JPS62296882A - グルタチオンｓ−トランスフェラ−ゼ遺伝子及び該遺伝子を含有する除草剤耐性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、除草剤の無毒化（ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ）によって植物に除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ
　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を付与するための、植物の形質
転換のための組換ＤＮＡ技法の使用に関する。さらに詳
しくは、本発明はグルタチオン５−ｔ−ランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）ｉｆｉ伝子を含む組換ＤＮＡ分子の造成及
び使用に関し、この遺伝子は植物中で発現する際該植物
中のＧＳＴ酵素活性のレベルを上昇せしめる。

〔従来の技術〕

グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ（ＥＣ２，５゜１
．１８）は外来物質（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）の無毒
化に関与する酵素類である。これらの酵素は微生物、植
物、昆虫、及び動物を包含するほとんどの生物に対して
ｅｉＷ的である。この類に屈する各グルタチオン５−１
−ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）酵素は別個のものである
が、しかしこれらの酵素はある重複した基質特異性を示
す。Ｊａｋｏｂｙ等、“Ｒａｔ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ
ｅＳ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａ
ｎｄ　Ｉ”ｈｙｓｉｃａｌ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ’＋
Ｇ１ｕｔａ（ｈｉＯ犯トＭｅｃｈ　ｎ１５ｍ　ａｎｄ　
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　　ｒ、Ａｒ１ａｓ及び−、Ｊａｋ
ｏｙ編（ラーベンプレス、ニューヨーク、１９７６）；
　Ｒｅｄｄｙ等、”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ
　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ−ｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉ
ｎｄｉｖｉｄｕａｌ　　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　　Ｓ
−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆｒｏｍ　５ｈｅｅｐ　Ｌｉ
ｖｅｒ’、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ　、
　ａｎｄ旦旦吐ｎユ、　　２２４　：　８７　１０１（
１９８３）　。

ＧＳＴの多くの機能の内、親電子性化合物へのグルタチ
オンの接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）　ヘのＧＳＴの
触媒作用が特に興味深い。Ｈ，Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ　
。

Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎ
ｄ　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｏｌｅ
ｓ　ｉｎ　）Ｉｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔｓ’、Ｐｈ犯仝
洟明り項、　２１　：２７７１−２７８１　（１９８２
）　ＨＭｅｉｓｅｒ及びＴａｔｅ、　”Ｇｌｕｔａｔｈ
ｉｏｎｅａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｇａｍｍａ−Ｇｌｕ
ｔａｎ＋ｙｌ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　：　Ｂｌｏ−５ｙ
ｎＬｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ”　
、　Ａｎ　、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

邦：　　５６０−６０４（１９７６）。除草剤、殺菌剤
及び殺虫剤を包含する多くの外来物質が親電子性化合物
である。該化合物の親電子性中心とゲルタデオンとの接
合において、グルタチオンのスル上１゛リル基が前記化
合物の親電子性中心と反応する。グルタチオンは親電子
性化合物との接合により親核性物質として関与する。こ
の接合は特定のＧＳＴ酵素により触媒される（Ｒｅｎｎ
ｅｎｂｅｒｇ、前掲）、。

植物において、この反応は外来化合物の無毒化のための
機構を提供するために重要である。接合体となった親電
子性外来化合物は水溶性で植物に対して無毒となる傾向
がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、遺伝子工学的技法を用いて植物中のグルタチオ
ンｓ−トランスフェラーゼ酵素活性のレベルを上昇せし
めることにより除草剤に対して耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ）を有する植物を開発することが望まれる。

ｃ問題点を解決するだめの手段〕 本発明は、除草剤を無毒化する蛋白質を生産することに
より植物に除位剤耐性を付与する組換ＤＮＡ分子に向け
られる。既知の無毒化機構には、グルタチオンｓ−トラ
ンスフェラーゼにより触媒される親電子性化合物へのグ
ルタチオンの接合、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ）へのＤ−アミノ酸の接合、並びにスルホニ
ル尿素のヒドロキシル化及び炭水化物接合が含まれる。

さらに詳しくは、本発明は除草剤を無毒化する酵素をコ
ードする組換ＤＮＡ分子により形質転換された除草剤耐
性植物に向けられる。特に、この発明はまた、グルタチ
オンＳ−）ランスフェラーゼポリペプチドをコードする
遺伝子配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子、及びグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ酵素活性のレベルが上昇し
ている除草剤耐性の遺伝子移行（ｔｒａｎｓｇｅｎ　ｉ
ｃ）植物細胞に関する。この発明においては植物細胞が
ゲルタデオンＳ−＋−ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝
子により形質転換され、この遺伝子は発現又は過剰発現
（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の際除草剤耐性を与
える。

この発明はまた、形質転換された細胞から再生された植
物及びその種子、並びに遺伝子移転（ｔｒａｎｓｇｅｎ
　ｉｃ）植物細胞から再生された、突然変異体（ｍｕｔ
ａｎｔ）及び変種（ｖａｒｉａｎｔ）子孫を包含する植
物の子孫に関する。

この発明はさらに、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ遺伝子を含有するキメラ遺伝子造成物、クローニング
ベクター及び宿主、並びに植物に除草剤耐性を付与する
方法に関する。

〔具体的な説明〕

以下の詳細な記載において組換ＤＮＡ及び植物遺伝技法
において使用される多くの用語を用いる。

明！ｌＩ書の明瞭且つ一貫した理解のために下記の定義
を与える。

、１’　　（ｈｅｔｅｒｏｌｏ　ｏｕｓ）　’　　−は
ＤＮＡ遺伝子が挿入される種とは異る種から得られる、
ある特定の生成物又は生物学的機能をコードするＤＮＡ
配列であって、外来遺伝子又はＤＮＡとも呼ばれる。

ｎ　　、’（ｈｏｍｏｌｏ　ｏｕｓ）’　　−＆！ＤＮ
−人遺伝子が導入されるのと同じ種から得られる、ある
特定の生成物又は生物学的機能をコードするＤＮＡの配
列である。

皿上１３びＬ二り二 これに作用可能に連結された同種性又は異種性ＤＮＡ遺
伝子配列の植物中での転写を生じさせることができるＤ
ＮＡ発現制御配列である。

この○ＰＰにより形質転換されていない宿主細胞におい
て天然に観察されるレベルより実質的に高いレベル（ｍ
ＲＮＡ又はポリペプチドの量により測定される）まで、
任意の作用可能に連結された機能的遺伝子配列（１又は
複数）の遺伝子移転された（ｔｒａｎｓｇｅｎ　ｉｃ）
植物細胞での発現を生じさせることができる植物プロモ
ーターである。

ル　　　ンＳ−ｉＺ入ヱ互ｉ二丸 この酵素の定義は機能的であり、そしてグルタチオンと
親電子性化合物との接合（ｃｏｎｊｕｇａ　ｔｉｏｎ）
を触媒するために所与の植物中で機能することができる
すべてのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ
　Ｔ）を包含する。従って、この用語は遺伝的形質転換
に関与する特定の植物種からの酵素のみならず、遺伝子
移転植物細胞中で機能することができる限り他の植物種
又は微生物もしくは哺乳類細胞からのＧＳＴをも包含す
る。ＧＳＴなる語は、天然ＧＳＴの長さよりも長いか又
は短いアミノ酸配列、例えばＧＳＴの機能的バイブリド
もしくは部分的断片、又はこれらの類似体をも包含Ｖる
。

植−立 膜に結合した核、染色体中に組織化された遺伝物質、膜
に結合した細胞質オルガネラ、及び有糸分裂を行う能力
により特徴付けられる植物界のすべての光合成する構成
員である。

植）ｌ土 原形質体及び細胞壁から成る、植物の構造的及び機能的
単位である。

１伯」且 構造的又は機能的単位に組織化された植物細胞群である
。

以下全白 ｉ物ＪＬｊｌ 植物の別個のそして視覚的に識別される部分、例えば根
、蓼、葉、又は胚である。

この発明は除草剤の無毒化により植物に除草剤耐性を付
与する組換ＤＮＡ分子に向けられる。既知の無毒化機能
はスルホニル尿素のヒドロキシル化及び炭水化物接合（
ｆｌｕ　ｔｃｈ　１ｓｏｎ等、ｈ口Ｒ同し…匹鳳り旦し
ハ…橡且、競：　　２４３−２４９（１９８４）　）、
２．４−ＤへのＤ−アミノ酸接合（Ｄａｖｉｄｏｎｉｓ
等、■虹しハ■、、測：　　３５７−３６０（１９８０
）　）　、及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼに
より触媒される親電子性化合物へのグルタチオンの接合
が包含される。

さらに詳しくは、この発明は除草剤を無毒化する酵素を
コードする組換Ｄ　Ｎ　Ａ分子により形質転換された除
草剤耐性植物に向けられる。特に、この発明はさらに、
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドをコ
ードする遺伝子配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子、並び
に上昇したレベルのグルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ酵素活性を有する除草剤耐性の遺伝子移転植物細胞及
び植物に関する。グルタチオン含存植物細胞及び植物が
、該植物細胞及び植物中での発現の際にＧＳＴ酵素活性
のレベルを上昇せしめそしてそれ故に該植物に除草剤耐
性を付与するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇ
　Ｓ　Ｔ）遺伝子により形質転換される。この発明は、
これらの植物の修飾において遺伝子工学技法を用いる。

この明細書において使用する場合、“除草剤耐性植物”
なる語は、除草剤の通常の有効量において生存し、そし
て好ましくは正常に生育する植物として定義される。こ
の発明に従う植物における除草剤耐性は植物中での無毒
化機構に関し、但し除草剤結合又は標的部位はなお感受
性である。抵抗性（ｒｅｓ　ｉｓ　ｔａｎｃｅ）は達成
され得る最大耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）である。

無冴化は、除草剤結合又は標的部位がもはや感受性でな
い様に該部位が変化する他の除草剤耐性付与機構と区別
すべきである。本発明においては、除草剤結合部位はな
お感受性のままであるが、除草剤が例えばＧＳＴ酵素に
よって無毒化されるために該除草剤がもはや前記結合部
位に結合しない。

すなわち、この発明において使用される“除草剤耐性”
なる語は、例えば上昇したＧＳＴ酵素活性レベルによる
除草剤の無毒化に基く除草剤への耐性（ｔｏｌｅｒａｎ
ｃｅ）及び抵抗性（ｒｅｓ　ｉｓ　Ｌａｎｃｅ）を包含
することを意味する。この発明の除草剤耐性植物は、除
草剤感受性植物の生育又は活力を損傷するか、又は致命
的である或種の除草剤の存在下で損傷を受けることなく
生存する。

本発明において意図する除草剤は、例えば、植物グルタ
チオン又はグルタチオンの類似体もしくは同族体、典型
的にはあらゆる親電子性化合物と接合体を形成すること
によって無毒化され得るすべての除草剤を包含する。こ
の発明において特に興味あるものは塩素残基を有する除
草剤である。

この発明において意図される除草剤はトリアジン類例え
ばクロロトリアジン類、アセタミド類、例えばクロロア
セトアニリド類、スルホニル尿素類、イミダゾリノン類
、チオカルバメート類、塩素化ニトロベンゼン類、ジフ
ェニルエーテル’Ｆｌ　等ヲ包含するが、しかしこれら
に限定されない。除草剤の若干の特定の例にはアトラジ
ン（ａｔｒａｚｉｎｅ）、アラクロール（ａ　１ａｃｈ
　ｆｏｒ）、Ｓ−エチルジプロピルチオカルバメート、
及びジフェニルエチルが含まれる。さらに、Ｈｅｒｂｉ
ｃｊｄｅ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ
（Ｉｌ、ＬｅＢａｒｏｎ及びＪ、Ｇｒｅｓｓｅｌ　ｇ集
、１９８２）を参照のこと。

除草剤の幾つかは典型的に光合成の有効な阻害剤である
。Ｆｒｅａｒ等、並Ｕ匹匡料旦■、工：　２１２３−２
１３２　（１９７０）（クロロトリアジン類）　　；　
Ｆｒｅａｒ等、傾１亘」±ｌ酬を竺担媛」す５ｉｏ１．
　、％し　２９９−３１０（１９８３）　（ジフェニル
エーテル）；Ｌａｙ等、Ｐｅ５ｔｉｃｉｄｅ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、ａｎｄ　Ｐｈ　５ｉｏ１．　、６　：　　４４
２−４５６（１９７６）　（チオカルバメート’ｉｎ＞
：及びＦｒｅａｒ等、Ｐｅ５ｔｉｃｉｄｅ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、ａｎｄ　Ｉ’ｈ　５ｉｏ１．　、２３　：　５６
　６５（１９８５）　（メトリブチン）。他の除草剤は
アミノ酸の生合成のために必要な酵素を不活性化する。

これらの化合物を記載するために“除草剤”な通用され
る多くの殺虫剤及び殺菌剤（病気、寄生体、及び略奪生
物を駆除するための）は植物の活力に不都合な効果を与
える。殺虫剤又は殺菌剤は葉及び茎を通して、又は植物
の根糸を通して土壌から、植物組織に吸収されるであろ
う。さらに、ＧＳＴ酵素活性により触媒される反応であ
るグルタチオンにより接合体を形成され得る親電子性化
合物である多くの外来物質（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）
が存在する。これらの外来化合物もこの発明の範囲に属
する。

この発明の１つの態様においては、予想される除草剤は
増感剤（ｓｅｎｓｉＬｉｚｅｒ）、すなわちＧＳＴ酵素
活性の阻害剤である。これらの増感剤はＧＳＴ−増感剤
接合体の形成により内因性無毒化機構を阻害する。除草
剤及び増感剤、例えばトリジファン（ｔｒｉｄｉｐｈａ
ｎｅ）の植物への適用はグルタチオンと除草剤との酵素
的接合を阻害するであろう。Ｅｚｒａ等、”Ｔｒｉｄｉ
ｐｈａｎｅ　ａｓ　ａ　Ｓｙｎｅｒｇｆｓｔ　ｆｏｒ　
１ｌｅｒｂｉｃｉｄｅｓｉｎＣｏｒｎ（ゼア・マイス（
Ｚｅａ　　髭Ｌ）　、及びＰｒ０３０Ｍ１ｌｌｅｔ　（
バニカム・ミリアセラム（Ｐａｎｔｃｕｍｍｉｌｉａｃ
ｅｕｍ）、Ｗｅｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　、　３３　：　
　２８７−２９０（１９８５）。

従って、この発明においては、ＧＳＴ酵素活性又は上昇
したレベルのＧＳＴ酵素活性を植物に付与するために使
用される遺伝子工学的技法が、トリジファンのごとき増
感剤に対して耐性又は抵抗性である遺伝子移転植物をも
たらす。こうして、例えば、増感剤及び除草剤を組合わ
せて除草剤感受性植物にそして同時にこの発明の除草剤
耐性植物に適用することができる。増感剤と除草剤との
組合わせは、典型的には、除草剤感受性植物には毒性で
あるが、しかし遺伝子移転耐性植物に対しては毒性でな
いであろう。

ゲルタデオン又はその８４以体、例えばホモグルタチオ
ンを含存し、そして遺伝子工学的技法により遺伝子操作
を受けることができるすべての植物をこの発明において
使用することができる。遺伝子転移植物はまたＧＳＴ遺
伝子を発現することができる。この明細書において使用
する場合、°植物”なる語は植物細胞、植物原形質体、
培養されそして植物体に誘４され得る植物組織培養物、
植物カルス、植物塊　（ｐｌａｎＬｃｌｕｍｐ）−、及
び植物体又は植物体の部分中で無傷の植物細胞を包含す
る。

“植物”はまた、遺伝子工学的技法で形質転換され得る
花粉を包含する。

植物中のグルタチオンは細胞下（ｓｕｂｃｅｌ　Ｉｕｌ
ａｒ）区画中で最も高濃度で典型的に見出される。最も
高濃度のグルタチオンは植物プラスチド（ρ１ａｓｔｉ
ｄ）中、典型的には葉緑体中に存在する。（Ｒｅｎｎｅ
ｎｂｅｒｇ。

１１、、Ｐｈ■匹耽虹旦Ｈ、２１：　２７７１−２７８
１　（１９８２）　）。

グルタチオンはγ−し一グルタミルーし一システイニル
ーグリシンの構造を有する。グルタチオンの同族体であ
るホモグルタチオンは幾つかの植物中で同定されており
、そしてα−Ｌ−グルタミルーＬ−システイニル−β−
アラニンの構造を有する。（Ｃａｒｎｅｇｉｅ　、　Ｐ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、　８９　：　　４５９　４
７１（１９６３）、及びＣａｒｎｅｇｉｅ　、　Ｐ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、　８９　：　　４７１−４７８
（１９６３）　）。植物は種々の量のグルタチオン又は
ホモグルタチオンを含有する。例えば、若干の豆科植物
は主としてホモグルタチオンを含有し、他方他の豆科植
物は主としてグルタチオンを含有する。典型的には、１
つの植物においてホモグルタチオン又はグルタチオンの
いずれかが支配的であり、他方の化合物は少量のみ見出
される。

（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ　、前掲）に の発明において使用することができるグルタチオン５−
）−ランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）遺伝子のだめのコ
ード領域は形質転換されるべき植物細胞又は植物に対し
て同種性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）でも異種性（ｈｅｔ
ｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）でもよい。しかしながら、生ずる
植物細胞中で、ＧＳＴをコードする遺伝子配列が発現さ
れそして機能的酵素又はポリペプチドを生産することが
必要である。すなわち、この発明はＧＳＴ酵素を発現す
る同種性ＧＳＴ遺伝子又は異種性ＧＳＴｉＪ！伝子のい
ずれかを含有する植物を包含する。さらに、異種性ＧＳ
Ｔは他の植物種から、又は異る界の生物、例えば微生物
又は哺乳類からのものであってもよい。

すでに記載したように、ＧＳＴ酵素は多機能酵素の１つ
の類である。従って、グルタチオンと親電子性化合物と
の接合を触媒するＧＳＴの遺伝子を選択することも必要
である。ＧＳＴは基質としてグルタチオンを認識するか
ら、グルタチオン接合体形成に特異的なＧＳＴ酵素が形
質転換された植物中でホモグルタチオンを受は入れるか
否かは本発明の前には不確かであった。Ｆｒｅａｒ等、
ハＬ１吐印謀吐び、　　９　：２１２３−２１２３　（
１９７ＯＮグルタチオン５−１−ランスフェラーゼが還
元されたグルタチオンに特異的であることを示した）。

グルタチオンに特異的な必要なＧＳＴ酵素は、種々のグ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼを識別するために基
質特異性を決定するであろうアッセイを用いることによ
り同定しそして選択することができる。典型的なアッセ
イにおいては、グルタチオン特異的ＧＳＴはアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより特徴付けることができる
。（Ｔｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ
、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍ、、ユ餞：４６１　４６
７　（１９８２）　；Ｔｕ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　、　　２５８　：４６５９−４６６２（１９８３）
　、及びＪａｋｏｂｙ等、Ｇ　Ｉ　ｕ　ｔａ　ｔｈ　１
ｏｎＣ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ　、　　（ラベンプレス、ニューヨーク、１９７６）
　）。

この発明の１つの態様においては、ＧＳＴは形質転換さ
れるべき植物に対して同種性の植物ＧＳＴから成る。こ
の発明の他の態様においては、ＧＳＴは形質転換される
べき植物に対して異種性の植物ＧＳＴから成る。十分な
ＧＳＴを含有する植物としてトウモロコシ及びサトウモ
ロコシ（ｓｏｒｇｌ＋ｕｍ）が挙げられる。この発明の
他の態様においては、ＧＳＴは哺乳類ＧＳＴから成る。

哺乳１ＧｓＴは知られており、そしてＲｅｄｄｙ等、八
ｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｎ、ａｎｄ　
　Ｂｉｏ　　ｈ　　５ｉｃｓ　　、　　　２２４　　：
　　８７−１０１　（１９８３）　（ヒツジ肝ｆａ）　
　；ＴＬＩ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　。

２５８　：　４６５９−４６６２（１９８３）　（ラッ
トの組織、例えば心臓、腎臓、肝臓、肺、肺臓及び翠丸
）に記載されている。好ましいＧＳＴ遺伝子はラット肝
臓ＧＳＴ遺伝子のコード領域、そして特に例ＩＡに記載
するＹ　ｂ２００、及び例ＩＢに記載されている様に完
成されたＹｂ１８７を含んで成る。この発明の他の態様
はラット脳ＧＳＴのコード領域、そして特に例Ｉ已に記
載されているｃ　ＤＮＡクローンＧＩＹｂを含んで成る
。しかしながら、他のＧ　Ｓ　Ｔ遺伝子が知られており
、そしてこの発明において使用され得る。Ｍａｎｎｅｒ
ｖｉｋ＋Ｂ−＋　ＭムハＵｍｏ１．Ｒｅ１ａｌＡｒｅａ
ｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、、ｐ：　　３５７　４１７（１
９８５）を参照のこと。

グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮ
Ａ配列は全体としてゲノムＤＮＡから、又は全体として
ｃＤＮＡから造成することができる。この方法に代り、
ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの両者のバイブ
リド造成物であることができ、この場合、ｃＤＮＡがゲ
ノムＤＮＡと同じ遺伝子に由来することができ、あるい
はｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが異る遺伝子に由来するこ
とができる。いずれにしても、ゲノムＤＮＡ及び／又は
ｃＤＮＡの両者は同じ遺伝子又は異る遺伝子から別々に
造成される。ＤＮＡ配列が複数の遺伝子からの複数の部
分を含んで成る場合、Ｋｌ　？ｊＴ　Ｒの遺伝子部分は
すべて同じ生物に由来することができ、同じ属の複数の
株、変種（νａｒｉｅｔｙ）又は種の生物に由来するこ
とができ、あるいは同一の界（ｋｉｎｇｄｏｍ）又は異
る界の複数の属の生物に由来することができる。

ＤＮＡ配列の部分を当業界で知られている方法により一
諸に連結して全グルタチオンｓ−トランスフェラーゼコ
ード配列を形成することができる。

幾つかの適当な方法には、例えば相同領域を有するＤＮ
Ａ配列のインビボ組換、及び適切な制限断片のインビト
ロ連結が含まれる。

この発明の広い概念に含まれる種々の態様が存在する。

この様な態様の１つにおいては、この発明の遺伝子は、
下記の配列を含んで成るキメラ遺伝子配列から成る： （ａ）所与の植物細胞中で遺伝子が発現した際にグルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ活性のために機能的であ
るグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼポリペプチドを
コードする第一の遺伝子配列：及び （ｂ）　Ｐｊ　Ｇ　Ｓ　Ｔコード領域のいずれかの側に
作用可能に連結された１個又は？ｊｉ数個の追加の遺伝
子配列。これらの追加の遺伝子配列はプロモーター領域
及び／又はターミネータ−領域を含む。この植物制御配
列は宿主細胞に対して異種性でも同種性でもよい。

ＧＳＴコード領域の発現を誘導することができる任意の
プロモーター及び任意のターミネータ−をキメラ遺伝子
配列中に使用することができる。

プロモーター及びターミネータ−の幾つかの適当な例に
はツバリン・シンサーゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈ
ａｓｅ）　（ｎｏｓ）遺伝子、オクトピン・シンサーゼ
（ｏｃｔｏｐｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）（ｏｃｓ）遺
伝子、及びカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）
遺伝子からのものが含まれる。

使用し得る効率的な植物プロモーターの１つのタイプは
過剰生産（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）植物プロモー
ターである。ＧＳＴのための遺伝子配列と作用可能に連
結されたこれらのプロモーターは前記ＧＳＴの発現をプ
ロモートして、ＧＳＴ酵素活性の存在又は上昇したレベ
ルのために形質転換された植物が除草剤に対して耐性で
あるようにするはずである。この発明において使用する
ことができる過剰生産植物プロモーターは大豆からのり
ブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ
の小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ
−Ｌ　ｏ　ｗ　ｅ等、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａ　ｄ
　Ａ　　１．Ｇｅｎ、、上：　　４８３−．１９８（１
９８２）　）　、及びクロロフィルａ　／　ｂ結合蛋白
質のプロモーターを包含する。これら２つのプロモータ
ーは真核植物細胞において光誘導されることが知られて
いる〔例えば、側匣旦り胚訂近■ｎＬｏｆ　　Ｐ　　　
ｎｔｓ　　　ａｎ　　Ａ　　ｒｉｃｕｌｔｕｒ　　　Ｐ
ｅｒｓ　　ｅｃｔｉｖｅ、　八６Ｃａｓｈｍｏｒｅ　、
ブレナム、ニューヨーク（１９８３）、２９−３８頁、
Ｃｏｒｕｚｚｉ　Ｇ、等、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ−１Ｃｈｅ１）ＩＵ−、２５
８：　１３９９（１９８３）、及びＤｕｎｓｍｕｉｒ、
Ｐ。

等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎ
ｄ　Ａ　　ｌ１ｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

２　：　２８５（１９８３）を参照のこと〕。

植物プロモーターに作用可能に連結されたグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子を含んで成るキメラ遺伝
子配列を適当なりローニングベクターに連結することが
できる。一般に、宿主細胞と適合性の種に由来する複製
配列及び制御配列を含有するプラスミドベクター又はウ
ィルス（バタテリオファージ）ベクターが使用される。

クローニングベクターは典型的には複製開始点、及び形
質転換された宿主細胞中で表現型選択マーカー、典型的
には抗生物質耐性又は選択された除草剤に対する耐性、
を提供することができる特定の遺伝子を担持するごあろ
う。形質転換ベクターは、宿主細胞での形質転換の後こ
れらの表現型マーカーにより選択することができる。

この発明において使用することができる宿主細胞には、
原核細胞、例えば細菌宿主、例えばＡ。

チュメファシエンス　（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉ７、Ｅ。

コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、Ｓ、ティフィムニウム（Ｓ。

ｕ執釦肛り蛙、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ−ａ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシアノバクテリア
（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）が含まれる。真核宿主
細胞、例えば酵母、糸状菌、及び植物細胞をこの発明に
おいて使用することもできる。

クローニングベクター及び該ベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞は、この発明において典型的にはベクター
のコピー数を増加せしめるために使用される。増加した
コピー数を伴って、ＧＳＴ遺伝子を含有するベクターを
単離することができ、そして例えばキメラ遺伝子配列を
植物細胞に導入するために使用することができる。

宿主細胞へのＤＮＡの導入は当業界において知られてい
る方法により達成することができる。細菌宿主細胞は、
例えば塩化カルシウムによる細胞の処理の後に形質転換
することができる。

植物細胞の原形質体をＤＮＡと直接的に接触せしめるこ
とによりＤＮＡを植物細胞に挿入することができる。別
の方法として、植物細胞をウィルス又はアグロバクテリ
ウム（戊虹旦加匹↓は１旦り−と接触せしめることによ
りＤＮＡを植物細胞に導入することができる。ウィルス
及びアグロバクテリウムとの接触は、感受性植物細胞の
感染を介して、又は植物細胞の原形質体とアグロバクテ
リウムとの同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉνａｔｉｏｎ）
を介して起こるであろう。これらの方法は、後で詳細に
検討する。

植物細胞にＤＮＡを直接挿入するための多数の方法が存
在する。例えば、ベクター中に含まれる遺伝物質をマイ
クロピペットを用いて植物細胞中に直接ｉｔ油注入ｍｉ
ｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）することにより組換ＤＮＡ
を機械的に移行せしめることができる。

遺伝物質はまた、植物の原形質体をポリエチレングリコ
ールで処理した後に植物原形質に移行せしめることもで
きる。（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等、ＥＭＢＯＪ、。

ｉ：　２７１７−２２（１９８４）　）。

この発明の他の態様においては、電気穿孔（エレクトロ
ポレーション；　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）に
よりＧＳＴ遺伝子を植物細胞中に導入することができる
。（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等、Ｂｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　
　、　３−二１０９９−１１０３（１９８５）　　；　
　Ｆｒｏｍｍ　　等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　。

ｆｉ２Ｌ：　５Ｂ２４　（１９８５）　）。この技法に
おいては、ＧＳＴ遺伝子造成物を含有するプラスミドの
存在下でＪｉｆｆ物原形体を電気穿孔する。高い電界強
度の電気的インパルスが生物膜を可逆的に透過性にし、
プラスミドの導入を可能にする。電気穿孔された植物原
形質体は細胞壁を再生し、分裂し、そして植物カルスを
形成する。発現されたＧＳＴ酵素を有する遺伝子移行植
物細胞の選択は前記の表現型マーカーを用いて達成する
ことができる。

この発明において植物細胞にＧ　Ｓ　”Ｆ遺伝子を導入
するためのベクターとしてカリフラワーモザイクウィル
ス（Ｃａ　Ｍ　Ｖ）を使用することもできる。

（ｔｌｏｌｎ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｕ＋ｗｏｒｓ”。

アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８２．５４２
−５６０頁；　ｌｌｏｗｅ　ｌ　１　、米国特許ＮＱ４
．４０７．９５６）　、全Ｃａ　Ｍ　ＶウィルスＤＮＡ
ゲノムを親細菌プラスミドに挿入して、細菌中で増幅す
ることができる組換ＤＮＡ分子を形成する。ＧＳＴ遺伝
子配列の挿入のため、この組換プラスミドを制限酵素に
よって、組換プラスミドのウィルス部分のランダム部位
又はユニーク非一致命的部位において、例えばアリマキ
−伝達性のための遺伝子において開裂せしめる。ユニー
ク制限部位を存する、リンカ−と称される小オリゴヌク
レオチドも挿入することができる。修飾された組換プラ
スミドを再びクローン化し、そしてユニーク制限部位へ
のＧＳＴ遺伝子配列の４人によりさらに修飾する。次に
、組換プラスミドの修飾されたウィルス部分を親細菌プ
ラスミドから切り出し、そして植物細胞又は植物に接種
するために使用する。

ＧＳＴ遺伝子を細胞に導入するだめの他の方法は、ＧＳ
Ｔ遺伝子で形質転換されたアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＊ｔｕｍｅｆ
ａｃ　ｆｅｎｓ）を植物細胞に感染せしめることである
。当業界において知られている適切な条件下で、遺伝子
移転植物細胞を増殖せしめるこ止により芽及び根を形成
せし、め、そしてさらに植物体への発達せしめる。ＧＳ
Ｔ遺伝子配列を、例えばアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスのＴｆ　プラスミドにより適切な植物細胞に
導入することができる。（ＤｅＣｌｅｅｎｅ等、Ｂｏｔ
、Ｒｅｖ、　、　４７　：　　１４７−１９４（１９８
１）　；　Ｂｏｔ、Ｒｅｖ、　、　４２　：　　３８９
−４６６（１９７６）　）。

Ｔｉプラスミドはアグロバクテリウムによる感染の際に
植物細胞に伝達され、そして植物ゲノムに安定に組み込
まれる。（ｔｌ　ｏ　ｒ　ｓ　ｃ　ｈ等、３ｃｉｅｎｃ
ｅ　＋２３３：４９６　４９８（１９８４）　　；　Ｆ
ｒａｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、−５
ｅｉ、ＵＳＡ　、　　８（し４８０３　（１９８３）　
）。

その細胞がアグロバクテリウムによる感染に対して感受
性でない植物については、対応する原形質体とアグロバ
クテリウムとの同時培養に頼ることができる。

Ｔｉ　プラスミドは形質転換された細胞の生産のために
必須の２つの領域を含有する。それらの１つ、トランス
ファーＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）領域は植物に移行し、そ
して腫瘍形成を誘導する。他方、すなわちビルレント（
ｖｉｒ）ｊＪｆ域はＩＩＩ瘍の形成には必須であるが、
しかしその維持には必須でない。トランスファーＤ　Ｎ
　Ａ　’６Ｂ域はその移行能力が影響を受けることなく
ＧＳＴ遺伝子配列の挿入によってサイズを増すことがで
きる。遺伝子移転植物細胞が非−腫瘍性であるように腫
瘍発生遺伝子を除去し、そして選択マーカーを付加する
ことにより、適当な植物細胞へのこの発明の遺伝子造成
物の移送のためのベクターとして変形されたＴｉプラス
ミドを使用することができる。

Ｔ−ＤＮＡＳＵ域及びｖｉｒ領域が同一ベクター上に存
在するか又はアグロバクテリウム細胞中の異るベクター
上に存在するかにかかわらず、ｖｉｒ令頁域はＴ−ＤＮ
Ａをアグロバクテリウムから植物細胞のゲノムに移行せ
しめる。染色体上のｖｉ「領域もまたベクターから植物
細胞への１’　−Ｄ　ＮＡの移行を誘導する。

Ｔ−ＤＮＡをアグロバクテリウムから植物細胞に移行せ
しめるための好ましい系は、該Ｔ−ＤＮＡ領域を含有す
るベクター以外のベクター上にｖｉｒ？ＩＪｌ域を含ん
で成る。このような系は二元ベクター系として知られて
おり、そしてＴ−ＤＮＡを含有するベクターは二元ベク
ターとして知られている。

植物細胞中に移行することができそして形質転換された
細胞が選択されることを可能にする任意のＴ−ＤＮＡ含
有ベクターがこの発明における使用のために適当である
。プロモーター、コード配列及びｐＣＩＢｌｏから造成
されるベクターが好ましい。

アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ　％ｐ
域の移行を生じさせる任意のｖｉｒ領域含有ベクターを
この発明において使用することができる。好ましいｖ　
ｉ　ｒ　ＳＪＩ域含有ベクターはｐＣＩ８５４２である
。

この発明のＤＮＡにより形質転換された植物細胞又は植
物は、ＧＳＴ遺伝子のほかにＤＮＡ中に存在する適切な
表現型マーカーにより選択され得る。これらの表現型マ
ーカーには抗生物質耐性マーカー、例えばカナマイシン
遺伝子及びハイグロマイシン遺伝子、又は除草剤耐性遺
伝子が含まれるが、これらに限定されない。他の表現型
マーカーが当業界において知られており、そしてこの発
明において使用することができる。

その細胞がＤＮＡの直接挿入により又はアグロバクテリ
ウムとの接触により形質転換され得るすべての植物をこ
の発明の方法にゆだねて、移行したＧＳＴ遺伝子を含有
する遺伝子移転全体植物を製造することができる。すべ
ての主要穀物種、甜菜、サトウキビ、綿、果樹及び他の
樹木、豆科植物、並びに野菜を包含するがこれらに限定
されない実際上すべての植物が、培養された細胞又は組
織から再生され得ることを示す証拠が増加しつつある。

さらに、この発明の範囲に含まれる標的作物には、例え
ば、フラガリア−７、ロツス （Ｌｏｔｕｓ）　、メディカゴコｙ則並Ｅ　Ｏ）−、オ
ノブリチス迎■両び材（１）ｄ、）！Ｊフオリウム旦ｍ
ｌ工江打り、トリゴネラ」工１凹俣↓回、ビグナ旦ｊｎ
ａ）、シトルス（Ｃｉｔｒｕｓ）、リヌム（Ｌｉｎｕｍ
）　、ゼラニウム（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、マニホット（
Ｍａｎｉｈｏｔ）　、ダウクスΩ且製旦、アラビドブシ
ス圏Ω坦並り鎚）、ブランシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）
、ラバヌス■」専虻！紋、シナビス４）　、アトロバ（
Ａ　１画、カプシクム旦且紅匹畦、タッテ（Ｄａｔｕｒ
ａ）、ヒオシャムス圓ヨお、□針、リコペルシコンユ五
凹ｅｒ−ｓｉｃｏｎ）、ニコチアナ］七亙■几−，Ｌ）
、ソラヌム血１ｎ」）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）
　、ジギタリス１ｉＬａｌｉｓ）、マジョラナ７、シコ
リウムー包±ｃｈｏｒｉｕｍ）、へりアンサス（Ｈｅｌ
ｉａｎｔｈｕｓ）、ラフツカ（Ｌａｃｔｕｃａ）、ブロ
ムス（Ｂｒｏｍｕｓ）、アスパラガス％ａｒａｐｕｓ）
、アンチリヌム（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）　、ヘメロ
カリス（ｌｌｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア（Ｎ
ｅｍｅｓｉａ）　、ベラルゴニウムザ且巨郵ｙ吐憇）、
バニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）　。

ペンニセツム（Ｐｅｎｎ　ｉｓｅ　ｔｕｍ）、ラヌツク
ルス皿ａｎ−ｕｎｃｕｌｕｓ）、セネシオ（Ｓｅｎｅｃ
ｉｏ）　、サルピグロソジスｍ旦耐、ククミス（Ｃｕｃ
ｕＩＩ＋ｉｓ）、ブロワリア（Ｂｒｏｗａ■亘）、グリ
シン４）、ロリウム山月１１、ゼア（Ｚｅａ）　、トリ
チクム（Ｔｒｉ　Ｌｉｃｕｍ）、及びツルガム−７）か
ら成る群の作物、並びにイボモニア置皿懸皿）、パンシ
フロラ狸且護工匡朋文、シクラメンμ匣ｄｌ■抛−、マ
ルス（Ｍａｌｕｓ）　、ブルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ロ
サ（Ｒｏｓａ）、ルブス」妨す）、ポプルス４）　、サ
ンタルム（Ｓａｎ　ｔａ　Ｉ　！−ｇ）、アリウム（八
］　Ｉ　ｉｕｍΣ、リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、ナルジ
ノナス（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）　、アナナス（Ａｎａｎ
ａｓ）、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）　、ファセオルス
（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）及びピスム（Ｐｉｓｕ＋＋＋）
から成る群の作物が含まれる。

これらすべての植物がアグロバクテリウムによって形質
転換され得るか否かについて現在限定された知識が存在
する。アグロバクテリウムの天然植物宿主でない種でさ
えインビトロで形質転換され得る。例えば、単子葉植物
、そして特に穀類及び草類はアグロバクテリウムの天然
宿主ではない。

ある種の単子葉植物がアグロバクテリウムにより形質転
換され得ることを示す証拠が増加しつつある。今や利用
可能となった通常の実験的アプローチを用いて穀類及び
草類の形質転換が可能である（Ｇｒ　ｉｎｓ　Ｉｅｙ　
、　Ｎ　、等、Ｎａｔｕｒｅ、　３２５　：１７７−１
７９（１９８７））。

培養された原形質体からの植物の再生はＥｖａｎｓ等、
”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”。

Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ、±：　　１２４−１７６（マクミラン・パ
ブリッシング社、ニューヨーク、１９８３）；Ｍ、Ｒ，
Ｄａｖｅｙ、’Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｓ　ｉｎ　ｔｌ＋ｅＣｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒｅｇｅ
ｒ＋ｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｐ
ｌａｓｔｓ″。

Ｐｒｏｔｏ　　１ａｓｔｓ　　、　　１９８３−Ｌｅｃ
ｔｕｒｅ　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、１９−２９頁（
ピークハウゼル、バーゼル、１９８３）　；Ｐ、Ｊ。

Ｄａｌｅ、”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ　
Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｒｅｃａｌｃｉ
ｔｒａｎｔ　Ｃｒｏｐｓ’。

ｈ坦」１ａｓｔｓ　＋　１９８３−Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、３１−４１頁（ビルクハウゼル
、バーゼル、１９８３）　；及びＨ，Ｂｉｎｄｉｎｇ、
”Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ″、
　ＰｌａｎｔＰｒｏｔｏ　１ａｓｔｓ　　＋２１−３７
頁（ＣＲＣプレス、ポカ・ラドン、１９８５）に記載さ
れている。

再生は植物の種により異るが、−ｉに、ＧＳＴ遺伝子の
多数コピーを含有する形質転換された原形質体、細胞又
は組織の懸濁液をまず得る。次に、該懸濁液から胚形成
を誘導し、そして天然胚のごとき成熟及び発芽を許容す
ることができる。培地は一般に種々のアミノ酸及びホル
モン類、例えばオーキシン及びサイトカイニン類を含有
するであろう。特にトウモロコシ及びアルファルファの
ごとき種のためにはグルタミン酸及びプロリンを培地に
添加することも有利である。芽及び根は通常同時に発生
する。効率的な再生は培地、遺伝子型及び培養の経歴に
依存するであろう。これら３種の可変条件が制御されれ
ば再生は十分に再現性がありそして反復可能である。

この発明において使用するために適当な植物には、例え
ば次の属：ロツス（Ｌｏｔｕｓ）　、メディカゴ（月ｅ
ｄｊｃａｐσ、オノブリチス（Ｏｎｏｂｒｄ、トリホリ
ウムー（Ｔｒｉｆｏ！ｉｕｍ）　、）リゴネラ（Ｔｒｉ
　ｏｎｅｌｌａ）、シトルス（Ｃｉ　Ｌｒｕｓ）、リヌ
ム（Ｌｉｎｕｓｉ）　、マニホット（Ｍａｎｉｈｏｔ）
　％ダウクス（Ｄａｕｃｕｓ）、アラビドブシスニＪ亘
）　、ブラッシ力（ＢｒａＳＳｉＣａ）、ラパヌス旦１
士邦且牡、シナビスぶ汀月且」）、アトロバ亘江ユ紅、
カブシクムｊｓｉｃｕｍ）、ダツラ則桂肛担−、ヒオシ
アムス４ｓ１．．リコペリシコン孤バ〃二葺匹煎、ニコ
チアナ（Ｎｉｃｏｔ負ユ）、ソラヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ
）　、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）　、マジョラナ７
ｊ−、シコリウム（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）　、ヘリアン
サス０ｌｅｌ　１ａｎＬｈｕｓ）、ラフツカ（Ｌａｃｔ
ｕｃａ）　、アスパラガスｍ）　、アンチリヌム（Ａｎ
ｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、パニクム旦且包」）、ペンニセ
ツム理ｙ…」フ刃−、ラヌツクルス（Ｒａｎｕｎｃｕ　
Ｉｕｓ）、サルビグロッシス旦虹且訃旦牡蛙、グリシン
伍ｎ亘匹）、ゴ、７シピ’）　ム７）　、マルス（Ｍａ
ｌｕｓ）　、プルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ロサ（Ｒｏｓ
ａ）、ボプルス用並吐服）、アリウム（Ａｌｌｉｕｍ）
、リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、ナルシソサス（Ｎａｒｃ
ｉｓｓｕｓ）　、アナナス（Ａｎａｎａｓ）、アラキス
（Ａｒａｃｈｉｓ）　、ファゼオルス（Ｐｈａｓｅｏｌ
ｕｓ）及びビスム（Ｐｉｓｕｌｌ）からの種が含まれる
。

オリザ（Ｏｒｉｚａ）　（稲）が原形質体から全体植物
に再生され得るから、グラミネア（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ
）科に属する他の植物も再生が可能なはずである。従っ
て、この発明において、ロリウム−（Ｃｏ土ワｗｙ、ゼ
ア（Ｚｅａ）　、トリチカ１、（Ｔｒ　ｉ　ｔ　ｉｃｕ
ｍ）、ツルガム−Ｑ旦邸〜恒岬）及びブロムス（Ｂｒｏ
ｍｕｓ）をこの発明の方法において使用することかでき
よう。

この発明の好ましい植物は、属：ニコチアナ（Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ）ｓｐｐ、　（例えばタバコ）、グリシン刊
旦置皿）　ｓｓｐ、　Ｃ特にグリシン・マックス（Ｇ１
ｃｉｎｅ清ａ×）、大豆］、及びゴソシピウム惧螢至■
工斐）ｓｓｐ、　（綿）からの植物である。

形質転換された植物細胞から成長した成熟植物を自家受
粉せしめて種子を製造する。これらの種子の幾つかは確
立された遺伝の法則に従う比率で」１昇したＧＳＴ酵素
活性レベルのための遺伝子を含有する。これらの種子を
生育させて除草剤耐性である植物を生産することができ
る。これらの種子の耐性は、例えば除草剤を含有する土
壌中で種子を生育させることにより決定することができ
る。

他の方法として、形質転換された植物の除草剤耐性は、
植物に除草剤を適用することにより決定することができ
る。

自家受粉を反復してホモ接合体を生成することにより除
草剤耐性近文系植物（ｉｎｂｒｅｄｓ）を得ることがで
きる。これらの近交系植物を用いて除草剤耐性雑種を開
発することができる。この方法においては、除草剤耐性
雑種を生産するために除草剤耐性細胞系を他の近交系と
交雑せしめる。

再生された植物から得られる部分、例えば花、種子、葉
、枝、果実等は、これらの部分が除草剤耐性細胞を含有
する限り、この発明の範囲に属する。再生された植物の
子孫（Ｍ種子係を含む）、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）及
び突然変異体（ｎ＋ｕ　ｔａｎ　ｔ）もこの発明の範囲
に含まれる。

ＧＳＴｊ云−′告ＪＩｌ゛　　び７．町、ＭＬ！１！Ｌ
律９散皿−前記のＣ３Ｔ遺伝子造成物はベクター中で、
除草剤耐性植物細胞、植物器官、植物組織、及び植物体
の製造のための中間体として使用することができる。

この発明の除草剤耐性植物の重要さは明らかである。こ
れらの植物は、農家が除草剤耐性作物を栽培し、そして
作物に不都合な影響を与えることなく農場の雑草を処置
することを可能にする。さらに、除草剤耐性植物は、例
えば自然に耐性の植物と自然に感受性の植物との輪作の
作物循環において、除草剤により処理された農場で農家
が作物を栽培することを可能にする。これらの除草剤で
処理された農場は土壌中に幾らかの量の“除草剤の持ち
越し”を含有するであろう。除草剤に対して自然に感受
性である輪作々物は、それらが耐性にされない限りこの
様な除草剤の持ち越しにより害を受ける可能性がある（
Ｓｈｅｅｔｓ、Ｔ、　ＲｅｓｉｄｕｅＲｅｖｉｅｗｓ　
、　３２　：　　２８７　３１０（１９７０）　；Ｂｕ
ｒｎｓｉｄｅ等、Ｗｅｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９　
：　　２９０−２９３（１９７１）　）。

例えば、農家は典型的にはトウモロコシと大豆を交互に
栽培する。トウモロコシはある種の除草剤、例えば幾つ
かのトリアジン除草剤、例えばアトラジンに対して自然
に耐性であるが、トウモロコシ農場が除草剤により処理
された後に栽培されるより感受性の大豆は用傷されるで
あろう。この発明の除草剤耐性植物の使用により、除草
剤の待ち越しによる損害が回避される。（Ｐｉｎｋ等、
凱叫５ｃｉｅｎｃｅ　、　１７膨３５−３６　（１９６
９）（大豆）　　；　Ｋｈａｎ等、Ｗｅｅｄ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　、　２１　：　９−１２　（１９８１）　　
（オート及びオオアワガエリ（ｔｉｍｏｔｈｙ　ｐｌａ
ｎｔ）；口ｒｉｎｋｍａｎ等、。

Ｃｒｏ　　５ｃｉｅｎｃｅ、２０：　　１８５−１８９
（１９８０）（オート）：Ｅｃｋｅｒ　Ｌ等、Ｊ、Ｒａ
ｎ　ｅ　Ｍ　ｍｔ、、２５．２１９　２２４（１９７２
）（小麦））。

本発明はまた植物の抑制方法に関し、この方法は除草剤
感受性植物、例えば雑草と本発明の除草剤耐性植物とか
ら成る混合集団を、除草剤感受性植物を抑制するのに十
分な、植物抑制量の除草剤と接触せしめることを含んで
成る。すなわち、除草剤耐性植物及び除草剤感受性雑草
を含む農場における植物の葉面除草剤処理（両タイプの
植物が処理作業中同時に除草剤と接力虫する）が本発明
中に含まれる１つの方法である。

さらに、前記のごとく、本発明は除草剤及び増悪剤を同
時に除草剤耐性植物及び除草剤感受性植物の両者に接触
することを含んで成る植物の抑制方法に関する。

“植物抑制批の除草剤”なる用語は、機能的に、所与の
植物の生育又は発達に影響を与えることができる除草剤
の量である。従って、この量は生育又は発達を単に阻害
又は抑制するのに十分な少量であってもよく、又は感受
性植物を非可逆的に…傷するのに十分な程ど多量であっ
てもよい。

除草剤の実際の量は除草剤及び抑制されるべき植物に依
存する。例えば、双子葉植物及び種子はしばしば０．５
〜１．５　ｋｉｒ　／　ｈａの除草剤濃度でしばしば抑
制される。単子葉植物については、０．５　ｋｇ　／ｈ
ａ〜約２．０　ｋ＋ｒ／ｈａの除草剤濃度が典型的であ
る。

若干の除草剤、例えばスルホニル尿素除草剤は有意に低
い？震度で植物を抑制することが知られている。

言うまでもな（、除草剤はよく知られている噴霧又は散
布方法を用いて該当する植物と接触せしめることができ
る。例えば、アトラジンにより雑草を抑制するために従
来技術において使用される葉面適用をこの発明のアトラ
ジン耐性植物に対して使用することができる。

以上、この発明を一般的に記載したが、一層の理解のた
め以下の例によりさらに具体的に説明する。但し、これ
らの例により、本発明の範囲を限定するものではない。

■ 以下の例において使用する手順はＭａｎｉａｔｉｓ等、
ム旦ｃｕｌａｒ　Ｃｌユ旦１．ゴールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−１１９８２に記載されている。酵素は
特にことわらない限りニューイングラットバイオラプス
から得ることができ、そして特にことわらない限り製造
者の推奨に従って使用する。

エラーゼ（Ｇ’５Ｔ）（アフィニティークロマトグラフ
ィー画分）に対する抗血清を、Ｔｕ等、Ｎｕｃｌｅｉｒ
Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、＋　ｔｃし５４０７−５４１９（
１９８２）に記載されている様にして調製する。ＩｇＧ
画分をプロティンＡ−セファロース（ファルマシア）カ
ラムから精製し、そして限外濾過（アミコン、ＸＭ−５
０１１Ｑ）により濃縮する（Ｋｒａｕｓ及びＲｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１ｄ　Ｓ　’　　Ａ、　
１１：４０１５−４０１９（１９８２））　、　、：、
れを５０％グリセリン及び０．２■／　ｎＪヘパリン中
に一１８℃にて貯蔵する。

匪ユｊニ左辺１景 ２匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重約３
００　ｇ　）からの肝臓（約２６ｇ）をＰｏｔｔｅｒ−
Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーにより１５０ｍ１７（
最終容量）の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩＣｊ！　　（ｐＨ
７，５）　、２５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、０．２５Ｍシュ
ークロース含有ベントナイト　（１■／−）、ヘパリン
＜０．２ｎｖ／ｍり及びシクロへキシミド（１マイクロ
グラム／ｍ／）中で幾つかの７リコートとしてホモジナ
イズしｌ　５　　（Ｗ／Ｖ）％ホモジネートとする。Ｋ
ｒａｕｓ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ−、前掲、の公表され
ている方法に正確に従ってポリゾームを単離する。収量
は透析の前１３８９４．．。ユニットであり、そして透
析の後１２０８Ａ２６０ユニツトである。

以下余白 ｆ」］２二に１坑」すＬＬ本ｐ１団＝Ｅ因待ｍ１１３０
ＡＺ６０ユニットのポリゾームを抗−ＧＳＴ　ＩｇＧ（
７，１■）を用いる免疫吸収により回収した。プロティ
ン−Ａ−セファロースアフィニティークロマトグラフィ
ー及び結合したＲＮＡの溶出はＫｒａｕｓ及びＲｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ−、前掲、に記載されている様にして行う。

溶出されたＲＮＡをすぐに０．５　Ｍ　ＮａＣ１及び０
．５％ドデシル硫酸ナトリウムに調整し、そしてオリゴ
（ｄＴ）−セルロースカラムによりさらに精製する（Ａ
ｕｉｖ及びＬｅｄｅｒ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　、　６９　；　１４０Ｂ−１４１２
（１９７２）；Ｂａｎｔｌｅ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、７２：　　４１３−４１７（１９７６）　）　
、精製されたポリ　（Ａ”）ＲＮＡをインビトロ翻訳及
び免疫沈澱によりアッセイしくＴｕ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　１０　：　５４０７−５４１
９（１９８２）；Ｐｅｌｈａｍ及びＪａｃｋｓｏｎ＋Ｅ
ｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６７　：　　２４７−
２５６（１９７６）　）　、次にｃＤＮＡ合成を行う。

免疫沈澱した物質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル上で分離し、そしてフルオログラフィー
により可視化する（１．ａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、
　２２７　：６８０　６８４（１９７０）；Ｓｗａｎｓ
　ｔｒｏｍ及び５ｈｅｎｋ、八ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、、ξｆ６：　　１８４−１９２（１９７８））　　。

ＧＳＴ　ｃＤＮＡクローンのＵｉｉ Ｇｕｂｌｅｒ及びＩｌｏｆｆｍａｎ　　（Ｇｕｂｌｅｒ
及びＩｌｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ。

Ｈ：　　２６３　２６９（１９８３）　）により改変さ
れたＯｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇの方法ＣＯｋａｙａｍ
ａ及びＢｅｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ紅ｏ１．、２　：
　　１６１−１７０（１９８）２）にわずかな変更を加
えてｃＤＮＡの合成を行った。免疫沈澱したポリゾーム
からの約１００−５００ｎｇのポリ　（ＡＩＲＮＡをｃ
ＤＮＡ合成のために使用する。ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの
逆転写は、５０　ｍＦＩＴｒｉｓ　　ｆｌｃ４（ｐＨ８
，３）　、１００ｍＭ　　ＮａＣ！！、１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｊｌ！ｚ、１０ｍＭＤＴＴ、４ｍＭビロリン酸ナトリ
ウム、１．２５ｍＭの４種類のｄ　ＮＴＰ、　１８００
Ｕ／ｍ／ＲＮＡ５ｉｎ（プロメガ・ビオチク）、１１０
０ｐ／ｎｄオリゴ−（ｄ　’ｒ）１２−１１１　（７ア
Ｊｌ／７　シＴ／　Ｐ　Ｌ）　及び３，０００Ｕ／ｍＩ
の逆転写酵素（モレキュラーゼネティクス）を含む４０
μｌ中で行う。

反応混合物を４３°Ｃにて２５分間インキュベートし、
そして２μｌの０．５　Ｍ　ＩＥＤＴＡの添加により反
応を停止する。反応混合物を１容量のフェノール：クロ
ロホルムで抽出し、そして水相を２分の１容量のクロロ
ホルムで逆抽出する。有機相をＴＥＪＩ衝液により再度
逆抽出する。

一緒にした水性相に１容量の４Ｍ酢酸アンモニウムを加
え、そして２容量のエタノールを添加しそしてドライア
イス上で２０〜３０分間冷却することにより核酸を沈澱
せしめる。次に、溶液を室温に５分間加温しそしてエッ
ペンドルス遠心管中で４℃にて１５分間遠心する。生ず
るペレットを２５４のＴＥ緩衝液に溶解する。酢酸アン
モニウム（２５Ｉ、４Ｍ）及び１００ｔ！１のエタノー
ルを加え、そして前記のように核酸を沈澱せしめそして
回収する。ペレットを７０％のエタノールで洗浄し、乾
燥し、そして２０ｍの水に溶解する。

ｍＲＮＡ　：　ｃＤＮＡバイブリド中のｍＲＮＡの置換
を、２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５
）　、５ｍＭ塩化マグネシウム、ｌ０ｍＭ硫酸マグネシ
ウム、１００１００ｌβ、Ｏ，１５ｍＭベーターＮＡＤ
、　０．０４ｎ＋との４種類のｄＮＴＰ、２０ｄの第−
鎖生成物、１０〜２０ｍＣの”Ｐ−ｄＡＴＰ、ＩＯＵ／
ｍ１のＥ、コリＤ　Ｎ　Ａ　１ガーゼにューイングラッ
トビオラブス）、２３０Ｕ／ａ／のＤＮＡポリメラーゼ
（ベーリンガーマンハイム）及び８．５Ｕ／−のＥ、コ
リＲＮＡ５ｅＨ（ファルマシャ／Ｐ　Ｌ）を含有する５
０ｄ中で行う。反応混合物を９０分間１２〜１４℃にて
インキュベートし、次に室温にて１時間インキュベート
する。二本鎖ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出
により精製し、そして第−鎖生成物について記載したの
と正確に同様にしてエタノール沈澱により回収する。最
終乾燥ペレットを２０Ｓの水にン容解する。

１０μノの二本鎖ｃＤＮＡを、１００ｍＭカコジル酸カ
リウム（ｐＨ７，０）　、１１Ｃｏ（：　ｌ□、０．２
ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭｄＣＴＰ及び５００　Ｕ　／　
Ｉｎ！のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼ（ファルマシア／Ｐ　Ｌ）を含有する２０μｌ
の全容量中でｄＣＴＰによりテイル形成する。反応混合
物を３７℃にて１〜２分間インキュベートし、次に２０
、Ｊの４　ｍＭ　ＥＤＴＡを添加し、そして６５℃にて
１０分間のインキュベーションにより酵素を熱失活せし
める。

Ｐｓｔｌで消化され、ｄＧでテイル形成されたｐＢＩ？
３２２　（ベセスダ・リサーチ・ラボラドリース社）を
、ｄＣテイル形成された二本鎖ｃＤＮＡに約１：ｌのモ
ル比（すなわち、予想される量のｃＤＮＡに対して約５
〜１０倍分子量過剰のベクター）で添加する。ＤＮＡ溶
液（ｃＤＮＡ十ベクター）を稀釈して、１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩＩ　　（ｐＨ７，５）　、１ｓＭ　ＥＤ
ＴＡ及び１５０ｍＭ　ＮａＣ７！の存在下０．５〜２．
Ｏｎｇ／Ｉの最終全ＤＮＡ濃度にする。混合物を６５°
Ｃにて５分間インキュベートし、そして次にＤＮＡを５
５〜５８℃にて９０分間アニールする。

アニールされたｃＤＮＡ：ベクターを、形質転換コンピ
テント細胞の２００４のアリコート当り５ＩのＤＮＡを
用いてＥ、３９１２９４株に形質転換する（Ｉｌａｎａ
ｈａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．ＬＬｏｉ、＋１５５　　：　　５
５７−５８０（１９８３）　）。対照形質転換頻度は共
有結合で閉環された環状ｐＢＲ３２２のＤＮＡ鱈当り１
〜２Ｘ１０８個の形質転換体である。形質転換された細
胞を１７μｇ／ｍＩのテトラサイクリンを含有するＬＭ
プレート（マグネシウムを含有しない）上にプレートす
る（ｌｌａｎａｈａｎ、前掲）。生ずるコロニーをアン
ピシリン感受性について試験する。テトラサイクリン耐
性であってアンピシリン感受性のコロニー（約５０％）
を拾い上げてさらに分析する。

ｐＧＴＲ２００のバイブリド−゛　　インビトロＶプラ
スミドＤＮＡをアルカリ溶解法［Ｂｊｒｎｂｏｉｍ及び
Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｒ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、
　　７　：１５１３　１５２３（１９７９）を用いて３
５４個のアンピシリン感受性形質転換体から精製し、そ
してこれらのＤ　Ｎ　ＡをＰｓｔｌにより消化してｃ　
ＤＮＡ挿入部のサイズを決定する。これらの内１３４個
がアガロースゲル電気泳動により観察可能なｃＤＮＡ挿
入部を含有している。８００ヌクレオチドより大きな挿
入部を有するものをサザン・プロット・ハイブリダイゼ
ーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、、９８：　５０３５１７（１９７５））により、Ｙａ
　（ｐＧＴＩ？２６１）及びＹｃ　（ｐＧＴＲ２６２）
をプローブとして使用して分析する（Ｌａｉ等、Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ工並叩、１％辺−：　５５３６−５５４２（１９
８４）　：　Ｔｕ等Ｌ１匡Ｌ−知、、２５９　　：　９
４３４−９３３９（１９８４））　。

次に、これらのプローブとハイブリダイズしない１２個
のクローンをバイブリド−選択インビトロ翻訳により特
徴付ける（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ等、鮭。

％）：９５−１０５（１９８０）　）。これらのネガテ
ィブクローンの１つをｐＧＴＲ２００と命名する。活性
化されたアミノフェニルチオエーテルセルロース（ＡＰ
Ｔ−ペーパー）上に固定化されたｐＧＴＲ２００Ｄ　Ｎ
　Ａにより選択されたラット肝臓ポリ　（Ａ”　）ＲＮ
Ａを７５℃及び１００℃において）容出し、そしてラビ
ット網状赤血球ライセード系でのインビトロ翻訳をプロ
グラムするために使用する。インビトロ翻訳生成物を全
ラット肝臓ＧｓＴｓに対する抗血清により免疫沈澱せし
め、次にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかける。

免疫沈澱した生成物はＹｂ移動度のものであり、他のク
ラスのＧＳＴサブユニットはｐＧＴＲ２００により選択
されない。Ｙａ及びＹｃを用いる先のバイブリド−選択
インビトロ翻訳実験はｙｂサブユニット生成物をなんら
示さない（Ｌａｉ等、前掲；Ｔｕ等、前掲〕。

ＧＴＩ１２００　ｃＤＮ八瞥へ合のヌクレオチド配置ｐ
ＧＴＲ２００中のｃＤＮＡのＤＮＡ配列を第１図に示す
方針に従って、Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの化学的
方法（Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、＋　６５：４９９−５６０（１９８
０）　）により決定する。種々の制服エンドヌクレアー
ゼ開裂により生じたＤＮＡ断片を３′末端において開裂
せしめる。各決定を少なくとも１回反復する。

ヌクレオチド配列を下記に示す。２１８残基のオープン
リーディングフレームについてアミノ酸の単文字コード
を使用する。（Ｏｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ。

賞力咀帥セｓ　ｏｆ声囚しり側上１規２区、（１９８５
）　、ブラノクウエルスパブリケーションズ、ロンドン
、３４６頁）。ポリＡ付加シグナルＡＡＴＡＡＡに下線
が付しである。

ＣＴＧＡＡＧＣＣＡＡ八ＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡ
ＧＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＤＹＤＩ？５ＱＷＬＮＩＥＫＦ
Ｋ ＰＤＦＥＫＱＫＰＥＦＬＫＴ ＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＴ
ＴＴＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡ実質的に同様の方法によ
りｃＤＮＡクローンＹｂ１８７を得た。Ｙｂ１８７はコ
ード配列の５′末端において９６ヌクレオチドを欠く部
分的Ｃ，Ｄ　Ｎ　Ａクローンである。欠けている９６ヌ
クレオチド及びＹｂ１８７のヌクレオチド配列及び対応
するアミノ酸配列を次に示す。

以下余白 組換によりインビボで、又は適切な制限断片の連結によ
りインビトロで、欠失しているヌクレオチドをＹ　ｂ１
８７に加える。これらの方法をそれぞれ第４Ｂ図及び第
４Ｃ図に示す。

組換は、ｃｏｌＥ１プラスミド（例えばｐＬＩ８又はｐ
ＢＲ３２２）に担持されているゲノムＤＮＡクローン及
びｉｎｃ　ＰＩプラスミド（例えばｐＨ１Ｋ２９０）に
担持されているＣＤＮＡクローンをＥ、コリ５Ｒ４３株
（１９８６年９月２２日に寄託されたＡＴＣＣ阻６７２
１７）に導入することにより行うことができる。５Ｒ３
４株はユ■Ｌ　ユ１変異を担持しており（Ｔａｃｏｎ浦
及び５ｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅむ、、　１４７　　：　　３３１−３３５（Ｌ９７６
）　）　、ｃｏｌＥ１プラスミドの複製は制限的温度（
４２°Ｃ）において阻害される。ｃｏｌＥ１プラスミド
により担持された抗生物質耐性（例えば、ｐＢＲ３２２
のＡρ耐性）についての選択を維持しながらの、これら
２種類のプラスミドを含有する５Ｒ３４株の許容温度（
２８℃）から４２°Ｃへの移行が、これら２種類のプラ
スミドの同時組込形（ｃｏｉｎｔｅ−ｇｒａｔｅｄ　ｆ
ｏｒｌｍ）を含む細菌の選択を可能にする。この様な同
時組込み（ｃｏ　ｉ　ｎ　ｔｅｇｒａ　ｔｅ）プラスミ
ドはＤＮＡ相同領域における組換により形成される。

同時組込みプラスミドの単離が、単−Ｐｓｔｌ又はＢａ
ｍＨＩ断片としての十分な長さのｃＤＮＡ配列及び上流
ゲノムＤＮＡのクローニングを可能にする。

上流ＤＮＡのＢａ１３１切断（ｒｅｓｅｃ　ｔ　１ｏｎ
）及びこれにｈＥ　＜　Ｂ　ａ　ｍリンカ−の付加が、
十分な長さのコード領域を含有するクローンの単離を可
能にする＜ＤＮＡ配列分析により確認される）。

十分な長さのコード領域をＢａｍ１ｌ　Ｉ断片として例
ＩＡに記載したようにしてｐＣＩＢ７１０にクローン化
して、植物細胞に移行せしめる。この同じ断片を例４に
後記するようにｐＤＲ５４０にクローン化してＥ、コリ
中で発現せしめる。

別の方法として、ｃＤＮＡの適切な制限断片とゲノムク
ローンを連結することによりＹｂ１８７に対応する完全
クローンを造成することができる（第４Ｃ図）　、　Ｐ
ｓｔ　ｔ　−１１ｉｎｄＩ［ｌ断片として挿入されたゲ
ノムクローンの５′末端を含有するプラスミドｐｕｃ１
９はコード配列の最初の約４００塩基を含有する。ｃＤ
ＮＡコード配列の３′末端を６３０塩基のＨ４ｎｆＪ断
片としてＢＲ３２５の部分的ｃＤＮＡから単離すること
ができる。そのユニークｔｌｉｎｆＩ部位で切断された
ｐＵＣプラスミド及び遺伝子の３′末端を含有する旧ｎ
ｆｌ断片を連結してＧＳＴ遺伝子の完全なコード配列を
再構成する。この完全な遺伝子をＢｇｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ
　ｌ断片として単離する。上流ＤＮＡのＢａ１３１切断
（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）及びこれに続くＢａｍＨＩリン
カ−の付加が上流配列を含まない十分な長さのコード領
域の単離を可能にする。前記のようにして、このＢａｍ
１ｌ　ｌ断片をｐ（：ＩＢ７１０及びｐＤＲ５４０に挿
入する。

±土旦、バイブ１　ドクローン 部分的ｃＤＮＡクローンＹｂ１８７と欠失したヌクレオ
チドとの組合せについて前記した方法（例ＩＣ）と実質
的に同様にして、２つのＤＮＡ断片源として異種性遺伝
子を用いて、異る遺伝子のコード配列に由来するバイブ
リドクローンを造成する。

廿ローＥ、　　ＧＳＴ−ｃＤＮ＾クローンＧＩＹｂのＬ
ｌｉファージ発現ベクターλｇｔｌｌ中のｃＤＮＡライ
ブラリー（Ｙｏｕｎｇ、Ｒ，Ａ、及びＤａｖｉｓ、Ｒ，
Ｗ、＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８（し１１９４　（１９
８３）を、前記の方法（例ＩＡ）に従って、ラットの脳
から単離されたポリ　（Ａ）ＲＮＡから造成する。ラッ
ト脳ＧＳＴに対して生じた抗体を用いる抗体スクリーニ
ング法によりｃＤＮＡを単離する。ＲＮＡの単離、並び
に対応するｃＤＮＡの造成及び単離は従来技術において
記載されている方法、例えばＹｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ
の方法（Ｙｏｕｎｇ、Ｈ１八、及びＤａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ
、。

５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２２　　：　　７７８−７８２
（１９８３）　）により達成する。

得られるｃＤＮＡクローンＧＩＹｂのヌクレオチド配列
及び対応するアミノ酸配列を下に示す。

Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕ　　Ｕｌｕ　　（ｉｌｕ　　Ａｒｇ　　ｔｔｅＡｌａ
　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ
　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　ＳｅｒプラスミドｐＬＷ１１１（
ＡＴＣＣ階４０２３５）は９Ｍ８９にクローン化された
カリフラワー・モザイク・ウィルス（Ｃａ　Ｍ　Ｖ）　
　（Ｆａｎｃｋ等、Ｃｅ１ｌ　、　２１　：　２８５−
２９４（１９８０）　）のＢＪＩ株の３個の小ＥｃｏＲ
Ｉ断片から成る。ｐｌ、讐１１１をＢｇｌＩＩで消化し
、そして１１４９ｂｐ断片（＃　６４９４−７６４３塩
基対）を単離する。この断片をｐ［Ｉｃ１９のＢａｍ１
ｌ　１部位に連結する。この制限断片はその転写のため
の、ＣａＭν３５Ｓ　ｌ？ＮＡのためのプロモーター及
びポリＡ付加シグナル（すなわちターミネータ−）の両
者をコードする。

土ｌ旦上ユ変異誘発 ユニークＢａｍ１１１部位を、このプロモーター及びタ
ーミネータ−の間にインビトロ変異誘発により挿入する
。配列中の塩基対＃　７４６４にＢａｍ１ｌ　ｒ制限部
位が挿入されている点を除きその領域中のＣａＭ■配と
同一である３６−塩基オリゴヌクレオチドを合成する。

上記からの１１４９ｂｐ　　Ｂｇｌ　ＩＩ断片をＭ１３
ｍｐ１９にクローン化し、そして単鎖ファージＤＮＡを
単離する。この単鎖ＤＮＡを前記の合成オリゴヌクレオ
チドとアニールし、該オリゴヌクレオチドをプライマー
として新たな鎖を合成し、そしてこのＤＮＡをＥ、コリ
ＪＭＩＯＩ株にトランスフェクトする（Ｚｏｌｌｅｒ及
びＳｍ１ｔｈ、　Ｄ　Ｎ　Ａ　　３　：４７９−４８８
（１９８０））。

挿入されたＢａｍｔｌ　１部位を有するＭ１３ファージ
を、Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ（前掲）に記載されて
いる様にして単離する。

゛　フ　−ジの゛ 前記３６塩基オリゴヌクレオチドを”Ｐ−ＡＴＰと共に
キナーゼ処理する。１セツトの形質転換されたＭＩ３フ
ァージをニトロセルロースフィルター上に存在せしめる
。このフィルターを上記のラベルされた３６−７−とハ
イブリダイズせしめる。

フィルターを上昇する温度段階において洗浄する。

変異したファージに結合したラベルされた３６−マーは
より高い洗浄温度において安定である。高温において安
定なこれらのファージの１つを単離し、そして配列決定
してＢａｍＨ１部位の存在を確認する。

匹■且虹■遺威 このファージから単離された二本鎖ＤＮＡをｌｌ１ｎｄ
ｌＩ［及びＩＥｃｏＲＩにより消化する。ｐＵｃ１９を
１ｌｔｎｄ■及びＥｃｏＲＩにより開裂せしめる。これ
ら２種類の消化されたＤＮＡを連結する。形質転換体を
アンピシリン耐性により選択する。この連結からの１つ
の形質転換体がｐＣＩＢ７１０である。このプラスミド
を第２図に示す。

１、　プラスミドｐＧＴＲ２００をＨａｅｌＩ　、　Ｐ
ｓｔｌ及びＰｖｏｌｌにより消化し、そしてＧＳＴコー
ド配列を含有する６７８ｂｐ　ＨａｅＥＩ　／　Ｐｓ口
断片をアガロースゲルから単離する。

２、　このＨａｅＨ／Ｐｓｔｌ断片をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼによる処理によって平滑末端化し、そしてこの平
滑末端にＢａｍ１ｌ　Ｉリンカ−（ｄＣＧＧＡＴＣＣＧ
、ニューイングラットビオラプス）をＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結する。

３、　プラスミドｐＣＩＢ７１０をＢａｍ１ｌ　Ｉで切
断し、そしてウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベーリ
ンガーマンハイム）で処理する。

４、　上記からのＢａｍ１ｌ　Ｉ−リンカ−を有するＧ
ＳＴ断片をＢａ１１１で消化されたｐＣＩＢ７１０に連
結し、連結混合物をＥ、３１１１８１０１株に形質転換
し、そして目的の形質転換体をアンピシリンに対する耐
性により選択する。ＣａＭＶプロモーター（ｐＣＩＢ１
２）からの転写のために適切な方向であり且つ逆の方向
（ｐＣＩＢｌｌ）にＧＳＴコード配列を担持する形質転
換体を特徴付ける。

５、プラスミドｐＣＩＢ１０　（例４を参照のこと）を
Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＴで消化する。

６、　プラスミドｐ（ｊＢ１２をＸｂａｌ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化し、そして小断片をアガロースゲルから単離す
る。

７、　キメラ遺伝子を担持する単離されたＸｂａＴ／Ｅ
ｃｏＲＩ断片を消化されたｐｃＩ８１０に連結し、連結
生成物をＥ、３１月１８１０１に形質転換し、そして形
質転換体をカナマイシン耐性により選択する。

ＣａＭＶプロモーターからの転写のために適切な方向に
ＧＳＴコード配列を担持するこれらの形質転換体をｐＣ
ＩＢ１４と命名する（第３図参照のこと）。

８、　プラスミドｐＣＩＢ１１を同様に操作してｐＣＩ
Ｂ１３を造成する。このプラスミドはＣａＭＶプロモー
ターからの転写のために適切な方向とは逆の方向にＧＳ
Ｔコード配列を有する。

アグロバクテリウムへのＣｌＢ１３　　びＣｌＢ１４の
道ｐｃ［Ｂ１３又はｐＣＩＢ１４の精製されたプラスミ
ドＤＮＡを形質転換により、ρＣｌＢ５４２（例７を参
照のこと）を１■持するアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスへ１３６　（Ｗａｔｓｏｎ等、Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、　　ｌブ２号３、：２５５−２６４（１
９７５）　）に導入した。形質転換体をカナマイシン（
５０μｇ／ａ／）及びスペクヂノマイシン（２５μｇ／
−）上で選択した。

プラスミドｐｃＩ［１１２をＢａｍｔｌ　！で消化し、
そして７０８ｂｐのＢａｍ−リンカ−を有するＧＳＴ遺
伝子断片を単離した。プラスミドｐＤＲ５４０（ファル
マシアＰ−Ｌバイオチミカルス）、ｔｒｐ−１ａｃ発現
ベクター（Ｒｕｓｓｅｌ、　Ｄ、Ｒ，及びＢｅｎｎｅｔ
ｔ、Ｇ、Ｎ、、　Ｇｅｎｅ。

２０：　　２３１−２４３（１９８２）　）をＢａｍ１
ｌ　Ｉで消化し、そしてＧＳＴ断片を連結した。生ずる
組換プラスミドをＥ、コリ月１０３株に形質転換した。

得られる株の培養物’ｃ　所望の時点で１．０ｍＭのイ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添
加することにより誘導した。

ＩＰＴＧによる誘導及びＧＳＴＹｂ２００遺伝子の発現
の後、細菌宿主細胞をペレット化する。この形成された
ベレットを５９−の０．２　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ／
　　（ｐＨ８，０）及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸濁す
る。この懸濁液に０．５−のエタノール中１１００ｆｆ
１フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及
び５１ＴＬ／の緩衝液中１０■／−リゾチームを添加す
る。このＱｉ液を、３７℃にて約１５分間、細菌細胞カ
リ岩屑するまでインキュベートする。溶解した細菌細胞
）懸濁液をペレット化し、そして上清を集める。この上
清を、１／１００容量のＰＭＳＦを含有する２５ｍＭＴ
ｒｉｓ−１１Ｃ１（ｐＨ８，０）に対して透析する。

透析された上清をＧＳＴ酵素活性についてアッセイした
。この後、透析された上清をＳ−ヘキシルグルタチオン
−アガロースアフィニティーカラムに、０．５　ｎＵ　
／分の流速で負荷した。このカラムを、２８０ｎｍにお
ける吸光が０．００５未満になるまで２５ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−１１Ｃｊ！及び０．２　Ｍ　　ＫＣｌにより洗浄
した。すべての未結合物質がカラムから洗浄された後、
結合した物質を、５ｍＭ　　Ｓ−ヘキシルグルタチオン
及び２．５　ｍＭグルタチオンを含有する２５ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！　０．２　Ｍ　　Ｋ！Ｊ　　（ｐ
Ｈ８，０）によりン容出した。溶出画分を２８０ｎｍに
おける吸光によりモニターした。精製された酵素を含有
すると信じられる画分を別々に、ＰＥＧを含有する０、
　１　ＭＮａＰＯ４（ｐＨｂ、　５　）に対して透析し
て画分を濃縮し、次にＰＥＧを含まない同じ緩衝液中で
透析した。

透析された各両分の体積を記録した。各百分について濃
縮の程度及びサンプルの量を計算し、そして稀釈して各
両分中に出発画分に対して同じ比率が存在するようにし
た。各両分を酵素活性についてアッセイした。

ＧＳＴ活性は基質として１−クロロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン（ＣＩＤＮＢ）を使用して測定した。

各反応について、１　ｍＭ　ＣＩＤＮＢ　（エタノール
中２０．２■／−）を５１還元型グルタチオン（０，１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中３０．８啄
／−〕及びＧＳＴ酵素に加えた。ＣＩＣＮＢ及び還元型
グルタチオンは毎日新しく調製した。反応は最終合計体
積ＩＷＪで行った。反応は室温で行い、ＣＦＤＮＢの添
加により開始した。反応をギルホード分光光度計により
３４０ｎｍにてモニターした。典型的な反応は１０〜５
０ユニー／　）のＧＳＴを含み、−当り１分間当り基質
１ナノモルを転換する量を１ユニツトとした。

酵素的に活性な百分の蛋白質濃度を出発材料において決
定した（ビオラド、ＢＳＡ標準）。酵素的に活性な両分
のそれぞれを、定量標準として標準酵素の稀釈物（１，
ＯＩＪｇ、０．３ＪＩｇ、及び０．１μｇ）を用いて１
５％のレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）ゲル上で分析した。

特異的抗体を用いるイムノブロッティングにより精製さ
れた酵素を検出した。

Ｍトーヨ顆　　ＣＩＢ　　　　γ゛　ＣＩＢ　　ａ　の
告」プラスミドｐｃＩ［１１０及びｐｃＩ８１０ａの造
成は’Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａむｉｏｎ　　ｏｆ　　ｆ月
ａｓｔｊｄｓ　　ａｎｄ　　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ
”と題する、１９８５年７月１９日に出願された出Ｗｉ
Ｉｔ７５７．０９８に記載されている。この明細占の記
載を引用により不発明細に組み入れる。前記の特許出願
中の下記の段階をこれらのプラスミドの造成のために使
用した（第７ａ図及び第７ｂ図を参照のこと）。

パ七汁侃刀艷或 １５、　ｐＴｉＴ３７からの左側ボーダーを含有するＴ
−ＤＮＡＩｉ片をｐＢＲ３２５（ＥｃｏＲＩ　２９）　
　（Ｙａｄａｖ等、Ｐｒｏ、Ｎａｔ’　ｌ　　Ａｃａｄ
、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　ユ９　　：　　６３２
２（１９８２））　　から単離する。ｐＢＲ３２５（Ｅ
ｃｏＲＩ　２９）をＥｃｏｌ’ｌ　Ｉで切断し、そして
１，１ｋｂｉｔｌ′ｒ片を１ｌｉｎｄｌｌリンカ−にュ
ーイングラットビオラブス）と連絡する。

１６、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ等、Ｇ
ｅｎｅ、　　２　ニア５）をｌ１ｉｎｄｉｌｌで切断す
る。

１７、段階１５に記載した左ボーダー含有断片をｐＢ！
？３２２のｌ１ｊｎｄｌＩＩ消化物に連結する。

１８、段階１７の左ボーダー含存ｐＢ１１３２２プラス
ミドをＣ１ａｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして１
．１ｋｂ１１ｉｎｄ　Ｉ［Ｉ　／　ＣＩａ　Ｉ断片をｉ
ｓする（Ｉｌｅｐｂｕｒｎ等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　　
１．　Ｇｅｎｅｔ、、　　２　：２１１（１９８３）　
）。

１９、プラスミドｐＵｃ１３　　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ
等、並匹。

２６　：　１ＯＨ１９８３）　）をＨｉｎｄｌｌＩ及び
ＥｃｏＲＩで切断し、６０ｂｐのポリリンカーをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ及びγ”ｐ−ｄＡＴＰを用いて
末端ラベルし、そしてアクリルアミドゲルがら単ｋｌす
る。

２０、プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＣ１ａ
ｌで切断し、そして大断片を単離する。

２１、前記６０　ｂｐ　　ｌ１ｉｎｄ　ｍ　／　Ｅｃｏ
ＲＩポリリンカー及びＥｃｏＲＴ　２９の１．１ｋｂ　
　ＨｉｎｄＩ［Ｉ／Ｃ１ａ！断片を、Ｃ１ａ！及びＥｃ
ｏＲＩで切断されたｐＢＩｌ１３２２に連結し、ｐＣＩ
Ｂ５を造成する（段階１５〜２１は第７ａ図を参照のこ
と）。

２２、カナマイシン耐性付与するキメラ遺伝子Ｃｎｏｓ
−ｎｅｏ−ｎｏｓ）　　をＢ１ｎ６　　ＣＢｅｖａｎ、
　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　ＡｃｄｓＲｅｓ、、　１２　：
　８７１１（１９８４））からＳ　ａｌ　Ｉ　／　Ｅｃ
ｏＲＩ断片として取る。

２３、プラスミドｐＵｃ１１１１をＥｃｏＲＩ及び５ａ
ｌｒにより切断する。

２４、段階２２からのキメラ遺伝子を含有するＳ　ａｌ
　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片をＥｃｏＲＩ及び５ａｌｌに
より切断されたｐＬＩｃ１８に連結する。

２５、このキメラ遺伝子のターミネーション配列中のＢ
ａｍＨＩ認識部位を、Ｂａｍｔｌｌで切断し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いてフィルインし、そして連結する
ことにより破壊する。

２６、生ずるプラスミドを５ｓｔｌｌ　（ベセスダリサ
ーチラボラトリーズ）及び旧ｎｄｌｌ［により切断する
。

２７、　ｐＢＩ？３２５　（ＩＩｉｎｄ２３）を旧ｎｄ
ｍ及び５ｓｔＩ［により切断しそして１．Ｏｋｂ断片を
単離することにより、ｎｏｓプロモーターの５′部分及
びｐＴｉＴ３７の右ボーダーを含有する断片を単離する
。

２日、この１．Ｏｋｂ　　Ｉｆｉｎｄｌ／５ｓｔｆ！断
片を段階２６の制限酵素処理されたｐＵｃｌＢに連結し
てｐＣＩＢ４を造成する（段階２２〜２８は第７ｂ図を
参照のこと）。

２９、左側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含有するｐＣＩＢ５を
Ａａｔｎで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる処
理によって平滑末端化し、そして次にεｃｏＲＩで切断
する。

３０、　ＰＣＩＢ４をＨｉｎｄｎｌで切断し、Ｅ、コリ
ＤＮＡポリメラーゼのにＩｅｎｏ−断片を用いる処理に
より平滑末端化し、そしてＥｃｏＲＩにより切断する。

３１、段階２９の制限酵素処理されたｐＣＩＢ５を制御
１＃素処理されたｐｃＩ８４　　（段階３０）と連結し
、キメラ・カナマイシン耐性遺伝子及びポリリンカーを
挟む左側及び右側Ｔ−ＤＮＡボーダーを含むｃｏｌＥｌ
　レプリコンであるｐｃＴＢ２を造成する（段階２９〜
３１は第７ｃ図を参照のこと）。

３２、プラスミドｐＲＺ１０２　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ
等＼及ｏ１゜Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、ｌｊユニ　６５
（１９７９）　）をＢａｍＨｌで消化し、そしてＫｌｅ
ｎｏｗを用いてフィルインする。

３３、プラスミドｐＡＯ３（Ｏｋａ　、　Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏ＋、。

１７４　：　２１７（１９８１）　）のＡｌｕ１部分消
化を行う。

３４、　Ａｌｕｌ消化物を段階３２の制限酵素処理され
たｐＲＺ１０２に連結し、カナマイシンに対する耐性に
より所望の形質転換体を選択する。

３５、生ずるプラスミドは１．０５ｋｂ　　Ｂａｍ１ｌ
　＋断片上に存在するＴｎ９０３コード配列を存し、該
断片はＢａｍ１ｌ　Ｉ消化の後に単離される。この断片
をＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで処理する。

３６、広宿主域プラスミドｆ？に２の誘導体であるプラ
スミドｐＲＫ２５２はサンジエゴ、カリホルニア大学の
Ｄｏｎ　ｔｌｅｌｉｎｓｋｉ博士から入手可能である。

このプラスミドは親プラスミドｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔ
ｔａ等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　７７
裟７３４７（１９８０））中に存在するＢｇｌｎ部位を
欠（、ｐＲＫ２５２をＳｍａｌ及び５ａｌｌで消化し、
Ｋｌｅｎｏ−を用いてフィルインし、そしてこの消化に
由来する大断片を単離する。

３７、段階３５で単離されたＴｎ９０３含有断片をｐＲ
Ｋ２５２からの大断片に連結し、ｐＲＫ２５２ｋｍを造
成する（段階３２〜３７は第７ｄ図を参照のこと）。

３８．１ラスミドｐＲＫ２５２ｋｍをＥｃｏｌｌ　１で
切断し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて平滑末端化し、そしてＢ
ｇｌＩＩリンカ−にューイングラットビオラブス）と連
結する。

３９、プラスミＦ−″ｐ（ｊＢ２をＥｃｏＲＶで切断し
、そして右側ボーダー及びｎｏｓ−ｎｅｏ−ｎｏｓを含
有する小断片を単離する。この断片をＫｌｅｎｏ−ポリ
メラーゼを用いてフィルインし、そしてＢｇｌＵリンカ
−にューイングラットビオラブス）を付加する。

４０、段階３９からのＢｇＩｎ断片を段階３８のリンカ
−を付与したｐＲＫ２５２にｌと連結し、ｐｃＬＢｌｏ
を調製する（段階３８〜４０は第７図ｅを参照のこと）
。

西旦刊とΩ遺戒 ４１、プラスミドｐＲＺ１０２　（Ｊｏｒｇｅｎｓｃｎ
等、（１９７９））をＢａｎ＋ｆｌｔで消化し、そして
Ｋｌｅｎｏｗを用いてフィルインする。

４２、プラスミドｐＡＯ３Ｃ０ｋａ等、（１９７８）　
）のＡｌｕ１部分消化を用う。

４３、　ＡｌｕＩ消化物を段階３２からの制限酵素処理
されたｐＲＺ１０２に連結し、カナマイシンに対する耐
性により所望の形質転換体を選択する。

４４、得られるプラスミドは１．０５ｋｂ　　Ｂａｍ１
ｌ　Ｉ断片上に存在するＴｍ２Ｏ３のコード配列を有す
る。この断片をＢａｍＨＩによる消化の後に単離し、そ
してに１ｅｎｏ−によりフィルインする。

４５．広宿主域プラスミドＲＫ２の誘導体であるプラス
ミドｐｌ？に２９０がサンジエゴ、カリホルニア大学の
Ｄｏｎ　ｔｌｅｌｉｎｓｋｉ博士から入手可能である。

ｐＲＫ２９０をＳｍａｌ及び５ａｌｔで消化し、にＩｅ
ｎｏｗを用いてフィルインし、そしてこの消化により生
ずる大断片を単離する。

４６、段階３５において単離されたＴｎ９０３含有断片
をｐｌ？に２９０からの大断片に連結し、ｐＲＫ２９０
Ｋｍを造成する。

４７、段階４６のプラスミドをＢｇｌｎで消化し、Ｋ　
ｌｅｎｏｗを用いてフィルインし、そして連結してその
Ｂｇ１１１部位を破壊するとこによりｐＲＫ２９０Ｋｍ
を造成する（段階４１〜４７については第７ｆ図を参照
のこと）。

４８、プラスミドｐＲＫ２９０ＫｍをＥｃｏＲＩで切断
し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて平滑末端化し、そして８ｇｌ
ｌｌリンカ−にニューイングラットビオラプス）と連結
する。

４９、プラスミドｐＣＩＢ２をＥｃｏＲＶで切断し、そ
して８ｇｌｌｌリンカ−にニューイングラットビオラプ
ス）と連結する。

５０、段階３９のＢｇｌ■リンカ−を付したｐｃＩ８２
を段階４７のベクターに連結してｐＣＩＢｌｏａを造成
する（段階４８〜５０については第７ｇ図を参照のこと
）。

プラスミドｐＲＫ２９０とｐＲＫ２５１をとりかえて段
階４１〜５０を反復することができる。

リブロースビス−ホスフェートカルボキシラーゼ（Ｒｕ
ＢＰＣ）　（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ等、Ｊ、　Ｍｏ１．
　旺吋。

Ｇｅｎｅｔ、　＋上：　　４８３−４９８（１９８２）
）の大豆−大サブユニット（Ｓ　Ｓ　Ｕ）の５′配列を
含有するプラスミドｐｓＲ５２，１を、アテンス、ジョ
ーシア３０６０２　、ジョーシア大学遺伝学部、Ｒｉｃ
ｈａｒｄ　Ｍｅａｇｔ＋ｅｒ博士から得る。このプラス
ミドをＥｃｏＲＩで消化する。大豆５ＳＵ５　’領域を
含有する２、１ｋｂ断片をアガロースゲルから単離する
。２．１　ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ断片をＤｄｅｌにより消
化する。４７１ｂｐ　Ｄｄｅ　Ｔ断片を単離する。この
断片はトランシット（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチド及び第
二エクソンの部分を含有する。

４７１ｂｐ　Ｄｄｅ　Ｉ断片をＫｌｅｎｏｗ　（−ｓ−
イングラットビオラプス）により処理する。この断片に
キナーゼ処理されたＢｇｌＵリンカ−Ｃｄ　（ＣＡＧＡ
ＴＣＴＧ）、ニューイングラットビオラプス〕を連結す
る。このＢｇｌＩＩ断片をＴａｑｌで消化する。生ずる
Ｔａｑｌ断片をＫｌｅｎｏｗ　（ベセスダ・リサーチ・
ラプス、ＤＮＡポリメラーゼ）で処理する。生ずる平滑
断片をキナーゼ処理されたＢａｍ１ｌ　ｆリンカ−（ｄ
（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧ）　、ニューイングラット
・ビオラプス〕に連結し、そして精製する。これらのＢ
ａｍ１ｌ　Ｉ断片をＢｇｌＩＩ及びＢａｍｔｌ　Ｉによ
り消化する。

約４００ｂｐのＢａｍｔｌ　Ｉ　／　Ｂ　ｇｌ　ＩＩ断
片を精製する。この断片は５ＳＵ５　’領域を含有する
。

ｐＣＩＢ７１０をＢａｍ１ｌ　Ｉで切断し、そしてウシ
腸アルカリ性ホスファターゼで処理する。４００ｂｐ　
ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をこのｐ］Ｂ７１０に連結
する。この連結生成物をＥ、コリ　ＩＩＢＩＯＩに形質
転換し、そして形質転換体をアンピシリン上で選択する
。

両方向にＢａ５ａｌｔ　Ｉ　／　Ｂ　ｇｌ　ＩＩ断片を
担持する形質転換体が見出される。　ｐＳＣＲ２は３５
Ｓプロモーターに隣してトランシットペプチドの５′領
域を有する。

Ｃ，ｐｓｃｒｌｌは逆方向にＢａｍＨＩ　／　Ｂ　ｇｌ
　Ｉｆ断片を有する。

ｐｃＩ８１２をＢａｍ１ｌｒで消化し、そしてｃ　ｓ　
”ｒ”遺伝子を担持する７０８ｂｐ　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ断
片を単離する。プラスミドｐＳＣＲ２をＢａｍ１ｌ　Ｉ
で切断し、そしてウシ小腸アルカリ性ホスファターゼで
処理する。ｐｃＩ１３１２からの７０８ｂｐ　ＢａｍＨ
Ｉ断片を、Ｂａｍｔｌ　Ｉで処理されたｐｓｃ！ン２に
連結する。連結生成物をＩｔ　Ｂ　１０１に形質転換し
、そして形質転換体をアンピシリン上で選択する。

５′制限Ｎ域に対してそれぞれの方向にＧＳＴ遺伝子を
担持する形質転換体が見出される。クローンρＣｌＢ２
２はＣａＭＶプロモーターからの転写のために適切な方
法にＧＳＴ遺伝子を有する。クローンｐＣＩＢ２１は逆
方向にＧＳＴ遺伝子を有する。

ｐｃｒＢ２２をＸｂａｌ及びＥｃｏＲＩにより消化する
。キメラ遺伝子を担持する断片をゲルから精製する。

プラスミドｐＣＩＢ１０をＸｂａｌ及びＥｃｏＲＩで消
化する。キメラ遺伝子を担持するＸ　ｂａ　Ｉ　／　Ｅ
ｃｏＲＩ断片を、消化されたｐＣＩＢｌｏに連結し、そ
して形質転換体をカナマイシン耐性により選択する。生
ずるプラスミドｐＣＩＢ２４は葉緑体トランシフトペプ
チド配列に付加されたキメラＧＳＴ遺伝子をｉｌｌ持す
る広宿主域プラスミドである。

同様の操作を用いそしてｐｃＩｎ２２の代りにクローン
ｐｃＩ８２１から出発してプラスミドｐＣＩＢ２３を造
成する。このプラスミドはｐＣＩＢ２４のＧＳＴ遺伝子
に対して逆方向にＧＳＴ遺伝子を担持する。

前記ｐＣＩＢ１３及びρＣＩＢＩ４と同様にして、これ
らのプラスミドをアグロバクテリウム株に導入する。

Ｔｉ　プラスミドｐＴｉＢｏ５４２　（Ｓｃｉａｋｙ　
、　Ｄ、　Ｍｏｎｔｏｙａ＋Ａ、　Ｌ、及びＣｈｉｌｔ
ｏｎ、　Ｍ−Ｄ＋Ｐｌａｓｎｉｄ、土：　２３８−２５
３（１９７８）　）は興味深い。なぜなら、このＴｉプ
ラスミドを担持するアグロバクテリウムは農業上重要な
豆科植物であるアルファルファ、及び大豆に感染するこ
とができるからである。（ｉｔ　ｏ　ｏ　ｄ　＋　ε。

Ｅｌ等、肛収１襲〃赴Ｊｄ＋　　２　ニア０２−７０８
（１９８４）　）。

Ｔ−ＤＮＡ上で除去が行われたｐＴｉＢｏ５４２誘導体
の造成が記載されている（ｔｌｏｏｄ、　Ｅｌｉｚａｂ
ｅｔｈ　Ｅ、。

（１９８５）、博士論文、ワシントン大学、セントルイ
ス、Ｍｏ）　、　ＥＨＡＩＯＩと称されるこの造成物に
おいてはＴ−ＤＮＡがカナマイシン耐性遺伝子により置
き換えられている。ＩＥＩＩＡＩＯＩの親であるＡ２８
１はＡＴＣＣＩｔ５３４８７としてＡＴＣＣに寄託され
ている。

カナマイシン耐性遺伝子がスベクチノマイシン耐性遺伝
子により置き換えられたＥＨＡＩＯＩの誘導体を造成し
た。プラスミドｐｐｉδ３０７　　（ＩＥ、　Ｈｏｏｄ
、ワシントン大学、論文（１９８５）　）はｐＴｉＢｏ
５４２　（ｌｌｏｏｄ等（１９８４，））のＢａｍ　ａ
の左側に同相な１．７ｋｂＲＪｌ域及びｐＴｉＢｏ５４
２のＢａｍ２ａの右側に相同なＱｋｂｆｉｌＩ域を有し
、これらの領域はユニークＥｃｏＲ１部位により分離さ
れている。プラスミドｐＭＯＮ３０　（、へＴＣＣ隘６
７１１．３）はＴｎ７　　（ｌｌｏｌｌｉｎｇｓｈｅａ
ｄ、　Ｓ、及びＶａｐｎｅｋ、　Ｄ、。

Ｐｌａｓｍｉｄ、　１３　：　１７−３０（１９８５）
）からのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性
遺伝子（ｓｐｃ／ｓ　ｔｒ）を担持する。ｐｈｏＮ３ｏ
をＥｃｏＲＩにより消化し、ｓｐｃ／ｓｉｒ遺伝子を含
有する５、　５　ｋｂ断片をアガロースゲルから単離し
、そしてＥｃｏＲＩにより処理されたプラスミドｐ　ｐ
ｉδ３０７に連結する。目的の形質転換体をスベクチノ
マイシン耐性（５０μｇ／−）テトラサイクリン感性（
ｌｏｇ／ｍ）形質転換体として選択する。このプラスミ
ドをアグロバクテリウム４１３６／ＥＩＩＡＩＯＩに形
質転換し、そしてそのストレプトマイシン耐性、テトラ
サイクリン耐性、カナマイシン耐性表現型により選択す
る。ＥＩＩＡＩＯＩのホモ部分二倍体（ｈｏｍｏｇｅｎ
ｏｔｅ）　　（Ｍａｔｚｋｅ。

八、　　Ｊ、　　Ｌ及びＣｈＨｔｏｎ、　　門　　Ｄ、
　　　Ｊ　　　Ｍｏｌ　　　Ａ　　　Ｉ。

Ｇｅｎｅｔ、、土：　３９−４９（１９８１））及びス
ペクチノマイシンブラスミドを、放逐（エビクション、
ｅｖｉｃｔｉｏｎ）プラスミドＲ７５１−ｐＭＧ２　（
Ｊａｃｏｂｙ、　Ｇ、等、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、１２７　：　１２７８−１２８５（１９７６））の導
入並びにゲンタマイシン（５０ｇ／＠ｌ）及びスベクチ
ノマイシン上での選択の後に選択した。目的のホモ部分
二倍体はゲンタマイシン耐性、スペクチノマイシン耐性
、テトラサイクリン感受性及びカナマイシン感受性表現
型を有していた。生ずるプラスミドの構造をサザンブロ
ノトのブロービングにより確認した。

■−１ヱ上立乏上謝上Ｘ二■口３旧旭凱仄狂ＧＳＴｉｊ
！伝子造成物ｐｃＩ８１４を担持する再生されたタバコ
植物は、 （２）対照植物又は雑草に対して毒性であるアトラジン
レベルにおいて実生が生育する能力；を含む幾つかの測
定唄口により決定した場合、アトラジンに対して耐性で
ある。

蛍光誘導アッセイは植物中の光化学装置の状態を示すも
のである。（Ｖｏｓｓ等、１４ｅｅｄ　５ｃｉｃｎｃｅ
＋　３２：６７５−６８０（１９８４）　）。このアッ
セイにおいては、葉組織に特定の波長の光を照射し、そ
して生ずる第二波長の蛍光を記録する。第５図は、切断
された葉柄（葉）を通しての取り込みにより緩衝液が浸
潤した切り取られたタバコ　（形質転換されていない）
の葉の蛍光誘導の典型的なパターンを示す（下方の曲線
）。光照射開始時の蛍光の急速な上昇、及びピーク後の
時間経過にともなうシグナルのなめらかな下降が見られ
る。このパターンは、葉緑体が入射光により励起され、
そして系に特徴的な波長の蛍光を発することを示してい
る。この時点で、エネルギーが先糸■及びＩの電子伝達
経路を通る電子の流れとして先糸から流出する。このこ
とは、蛍光シグナルのなめらかな下降曲線により示され
る。しかしながら、葉が１０−’Ｍアトラジンの溶液に
より浸潤されれば、第５図の上方の曲線のようなパター
ンが見られる。ここでは、光エネルギーが吸収され、葉
緑体が励起され、そして蛍光を発するが、先糸■のキノ
ン結合段階において電子の流れがブロックされるのでエ
ネルギーの流出（ｃｈａｎｎｅｌ　ｉｎｇ）が起らない
。これはあたかも先糸が励起された状態で凍結されたご
ときである。従って、蛍光の急速な上昇は見られるがそ
れに続く下降が全く起らない。

１０−５Ｍアトラジンの存在下で、この発明に従って遺
伝子操作されたタバコ植物について上記のごとき測定を
行った場合、すべての対照植物は非−遺伝子移行タバコ
と同じ蛍光誘導パターンを示す。

実験植物に対して測定を行った場合、これらはその蛍光
誘導パターンに従って３クラスに分けられる（第６図）
。

遺伝子移行植物の幾つかはアトラジンの無毒化の証拠を
示さず（最上部の曲線）、幾つかは控えめな無毒化を示
しく中間の曲線）、そして幾つかは有意なアトラジン無
毒化を示した（下方の曲線）。

これは先糸を通しての正光な電子の流出により示される
。こうして特徴付けられた２７の植物の内、５植物がア
トラジンを無毒化する能力の有意な証拠を示した。

■−１２のアグロバクーリウム感−０ 異る遺伝子型のアグロバクテリウム・チュメファシエン
スをＡＢ最少培地［Ｗａｔｓｏｎ、　Ｂ、等、ムＢａｃ
ｔｅｒｉｏ１．．１２３　：　２５５　２６４（１９７
５）　）　＋マンニトール上で２８℃にて４０時間増殖
せしめた。細菌をペレット化し、２倍稀釈でＭＳＢＮ培
地中に再懸濁し、そして２５°Ｃにて３時間保持した。

（ＭＳＢＮ培地は前包装された混合物（ＫＣビオロシカ
ルス）を用いて調製し、バｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏ
ｏｇの高塩濃度及び低塩濃度とし、次の添加物（最後濃
度）を加えた：ヘンジルアデニン（Ｉｍｇ／ｊ２）　　
；ナフチル酢酸（０，１■／ｌ）；ミオ−イノシトール
（１■／β）；ニコチン酸（１ｍ＋ｒ／ｊ２）；ピリド
キシン（１＋＋ｖ／Ａ）；チアミンＩＩＣｊ！（１０■
）；及びシュークロス（３０■／ｌ）〕。ρ■を５．７
〜５．８に調製した。インビトロ培養されたニコチアナ
・タバカム・ＣＶ・ペタイト・ハバナ５ＲＩ（Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、　ｐｅｔｉｔｅ　
１ｌａｖａｎａ　５ＲＩ）植物の葉片を、１ｌｏｒｓｈ
、　Ｒ，等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７　：　１２２９
−１２３１　（１９８５）の方法の変法において、細菌
懸濁液上に１０分間浮べた。次に、これらを抗生物質を
含有しないＭＳＢＮ上の濾紙に移した。４８時間目に葉
片を５００■／ｌのカルベニシリンを含有する液体ＭＳ
ＢＮに浸たし、そして１００ｍｇ／ｌのカナマイシン及
び５００■／ｌのカルベニシリンを含有する固体ｉ！択
培地に移した。

ｋ良釦灯り℃１１粒 選択培地上のカルスから生じた芽を取り出し、そして１
００■／ｌのカナマイシン及び２５０■／ｌのカルベニ
シリンを含有すＯＭＳに移し、そして３週間発育を続け
させた。次にこれらを土壌に植え付け、そしてグリーン
ハウスに移した。グリーンハウスに移した後４〜８週間
で花を形成した。

開花しそしてその釣が伊裂　　したとき、ビンセットを
使って豹を取りそして杓を柱頭にこすりつけることによ
り各花を自家受粉せしめた。４０日間で種子のさやが成
熟した。

まず、種子を成熟したさやから無菌的に取り出し、そし
て無菌ベトリ皿に貯蔵した。次に種子を、完全濃度のＭ
ｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇの多量塩及び微量塩（
ＫＣビオロジカルス）、１■／！のチアミン塩酸塩及び
０．６％の精製寒天（ディフコ）を含んで成る半軟性種
子発芽培地（ＳＧＭ）上に置いた。分析グレードのアト
ラジンを１０−７Ｍ、３×１０−’Ｍ、５　Ｘｌ０−’
Ｍ、’　８　Ｘｌ０−７Ｍ及び１０−ｂＭの濃度の培地
に加えた。実生の生育及び生存をこれらの濃度上及び０
レベルのアトラジン上で１４日目に評価した。結果を第
１表に示す。すべての対照植物及び対照遺伝子移転植物
は発芽したが、しかし５ＸＩＱ−’Ｍ以上のアトラジン
濃度において、生育の子葉の段階の後生育に失敗した。

すべての自家受粉ｐｃ［［１１／ｌ植物の種子から生育
した実子の内約７５％が５Ｘ１０−’Ｍにおいて緑色の
ままであり、そして−成葉を形成したが、アトラジン濃
度８×１０−’Ｍ以上での実生は子葉のみを形成した後
変色しそして乾燥した。耐性実生は、アトリジン不含有
培地上はどには良好にアトラジン培地上で生育しなかっ
たが、これらは同じ培地上で感受性実生から容易に識別
することができた。

以下余白 ＬＢＡ　４４０４　　　　　　　　＋　　　　　＋　　
　　○　　　　○　　　０Ｂｉｎ　６　　　　　　　　
　　＋　　　　　＋　　　　　Ｏ○　　　○ｐＣＩＢ１
３　　　　　　　　　＋　　　　　＋　　　　○　　　
　Ｏ０表中には、ｐＣＩＢ１４遺伝子移転植物からの子
孫とすべての対照からの子孫との間の生育及び生存の差
を示す。陽性生育反応は十で示し、○は生育しなかった
ことを示す。

以上、本発明を具体的に説明したが、本発明の範囲がこ
れらの具体例に限定されるものではない。

与えられた具体的なヌクレオチド配列を有しそしてゲル
タデオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドをコード
するＤＮＡ分子のみならず、グルタチオンＳ−）ランス
フェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードする変異体
又は突然変異体も、この発明の態様である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラット肝臓グルタチオンｓ−トランスフェラ
ーゼ遺伝子Ｙ　ｂ２００のｐＧＴＲ２００ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ挿入部のための配列決定方法を示す。 第２図は、ＣａＭＶ３５Ｓ　　ＤＮＡ転写のためのプロ
モーター及びそのターミネータ−並びにポリＡ付加シグ
ナルを含有するＥ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　　レプリ
コンであるプラスミドｐＣＩＢ７１０を示す。 第３図は、ラソ（・肝臓グルタチオンｓ−トランフフェ
ラーゼｃ　ＤＮＡ遺伝子Ｙ　ｂ２００に連結されたＣａ
ＭＶ３５Ｓ　　プロモーター及びＣａＭＶターミネータ
−を有するキメラ遺伝子を含むＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ
）　　レプリコンであるプラスミドｐＣＩＢ１２の造成
を示す。 第４Ａ図は、ラット肝臓グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ遺伝子Ｙ　ｂ２００に連結されたＣａＭＶ　３５
　Ｓ　　プロモーター、ＣａＭＶターミネータ−及びカ
ナマイシン耐性遺伝子ｎｏｓ−ｎｅｏ−ｎｏｓを含むキ
メラ遺伝子を伴い、Ｔ−ＤＮＡボーダー内に２個のキメ
ラ遺伝子を含有する広宿主域レプリコンであるプラスミ
ドｐ（ＪＢ１４の造成を示す。 第４Ｂ図は、インビボ組換法による部分クローンの完成
を示す。 第４Ｃ図は、インビトロ連結法による部分クローンの完
成を示す。 第５図は、遺伝子移転されないタバコの葉に典型的な蛍
光の誘導のパターンを示す。上方の曲線は葉が１０−’
Ｍアトラジンを４８時間吸収した後に見られる。下方の
曲線は緩衝液のみによる阻害の後に見られる。 第６図は、ｐＣＩ８１４遺伝子移転タバコ植物の葉にお
いて、１０−５Ｍアトラジンを４８時間吸収した後に見
られる。３種類の応答が見られ、（ｉ）アトラジンの無
毒化を示さない上方曲線；（ｉｉ）アトラジンの有意の
無毒化を示す下方曲線１及び（ｉｉｉ　）幾らかの中程
度の無毒化を示す中央曲線である。 第７ａ図はｐＣＩＢ５の造成を示す。 第７ｂ図はｐＣＩＢ４の造成を示す。 第７Ｃ図はρＣｌ８２の造成を示す。 第７ｄ図及び第７ｅ図はρＣｌＢ１０の造成を示す。 第７ｆ図及び第７ｇ図はｐ（ｊＢｌｏａの造成を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、除草剤を無毒化することにより植物に除草剤耐性を
   付与する組換ＤＮＡ分子。 ２、前記除草剤がクロロアセタミド類、スルホニル尿素
   類、トリアジン類、ジフェニルエーテル類、イミダゾリ
   ノン類又はトリカルバメート類である特許請求の範囲第
   １項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ３、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチド
   をコードする遺伝子配列を含んで成る特許請求の範囲第
   １項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ４、前記遺伝子配列が植物細胞中で発現されるものであ
   る特許請求の範囲第１項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ５、前記植物細胞がタバコ植物の細胞、大豆植物の細胞
   又は綿植物の細胞である特許請求の範囲第４項に記載の
   組換ＤＮＡ分子。 ６、前記植物細胞が全体植物の部分である特許請求の範
   囲第４項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ７、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチド
   をコードする前記遺伝子配列が哺乳類由来のものである
   特許請求の範囲第３項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ８、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチド
   をコードする前記遺伝子配列がラット由来のものである
   特許請求の範囲第７項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ９、ラット−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリ
   ペプチドをコードする前記遺伝子配列が次のヌクレオチ
   ド配列： 【遺伝子配列があります】 を含んで成る特許請求の範囲第８項に記載の組換ＤＮＡ
   分子並びにグルタチオン５−トランスフェラーゼ活性を
   有するポリペプチドをコードするその突然変異体及び変
   異体。 １０、ラット−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポ
   リペプチドをコードする前記遺伝子配列が次のヌクレオ
   チド配列： 【遺伝子配列があります】 を含んで成る特許請求の範囲第８項に記載の組換ＤＮＡ
   分子並びにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性を
   有するポリペプチドをコードするその突然変異体及び変
   異体。 １１、ラット−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポ
   リペプチドをコードする前記遺伝子配列が次のヌクレオ
   チド配列： 【遺伝子配列があります】 を含んで成る特許請求の範囲第８項に記載の組換ＤＮＡ
   分子並びにグルタチオン５−トランスフェラーゼ活性を
   有するポリペプチドをコードするその突然変異体及び変
   異体。 １２、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第８項に記載の組換ＤＮＡ分子
   並びにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性を有す
   るポリペプチドをコードするその突然変異体及び変異体
   。 １３、前記遺伝子配列がゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡから
   成る特許請求の範囲第１項、第２項又は第８項のいずれ
   かに記載の組換ＤＮＡ分子。 １４、前記遺伝子配列がゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両
   者を含んで成る特許請求の範囲第１項、第２項又は第８
   項のいずれかに記載の組換ＤＮＡ分子。 １５、前記遺伝子配列が複数の属の生物の遺伝子の部分
   を含んで成る特許請求の範囲第１項、第２項、又は第８
   項のいずれかに記載の組換ＤＮＡ分子。 １６、前記遺伝子配列が同一生物の複数の株、変種又は
   種に由来する複数の遺伝子の部分を含んで成る特許請求
   の範囲第１項、第２項又は第８項のいずれかに記載の組
   換ＤＮＡ分子。 １７、前記遺伝子配列が同一生物の複数の遺伝子の部分
   を含んで成る特許請求の範囲第１項、第２項又は第８項
   のいずれかに記載の組換ＤＮＡ分子。 １８、植物プロモーターに作用可能に連結されている、
   グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドをコ
   ードする遺伝子配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子。 １９、前記遺伝子配列が植物プロモーターに関して異種
   性である特許請求の範囲第１８項に記載の組換ＤＮＡ分
   子。 ２０、前記遺伝子配列が植物細胞中で発現されるもので
   ある特許請求の範囲第１８項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２１、前記遺伝子配列が植物細胞中で発現されるもので
   ある特許請求の範囲第１９項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２２、前記植物細胞がタバコ植物の細胞、大豆植物の細
   胞又は綿植物の細胞である特許請求の範囲第２０項に記
   載の組換ＤＮＡ分子。 ２３、前記植物細胞が全体植物の部分である特許請求の
   範囲第２０項に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２４、前記植物プロモーターがｎｏｓプロモーター、ｏ
   ｃｓプロモーター及びＣａＭＶプロモーターから選択さ
   れたものである特許請求の範囲第１８項に記載の組換Ｄ
   ＮＡ分子。 ２５、前記植物プロモーターがリプロースビス−ホスフ
   ェートカルボキシラーゼの大豆小サブユニットのプロモ
   ーター、及びクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質のプロモー
   ターから選択されたものである特許請求の範囲第１８項
   に記載の組換ＤＮＡ分子。 ２６、特許請求の範囲第１項、第２項、又は第８項〜第
   １３項のいずれかに記載の組換ＤＮＡ分子を含んで成る
   ＤＮＡ移動ベクター。 ２７、特許請求の範囲第１項、第２項、又は第８項〜第
   １３項のいずれか１項に記載の組換ＤＮＡ分子を含んで
   成るＤＮＡ発現ベクター。 ２８、特許請求の範囲第２６項に記載のＤＮＡ移動ベク
   ターを含んで成る宿主細胞。 ２９、特許請求の範囲第２７項に記載のＤＮＡ発現ベク
   ターを含んで成る宿主細胞。 ３０、前記宿主細胞が微生物である特許請求の範囲第２
   ８項又は第２９項に記載の宿主細胞。 ３１、前記細胞が植物細胞である特許請求の範囲第２８
   項又は第２９項に記載の宿主細胞。 ３２、特許請求の範囲第１項、第２項、又は第８項〜第
   １３項のいずれか１項に記載の組換ＤＮＡ分子を含んで
   成る宿主細胞。 ３３、前記宿主細胞が微生物である特許請求の範囲第３
   ２項に記載の宿主細胞。 ３４、前記宿主細胞が植物細胞である特許請求の範囲第
   ３２項に記載の宿主細胞。 ３５、特許請求の範囲第３４項に記載の植物細胞を含ん
   で成る植物及びその種子。 ３６、特許請求の範囲第３５項に記載の植物細胞から再
   生された、突然変異体及び変種子孫を包含する植物の子
   孫。 ３７、ロツス￥（Ｌｏｔｕｓ￥）、メディカゴ￥（Ｍｅ
   ｄｉｃａｇｏ）￥、オノブリチス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉ
   ｓ）、トリフォリウム￥（Ｔｒｉｒｏ１ｉｕｍ￥）、ト
   リゴネラ￥（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）￥、シトルス￥（
   Ｃｉｔｒｕｓ）￥、リヌム￥（Ｌｉｎｕｍ￥）、マニホ
   ット￥（Ｍａｎｉｈｏｔ￥）、ダウクス￥（Ｄａｕｃｕ
   ｓ）￥、アラビドプシス￥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ￥
   ）、ブラッシカ￥（Ｂｒａｓｓｉｃａ）￥、ラパヌス￥
   （Ｒａｐｈａｎｕｓ）￥、シナピス￥（Ｓｉｎａｐｉｓ
   ￥）、アトロパ￥（Ａｔｒｏｐａ）￥、カプシクム￥（
   Ｃａｐｓｉｃｕｍ）￥、ダツラ￥（Ｄａｔｕｒａ）￥、
   ヒオスシアムス￥（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）￥、リコペ
   ルシコン￥（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）￥、ニコチァ
   ナ￥（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ￥）、ソラヌム￥（Ｓｏｌａ
   ｎｕｍ￥）、ペツニア￥（Ｐｅｔｕｎｉａ￥）、マジョ
   ラナ￥（Ｍａｊｏｒａｎａ￥）、シコリウム￥（Ｃｉｃ
   ｈｏｒｉｕｍ￥）、ヘリアンサス￥（Ｈｅｌｉａｎｔｈ
   ｕｓ）￥、ラクツカ￥（Ｌａｃｔｕｃａ￥）、アスパラ
   ガス￥（Ａｓｐａｒａｇｕｓ￥）、アンチリヌム￥（Ａ
   ｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ￥）、パニクム￥（Ｐａｎｉｃｕ
   ｍ￥）、ペンニセツム￥（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）￥、
   ラヌンクルス（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、サルピグロッ
   シス￥（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）￥、グリシン￥（
   Ｇｌｙｃｉｎｅ￥）、ゴッシピウム￥（Ｇｏｓｓｙｐｉ
   ｕｍ￥）、マルス￥（Ｍａｌｕｓ￥）、プルヌス￥（Ｐ
   ｒｕｎｕｓ）￥、ロサ￥（Ｒｏｓａ）￥、ポプルス￥（
   Ｐｏｐｕｌｕｓ￥）、アリウム￥（Ａｌｌｉｕｍ）￥、
   リリウム￥（Ｌｉｌｉｕｍ）￥、ナルシッスス￥（Ｎａ
   ｒｃｉｓｓｕｓ￥）、アナナス￥（Ａｎａｎａｓ）￥、
   アラチス￥（Ａｒａｃｈｉｓ￥）、ファセオルス￥（Ｐ
   ｈａｓｅｏｌｕｓ￥）、及びピスム￥（Ｐｉｓｕｍ￥）
   から成る群から選択された特許請求の範囲第３５項に記
   載の植物。 ３８、ロリウム￥（Ｌｏｌｉｕｍ）￥、ゼア￥（Ｚｅａ
   ）￥、トリチカム￥（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）￥、ソルガム
   ￥（Ｓｏｒｇｈｕｍ￥）、及びブロムス￥（Ｂｒｏｍｕ
   ｓ）￥から成る群から選択された特許請求の範囲第３５
   項に記載の植物。 ３９、特許請求の範囲第３５項に記載の植物の種子。 ４０、特許請求の範囲第３６項に記載の植物の種子。 ４１、特許請求の範囲第３７項に記載の植物から再生さ
   れた、変異体及び変種子孫を包含する植物の子孫。 ４２、特許請求の範囲第３８項に記載の植物から再生さ
   れた、変異体及び変子を包含する植物の子孫。 ４３、特許請求の範囲第１項、第２項、又は第８項〜第
   １３項のいずれか１項に記載の組換ＤＮＡ分子により植
   物細胞を形質転換することを含んで成る除草剤耐性植物
   細胞の製造方法。 ４４、特許請求の範囲第３４項に記載の植物細胞から植
   物を再生することを含んで成る除草剤耐性植物の製造方
   法。 ４５、除草剤感受性植物と特許請求の範囲第３５項又は
   第３６項に記載の除草剤耐性植物とから成る混合集団中
   の除草剤感受性植物を選択的に抑制する方法であって、
   前記混合集団を前記除草剤感受性植物の生育又は発達に
   影響を与えるのに十分な植物抑制量の除草剤と接触せし
   めることを含んで成る方法。 ４６、除草剤感受性植物と特許請求の範囲第３５項又は
   第３６項に記載の除草剤耐性植物とから成る混合集団中
   の除草剤感受性植物を選択的に抑制する方法であって、
   前記混合集団を前記除草剤感受性植物の生育又は発達に
   影響を与えるのに十分な植物抑制量の除草剤及び増感剤
   と接触せしめることを含んで成る方法。 ４７、￥ｖｉｒ￥プラスミドｐＣＩＢ５４２。 ４８、プラスミドｐＣＩＢ５４２及びＴ−ＤＮＡプラス
   ミドを含有するアグロバクテリウム・チュメファシエン
   ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
   ｎｓ）により形質転換された細胞を含む植物。 ４９、フラガリア￥（Ｆｒａｇａｒｉａ）￥、ロツス￥
   （Ｌｏｔｕｓ￥）、メディカゴ￥（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
   ￥、オノブリチス￥（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）￥、トリ
   フォリウム￥（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ￥）、トリゴネラ￥
   （Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）￥、ビグナ￥（Ｖｉｇｎａ￥
   ）、シトルス￥（Ｃｉｔｒｕｓ）￥、リヌム￥（Ｌｉｎ
   ｕｍ￥）、ゼラニウム￥（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）￥、マニ
   ホット￥（Ｍａｎｉｈｏｔ￥）、ダウカス￥（Ｄａｕｃ
   ｕｓ）￥、アラビドプシス￥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
   ￥）、ブラッシカ￥（Ｂｒａｓｓｉｃａ）￥、ラパヌス
   ￥（Ｒａｐｈａｎｕｓ）￥、シナピス￥（Ｓｉｎａｐｉ
   ｓ）￥、アトロパ￥（Ａｔｒｏｐａ）￥、カプシカム￥
   （Ｃａｐｓｉｃｕｍ）￥、ダツラ￥（Ｄａｔｕｒａ）￥
   、ヒオシアムス￥（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）￥、リコペ
   ルシコン￥（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）￥、ニコチァ
   ナ￥（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）￥、ソラヌム￥（Ｓｏｌａ
   ｎｕｍ￥）、ペチュニア￥（Ｐｅｔｕｎｉａ￥）、ジギ
   タリス￥（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ￥）、マジョラナ￥（Ｍ
   ａｊｏｒａｎａ）￥、シコリウム￥（Ｃｉｃｈｏｒｉｕ
   ｍ￥）、ヘリアンサス￥（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）￥、
   ラクツカ￥（Ｌａｃｔｕｃａ￥）、ブロムス￥（Ｂｒｏ
   ｍｕｓ）￥、アスパラガス￥（Ａｓｐａｒａｇｕｓ￥）
   、アンチリヌム￥（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ￥）、ヘメ
   ロカリス￥（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）￥、ネメシア
   ￥（Ｎｅｍｅｓｉａ￥）、ペラルゴニウム￥（Ｐｅｌａ
   ｒｇｏｎｉｕｍ￥）、パニクム￥（Ｐａｎｉｃｕｍ￥）
   、ペンニセツム￥（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）￥、ラヌン
   クルス￥（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）￥、セネシオ￥（Ｓ
   ｅｎｅｃｉｏ￥）、サルピグロッシス￥（Ｓａｌｐｉｇ
   ｌｏｓｓｉｓ）￥、ククミス￥（Ｃｕｃｕｍｉｓ￥）、
   ブロワリア￥（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ￥）、グリシン￥（
   Ｇｌｙｃｉｎｅ￥）、ロリウム￥（Ｌｏｌｉｕｍ）￥、
   ゼア￥（Ｚｅａ￥）、トリチカム￥（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
   ）￥、ソルガム￥（Ｓｏｒｇｈｕｍ￥）、イポモエア￥
   （Ｉｐｏｍｏｅａ￥）、パッシフロラ￥（Ｐａｓｓｉｆ
   ｌｏｒａ）￥、シクラメン￥（Ｃｙｃｌａｍｅｎ）￥、
   マルス￥（Ｍａｌｕｓ￥）、ペルヌス￥（ｐｒｕｎｕｓ
   ）￥、ロサ￥（Ｒｏｓａ）￥、ルブス￥（Ｒｕｂｕｓ￥
   ）、ポプルス￥（Ｐｏｐｕｌｕｓ￥）、サンタルム￥（
   Ｓａｎｔａｌｕｍ）￥、アリウム￥（Ａｌｌｉｕｍ）￥
   、リリウム￥（Ｌｉｌｉｕｍ）￥、ナルシッサス￥（Ｎ
   ａｒｃｉｓｓｕｓ￥）、アナナス￥（Ａｎａｎａｓ）￥
   、アラチス￥（Ａｒａｃｈｉｓ￥）、ファセオルス￥（
   Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ￥）及びピスム￥（Ｐｉｓｕｍ￥）
   から成る群から選択された特許請求の範囲第４８項に記
   載の植物。 ５０、特許請求の範囲第４９項に記載の植物細胞から再
   生された植物及びその種子。 ５１、特許請求の範囲第４９項に記載の植物細胞から再
   生された、突然変異体及び変種子孫を包含する植物の子
   孫。