣＡＧ４８２ （ｈｔｐＲｘ
６５突然変異体、８０、ｒｐｏＤ８００）において測
定した。ＣＡＧ４８２は、８０における遺伝子がｈｔｐ
Ｒ突然変異体ｔｆｆＩ胞の蛋白分解表現型に影響しない
ことを証明するための対照である。３０℃で指数的に増
殖する細胞Ｂｓ−メチオニンで１０分間ラベルした。過
剰（ＩＭｌ／ ｍｌ ）の非放射性メチオニンの添加後
、培養物を４２℃−＼シフトするかまたは３０℃のまま
にしておき、定期的にサンプリングを行った。 ｒｐｏＤ８００でコード付けしたシグマの含有場につい
て試料を分析した。初期時間（ｔ＝０）をチェイスの添
加２分後にとったが、シグマにおいて５０００〜１００
００ ｄｐｍの範囲内である。 ３０℃において、ｒｐｏＤ８Ｑｏでコード付はしこ＋ 突然変異体シグマ蛋白質はｈｔｐＲ株におけるよりもｈ
ｔｐＲ−突然変異株における方がゆっくりと分解された
。より効果的な５ｕｐＦ（Ｓｕ １ＩＩ）サプレッサー
が存在すると３０″Ｃにおける急速な分解は回復した。 ｓｕｐ Ｆ （Ｓｕ ＩＵ サプレッサーは熱シヨツク
蛋白質の合成を行う能力を回復すると共に４２℃におい
て蛋白分解を行うｈｔｐＲ１６５条件突然変異体細胞の
能力を回復することも明確にされた。かくして、サプレ
ッションのレベルを上げることは正常な熱シヨツク応答
と蛋白分解を同時に回復した。 これらの実談は、ｈｔｐＲγンバー突然変異（すなわち
ｈｔｐＲ１６５）が静士期増殖条件下の低温において並
びに高温へのシフト後の双方において蛋白分解欠１をひ
き起こすのに十分であることを示す。 実施例４ ｈｔｐＲ−株におけるヒトｃ−ｍｙｃの２つの異なる形
態の表現の安定化 Ａ、細１株およびプラスミド 発現ベクターの組立てで用いた宿主はイー・コ＋Ｊ Ｍ
Ｍ２９４ （λｃｌ”）であった。蛋白質表現の研究に
はイー・コリＩＡＲ６８を利用した。プラスミドベクタ
ー、ｐｏＴｓは発現ベクターｐ ＡＳ １の誘導体テア
リ、テハレら（Ｄｅｖａｒｅ ｅｔ ａｌ、） ［セ
ル（Ｃｅｌｌ）、１亙、４３〜４９（１９８４）］によ
って記載されている。 全ての標準的な分子クローニング法（例えば、制限消化
、結紮、形質転換など）は特に断らない限りマニアテイ
スら（Ｎｉａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、） ［「モレ
キュラー・タロウニング、ア・ラボラトリ−・マニュＴ
ル（ｋｉｌｌ）Ｉｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ａ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙｋｌａｎｕａｌ、） Ｊ、
コウルド・スプリング・バーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ）研究所（１８９２）］
、７）方法によって行った。 Ｂ、 ｐＯＴｓ−ｍｙｃ、 ｃ−ｍｙｃ表現プラス
ミドの組立て ｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子の蛋白質コーディング配列はヒト
防白血病細胞系に５６２ から４製されたｃＤＮＡ
ライブラリーから単ｉされ、ワットら（Ｗａｔｔ ｅｔ
ａｌ、 ） ［ピーエヌエイエス（ＰＮＡＳ）、８０
．６３０７〜６３１１ （１９８３）］の方法により調
製すれｆ、−ｃＤＮＡりｏ −ン（ｐＭＹ ＣＩａＣ）
から得た。ｃ−ｍｙｃコーディング配列の５°端部はア
ガロースゲル電気泳動により４７〇−塩基対ＴｈａＩ制
限フ制限フラグメン車上し、次いで結紮して、ＤＮＡポ
リメラーゼ■のクレノー断片を用いＢａｍ１１１で消化
し平滑末端としたｐＯＴｓベクター中に入れた。このプ
ラスミド組立体をＰｖｕ口で部分的に消化し、ひき続い
てＸｂａＩで消化し、クレノーＩ’ｏｌ［で末端を満た
した。Ｔｈａ［フラグメント内のＰｖｕ［部位のみの消
化によって直線化されたプラスミド組立体をアガロース
ゲル電気泳動によって単環した。ｃ−ｍｙｃコーディン
グ配列の３端部を１１００−塩基対Ｐｖｕ［／Ｂｃ Ｉ
［７５グメント上で単離し、結紮して前記の部分的に
消化した組立体中に入れた。かく産生されたｐＯＴＳ
−ｍｙｃ表現プラスミドはｐＯＴｓベクター上に配され
た翻訳開始コードンとインフレーム融合した全ｃ −ｍ
ｙ ｃコーディング領域を含有する。得られた組立体は
ｃ−ｍｙｃコーディング配列の５端部上にさらに４個の
コードンを含有する。 Ｃ１誘発粗菌蛋白質の分析 マニアナイスら（〜１ａｒ＋１ａｔｉｓ ｅｔ ａｌ
、 ） （前掲）の方法によりｐＯＴ Ｓ −ｍｙｃま
たはｐＯＴｓ で形質転換したイー・コリ株ＡＲ６８、
ｈｔｐＲ突然変異体における蛋白質の合成速度をローゼ
ンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｃ ａｌ、）
〔ｙｒ ”／ ツズーエンザイモラジ−（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ）、上回１．１２３〜１３８
（１９８３）：）の方法によるパルス標識法によって４
２℃における誘発の前後で調べた。細胞の２００リット
ル分を１０Ｃｉ の〔３５Ｓ〕メチオニン（１２２１
Ｃｉ／ｒｒｍｏｌ ； ＝ニー・イングランド・ヌクＬ
／７ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
）で熱誘発の後何回もパルス標識を３分間行った。パ
ルス標識の後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）−３５％２−メルカプトエタノール３０μｍ を加え
、試料を９５℃で１分間加熱°し、ひき続いてドライア
イス−エタノール浴中で急速に冷凍し、トリクロロ酢酸
（最終濃度、１０％）で沈殿させた。 沈殿物を冷エタノールで２回洗浄し、試料緩衝液中に懸
濁し、９５℃で５分間加熱し、１０％ポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動に付した。最後に該ゲルを乾燥し、
螢光写真をとった。試料は細胞数およびゲル上に負荷さ
れたカウント数のいずれについても正規化しなかった。 該ゲルの分析結果は、新しい６４０００ダルトンの蛋白
質（すなわちｃ−ｍｙｃ）の合成がｐＯＴＳ−ｍｙｃ
で形質転換した細胞中で誘発されたが親ベクターｐＯ
ＴＳで形質転換した細胞中では検出されなかったことを
示した。３分のパルス期内に蛋白質中に一体化された［
３５ｓ ］メチオニンのがなりの割合かｃ−ｍｙｃ遺
伝子産生物中に出現するのでこの（３４０００ダルトン
の蛋白質は高速で表現された。この蛋白質が細菌中で高
レベルで蓄積され得るか否かＰ調べるために細胞を１２
０分まで誘余し、異なる時間（ｌこ採取した分を５ＤＳ
−ゲル電気泳動によってｃ−ｍｙｃ産生について調査し
た。ゲルのコーマシーブルー染色は、誘発産生物が２時
間で全イー・コリ蛋白質の１０％を超えて蓄積したこと
を示した。 ＡＲ６８形質転換体によって産生きれた６４０００ダル
トンの蛋白ｆｔｌニスバックマンら（Ｓｐａｃｋｍａｎ
ｅ ｔａｌ、）〔アナリテイカル・ケミストリー（Ａ
ｎａｌ。 Ｃｈｅｍ、 ）、３０．１３９０〜１２（１６（１９５
８，１）およびヘライックら（Ｈｅｗｉｃｋ ｅｔ
ａｌＪ ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
ト＋１（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５６．７９９０〜７９９７
（ｊ９８１）〕の方法によるアミノ酸分析および配列決
定によってｃ−ｍｙｃ蛋白質であると確認された。 ＋ Ｄ、 ｈｔｐＲ株（ＣよるＣ−ｎ１５’Ｃの表現＋ 前記の如く３種のｈｔｐＲ株 （すなわちＮ５１５１、
ＡＲ６６およびＡＲ５８）をｐＯＴｓ−ｍｙｃベクター
で形質転換した。パルス標識したイー・コリ抽出物の５
ＤＳ−ゲル電気泳動によって示されたＱ口く、全ての株
はｐＯＴ Ｓ −ｍ ｙ ｃベクターで順調に形質＋ 転換されたが、ｈｔｐＲ形質転換体はｃ−ｍｙｃ産生物
を安定に表現できなかった。と言うのは、該産生物はゲ
ルのコーマシーブルー染色によって検出できなかったか
らである。ｃ−ｍｙｃはＡＲ６８（ｈＬｐＲ−突然変異
体〕において安定に表現されたかその同型遺伝子、 Ａ
Ｒ６６（ｈｃｐＲ）においては安定に表現されなかった
ので、ＡＲ５８中に存在するｂｔｐＲ−突然変異はイー
・コリにおけるｃ−ｍｙｃ遺伝子産生物の蓄積、従って
安定化にとって不可欠のものであった。 従って、ｈｔｐＲ突然変異は形質転換したイー・：＋ｌ
ｌ宿ｉにおけるｃ−ｍｙｃコーディング配列の安定した
表現を可能とするのに必要であった。 実施例５ ｈｔｐＲ−条件突然変異株における酵母ＧＡＬ４遺伝子
産生物（標品蛋白または切断変種）の表現の安定化 Ａ、標品酵母ＧＡＬ４ 蛋白質についてのコーディング
配列を含有する細菌ベクターの組立てその５端部で最初
の３２ｂｐを欠（酵母ＧＡＬ４コーディング領域をプラ
スミドｐＳＪ４から５Ｐｈｌ−Ｈｉｎｄｌｌ（制限エン
ドヌクレアーゼフラグメントとして得た〔ジョンストン
ら（Ｊｏｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌＪ、プロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・γカデミーーオブーサイｆ−
ンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｃｌ、 ＳＣｒ、）へ ＵＳＡ、７９．６９７１〜６９７５（１９８２）８照３
゜５ｐｈＩ切断に先立ち、Ｂ１１ｎｄ １１ 部位をま
ずＤ Ｎ ＡポリメラーゼＩ（クレノー）での処理によ
って平滑木端とした。次いでこのフラグメントをボ１ｊ
アクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、ＲＡＳＩ
発現ベクターの５ｐｈｌおよびＮｒｕ Ｉ部位間に挿入
してｐｃＤ１（１６を得た。、ｐＡＳＩはローゼンベル
グら（Ｒｏｉｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｔ、）、メソツ
ズ◆エンザイモラジ−（Ｆｉ４ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、）、１０１，１２３〜１３８（１９８３）に
記載されている。プラスミドｐｃＤ１（１６をＲａｍ
Ｉ（Ｉで消化し、ひき続いてマング・ビーン（Ｍｕｎｇ
Ｂｅａｎ）エキソヌクレアーゼで処理してｐＡｓｌ
ベクター上に配された開始コードンに直ぐ隣接する平１
’Ａ末端のクローニング部位を得た〔ローゼンベルグら
（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ 、）、前掲参照
〕。次いでプラスミドを５ｐｈＩで再切断し、５ｐｈＩ
部位に対する第２コードンから伸びるＧＡＬ４ の全ア
ミノ末端コーディング配列を再び組立てた合成りＮＡＩ
ンカーを挿入した。 該リンカ−のヌクレオチド配列はＧＡＬ４遺伝子のＤ
Ｎ Ａ配列と幾分具なるようにされていたが、蛋白質の
アミノ酸配列は変化しなかった。イー・コりにおＩｊる
コードンの使用を改良するために〔グｏスジーンら（Ｇ
ｒｏｓｊｅａｎ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（ＧＣｎｅ）
、１１旦、１９９〜２０９（１９８２）参照〕、および
遺伝子（Ｓ＋ｓｃｌ 、 Ｐｖｕｊ）のアミノ末端端部
においてさらに制限部位を産生ずるために７回のヌクレ
オチドの変化を行った。最後の組立体、ｐｃＤ１０７は
１１Ａｓ１ 上に配された翻訳開始コードンと共にフ
レーム中に位置した再組立全長ＧＡＬ４コーディング配
列より成る。 Ｂ、酵母ＧＡＬ４ 欠失突然変異体についてのコーディ
ング配列を含有する細菌ベクターの組立てｐＡｓｌ
ｆｆ３現ベクターはいずれの遺伝子の切断誘導体の組立
ておよび表現も容易に可能ならしめる。該ベクターは：
Ｉボソーム結合部位並びにＡＴＧ開始コードンを供給す
るので、このＡＴＧと共にフレーム中に位置するいずれ
の配列も表現される可能性を有する。この能力を利用し
、て酵母ＧＡＬ４コーディング配列の数個の切断誘導体
を産生じた。 プラスミドｐＣＤ９３はＧＡＬ４の最初の７４個のアミ
ノ酸を除去するアミノ末端欠失を担持している。それは
ＢａｍＨＩおよびＸ ｈ ｏ Ｉでの消化、ひき続いて
のマングービーン（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ）エキソヌク
レアーゼでの処理および再結紮により前記の９口く調製
してｐｃＤ１（１６から得た。この方法はＧＡＬ４ （
Ｄ （ＸｈｏＩ 部位Ｖｃオケル） ７５ 番目ノコ−
トンをｐＡＳｌ上に配された（ Ｂａｍ ０１部位にお
ける）ＡＴＧ開始コードンに正確に融合した。 プラスミドｐｃＤ１１１およびｐｃＤ１４４を所Ｈ己の
９口＜ＰＣＤ１０７から組立てたが、それらは谷々ＧＡ
Ｌ４の４１４番目のコードン（ｐｃＤ］目Ｊまたは３３
４番目のコードン（ｐｃＤ１４４）から蛋白質の端部に
伸びるカルボキシル木端欠失を担持している。ＰＣＤＩ
１１はＳａｔ Ｉでの初期消化によってｐｃＤ１０７
から得た。次いで得られた４塩塙凹部３端部をＤＮＡボ
１１メラーゼ■（クレノー断片）で満たし、該プラスミ
ドを結紮によって再環化した。この方法は満たした５ａ
１１部位におけるＧＡＬ４ 翻訳解読フレームをＧＡＬ
４ の４１４番目のコードン後の数個のトリブレット
のみを未熟に翻訳停止する土１解読フレームまでシフト
した。 ＷｒｕＩおよび５ａ１１ での初期消化、ひき続いての
５ａｊｌ凹部３゛端部を満たすためのＤＮＡ ポリメラ
ーゼＩでの処理および再結紮によって、同様にしてｐｃ
Ｄ１０７からプラスミドｐｃＤ１４４を産生じた。この
方法はＧＡＬ４の（ＮｒｕＩ部位における）３３３番目
のコードンを（満たしたＳａｌ １ 部位における）未
熟に停止する＋１解読フレームに融合し、その結果アミ
ノ酸３３４ないし８８１を欠＜ｃＡｔ、４切断誘導体を
得た。 プラスミドｐＣＤ９８は前記のグロく調製し、ｐＣＤ９
３由来のものであったが、ＧＡＬ４ コーディング配
列のアミノ−並びにカルボキシル−末端欠失を担持する
。このプラスミドから表現された蛋白質はＧ Ａ Ｌ、
４のアミノ酸７５ないし４１３より成る。 ｐｃＤ９８はｐｃＤｌｌｌの組立てについて前記したの
と同一の操作によってｐＣＤ９３から得た。 最後に、プラスミドｐｃＤ１５１およびｐＣＤ１５０は
各々ＧＡＬ４コーディング配列中に内部ｐｃＤ１５１
）もしくはＨｐａ ［（ｐｃＤＩ ５０ ）での制限、
ひき続いてのＸｈｏｆｉ凹部３゛端部を満たすためのＤ
ＮＡポリメラーゼ■での処理および再結紮によって前記
の４口く調製し、ｐｃＤＩ０７から得た。 この操作によりＧＡＬ４コーディング配列から２５６個
のコードン（７５ないし３３４、ｐｃＤＩ ５１ ）ま
たは１４７個のコードン（７５ないし２５９゜ｐｃＤＩ
５０）のフレーム内欠失か生じる。 Ｃ０硯品または明所酵素ＧＡＬ４蛋白質についてのコー
ディング配列を含有する細菌ベクターでのｈｔｐＲ 突
然変異体およびｈｔｐＲ＋珠、の形質転換前記パー）Ａ
およびＩ′Ｓに記載した如く調製したｐＡｓｌ−ＧＡＬ
４組立体をマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａ
ｌ、）（「モｖキュ５− 、りｃｌ ＋７ ＝ ング（
Ｍｏｌ ｅｃｕｌ ａｒＣｌｏｎｉｎｇ ） Ｊ 、コ
ウルド・スプリング−ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｆｌａｒｂｏｒ ）研究所〕Ｄ方法によってＡｌ１
５、Ａ艮６６、Ａｌ１７ （ｈｔｐＲ−突然変異体、＋ ｈｔｐＲ株ＡＲ５５に対して同遺伝子型）、およびＡｌ
１８（ｈｔｐＲ−突然変異体、ｈｔｐＲ＋ＡＲ６６に対
して同遺伝子型〕に導入した。形質転換体をアンピシリ
ン耐性のそれらの表現に基づいて選択した。 Ｄ、誘発ＧＡＬ４産生の分析 前記の如く調製した形質転換体によって含有される発現
ベクターのＰＬプロモーターを温度シフトによって誘発
した。産生された蛋白質をローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ） ［メンッズ・エン
ザイモラジ−（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１０
１゜１２３〜１３８（１９８３））の方法により３５Ｓ
−メチオニンでラベルした。加熱誘発の３０分後、１０
０マイクロキユーリーの３５５−メチオニンで２分間形
質転換体をラベルし５次いで２ｍＭ冷メチオニンおよび
５００μｇ／ｍｌクロラムフエニフールの等容量を加え
た。種々の時間に一部を取り出してローゼンベルグら（
Ｒｏｓｅｎｂｅ＞°ｇ ｅｔ ａｌ、）（前掲）の方
法により５ＤＳ−ボ゛」アクリルアミドゲル電気泳動（
パルス・チェイス実験うの後蛋白質の安定性を評価した
。 ゲルの分析は、全ての形質転換体（ｈｔｐＲ７突然士 変異体およびｈｔｐＲ共に〕が４品もしくは切断ＧＡＬ
４産生物のいずれかを産生じたが、ｈｔｐＲ−条件突然
変異株のみが加熱誘発に際し遺伝子産生物の蓄積を示し
たので、標品もしくは切断の両度生物の表現はｈｔｐＲ
７突然変異株において有意に安定化されたことｂ＜明ら
かになった。 実施例６ ｈｔｐＲ条件突然変異株における突然変異体ｃ［ｌコー
ディング配列の表現の安定化 バタテリオファージλのＣ［蛋白・貫は転写の陽性調節
蛋白質である。 ｃ［ｌ遺伝子、および全ｃｌｌ構造遺伝子の異なる領域
を網羅するｃｌｌ蛋白質の３０以上の点突然変異ヲクロ
ーンしてｐＫＣ３０に入れ、加熱誘発によって形質転換
して遺伝子表現についての溶原菌に入れた。 Ａ、 ＣＩ突然変異体コーディング配列の産生ウルツ
ら（Ｗｕｌｆｆ ｅｔ ａｌす〔プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・すイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ） Ｕ
Ｓ Ａ。 ８１．５５５〜５５９（１９８４）］の方法により用い
た全てのＣＩ突然変異体コーディング配列を産生しかつ
配列した。調べた全てのｃ［ｌ突然変異体はｃ［蛋白質
の構造遺伝子における塩基対置換によってひき起こされ
た１つの点突然変異（すなわち、単一のアミノ酸配列の
変化〕を有していた。 野生型ｃｌｌ蛋白質および突然変異体Ｃ口上白質をホら
（ｎｏ ｅｔ ａｌ、） （ジャーナル・オブφバイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、 ） 。 ２６７（１５）、９１２８〜（Ｊ］３４（１９８２）］
の方法により精製した。 Ｂ、ｃ［コーディング配列または突然変異体コーディン
グ配列を含有する発現ベクターの組立てシマタケら（Ｓ
ｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ、） （ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ ）、２９２（５８１９）、１２８〜１３２
（１９８１）〕の方法によりＣＩココ−ィング配列をク
ローンして発現ベクター、ｐＫｃ３０に入れた。０蛋白
質コーディング配列１ＤＮＡクローニングフテグメント
から排して精製手順を容易にした以外は基本的にはシマ
タケら（Ｓｈｉｍａｃａｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）（前
掲）の方法によりバートＡに記載した如く調製した３０
突然変異したｃ［コーディング配列をクローンしてｐＫ
ｃ３０に入れた。 Ｃ，ｈｔｐＲ＋およびｈｔｐＲ絽胞秩の形質転換？ ＝
了テイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 ）
［ｒモレキュラー・クロウニング、ア・ラボラトリイ
、 ７ ： ニア／Ｉ／ （Ｍｏｌ ｅｃｕｌ ａｒ
Ｃ１ｏｎ ｉｎｇ 、 Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ ） Ｊ、コウルド・スプリング・ハーバ−
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ）研究所
（１９８２）〕の方法により、パー）Ｂに記載した如く
調製した発現ベクターを形質転換してＡｌ６７（ｈ’Ｐ
Ｒ−突然変異体）およびｕｃ６８２２ （ｈｔｐＲ＋）
に入れた。マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、）（ｉ＠掲）ＣＤ７ｄＥ４Ｃヨに入れた。 Ｄ、誘発蛋白質の分析 バートＣに記載した如く調製したｃ［ｌ蛋白質または形
質転換体によって表現された突然変異したＣ［［蛋白質
を、４２℃でつ誘発後、ローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ） ［） ７７ズーエンザ
イモラジー（Ｍｅｔｈｏａｓ Ｅｎｚｙｍｏ！ 、）
、１０１．１２３〜１３８（１９８３，）］ ７）３５
Ｓ−Ｌ−メチオニンパルス−チェイス法によって調べた
。野生型ｃｌＪ蛋白質はＡｌ１７ （ｈｔｐＲ突然変異
体）、Ａ艮６５（ｈｔｐＲ７’）およびＵＣ５８２２（
ｈｔｐＲ＋）において同一レベ２．の安定性で表現され
た。突然変異したｃｌｌ蛋白質（讃生型ｃｌｌ蛋白質の
場合のようには［Ｊ Ｃ５８２２（ｈｔｐＲ”）におい
て安定に表現されなかった。Ｕ’Ｃ’５８２２における
ほとんどのｃ［突然変異体蛋白質の半減期は、野生型ｃ
ｌｌ蛋白・質の場合２０分であるのに対し、３〜５分で
あった。突然変異体ｃｌｌ蛋白質のうちにＣ工ＵＣ５８
２２におし・てく］分の半減期を有＋ するものがあった。用いた池のｈｔｐＲ細胞系、すなわ
ちＡｌ５５、Ａ Ｒ５８、ＡＲ】３およびＮ５１５】は
いずれも半減期または突然変異体ｃ［蛋白質の純蛋白質
蓄積にお−いて有異に異なる結果を与えなかった。全て
の突然変異体ｃ［蛋白質の安定性は： Ａｌ１７ （”
ｈ！ＰＲ−突然変異体、ｈｔｐＲ”株ＡＲ６５に対して
同遺伝子型）において有意に促進された。 すなわち野生５ｃｎ蛋白質と同一レベルの安定性まで上
昇された。例えば、非常に不安定な突然変異体Ｃ口上白
質、ＣＨｌ ３０８５の半減期はへ＆６５十 を包含するｈｔｐＲ細胞系における０、５分からその同
型遺伝子ＡＲ６７（ｈｔｐＲ−突然変異体）における〜
２０分まで延長された。 特肝出願人 スミスクラ４ン・ベックマン・コーポレイ
ション
のｐＦＮ９２およびｈｔｐＲ一対立遺伝子間の組換えの
結果によるｈｔｐＲ突然変異株（ＣＡＧ５１０７）由来
のものであった。ｐＦＮ９２でのＣＡＧ５１１０の形質
転換はＮｅ１ｄｈａｒｄｔ Ｉの方法によるその選択に
先立って行った。 Ａ、熱シヨツク応答の回復 株ＣＡＧ５１Ｃ＋７およびＣＡＧ５］１０を３０℃にて
、あるいは４２’Ｃへのシフトの５分後に３５５メチオ
ニンで２分間パルス標識し、次いで非放射性メチオニン
で１分間追跡した。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上
のＮＫ分解によって試料を熱シヨツク応答について分析
した。非組換体株（ＣＡＧ５１０７）におまるわずかな
熱シヨツク応答はｈｔｐＲ突然変異株、ＣＡＧ４５６に
おける熱シヨツク応答および他の研究者によってｈｔｐ
Ｒ−株から観察された熱シヨツク応答〔ヤマモリら（Ｙ
ａｍａｍｏｒｉ ｅＬ ａｌ、 ）、ピーエヌエイエス
（ＰＮＡ Ｓ ）、７９，８６０〜８６４（１９８２）
、およびティリーら（Ｔｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ、）、セ
ル（Ｃｅｌｌ）、３４，６４１〜６４６（１９８３）参
照〕と区別がつかなかった。組換体法（ＣＡＧ５１１０
）十 における熱シヨツク応答はｈｔｐＲ株ＳＣＩ ２２
における熱シヨツク応答と区別がつかなかった。 Ｂ、突然変異体β−ガラクトシダーゼ（Ｉ ａｃＺ Ｘ
９０ポリペプチド）の分解 ３０℃にてＭ９グリセロール培地中で指数的に増殖する
株ＣＡＧ５１０７およびＣＡＧ５１１０をＩＰＴＧで誘
発し、誘発の１０分後４２℃までシフトした。４２℃へ
のシフトの２０分後、 Ｓメチオニンで細胞を１．５
分間ラベルし、過剰の非放射性メチオニンで追跡し、定
期的にサンプリングを行った。β＋β°サブユニットの
フラクションとしてのβ−ガラクトシダーゼの含有はに
ついて一次元ゲル上で試料を分析した。初期時間（Ｌ＝
０）をチェイスの添加２分後にとったが、β−ガラクト
シダーゼにおいて５０００ ｄｐｍを示す。ｈｔｐＲ＋ 突然変異株はｈｔｐＲ株（Ｔ ］／２ ＝ ７分）より
もかなりゆっくりと（Ｔｌ／２＞６（３分）ＩａｃＺＸ
９０逍伝子産生物を分解した。 Ｃ，５ｕｐＦサプレツサー（Ｓｕ［ＩＩ）を有するおよ
び有さないｈｔｐＲ株における（ｒＰＯＤ８００ シ
グマ対立遺伝子によってコード付けされた）突然変異体
シグマの分解 ｓｕｐＣｔｓサプレッサーはｈｔｐＲ］６５突然変異の
効果的でないサプレッサーである。かくして、４２℃に
おいてかかるｈｔｐＲ突然変異体細胞において観察され
る蛋白分解における欠榎は４２℃における熱シヨツク応
答またはｈｔｐＲ合成のいずれかの欠損よりもむしろ３
０℃において合成されるｈｔｐＲ産生物のより低量によ
るものであり得る。前者の場合、ｈ、ｔｐＲ−突然変異
体細胞によって示される蛋白分解における欠１は３０℃
並びに４２℃で起こ＋ るはずである。同遺伝子型ｈｔｐＲおよびｈｔｐＲ突然
変異体細胞におけるｒｐｏＤ８００ でコード付けし
たシグマサブユニットの分解速度−ｐ３０℃で比較した
。と言うのは、ｒｐｏＤ８００ でコード付けしたシ
グマサブユニットは低温においてさえ野生型細胞におい
て分解されるからである。４２℃で蛋白分解を行うｈＬ
ｐＲ１５５条件突然変異体細胞の能力を回復する有効な
５ｕｐＦ（Ｓｕ［）サプレッサーの能力も調べた。 突然変異体シグマの分解を３種の株：株ＣＡＧ５ ］
０ （ｈｔｐＲｘ、ｒｐｏＤ８００ ）、株ＣＡＧ４８
３（ｈｔｐＲ］６５突然変異体、ｇ Ｑ ｐｓｕ［ｌ、
ｒｐｏＤ８００人および株ＣＡＧ４８２ （ｈｔｐＲｘ
６５突然変異体、８０、ｒｐｏＤ８００）において測
定した。ＣＡＧ４８２は、８０における遺伝子がｈｔｐ
Ｒ突然変異体ｔｆｆＩ胞の蛋白分解表現型に影響しない
ことを証明するための対照である。３０℃で指数的に増
殖する細胞Ｂｓ−メチオニンで１０分間ラベルした。過
剰（ＩＭｌ／ ｍｌ ）の非放射性メチオニンの添加後
、培養物を４２℃−＼シフトするかまたは３０℃のまま
にしておき、定期的にサンプリングを行った。 ｒｐｏＤ８００でコード付けしたシグマの含有場につい
て試料を分析した。初期時間（ｔ＝０）をチェイスの添
加２分後にとったが、シグマにおいて５０００〜１００
００ ｄｐｍの範囲内である。 ３０℃において、ｒｐｏＤ８Ｑｏでコード付はしこ＋ 突然変異体シグマ蛋白質はｈｔｐＲ株におけるよりもｈ
ｔｐＲ−突然変異株における方がゆっくりと分解された
。より効果的な５ｕｐＦ（Ｓｕ １ＩＩ）サプレッサー
が存在すると３０″Ｃにおける急速な分解は回復した。 ｓｕｐ Ｆ （Ｓｕ ＩＵ サプレッサーは熱シヨツク
蛋白質の合成を行う能力を回復すると共に４２℃におい
て蛋白分解を行うｈｔｐＲ１６５条件突然変異体細胞の
能力を回復することも明確にされた。かくして、サプレ
ッションのレベルを上げることは正常な熱シヨツク応答
と蛋白分解を同時に回復した。 これらの実談は、ｈｔｐＲγンバー突然変異（すなわち
ｈｔｐＲ１６５）が静士期増殖条件下の低温において並
びに高温へのシフト後の双方において蛋白分解欠１をひ
き起こすのに十分であることを示す。 実施例４ ｈｔｐＲ−株におけるヒトｃ−ｍｙｃの２つの異なる形
態の表現の安定化 Ａ、細１株およびプラスミド 発現ベクターの組立てで用いた宿主はイー・コ＋Ｊ Ｍ
Ｍ２９４ （λｃｌ”）であった。蛋白質表現の研究に
はイー・コリＩＡＲ６８を利用した。プラスミドベクタ
ー、ｐｏＴｓは発現ベクターｐ ＡＳ １の誘導体テア
リ、テハレら（Ｄｅｖａｒｅ ｅｔ ａｌ、） ［セ
ル（Ｃｅｌｌ）、１亙、４３〜４９（１９８４）］によ
って記載されている。 全ての標準的な分子クローニング法（例えば、制限消化
、結紮、形質転換など）は特に断らない限りマニアテイ
スら（Ｎｉａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｔ、） ［「モレ
キュラー・タロウニング、ア・ラボラトリ−・マニュＴ
ル（ｋｉｌｌ）Ｉｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ａ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙｋｌａｎｕａｌ、） Ｊ、
コウルド・スプリング・バーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ）研究所（１８９２）］
、７）方法によって行った。 Ｂ、 ｐＯＴｓ−ｍｙｃ、 ｃ−ｍｙｃ表現プラス
ミドの組立て ｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子の蛋白質コーディング配列はヒト
防白血病細胞系に５６２ から４製されたｃＤＮＡ
ライブラリーから単ｉされ、ワットら（Ｗａｔｔ ｅｔ
ａｌ、 ） ［ピーエヌエイエス（ＰＮＡＳ）、８０
．６３０７〜６３１１ （１９８３）］の方法により調
製すれｆ、−ｃＤＮＡりｏ −ン（ｐＭＹ ＣＩａＣ）
から得た。ｃ−ｍｙｃコーディング配列の５°端部はア
ガロースゲル電気泳動により４７〇−塩基対ＴｈａＩ制
限フ制限フラグメン車上し、次いで結紮して、ＤＮＡポ
リメラーゼ■のクレノー断片を用いＢａｍ１１１で消化
し平滑末端としたｐＯＴｓベクター中に入れた。このプ
ラスミド組立体をＰｖｕ口で部分的に消化し、ひき続い
てＸｂａＩで消化し、クレノーＩ’ｏｌ［で末端を満た
した。Ｔｈａ［フラグメント内のＰｖｕ［部位のみの消
化によって直線化されたプラスミド組立体をアガロース
ゲル電気泳動によって単環した。ｃ−ｍｙｃコーディン
グ配列の３端部を１１００−塩基対Ｐｖｕ［／Ｂｃ Ｉ
［７５グメント上で単離し、結紮して前記の部分的に
消化した組立体中に入れた。かく産生されたｐＯＴＳ
−ｍｙｃ表現プラスミドはｐＯＴｓベクター上に配され
た翻訳開始コードンとインフレーム融合した全ｃ −ｍ
ｙ ｃコーディング領域を含有する。得られた組立体は
ｃ−ｍｙｃコーディング配列の５端部上にさらに４個の
コードンを含有する。 Ｃ１誘発粗菌蛋白質の分析 マニアナイスら（〜１ａｒ＋１ａｔｉｓ ｅｔ ａｌ
、 ） （前掲）の方法によりｐＯＴ Ｓ −ｍｙｃま
たはｐＯＴｓ で形質転換したイー・コリ株ＡＲ６８、
ｈｔｐＲ突然変異体における蛋白質の合成速度をローゼ
ンベルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｃ ａｌ、）
〔ｙｒ ”／ ツズーエンザイモラジ−（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ）、上回１．１２３〜１３８
（１９８３）：）の方法によるパルス標識法によって４
２℃における誘発の前後で調べた。細胞の２００リット
ル分を１０Ｃｉ の〔３５Ｓ〕メチオニン（１２２１
Ｃｉ／ｒｒｍｏｌ ； ＝ニー・イングランド・ヌクＬ
／７ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
）で熱誘発の後何回もパルス標識を３分間行った。パ
ルス標識の後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）−３５％２−メルカプトエタノール３０μｍ を加え
、試料を９５℃で１分間加熱°し、ひき続いてドライア
イス−エタノール浴中で急速に冷凍し、トリクロロ酢酸
（最終濃度、１０％）で沈殿させた。 沈殿物を冷エタノールで２回洗浄し、試料緩衝液中に懸
濁し、９５℃で５分間加熱し、１０％ポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動に付した。最後に該ゲルを乾燥し、
螢光写真をとった。試料は細胞数およびゲル上に負荷さ
れたカウント数のいずれについても正規化しなかった。 該ゲルの分析結果は、新しい６４０００ダルトンの蛋白
質（すなわちｃ−ｍｙｃ）の合成がｐＯＴＳ−ｍｙｃ
で形質転換した細胞中で誘発されたが親ベクターｐＯ
ＴＳで形質転換した細胞中では検出されなかったことを
示した。３分のパルス期内に蛋白質中に一体化された［
３５ｓ ］メチオニンのがなりの割合かｃ−ｍｙｃ遺
伝子産生物中に出現するのでこの（３４０００ダルトン
の蛋白質は高速で表現された。この蛋白質が細菌中で高
レベルで蓄積され得るか否かＰ調べるために細胞を１２
０分まで誘余し、異なる時間（ｌこ採取した分を５ＤＳ
−ゲル電気泳動によってｃ−ｍｙｃ産生について調査し
た。ゲルのコーマシーブルー染色は、誘発産生物が２時
間で全イー・コリ蛋白質の１０％を超えて蓄積したこと
を示した。 ＡＲ６８形質転換体によって産生きれた６４０００ダル
トンの蛋白ｆｔｌニスバックマンら（Ｓｐａｃｋｍａｎ
ｅ ｔａｌ、）〔アナリテイカル・ケミストリー（Ａ
ｎａｌ。 Ｃｈｅｍ、 ）、３０．１３９０〜１２（１６（１９５
８，１）およびヘライックら（Ｈｅｗｉｃｋ ｅｔ
ａｌＪ ［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
ト＋１（Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５６．７９９０〜７９９７
（ｊ９８１）〕の方法によるアミノ酸分析および配列決
定によってｃ−ｍｙｃ蛋白質であると確認された。 ＋ Ｄ、 ｈｔｐＲ株（ＣよるＣ−ｎ１５’Ｃの表現＋ 前記の如く３種のｈｔｐＲ株 （すなわちＮ５１５１、
ＡＲ６６およびＡＲ５８）をｐＯＴｓ−ｍｙｃベクター
で形質転換した。パルス標識したイー・コリ抽出物の５
ＤＳ−ゲル電気泳動によって示されたＱ口く、全ての株
はｐＯＴ Ｓ −ｍ ｙ ｃベクターで順調に形質＋ 転換されたが、ｈｔｐＲ形質転換体はｃ−ｍｙｃ産生物
を安定に表現できなかった。と言うのは、該産生物はゲ
ルのコーマシーブルー染色によって検出できなかったか
らである。ｃ−ｍｙｃはＡＲ６８（ｈＬｐＲ−突然変異
体〕において安定に表現されたかその同型遺伝子、 Ａ
Ｒ６６（ｈｃｐＲ）においては安定に表現されなかった
ので、ＡＲ５８中に存在するｂｔｐＲ−突然変異はイー
・コリにおけるｃ−ｍｙｃ遺伝子産生物の蓄積、従って
安定化にとって不可欠のものであった。 従って、ｈｔｐＲ突然変異は形質転換したイー・：＋ｌ
ｌ宿ｉにおけるｃ−ｍｙｃコーディング配列の安定した
表現を可能とするのに必要であった。 実施例５ ｈｔｐＲ−条件突然変異株における酵母ＧＡＬ４遺伝子
産生物（標品蛋白または切断変種）の表現の安定化 Ａ、標品酵母ＧＡＬ４ 蛋白質についてのコーディング
配列を含有する細菌ベクターの組立てその５端部で最初
の３２ｂｐを欠（酵母ＧＡＬ４コーディング領域をプラ
スミドｐＳＪ４から５Ｐｈｌ−Ｈｉｎｄｌｌ（制限エン
ドヌクレアーゼフラグメントとして得た〔ジョンストン
ら（Ｊｏｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌＪ、プロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・γカデミーーオブーサイｆ−
ンシズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｃｌ、 ＳＣｒ、）へ ＵＳＡ、７９．６９７１〜６９７５（１９８２）８照３
゜５ｐｈＩ切断に先立ち、Ｂ１１ｎｄ １１ 部位をま
ずＤ Ｎ ＡポリメラーゼＩ（クレノー）での処理によ
って平滑木端とした。次いでこのフラグメントをボ１ｊ
アクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、ＲＡＳＩ
発現ベクターの５ｐｈｌおよびＮｒｕ Ｉ部位間に挿入
してｐｃＤ１（１６を得た。、ｐＡＳＩはローゼンベル
グら（Ｒｏｉｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｔ、）、メソツ
ズ◆エンザイモラジ−（Ｆｉ４ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、）、１０１，１２３〜１３８（１９８３）に
記載されている。プラスミドｐｃＤ１（１６をＲａｍ
Ｉ（Ｉで消化し、ひき続いてマング・ビーン（Ｍｕｎｇ
Ｂｅａｎ）エキソヌクレアーゼで処理してｐＡｓｌ
ベクター上に配された開始コードンに直ぐ隣接する平１
’Ａ末端のクローニング部位を得た〔ローゼンベルグら
（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ 、）、前掲参照
〕。次いでプラスミドを５ｐｈＩで再切断し、５ｐｈＩ
部位に対する第２コードンから伸びるＧＡＬ４ の全ア
ミノ末端コーディング配列を再び組立てた合成りＮＡＩ
ンカーを挿入した。 該リンカ−のヌクレオチド配列はＧＡＬ４遺伝子のＤ
Ｎ Ａ配列と幾分具なるようにされていたが、蛋白質の
アミノ酸配列は変化しなかった。イー・コりにおＩｊる
コードンの使用を改良するために〔グｏスジーンら（Ｇ
ｒｏｓｊｅａｎ ｅｔ ａｌ、）、ジーン（ＧＣｎｅ）
、１１旦、１９９〜２０９（１９８２）参照〕、および
遺伝子（Ｓ＋ｓｃｌ 、 Ｐｖｕｊ）のアミノ末端端部
においてさらに制限部位を産生ずるために７回のヌクレ
オチドの変化を行った。最後の組立体、ｐｃＤ１０７は
１１Ａｓ１ 上に配された翻訳開始コードンと共にフ
レーム中に位置した再組立全長ＧＡＬ４コーディング配
列より成る。 Ｂ、酵母ＧＡＬ４ 欠失突然変異体についてのコーディ
ング配列を含有する細菌ベクターの組立てｐＡｓｌ
ｆｆ３現ベクターはいずれの遺伝子の切断誘導体の組立
ておよび表現も容易に可能ならしめる。該ベクターは：
Ｉボソーム結合部位並びにＡＴＧ開始コードンを供給す
るので、このＡＴＧと共にフレーム中に位置するいずれ
の配列も表現される可能性を有する。この能力を利用し
、て酵母ＧＡＬ４コーディング配列の数個の切断誘導体
を産生じた。 プラスミドｐＣＤ９３はＧＡＬ４の最初の７４個のアミ
ノ酸を除去するアミノ末端欠失を担持している。それは
ＢａｍＨＩおよびＸ ｈ ｏ Ｉでの消化、ひき続いて
のマングービーン（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ）エキソヌク
レアーゼでの処理および再結紮により前記の９口く調製
してｐｃＤ１（１６から得た。この方法はＧＡＬ４ （
Ｄ （ＸｈｏＩ 部位Ｖｃオケル） ７５ 番目ノコ−
トンをｐＡＳｌ上に配された（ Ｂａｍ ０１部位にお
ける）ＡＴＧ開始コードンに正確に融合した。 プラスミドｐｃＤ１１１およびｐｃＤ１４４を所Ｈ己の
９口＜ＰＣＤ１０７から組立てたが、それらは谷々ＧＡ
Ｌ４の４１４番目のコードン（ｐｃＤ］目Ｊまたは３３
４番目のコードン（ｐｃＤ１４４）から蛋白質の端部に
伸びるカルボキシル木端欠失を担持している。ＰＣＤＩ
１１はＳａｔ Ｉでの初期消化によってｐｃＤ１０７
から得た。次いで得られた４塩塙凹部３端部をＤＮＡボ
１１メラーゼ■（クレノー断片）で満たし、該プラスミ
ドを結紮によって再環化した。この方法は満たした５ａ
１１部位におけるＧＡＬ４ 翻訳解読フレームをＧＡＬ
４ の４１４番目のコードン後の数個のトリブレット
のみを未熟に翻訳停止する土１解読フレームまでシフト
した。 ＷｒｕＩおよび５ａ１１ での初期消化、ひき続いての
５ａｊｌ凹部３゛端部を満たすためのＤＮＡ ポリメラ
ーゼＩでの処理および再結紮によって、同様にしてｐｃ
Ｄ１０７からプラスミドｐｃＤ１４４を産生じた。この
方法はＧＡＬ４の（ＮｒｕＩ部位における）３３３番目
のコードンを（満たしたＳａｌ １ 部位における）未
熟に停止する＋１解読フレームに融合し、その結果アミ
ノ酸３３４ないし８８１を欠＜ｃＡｔ、４切断誘導体を
得た。 プラスミドｐＣＤ９８は前記のグロく調製し、ｐＣＤ９
３由来のものであったが、ＧＡＬ４ コーディング配
列のアミノ−並びにカルボキシル−末端欠失を担持する
。このプラスミドから表現された蛋白質はＧ Ａ Ｌ、
４のアミノ酸７５ないし４１３より成る。 ｐｃＤ９８はｐｃＤｌｌｌの組立てについて前記したの
と同一の操作によってｐＣＤ９３から得た。 最後に、プラスミドｐｃＤ１５１およびｐＣＤ１５０は
各々ＧＡＬ４コーディング配列中に内部ｐｃＤ１５１
）もしくはＨｐａ ［（ｐｃＤＩ ５０ ）での制限、
ひき続いてのＸｈｏｆｉ凹部３゛端部を満たすためのＤ
ＮＡポリメラーゼ■での処理および再結紮によって前記
の４口く調製し、ｐｃＤＩ０７から得た。 この操作によりＧＡＬ４コーディング配列から２５６個
のコードン（７５ないし３３４、ｐｃＤＩ ５１ ）ま
たは１４７個のコードン（７５ないし２５９゜ｐｃＤＩ
５０）のフレーム内欠失か生じる。 Ｃ０硯品または明所酵素ＧＡＬ４蛋白質についてのコー
ディング配列を含有する細菌ベクターでのｈｔｐＲ 突
然変異体およびｈｔｐＲ＋珠、の形質転換前記パー）Ａ
およびＩ′Ｓに記載した如く調製したｐＡｓｌ−ＧＡＬ
４組立体をマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａ
ｌ、）（「モｖキュ５− 、りｃｌ ＋７ ＝ ング（
Ｍｏｌ ｅｃｕｌ ａｒＣｌｏｎｉｎｇ ） Ｊ 、コ
ウルド・スプリング−ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｆｌａｒｂｏｒ ）研究所〕Ｄ方法によってＡｌ１
５、Ａ艮６６、Ａｌ１７ （ｈｔｐＲ−突然変異体、＋ ｈｔｐＲ株ＡＲ５５に対して同遺伝子型）、およびＡｌ
１８（ｈｔｐＲ−突然変異体、ｈｔｐＲ＋ＡＲ６６に対
して同遺伝子型〕に導入した。形質転換体をアンピシリ
ン耐性のそれらの表現に基づいて選択した。 Ｄ、誘発ＧＡＬ４産生の分析 前記の如く調製した形質転換体によって含有される発現
ベクターのＰＬプロモーターを温度シフトによって誘発
した。産生された蛋白質をローゼンヘルグら（Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ） ［メンッズ・エン
ザイモラジ−（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１０
１゜１２３〜１３８（１９８３））の方法により３５Ｓ
−メチオニンでラベルした。加熱誘発の３０分後、１０
０マイクロキユーリーの３５５−メチオニンで２分間形
質転換体をラベルし５次いで２ｍＭ冷メチオニンおよび
５００μｇ／ｍｌクロラムフエニフールの等容量を加え
た。種々の時間に一部を取り出してローゼンベルグら（
Ｒｏｓｅｎｂｅ＞°ｇ ｅｔ ａｌ、）（前掲）の方
法により５ＤＳ−ボ゛」アクリルアミドゲル電気泳動（
パルス・チェイス実験うの後蛋白質の安定性を評価した
。 ゲルの分析は、全ての形質転換体（ｈｔｐＲ７突然士 変異体およびｈｔｐＲ共に〕が４品もしくは切断ＧＡＬ
４産生物のいずれかを産生じたが、ｈｔｐＲ−条件突然
変異株のみが加熱誘発に際し遺伝子産生物の蓄積を示し
たので、標品もしくは切断の両度生物の表現はｈｔｐＲ
７突然変異株において有意に安定化されたことｂ＜明ら
かになった。 実施例６ ｈｔｐＲ条件突然変異株における突然変異体ｃ［ｌコー
ディング配列の表現の安定化 バタテリオファージλのＣ［蛋白・貫は転写の陽性調節
蛋白質である。 ｃ［ｌ遺伝子、および全ｃｌｌ構造遺伝子の異なる領域
を網羅するｃｌｌ蛋白質の３０以上の点突然変異ヲクロ
ーンしてｐＫＣ３０に入れ、加熱誘発によって形質転換
して遺伝子表現についての溶原菌に入れた。 Ａ、 ＣＩ突然変異体コーディング配列の産生ウルツ
ら（Ｗｕｌｆｆ ｅｔ ａｌす〔プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・すイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ） Ｕ
Ｓ Ａ。 ８１．５５５〜５５９（１９８４）］の方法により用い
た全てのＣＩ突然変異体コーディング配列を産生しかつ
配列した。調べた全てのｃ［ｌ突然変異体はｃ［蛋白質
の構造遺伝子における塩基対置換によってひき起こされ
た１つの点突然変異（すなわち、単一のアミノ酸配列の
変化〕を有していた。 野生型ｃｌｌ蛋白質および突然変異体Ｃ口上白質をホら
（ｎｏ ｅｔ ａｌ、） （ジャーナル・オブφバイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、 ） 。 ２６７（１５）、９１２８〜（Ｊ］３４（１９８２）］
の方法により精製した。 Ｂ、ｃ［コーディング配列または突然変異体コーディン
グ配列を含有する発現ベクターの組立てシマタケら（Ｓ
ｈｉｍａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ、） （ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ ）、２９２（５８１９）、１２８〜１３２
（１９８１）〕の方法によりＣＩココ−ィング配列をク
ローンして発現ベクター、ｐＫｃ３０に入れた。０蛋白
質コーディング配列１ＤＮＡクローニングフテグメント
から排して精製手順を容易にした以外は基本的にはシマ
タケら（Ｓｈｉｍａｃａｋｅ ｅｔ ａｌ、 ）（前
掲）の方法によりバートＡに記載した如く調製した３０
突然変異したｃ［コーディング配列をクローンしてｐＫ
ｃ３０に入れた。 Ｃ，ｈｔｐＲ＋およびｈｔｐＲ絽胞秩の形質転換？ ＝
了テイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 ）
［ｒモレキュラー・クロウニング、ア・ラボラトリイ
、 ７ ： ニア／Ｉ／ （Ｍｏｌ ｅｃｕｌ ａｒ
Ｃ１ｏｎ ｉｎｇ 、 Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ ） Ｊ、コウルド・スプリング・ハーバ−
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ）研究所
（１９８２）〕の方法により、パー）Ｂに記載した如く
調製した発現ベクターを形質転換してＡｌ６７（ｈ’Ｐ
Ｒ−突然変異体）およびｕｃ６８２２ （ｈｔｐＲ＋）
に入れた。マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、）（ｉ＠掲）ＣＤ７ｄＥ４Ｃヨに入れた。 Ｄ、誘発蛋白質の分析 バートＣに記載した如く調製したｃ［ｌ蛋白質または形
質転換体によって表現された突然変異したＣ［［蛋白質
を、４２℃でつ誘発後、ローゼンベルグら（Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、 ） ［） ７７ズーエンザ
イモラジー（Ｍｅｔｈｏａｓ Ｅｎｚｙｍｏ！ 、）
、１０１．１２３〜１３８（１９８３，）］ ７）３５
Ｓ−Ｌ−メチオニンパルス−チェイス法によって調べた
。野生型ｃｌＪ蛋白質はＡｌ１７ （ｈｔｐＲ突然変異
体）、Ａ艮６５（ｈｔｐＲ７’）およびＵＣ５８２２（
ｈｔｐＲ＋）において同一レベ２．の安定性で表現され
た。突然変異したｃｌｌ蛋白質（讃生型ｃｌｌ蛋白質の
場合のようには［Ｊ Ｃ５８２２（ｈｔｐＲ”）におい
て安定に表現されなかった。Ｕ’Ｃ’５８２２における
ほとんどのｃ［突然変異体蛋白質の半減期は、野生型ｃ
ｌｌ蛋白・質の場合２０分であるのに対し、３〜５分で
あった。突然変異体ｃｌｌ蛋白質のうちにＣ工ＵＣ５８
２２におし・てく］分の半減期を有＋ するものがあった。用いた池のｈｔｐＲ細胞系、すなわ
ちＡｌ５５、Ａ Ｒ５８、ＡＲ】３およびＮ５１５】は
いずれも半減期または突然変異体ｃ［蛋白質の純蛋白質
蓄積にお−いて有異に異なる結果を与えなかった。全て
の突然変異体ｃ［蛋白質の安定性は： Ａｌ１７ （”
ｈ！ＰＲ−突然変異体、ｈｔｐＲ”株ＡＲ６５に対して
同遺伝子型）において有意に促進された。 すなわち野生５ｃｎ蛋白質と同一レベルの安定性まで上
昇された。例えば、非常に不安定な突然変異体Ｃ口上白
質、ＣＨｌ ３０８５の半減期はへ＆６５十 を包含するｈｔｐＲ細胞系における０、５分からその同
型遺伝子ＡＲ６７（ｈｔｐＲ−突然変異体）における〜
２０分まで延長された。 特肝出願人 スミスクラ４ン・ベックマン・コーポレイ
ション
Claims (22)
- （１）（ａ）表現制御配列に作動的に連結したポリペプ
チドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子で宿主イー
・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｈｔｐＲ＾−突然変異体細胞を
形質転換し、次いで（ｂ）該コーディング配列が表現さ
れるような条件下で該形質転換した宿主を適当な培地中
で培養することを特徴とするｈｔｐＲ＾＋遺伝子の制御
下でプロテアーゼによる分解のためイー・コリｈｔｐＲ
＾＋株において安定に表現されない外来ポリペプチドコ
ーディング配列を安定に表現する方法。 - （２）該宿主ｈｔｐＲ＾−細胞がｓｕｐＣ＾ｔ＾ｓ遺伝
子も有するｈｔｐＲ１６５株；またはｒｐｏＤ８００遺
伝子も有するｈｔｐＲ１０７株、ｈｔｐＲ１１１株、ｈ
ｔｐＲ１１２株またはｈｔｐＲ１１３株である前記第（
１）項の方法。 - （３）該宿主ｈｔｐＲ＾−突然変異体細胞がＫｌ６５、
ＣＡＧ４５６、ＣＡＧ４８１、ＣＡＧ４８２、ＣＡＧ４
８３、ＣＡＧ６０４、ＡＲ６７またはＡＲ６８である前
記第（２）項の方法。 - （４）該表現制御配列がＰ＿Ｌプロモーターである前記
第（１）項の方法。 - （５）該ＤＮＡ分子がｐＡＳ１またはｐＫＣ３０の如き
Ｐ＿Ｌベクターから由来する前記第（１）項の方法。 - （６）表現制御配列に作動的に連結した外来ポリペプチ
ドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子で形質転換し
た宿主イー・コリｈｔｐＲ＾−突然変異体細胞。 - （７）ｓｕｐＣ＾ｔ＾ｓ遺伝子も有するｈｔｐＲ１６５
株である前記第（６）項の宿主。 - （８）該ｈｔｐＲ１６５株がＫｌ６５、ＣＡＧ４５６、
ＣＡＧ４８１、ＣＡＧ４８２、ＣＡＧ４８３、ＣＡＧ６
０４、ＡＲ６７またはＡＲ６８である前記第（７）項の
宿主。 - （９）ｒｐｏＤ８００遺伝子も有するｈｔｐＲ１０７株
、ｈｔｐＲ１１１株、ｈｔｐＲ１１２株またはｈｔｐＲ
１１３株である前記第（６）項の宿主。 - （１０）該ＤＮＡ分子がｐＡＳ１またはｐＫＣ３０の如
きＰ＿Ｌベクターから由来する前記第（６）項の宿主。 - （１１）該表現制御配列がＰ＿Ｌプロモーターである前
記第（６）項の宿主。 - （１２）（ａ）表現制御配列に作動的に連結したポリペ
プチドコーディング配列を含有するＤＮＡ分子で宿主イ
ー・コリｈｔｐＲ＾＋細胞を形質転換し、（ｂ）該形質
転換したｈｔｐＲ＾＋細胞の表現型をｈｔｐＲ＾−突然
変異体に変化させ、次いで（ｃ）該コーディング配列が
表現されるような条件下で該形質転換したｈｔｐＲ＾−
突然変異体を適当な培地中で培養することを特徴とする
ｈｔｐＲ＾＋遺伝子の制御下でプロテアーゼによる分解
のためイー・コリｈｔｐＲ＾＋株において安定に表現さ
れない外来ポリペプチドコーディング配列を安定に表現
する方法。 - （１３）該ｈｔｐＲ＾＋細胞の表現型をｒｐｏＤ８００
遺伝子も有するｈｔｐＲ１６５株、ｈｔｐＲ１１１株、
ｈｔｐＲ１１２株またはｈｔｐＲ１１３株に変化させる
前記第（１２）項の方法。 - （１４）該ｈｔｐＲ１６５株がＫｌ６５、ＣＡＧ４５６
、ＣＡＧ４８１、ＣＡＧ４８２、ＣＡＧ４８３、ＣＡＧ
６０４、ＡＲ６７またはＡＲ６８である前記第（１３）
項の方法。 - （１５）該表現制御配列がＰ＿Ｌプロモーターである前
記第（１２）項の方法。 - （１６）該ＤＮＡ分子がｐＡＳ１またはｐＫＣ３０の如
きＰ＿Ｌベクターから由来する前記第（１２）項の方法
。 - （１７）宿主イー・コリｈｔｐＲ＾−突然変異体細胞を
ＤＮＡ分子で形質転換することを特徴とする表現制御配
列に作動的に連結した外来ポリペプチドコーディング配
列を有するＤＮＡ分子で形質転換した宿主イー・コリｈ
ｔｐＲ突然変異体細胞を産生する方法。 - （１８）該宿主がｓｕｐＣ＾ｔ＾ｓ遺伝子も有するｈｔ
ｐＲ１６５株である前記第（１７）項の方法。 - （１９）該宿主がｈｔｐＲ１６５株Ｋｌ６５、ＣＡＧ４
５６、ＣＡＧ４８１、ＣＡＧ４８２、ＣＡＧ４８３、Ｃ
ＡＧ６０４、ＡＲ６７またはＡＲ６８である前記第（１
８）項の方法。 - （２０）該宿主がｒｐｏＤ８００遺伝子も有するｈｔｐ
Ｒ１０７株、ｈｔｐＲ１１１株、ｈｔｐＲ１１２株また
はｈｔｐＲ１１３株である前記第（１７）項の方法。 - （２１）該表現制御配列がＰ＿Ｌプロモーターである前
記第（１７）項の方法。 - （２２）該ＤＮＡ分子がｐＡＳ１またはｐＫＣ３０の如
きＰ＿Ｌベクターから由来する前記第（１７）項の方法
。
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