JPS62278A - 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主朶上皇肌朋光団 本発明は一般的にはＰＤＧＦ類（Ｕ因子の産生に関する
ものであり、更に詳細には真核生物における生物学的に
活性なＰＤＧＦＩｉ似因子の発現に関する。

従速４υ支逝 ヒトのＰＤＧＦ即ち血小板誘導生長因子（ｐｌａｔｅｌ
ｅｔｃｌｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）
は間葉誘導細胞について血清中の主要な有糸分裂促進因
子タンパク質（ｎ＋ｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ
）であることが証明された。

この事実は平滑筋細胞、線維芽細胞及び神経膠細胞の培
養物中での細胞増殖又はＤＮＡ合成（細胞分裂の前提条
件）を誘導する血小板抽出物又は純化されたＰＤＧＦに
関する数多の研究報告に記載されている〔ロス（Ｒｏｓ
ｓ）等、　ＰＮＡＳ、　　７１．１２０７゜１９Ｔ４ｓ
コーラ−及びリプトン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄｌ、１ｐ
ｔｏｎ）、ＥＸｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　　８７．
　２９７．１９７４　；ウエスタマーク及びウエストソ
ン（Ｗｅｓ　ｔｅｒｍａｒｋａｎｄ　Ｗａｓｔｅｓｏｎ
）＋　ｆ！ｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　９８．　１
７０゜１９７６）；ヘルジン（ｌｌｅｌｄｉｎ）等、　
Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、。

１０５．２３５．１９８０）；レース及びロス（Ｒａｉ
ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ）＋Ｊ、旧ｏ１．　Ｃｈｅｓ
ｓ、、　　２５７．５１５４゜１９８２））。更にＰＤ
ＧＦはマイトジェン（ｎ＋　ｉ　ｔｏｇｅｎ）として細
胞に応答する有効な化学的誘引物質である〔グロテンド
ルスト（Ｇｒｏ　Ｌｅｎｄｏｒｓ　ｔ）等、　Ｊ、Ｃｅ
１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、１１３．　２６１．　１９Ｂ
’２；セパ（Ｓｅｐｐａ）等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ
、、　　９２．　５８４゜１９８２　）。この場合はマ
イトジェンが走化性物質としても作用する場合と一般的
に異なる。！’ＤＧＰの有糸分裂促進活性にもとづきＰ
ＤＧＦは培養中の咄乳動吻細胞の生育のための限定され
た培地の重要成分として有用であり、動物細胞生物学の
研究に多用される価値ある研究用試薬となっている。

生体内においてＰＤＧＦは血小板のアルファ顆粒内に貯
えられる循環物質であることが普通である。動脈内皮の
裏面が損傷されると露出された結合組織への血小板の付
着が起ってその顆粒群が放出される。放出されたＰＤＧ
Ｆは綿維芽細胞と平滑筋細胞とを傷害個所へ走化的に誘
引し、創傷回復過程の一環として創傷部における細胞増
殖を誘４すると考えられる〔ロス及びクロムセット（Ｒ
ｏｓｓａｎｄ　Ｇｒｏｍｓｅｔ）、Ｎ、　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

２９５．３６９．１９７６）。

創傷に対する上記の応答の一部分としてＰＤＧＦは血小
板から放出されてアテローム性動脈硬化症の進行域の拡
大の原因をなす［ロス及びグロムセ・７ト、前掲報文］
ことが推定されているが該アテローム性動脈硬化症は心
筋梗塞及び大脳梗塞の主原因のひとつでもある。しゆく
腫形成の予防と治療とのための方策は過去において該病
気の危険要因の減少化、例えば高血圧症の患者における
血圧低下及び高コレスロール血症の患者におけるコレス
テロールの高値の低下の方向に集中させることにあった
。

近時の諸研究の結果ＰＤＧＦ及びシミアン腫瘍ウィルス
（ｓｉｍｉａｎ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ（ＳＳＶ
）　）即ち急性の形質転換レトロウィルス、の推測され
た形質転換タンパク質を包含する二種のタンパク質鎖の
ひとつが同じか又は近縁の細胞遺伝子（ｃｅｌｌｕｌａ
ｒｇｅｎｅｓ）から生成されたらしいことが示された。

特にＰＤＧＦの部分的アミノ酸配列のコンピューターに
よる分析によりＳＳｖの遺伝子にもとづく産生物（ｇｅ
ｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）、即ちｐ２Ｂｓ＝ｓ、との著し
い相同が明かにされた〔トリトル、ウォターフィルド及
びジョンソン（ＤｏｏｌｉＬｔｌｅ、　Ｗａｔｅｒｆｉ
ｅｌｄ　ａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ）　、前掲軸車〕。更に
最近の研究の結果ｐ２８１”３及びＰＤＧＦは抗原性及
び構造的類似性を示すことが例証された〔ロビンス（Ｒ
ｏｂｂｉｎｓ）等、Ｎａｔｕｒｅ、　　３０５．　６０
５．　１９８３　；ニマン（Ｎｉｍａｎ）、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、３０７．　１８０．　１９８４）。

既往の研究企画、例えばデバル（Ｄｅｖａｒｅ）等（Ｃ
ｅｌｌ。

３６．４３．１９８４）が総括した企画により形質転換
微生物体の中でｖ　　ｓｉｓ遺伝子が発現されたけれど
もデバル等はマイトジェン物質産生に成功するに至らな
かった。最近成る研究者等はＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）中でｐ２８ｓ１が融合タンパク質として産生されるこ
とを記載した〔ワンプ（Ｗａｎｇ）等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、、　　２５９．　１０６４５．１９８４
）。

該タンパク質はＰＤＧＦ受容個所（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　
５ｉｔｅｓ）への結合についてＰＤＧＦと比肩するよう
にみえる。ＳＳＶで形質転換されたネズミの細胞はＰＤ
ＧＦに類似のマイトジェン活性を示すことが証明された
〔デュエル（Ｄｅｕｅｌ）等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２
２１　、１３４８゜１９８３；オーエン（Ｏｗｅｎ）等
、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５　。

５４．１９８４）けれども該活性がＳＳＶ　（即ちｐ２
８”）から産生された遺伝子によるのか否か明かでない
。更にＳＳ■以外の各種のウィルスにより形質転換され
た細胞は培地中へＰＤＧＦ様のマイトジェンを産生ずる
〔ボウエンーボーブ（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ）等、　Ｐ
ＮＡＳ、　　８１．　２３９６．１９８４）　。

天然源のＰＤＧＦは出発原料としてのヒトの血漿又は血
小板から単離され得るけれども出発原料の入手が局限さ
れていることにも部分的原因があるので複雑で高費用を
要する工程となる。更に他の血清成分から高収率でＰＤ
ＧＦを純化することは困難であるがそれは量的に著しく
少いことと生化学的諸性質とにもとづくのである。しか
もヒトの血液から導かれた製品の治療上の使用は例えば
肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス又は獲得免疫欠乏
症（Ａｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｔｃｉｅｎ
ｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＩＤＳ））の原因物質によ
る汚染にもとづく病気の伝播の危険を伴う。

傷害の治療のために線維芽細胞及び平滑筋細胞の増殖を
要するが該傷害の治療の際のＰＤＧＦの臨床的応用性に
かんがみ及び哺乳動物細胞の培養だめの規定された培地
中の重要成分としてのＰＤＧＦの価値にかんがみ、マイ
トジェン活性をもつ真正のＰＤＧＦに類似するタンパク
質分子の有用量の製造は明かに極めて貴重である。

加うるに比較的大量のＰＤＧＦの製造能力は新形成過程
におけるｖ−ｓｉｓタンパク質、即ちｐ２Ｂｓ′ｓ、の
推定上の役割を明かにするための有用な手段である。

更に動脈壁のインフマル層（ｉｎｔａｍａｌ　１ａｙｅ
ｒ）内の平滑筋細胞群の局所的集積はアテローム性動脈
硬化域の拡大に対する中心的要因である〔ロス及びグロ
ムセソト、前掲軸車〕。従ってアテローム性動脈硬化症
の予防及び治療の一方策は平滑筋細胞の増殖の抑制にあ
る。ＰＤＧＦの大量生産能はアテローム性動脈硬化症患
者におけるＰＤＧＦの生体内活性の阻止又は妨害に対す
る阻止剤の開発のために、又は特異的アプローチの計画
のために有用である。

主班■皿丞 簡言すると本発明は真核生物細胞内で生物学的に活性な
ＰＤＧＦＩ似因子の発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ構
成体を開示する。該ＤＮＡ構成体は転写促進因子（転写
プロモーター）を含有しており、該プロモーターはその
下流に“ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又は）ＰＤＧ
Ｆと同様の有糸分裂促進活性を存するタンパク質をコー
ドする遺伝子であって真核生物細胞からの該タンパク質
の分泌を指令し得る信号配列をコードする該遺伝子”を
伴う。該遺伝子は生物学的活性をもつタンパク質をコー
ドするｖ−ｓｉｓ遺伝子であるか又は“、シミアン腫瘍
ウィルスのｖ−ｓｉｓ遺伝子の誘導体或はその部分的誘
導体”である。更にｖ　−５ｉｓ遺伝子はＰＤＧＦのＢ
鎖と実質上相同であるｖ　−５ｉｓ遺伝子の一部分であ
り得る。加うるに該遺伝子は生物学的活性をもつタンパ
ク質をコードするＰＤＧＦに対するヒトのｃＤＮＡ遺伝
子又はその部分的遺伝子であり得る。

本発明の他の態様として真核生物細胞中に生物学的活性
ＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ構
成体を真核生物宿主の中へ導入することにより生物学的
活性ＰＤＧＦ類似因子を製造する方法を開示する。該Ｄ
ＮＡ構成体は転写プロモーターを含有しており、該プロ
モーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び
（又は）ＰＤＧＦと同様のマイトジェン活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子であって真核生物細胞から
のタンパク質の分泌を指令し得る信号配列をコードする
遺伝子”を伴う。真核生物宿主の中へＤＮＡ構成体を謹
大した後に本発明の方法は該真核生物宿主を適切な培地
中で生育させて該真核生物宿主から遺伝子にもとづくタ
ンパク質製品を単離する。本発明は又かようなりＮＡ構
成体を有する形質転換された真核細胞宿主をも開示する
。

本発明は更に真核生物細胞中へ生物学的活性ＰＤＧＦ類
似因子の発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ構成体を有す
る形質転換された真核生物細胞によって発現された生物
学的活性ＰＤＧＦ類似因子を有する細胞群を恒温焙養す
ることによる哺乳動物細胞群の生長促進方法を提供する
。該ＤＮＡ構成体は転写プロモーターを含有しており、
該プロモーターはその下流にＰＤＧＦと実質上同じ構造
及び（又は）ＰＤＧＦと同様の有糸分裂促進活性を有す
るタンパク質をコードする遺伝子であって真核生物細胞
からのタンパク質の分泌を指令し得る信号配列をコード
する遺伝子”を伴う。

本発明の一興体例において真核生物細胞は酵母細胞であ
ってよく、ＤＮＡ構成体は染色体外の要素であると言う
方が適切である。

本発明の他の特徴的態様は下文及び添付図面を参照して
明かとなろう。

Ｈの　　のための最　の７１ 本発明の説明に先立ち本明細書中の用語の定義について
述べることが理解の助けとなるであろう。

ポリペプチド；これはアミノ酸のポリマーである。

？Ｅ　’！　（Ｒｅａｄｉｎ　　Ｆｒａｍｅ）　：これ
はアミノ酸の非中断延長（ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ
　５ｔｒｅｔｃｈ）をコードするヌクレオチド配置であ
る。ｍＲＮＡの翻訳に際し正常な解読枠（リーディング
フレイム）が維持されねばならない。例えば配列ＧＣＵ
ＧＧＵＵＧＵＡＡＧはＧから始めるか、Ｃから始めるか
又はＵから始めるかに依存して３種のリーディングフレ
イム又は相（ｐｈａｓｅｓ）へ翻訳され得るので３種の
異るペプチド製品を生成する。テンプレート（ｔｅｍｐ
ｌａｔｅ）の翻訳はＡＵＧコドンにおいて始まり、特定
のアミノ酸に対するコドンについて継続し、翻訳終了コ
ドン（複数）のうちのひとつにおいて終止する。

ユ３：これはＤＮＡ配列であって、適当なリーディング
フレイムの中にあり、タンパク質のアミノ酸群を直接コ
ードする。

相補的ＤＮＡ　：又はｃＤＮＡと記される。これはｍＲ
ＮＡテンプレート中に存在する配列から酸素化学的に合
成されたＤＮＡ分子又はＤＮＡ配列である。

立撤儂号配剋：これは信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌｐ６
ｐｔｉｄｅ）をコードする遺伝子の部分である。信号ペ
プチドは分泌タンパク質内のアミノ酸配列であって細胞
の分泌経路の中へその転置を信号する。

信号ペプチドは一船にタンパク質の開始点（アミノ末端
）に存在していて２０〜４０個のアミノ酸の鎖長をもち
その中央部に９〜１０個の疎水性アミノ酸の伸長鎖を有
する。しばしば信号ペプチドは分泌過程においてタンパ
ク質からタンパク分解反応によって開裂される。

員膳１皿叉産体：これは細胞表面におけるタンパク質分
子であって細胞表面に接近する分子と特異的に相互反応
、即ち結合する。該受容体が同系の分子と結合すると細
胞の生理に特異的変化を与える。

マイトジェン：これは細胞に有糸分裂を起させるように
刺激する分子である。有糸分裂は無性的体細胞分裂であ
って２個の娘細胞を与え、各娘細胞は親細胞と同じ数の
染色体を有する。

形質転換：これは純化ＤＮＡの導入により受容細胞又は
受容微生物の遺伝子型を安定に相続可能に変化させる過
程である。これは受容微生物の表現型の変化にもとづき
その典型的検出が可能である。

転写：これはｍＲＮＡテンプレートを構造遺伝子から産
生させろ過程である。

λ里；これは構造遺伝子を用いて開始させてポリペプチ
ドを製造する過程であり、転写と翻訳との組合せの過程
である。発現ベクターはヘタター上に存在する遺伝子の
発現を可能にするように設計された構造からみちびかれ
たプラスミドである。

プラスミド：これは完全な“レプリコン（ｒｅｐｌｉｃ
ｏｎ）　”を含有する染色体外の２本ｔ）￥　Ｄ　Ｎ　
Ａ配列であって該プラスミドは宿主細胞の中で複製され
る。プラスミドが均質細胞（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ）
の微生物体内に置かれるとこの微生物の特性はプラスミ
ドのＤＮＡ配列の発現の結果として変化する。

即ち形質転換される。例えばテトラサイクリン耐性（Ｌ
ｅｔ”　）に対応する遺伝子をもつプラスミドは形質転
換前にテトラサイクリン怒受性であった細胞をテトラサ
イクリン耐性へ形質転換させる。

７Ｃ）−Ｅ−１え：−：これは転写を促進する酵母の遺
伝子から上流に向うＤＮＡ配列である。

生豆ヱ血貢性；これは生物学的関係にある（即ら微生物
体内又は試験管内での複写における）分子によって与え
られた活性の成る官能又は成る一組（セント）である。

ＰＤＧＦの場合には該生物学的活性は細胞表面受容分子
への結合、応答型細胞の走化性の導入又は有糸分裂性の
導入を包含する。

既述の通りヒトの血小板から導かれた生長因子（ＰＤＧ
Ｆ）は血清中の主要な有糸分裂促進因子タンパク質であ
ることが証明されている。ＰＤＧＦは２種のポリペプチ
ド鎖、即ちＡ鎖及びＢ鎖から成ることが既知であってこ
れらは二硫化結合によって相互に保持されて生物学的活
性分子を形成している。該Ａ鎖及びＢ鎖の夫々単独は「
糸分裂能を発揮しないらしい（レース及びロス、前掲軸
車）。

そして還元型ポリペプチドの再酸化による活性再構成の
試みは未だ成功していない。最近Ｂ鎖のアミノ酸配列は
ｖ−ｓｉｓ遺伝子産生物の一部分、即ちｐ２８３”３、
と実質的相同であることが示された〔トリトル等、　５
ｃｉｅｎｃｅ、　２２　Ｌ　、　　２７５　、１９８３
；ウォクーフィルド等、Ｎａｔｕｒｅ、　　３０４．　
３５゜１９８４、及びジョンソン等、　Ｅｍｂｏ、　　
３．　９２１゜１９８４）。これらの２種タンパク質の
相同性はそれらが同じか又は近縁の細胞遺伝子からみち
びかれたものであることを強く示唆する。

生物学的活性のＰＤＧＦはＡ鎖及びＢ　ｔｉｔの等モル
量を含むことが既知であること、及びＥ、コリ中のｖ−
ｓｉｓ配列を発現させようとした既往の試みは有糸分裂
促進物質を産生じなかったことを考え合せるならば微生
物体中でＰＤＧＦ遺伝子の部分に相同なり一５ｉｓ遺伝
子の部分を単に発現させても有糸分裂促進活性を呈する
分子を与えるに至ることは期待されないであろう。しか
しながら本発明は該上記の既往の企画とは対照的に、発
現された分子群がＰＤＧＦのＢ鎖に−そう近縁であるよ
うに、非相同的配列を有しないｖ−ｓｉｓ遺伝子又はそ
の部分的遺伝子の発現を企図したのである。

更に本発明の発現系は真核生物の分泌経路を経て遺伝子
にもとづく製品を産生させるように企図したのである。

かように企図したことによって発現されたタンパク質分
子群は生物学的活性を呈するように正常に処置され集積
され得る。事実、本発明は、従来技術における努力とは
対照的に、生物学的活性を有するＰＤＧＦ［似因子の分
泌をもたらしたのである。

ＰＤＧＦは活性型である場合においては熱安定性タンパ
ク質であって２８０００〜３１０００ダルトンの不均一
のサイズをもつスペシイズ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ
ｌｙ　５ｉｚｅｄ　５ｐｅｃｉｅｓ）から構成され、夫
々のスベシイズのすべてがＤＮＡ合成を刺激する活性を
もつ〔レース及びロス、前掲軸車；デュエル等、Ｊ、　
Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、、　　２５６．　８８９６゜１
９８１；アトニアデス（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ）　、　
’　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　。

７８．７３１４．１９８１）。分子ｆｆ１２７０００；
２８５００　；２９０００及び３１０００ダルトンを有
する各スペシイズが単離され試験されたがその場合に該
スベシイズは比較され得る有糸分裂促進活性及びアミノ
酸組成を有することが見出された（レース及びロス、前
掲作文）。更に該スペシイズは広汎なトリブチイックペ
プチド相同性を示した。該スペシイズにおける僅かな寸
法変化は炭水化物組成及びタンパク分解における差異に
主としてもとづくものである。

ＰＤＧＦの研究の際に咳ＰＤＧＦは血小板に冨むヒトの
血漿から充分に純化されたが、ＰＤＧＦは２種のポリペ
プチド鎖即ちＡ鎖（１４０００ダルトン）及びＢ鎖（１
６０００ダルトン）から成り、これらは相互にジスルフ
ィド結合して生物学的活性二量体分子を形成することは
既述した通りである（レース及びロス、デュエル等、ア
ンドニアデス、前掲作文）。文献記載のＰＤＣ；Ｆとい
う名称は確定されていない（トリトル等、ウォターフィ
ルド等、レース及びロス、ジョンソン等、前掲作文）。

ジョンソン等（前掲作文）の命名法が採用されたが該純
粋のＰＤＧＦ中に見出された２種のペプチドを“Ａ鎖”
及び“Ｂ　ｔＭ”と呼んだ。

ＢｆＡはｐ２８”と相同であって以前は“ペプチドＩ”
と呼ばれ〔ウォターフィルド等、前掲作文〕又は“ｌａ
”と呼ばれた〔トリトル等、前掲作文〕。

Ａ鎖は以前は“ペプチド■”　〔ウォターフィルド等、
前掲作文〕又は“２ａ゛　〔トリトル等、前掲作文〕と
呼ばれた。ＰＤＧＦの部分的アミノ酸配列からみちびか
れたデータは該２種のポリペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖）
は成る相同性を呈することが示されている〔トリトル等
、前掲軸車；ウォターフィルド等、前掲作文；ジョンソ
ン等、前掲作文；アントニアデス及びバンカピラ（ｌｌ
ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）　＋５ｃｉｅｎｃｅ、２２０．
　９６３．　１９８３）　、　Ａ鎖及びＢ鎖の夫々単独
は有糸分裂促進活性を現わさないらしく還元型ポリペプ
チドの再酸化による活性再構成の企画は成功しなかった
〔レース及びロス、前掲作文〕。

既述の通りｖ−ｓｉｓ遺伝子はシミアン腫瘍ウィルス（
ＳＳＶ）の形質転換された遺伝子である。該ｖ−ｓｉｓ
遺伝子がクローン化されそのＤＮＡ配列が決定された〔
デバル等、ＰＮＡＳ、　　７９．３１７９．１９８２；
デバル等、ＰＮＡＳ、８０，７３１゜１９８３）。この
配列を分析した結果２８０００ダルトンのタンパク質、
記号ｐ２８Ｓｉｓ、をコードし得る開放読解枠（ｏｐｅ
ｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａａ＋ｅ）が解明された。次
に、このタンパク質はＳＳＶ感染細胞の中に存在するこ
とが同定された〔ニマン、前掲軸車；ロビンス、前掲作
文〕。シーｓｉｓ遺伝子産生物、ｐ２８ｓ′ゝ、の予測
されたアミノ酸配列はＰＤＧＦのＢ鎖の部分の真正のア
ミノ酸配列と高度に相同性であることが見出された〔ジ
ョンソン、前掲作文〕。ＰＤＧＦのＢ鎖とｖ−ｓｉｓ遺
伝子産生物との相同はｐ２Ｂ”のアミノ酸６７、即ちセ
リン、において開始されアミノ酸１７５におけるスレオ
ニン残基に至るまでおよそ１０９個のアミノ酸に対応し
て継続する。ｐ２８””のＢ　ｉｆｆ相同域に先行し及
び後続するアミノ酸配列は完全（ｍａｔｕｒｅ）なＰＤ
ＧＦのＡ鎖及びＢ鎖のいずれにも相同でない〔ジョンソ
ン等、前掲作文〕。更にＰＤＧＦ及びｐ２８”３は類似
の抗原性のものであることが証明された〔ニマン、前掲
軸車；ロビンス、前掲作文〕。ｖ−ｓｉｓ遺伝子産生物
、ｐ２Ｂｓｉｓ、は約２２５個のアミノ酸をもつタンパ
ク質であってＳＳｖ感染細胞についてタンパク分解によ
って処理されると約２００００ダルトンのタンパク質（
ｐ　２８”’　）を与える〔ニマン、前掲軸車；ロビン
ス、前掲作文〕。該２００００ダルトンタンパク質はＰ
ＤＧＦに対する抗血清を用いて免疫学的に沈降し得る。

上記の通り原核生物にｖ−ｓｉｓ配列を発現させる既往
の企画は生物学的活性物質を産生させなかった。更にｖ
−ｓｉｓ遺伝子製品ｐ２ｇｓｉｓ並びにＰＤＧＦそれ自
体は分泌された哺乳動物のタンパク質である。生物学的
活性物質の製造の達成のために本発明はシーｓｉｓ遺伝
子及びシーｓｉｓ遺伝子誘導体の発現のための真核生物
細胞の分泌径路を利用する。真核生物細胞からのｖ−ｓ
ｉｓ遺伝子製品の発現及び分泌は本来の活性ある構造を
もつ分子群を与える処理及び構成を可能とする。

大部分の真核生物の分泌径路は相似であると信ぜられる
。特に哺乳動物細胞と酵母細胞とはその分泌径路が良好
に特性化されて相同である。発現されたポリペプチド上
の分泌信号配列の存在は真核生物における重要な要素で
あるがそれは分子を分泌径路へ導入し、それによって正
常な構成及び処理へみちびく役目を果すからである。適
切な転写プロモーターと分泌信号配列とを利用する条件
の下であれば一般にいかなる真核生物もｖ−ｓｉｓ遺伝
子産生物を生物学的活性形において発現し分泌すること
ができる。

取扱容易で良好に特性化される真核生物は酵母細胞であ
る。これらの理由により本発明における適切な真核生物
細胞のモデルの一例として酵母を選択した。従ってＰＤ
ＧＦのＢ鎖に相同な１０９アミノ酸をコードするｖ−ｓ
ｉｓ遺伝子及びそのフラグメント（断片）を生物学的活
性のＰＤＧＦ類似因子の発現を指令し得る酵母プロモー
ターを含有する酵母の染色体外要素の中へ挿入した。本
発明に従い酵母プロモーターはその下流に実質上ＰＤＧ
Ｆと同じ構造及び（又は）同じ有糸分裂促進活性を有す
るタンパク質をコードするｖ−ｓｉｓのフラグメントを
伴う。

ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又は）実質上同じ有糸
分裂促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は
シミアン腫瘍ウィルス（Ｓ　Ｓ　Ｖ）のｖ−ｓｉｓ遺伝
子又はｖ−ｓｉｓ遺伝子の誘導体又はそれらの部分的遺
伝子を包含するか又はＰＤＧＦに対応するヒトのｃＤＮ
Ａ遺伝子又はその部分的遺伝子を包含する。詳細にはＰ
ＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列が好適である。染色体外要素の中で使用され
る遺伝子は標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて単離され
得る。

ヒトのＰＤＧＦのｃＤＮＡ遺伝子は雑種生成のプローブ
（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅ）としてｖ
−ｓｉｓ遺伝子又はそのフラグメントを用いることによ
りメツセンジャーＲＮＡの適切な給源からつくられたヒ
トｃＤＮＡライブラリィ　（貯蔵所）から取り出され得
る。ｍＲＮＡの好適給源はヒトの調帯静脈内皮細胞であ
る。これらの細割群は短時間だけインビトロで培養し得
られ、培地中へＰＤＧＦを分泌することが公知である〔
ジコルレト（ＤｉＣｏｒｌｅｔｏ）及びポウエン−ホー
プ、ＰＮＡＳ、　　８０．１９１９゜１９８３）。該Ｐ
ＤＧＦをコードする遺伝子としてのｃＤＮＡ遺伝子の同
定はＤＮＡ配列法によって遂行され得る。

酵母中において使用され得るプロモーターは酵母アルフ
ァ因子（ＭＦαｌ）プロモーター及び酵母トリオースホ
スフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーターを包含
する。他の酵母遺伝子、例えばアルコールデヒドロゲナ
ーゼ１　　（ＡＤＨＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ
２（ＡＤＨ２）からも又プロモーターを得ることができ
る。

本明細書における構成は次の通りである。即ちｖ−ｓｉ
ｓ遺伝子産生物を酵母細胞から培地の中へ分泌させる。

このことは酵母の交配フェロモンアルファ因子（ｙｅａ
ｓｔ　ｍａｔｉｎｇ　ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ　ａｌｐｈａ
−ｆａｃｔｏｒ）の分泌信号配列の使用によって達成さ
れる〔クルシャン及びヘルスコビツ（Ｋｕｒｊａｎ　ａ
ｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）。

Ｃｅ１ｌ、３０，９該．１９８２．ユリウス（Ｊｕｌｉ
ｕｓ）等、Ｃｅ１１．３６，３０９．１９８４；及びブ
レイク（Ｂｒａｋｅ）等、ＰＮＡＳ、　　８１．　４６
４２．１９８４）けれども他の分泌信号を使用してもよ
い。ｍＲＮＡの効果的な転写の終了及びポリアデニル化
を確実化するために酵母のタミネーター配列、例えばト
リオースホスフエートイソメラーゼクーミネーターを添
加した〔アルベル及びカワサキ（Ａｌｂｅｒ　ａｎｄＫ
ａｈａｓａｋｉ）、　　、ｒ、　　Ｍｏ１ｅｃ、　　Ｇ
ｅｎｅｔ、　　八ｐｐ＋、　　　１．　　４　１　９゜
１９８２）。

本発明の目的である遺伝子を有する適切なりＮＡフラグ
メントが同定されたならば、それを適切なプロモーター
及び分泌信号配列に結合させる。

ＤＮＡフラグメントの結合方法は充分に記述されていて
〔マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２　）当業界の技術者によ
って良好に遂行される。ｖ−ｓｉｓ発現構造体の製造の
後に該構成体を酵母の発現ベクターの中へ挿入する。

複製のオリジン（源）及び選択され得るマーカー（目印
）を有する複製用プラスミドＹＥｐ　１３、即ちＬＥＵ
２遺伝子、を初期発現構成体として使用した。選択マー
カーＬＥＵ２は酵母細胞内でロイシン合成能を欠失して
いるのでロイシン不添加生育培地上での生育能によりＬ
Ｅ０２プラスミド含有細胞の陽性選択を可能とする。こ
れらの構成体は成る程度の有糸分裂促進活性を有する産
生物の発現を指令するけれども培養物に”おいてより多
い有糸分裂促進活性を生ずるために宿主細胞内で増加さ
れた安定性を保つ成る発現ベクターを使用することが好
ましい。

この点において適切な酵母の発現ベクターはプラスミド
ｐｃｐｏ’ｒ及びｐＭＰＯＴ２であり、これらは解糖酵
素トリオースホスフェートイソメラーゼをコードするシ
ゾサツカロミセスボムベ遺伝子（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ｇｅｎｅ）　（Ｐ　
ＯＴ　１遺伝子゛）を包含する。ＰＯＴＩ遺伝子を包含
することはこの宿主細胞の中に存在する対応遺伝子欠失
を補足する能力にもとづき適切な宿主細胞の中のプラス
ミドの安定保持を確実にする。更にＭＦα１プロモータ
ーをサツカロミセスセレビシェＴＰＩによって代替する
がこれは転写と発現とを更に増加させるためである。

ＴＰＩプロモーターを導入されたＤＮＡ構成体、アルフ
ァ因子分泌信号配列、ＰＤＧＦに対応するｖ−ｓｉｓ遺
伝子又はヒトのｃＤＮＡ遺伝子の適切なセグメント、及
び適切なベクターの中のＴＰＩターミネータ−が調製さ
れた後に該ＤＮＡ構成体をＴＰＩ欠失を以て酵母宿主の
中へ形質転換させる。

酵母を形質転換させる操作は文献によって周知である。

形質転換した酵母細胞は、ｐｃｐｏ’ｒベクター使用の
場合に、グルコース含有の常用の複合培地上での生育に
よって選択され得る。慣用の培地例えばＹＥＰＤ　（グ
ルコース２０ｇ、バタトーペプトン２０ｇ１酵母抽出物
１０ｇを１１中に含有する）を使用してよい、ｉＩ択さ
れるとｖ−ｓｉｓ発現構造体を含む形質転換体を慣用の
複合培地上で静止相において生育させ、細胞群を分離し
、培地を濃縮する。真正のヒトのＰＤＧＦは高度にカチ
オン性で疏水性のタンパク質である〔レース及びロス、
前掲和文；アントニアデス、前掲軸車；デュエル等、１
９８１、前掲和文〕ことに注意を払い、想定上の酵母産
生物は類慎の特性を有することが期待され、それを疏水
性クロマトグラフィマトリクス例えばＣ８−セファロー
ス［ファルマシアファインケミカルスＡ　Ｂ　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓＡＢ＋　
Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）］上で濃縮した。

多数種の試験法を使用した結果ｖ−ｓｉｓ誘導体を発現
した酵母培養からの生育培地は真正のヒトのＰＤＧＦと
同一の生物学的活性を有することが判明した。

酵母以外の真核生物細胞の中の生物学的活性のｖ−ｓｉ
ｓ誘導体の発現は適切な発現／規制信号の使用の下で当
業界の技術者によって達成され得る。

シーｓｉｓ配列の発現を指令し得る転写プロモーターは
特定の真核生物細胞型の中における効率的及び（又は）
規制的な発現を与える能力に対応して選択される。細胞
の分泌過程の中へｖ−ｓｉｓ遺伝子産生物を指令し得る
信号配列は適切な細胞型の中での作用に対応して選択さ
れる。他の有用な規制信号、例えば転写終了信号、ポリ
アデニル信号及び転写増強用配列は適切な細胞型の中で
のそれらの作用に対応して又選択され、その選択は適業
技術者にとって明らかである。

細胞培養技法は培養物中で生育する哺乳動物細胞の多数
及び多種におけるように過去数年の間にかなりの進歩を
遂げた。該進歩の中核は栄養要求量（即ちホルモン類及
び生育因子類）に関する充分な理解である（バーネス及
びサトウ（Ｂａｒｎｅｓａｎｄ　５ａｔｏ）、　Ｃｅ１
ｌ、２２．６４９．１９８０）　、培養物中で生育し得
る細胞の型はおおまかに２群に分けられる。即ち正常型
と形質転換型と七ある。

いわゆる“正常”細胞は一般に培養物中で不死であり、
動物に注射されたときに腫瘍を形成せず、正常な二倍体
の抜型を保持する。正常細胞は又培養物中で識別され得
る性格の大部分をも保有する。

正常細胞のカテゴリイに属する細胞は培養物中で制限さ
れた数の世代において生育するのみであって“細胞スト
レイン（ｃｅｌｌ　５ｔｒａｉｎｓ）　　’又は“プラ
イマリイ　カルチュア（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒ
ｅ　）　　″と称される。成る正常細胞系は形質転換の
すべての基準に合致しないけれども培養物中で不定に生
育する。形質転換細胞は培養物中で生育して不死であり
、典型的には識別され得る表現型を喪失し、獲得された
核型異常を呈する。該形質転換細胞は独立的固定生育（
ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｃｈｏｒａｇｅ　
ｆｏｒｇｒｏｗｔｈ）をなし適宜の宿主動物に注射され
た時に腫瘍を誘発する。このカテゴリイに属する細胞は
インビトロで生育してＰＤＧＦ受容体を持ち、培養物中
で本発明によるＰＤＧＦ類似因子に対して反応する。

下記の諸例を要約すると例ＩはプラスミドｐＵｃ１３を
複製するＥ、コリ中のｐＳＳＶ−１１のｖ−ｓｉｓサブ
クローンの構造を示す。例■はＭＦα１プロモーター及
び分泌信号配列に対するシーｓｉｓの結合を含むプラス
ミドｐＶＳαの構造を示す。例■はＰＤＧＦのＢ鎖に相
同でないシーｓｉｓ遺伝産生物、ｐ２　Ｂ　５ｉｓ１の
最初の６６アミノ酸を欠失させるために一本鎖バタテリ
オファージＭ１３を使用する技法にもとづきｖ−ｓｉｓ
遺伝子の最初の１９５塩基対合の変異誘発の欠除を指令
されたオリゴヌクレオチドを示す。得られたファージは
正しい欠失部を有していてｍ１ｌｖｓ２αと記号された
。例■は例■及び■に記載されたシーｓｉｓ関連の構造
体の酵母複製ベクターＹＥｐ１３の中への導入及び酵母
ＴＰＩターミネーター配列の付加を示す。これに続いて
ＶＳ２α配列をプラスミドｐｃｐｏ’ｒの中へ挿入し、
かようにして宿主細胞内のプラスミドの安定保持を確実
にした。このプラスミドはｐＨ７−２と記号された。

本例はプラスミドｐＶｓＢの構造及び発現ベクターｐＭ
ＰＯＴ２の構造をも示す。例■はプラスミ）’ＹＥｐＶ
ＳｄＳＹＥｐＶＳ２α、ｐＨ７−２及び制御プラスミド
ｐ２７０及びｐｃｐｏ’ｒを用いる酵母宿主細胞の形質
転換及びそれに続く転写分析を示す。例■はｖ−ｓｉｓ
発現形質転換体を含有する培養物からの使用済みの酵母
生育培地の濃縮及びＥＬＩＳＡ、ラジオレセプター（ｒ
ａｄｉｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び有糸分’１２　＆　
；ｆ−ｊ性試験によるＰＤＧＦＩ偵物賞に対する分析を
示す。上記のシーｓｉｓ関連遺伝子にもとづく産生物を
含有する該酵母生育培地は真正のヒトのＰＤＧＦの生物
学的活性と同一の生物学的活性を存することが明かに証
明された。

下記の諸例は例示のためであって本発明の範囲を限定す
るものではない。

■ 他にことわらない限り、標準分子生物学的方法を使った
。制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ修飾酵素（
すなわちＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、子牛アルカリ
性ボスファターゼ、クレナウＤＮＡポリメナーゼ）はベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、二ニー・イングラ
ンド・バイオラブズ、ベリンガーーマンハイムまたはコ
ラボラチブ・リサーチから得たもので、他にことわらな
い限り製造業者の提案した通り使った。Ｍ１３ファージ
、ｐＵＣプラスミドベクターおよび適当な宿主細胞株は
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから得た。Ｅ、コ
リ培養物はダゲルト・エールリッヒの塩化カルシウム法
〔ジーン、６巻、２３頁、１９７９年）により形質転換
した。酵母培養物はベグズ（ネーチャー、２７５巻、１
０４頁、１９７８年）に記載のように形質転換した。プ
ラスミドおよびＭ１３複製型分子（ＲＦ）ＤＮＡはビル
ンボイムおよびドリーの方法（ヌクレイツク・アシッズ
・リサーチ、７巻、１５１３頁、１９７９年）の方法に
よりＥ、コリ形質転換細胞からつくった。

−重１￥Ｍ１３ファージＤＮＡはＳ、アンダーソン（ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ、１３巻、３０１５頁
、１９８１年）により記載のようにつくった。ＤＮＡフ
ラグメントはＪ、ラングリッジらの方法（アナリチカル
・バイオケミストリー、１０３巻、２６４頁、１９８０
年）によりアガロースゲルから抽出した。ＤＮＡ配列は
Ｍ１３鋳型上でジブオキ法（メッラング、メソドロジー
・イン・エンチモロジー、１０１巻、２０頁１９８３年
）により行なった。

グ そのゲノムにＳＳ■を組込んだ５ＳＶ−１１を非生産的
感染させた正常のラットの腎臓（ＮＲＫ）細胞からＳＳ
■レトロウィルスゲノムをクローニングした（デバール
ら、上記、１９８２年）。

ＳＳＶ　　ＤＮＡは５．８キロベース（ｋｂ）　Ｅｃｏ
　Ｒ１フラグメントとして単離し、ついでプラスミドｐ
ＢＲ３２２を挿入し、クローンｐＳＳＶ−１１を得た。

このクローンはＳ、アアロンソン（ナショナル、インス
チチュート・オプ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ）から得た
。

第１Ａ図はＳＳＶの５．８キロベースプロウイルスゲノ
ムの模式的制限マツプである。本発明に関連した制限位
置だけを示す。オープンボックスはり一５ｉｓ遺伝子の
ｐ２Ｂｓｉｓコーディング部分を示す。

ｉｌＢ図はｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド配列および
若干の側面ＳＳＶ配列を示す。ｖ−ｓｉｓ遺伝子はＳＳ
Ｖのエンベロープ（、ｅｎｖ）遺伝子の推定のＡＴＧ開
始コドンの１９ヌクレオチド３′に挿入される（デバー
ルら、１９８２年、上記）。

ｖ−ｓｉｓ配列の転写と翻訳はＳＳＶ配列によって指図
され、ｅｎｖ−ｓｉｓ融合蛋白質を生じる。第１Ｂ図に
示したヌクレオチド配列は１９８２年（上記）のデバー
ルらにより公表されたものから修正しである。修正はデ
バールら（１９８３年、上記）および本発明者によりな
されたものを含む。デバールら（１９８２年、上記）の
もとの番号付は図表をここで保持しである。第１Ａ図の
制限位置に割当た数は第１Ｂ図からのものである。

ｖ−ｓｉｓ遺伝子の部分を含むｐＳＳＶ−１１のザブク
ローン（第２図）は、Ｅ、コリ複製プラスミドｐＵｃ１
３中で構成された（ビエイラ、メッラング、ジーン、１
９巻、２５９頁、１９８２年；メフラング、メソドロジ
ー、イン・エンベロ−プ −１１の５マイクログラム（ｕｇ）を制限エンドヌクレ
アーゼＰｓｔ　　Ｔで消化し、配列番号４５４−１６７
９　（第１図）を含む１．２ｋｂ　　フラグメントをア
ガロースゲル電気泳動（０，９％）で精製し、ゲルから
セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）と
ブタノールで抽出した（ラングリッジら、上記）。また
ｐＵｃ１３の２ｕｇをＰｓｔ　Ｉで消化し、フェノール
／クロロホルム（ＣＩＩＣ＆　ｘ　）抽出し、エタノー
ル（ＥｔＯｌｌ）で沈殿させた。１．２ｋｂｙ−ｓｉｓ
フラグメント４０ｎｇと　ＰｓｔカントｐＵｃ１３　５
０ｎｇを室温で一夜’ｒａ　ＤＮＡリガーゼ４０単位（
Ｕ）で連結反応させた。連結反応混合物を使って、５−
ブロモ、４−クロロ、３−イントリルーβ−Ｄ−ガラク
トシド（Ｘ−ｇａｌ）およびイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＯ）の存在で、Ｅ、コリに一１
２細胞株ＪＭ８３を形質転換した（メッラング、レコビ
ナント・ＤＮＡテクニカル・ブユレタン、ＮＩＴ（パブ
リケーションＮｏ、７９−００９．２頁、Ｎ００２．４
３−４８頁、１９７９年）。アンピシリン耐性白色コロ
ニーからつくったプラスミドＤＮＡをＰｓｔ　Ｉで消化
し挿人物の存在を確かめ、生成プラスミドを１’）　Ｖ
ＳｒＳ／　Ｐ　ｓ　ｔと命名した。

大旌桝主 プラスミドｐＶＳαの構成 Ａ、ＭＦα１へ融合のためのＶ−５ＩＳの調製プラスミ
ドｐＳＳＶ−１１（第２図）６００ｕｇ　　を、５０　
ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．１０ｍＭト
リスｐＨ７，５（培地塩緩衝液）、１１００ｕ／ｍｊ！
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の２００μβ中で、３７℃
で一夜、制限エンドヌクレアーゼＢａｎ　ＨＩおよびＰ
ｖｕ　Ｈで消化した。

消化生成物を１．１％アガロースゲルを通し電気泳動し
、１１００塩基対（ｂｐ）　ＢａｍＨＩ　−Ｐｖｕ■フ
ラグメント（第２図）を切りとき、抽出し、ＥｔＯｌｌ
で沈殿させた。ＤＮＡベレットを７５μβの１ｌｐｈ　
　Ｉ緩衝液に溶かし、これにＢ５Ａｌ■／ｍ　１２０．
１７１２とｔｌｐｈ１５＃ｆを加えた。３７℃で一夜消
化後、混合物を１．２５％アガロースゲルを通し電気泳
動し、ゲルから３９６ｂｐ　Ｈｐｈ　１−Ｐｖｕ　Ｕフ
ラグメントを単離し、Ｅ　ｔＯ）１で沈殿させた。ＤＮ
Ａペレットをフレナラ緩衝液６ｍＭトリスｐＨ７，５，
６ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．６０ｍＭＮａＣｊり３０μｊ！
に溶かし、１ｌｐｈｌ開裂位置における３”突出たヌク
レオチドを、タレナラポリメラーゼ５Ｕで３７℃で５分
処理することにより除いた。各１ｍＭですべての４デオ
キシリポヌクレオチドを含む混合物ｌμｌを加え、反応
混合物をさらに１０分培養した。フェノール／ＣｌＩＣ
ｉ　／エーテル（ＥｔＯＨ）抽出およびＩ！ｔ０１１沈
殿後、ＤＮＡペレットを培地塩緩衝液３０μｌに溶かし
、８ｇ１５ｕで３７℃で３時間消化した。ＤＮＡを１．
２５％アガロースゲルを通し電気泳動し、２６９ｂｐ　
Ｈｐｈ　Ｉ　−Ｂｇｇ　　［［フラグメントを抽出し、
ＥｔＯｌｌで沈殿させた。このフレナラプラントフラグ
メントのｌ１ｐｂ　　Ｉ開裂末端はトリヌクレオチド配
列ではじまる。

５’　ＡＴＧ・・・・・・（第２図） ３°　ＴＡＣ・・・・・・ Ｂ、ＭＦαｌプロモーターおよび分泌リーダーフラグメ
ント プラスミドｐ１９２　（第３図）は、バクテリアプラス
ミドｐＵｃ１３中でクローニングした酵母接合フェロモ
ンα−因子（ＭＦα１遺伝子）用の遺伝子の一部分から
なる（ビエイラ、メッラング、上記；メッラング、メソ
ドロジー・イン・エンチモロジー、１０１巻、２０頁、
１９８３年）。ゲノムライブラリーからのＭＦαｌ遺伝
子のクローニングはクルシャン、ヘルスコウィッツ（上
記）により記載されている。原料としてＹＥｐ　１３の
Ｒａｍ　Ｈ１位置にクローニングした部分５ａｕ３Ａフ
ラグメントの酵母ゲノムライブラリーを使い（ナスマイ
ス、タッチエル、セル、１９巻、７５３真、１９８０年
）、上記遺伝子を類似の方法でこの実験室で単離した。

このライブラリーから、マットα２−３４突然変異のた
めの酵母ホモ接合の二倍体細胞株中のα−因子を表現し
たプラスミドを単離した（マンネーら、ジャナール・セ
ル・バイオロジー、９６巻、１５９２頁、１９．８３年
）。ＭＦα１遺伝子で重複した挿入物を含むクローンは
クルシャン、ヘルスコウィッッ（上記）によりキャラク
タリゼーシシンされた。ｐＺＡ２　（第３図）として知
られるこのプラスミドをＥｃｏ　ＲＩで切り、ＭＦα１
遺伝子からムる１７００ｂｐフラグメントを精製した。

ついでこのフラグメントを１）ＵＣｌ３のＨｃｏ　Ｒ１
位置にサブクローニングしてプラスミドｐ１９２を得た
。

プラスミドｐ１９２　１５μｇを培地塩緩衝液３０με
中で旧ｎｄｌｎ２０単位で３７℃で一夜消化した。反応
混合物をフレナラ緩衝液で６０ｔｔｌにうすめ、４デオ
キシリボヌクレオチドを加えて各々５０μＭの最終濃度
にした。水冷混合物にタレナウボリメラーゼ１０単位を
加え、１５℃で１２分培養した。フェノール／ＣｌＩＣ
／　ｚ　／　［！ｔｚＯ抽出後、水相を凍結乾燥により
１０ｔｔｌまで濃縮し、ＥｃｏＲＩ２Ｑ単位で３７℃で
７０分消化した。生成物を０．９％アガロースゲルを通
し電気泳動し、１．２　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＴ−ｔｌｉｎ
ｄ　ＩＩＩ　（プラントした）ＭＦαｌフラグメントを
抽出し、ＥｔＯＨで沈殿させた。このＤＮＡフラグ／ン
トはＭＦαｌの転写プロモーターおよび分泌シグナル配
列を含む。

Ｃ，ｖ−ｓｉｓ３°配列およびクローニング　ベクター
ｐＵｃ１２の調製；フラグメント連結反応 プラスミドｐＶＳＩＳ／ｌ’ｓｔ　２０μｇを、培地塩
緩衝液４０μ！中でＢｇＮ　　■およびＸｂａ　　１で
消化した。１％アガロースを通し、電気泳動後、ＤＮＡ
の抽出およびＥｔ０１１沈殿で精製したＶ−ｓｉｓ　７
５６ｂｐ　Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｘｂａ　　Ｉフラグメント
を与えた（第２図）。Ｅ、コリ複製プラスミドｐＵｃ１
２　　（５μｇ）をＥｃｏ　ＲＩおよびＸｂａ　　１で
消化し、上記のようにゲル精製した（第２図）。

第２図で、上記の４ＤＮＡフラグメントの等モル量を、
２９６ｂｐ　１ｌｐｈ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｕ　ｖ−ｓｉｓ
フラグメント１０ｎＨに調節し、リガーゼ緩衝液（６ｍ
Ｍｔ−リスｐＨ１，６，６，６ｍＭ　　ＭｇＣ１，，０
，４ｍＭ　　ＡＴＰ、２ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ　
　ＤＴＴ、１００．１７ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）１５ｐｉｌ
中で混合し、Ｔ、ＤＮＡｌ７．’／−ゼ４゜単位で１４
℃で一夜連結反応させた。反応混合物を室温にし、Ｔ４
リガーゼをさらに１５０単位加え、さらに１０時間培養
した。連結反応混合物７μｌを使ってＥ、コリに一１２
ＲＲ１（ＡＴＣＣＮｏ、　　３１３４３　；　Ｅ、　　
ポリバーら、ジーン、２巻、９５頁、１９７７年）を形
質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を選んだ。

１２の上記バクテリアコロニーからプラスミドＤＮＡを
つくり、Ｘｂａｌで消化した。２コロニーは適当なフラ
グメントの整列により予想される〜２．２ｋｂバンドを
与えた（第２図）。Ｂｇβ■−Ｘｂａｒ制限地図作成に
よるこれらのさらに分析は、Ｍ　Ｆ　ｔＸ　１　／　ｖ
−ｓｉｓ融合から約１．５ｋｂの予期のバンドを与え、
Ｂｇｌ　Ｕ　−Ｘｂａｌ　　ｖ−ｓｉｓフラグメントに
対７６０ｂｐを与えた。ＤＮＡ配列分析はＭＦα１／ｖ
−ｓｉｓ結合において望むヌクレオチド配列を立証した
。生成プラスミドをｐＶＳαと命名した。

大施炭主 ６６アミノ末端ｖ−ｓｉｓコドンのオリゴヌクレオチド
指令欠失突然変異誘発 ｖ−ｓｉｓ蛋白質ｐ２ＢｓｉｔとＰＤＧＦの間の相同は
、ｐ２８”のアミノ酸６７、ＰＤＧＦ　　Ｂ鎖のＮｉｌ
□末端残基に相当するセリン残基ではじまる（ジョンソ
ン、上記）。

ＭＦα１−次翻訳生成物の蛋白質分解プロセシングはイ
ニシェークーメチオニンからＬｙｓ　−Ａｒｇ開裂シグ
ナル８５アミノ酸で起る（クルシャン、ヘルスコウィソ
ツ、上記）。ｖ−ｓｉｓのセリン残基６７がＭ　Ｆ　ｃ
ｔ　Ｉ　　Ｌｙｓ−Ａｒｇプロセシングシグナルに直ち
に従うようにｐ２８ｓｉ″の第１　６６コドンが除去さ
れているｖ−ｓｉｓ誘導体が構成された。

第４図を参照すると、ｐＶＳαのゲル精製２．２ｋｂ　
　Ｘｂａ　　ｒフラグメントの約４０ｎｇを、Ｘｂａ　
　Ｉ消化アルカリ性ホスファターゼ処理Ｍ１３ｍｐＨＤ
ＮＡ１２０ｎｇと連結反応させた（スプリング、メソド
ロジー・イン・エンチモロジー、上記）。

連結反応混合物を使い、Ｘ−ｇａｌおよびＩ　ＰＴＧの
存在でＥ、コリに一１２細胞株ＴＭ　１０１　　（ＡＴ
ＣＣ該８７６）を形質転換した。単離した白色プラーク
をとり、ログ相発育ＪＭＩＯＩ細胞の３ｍｊ２培養物の
感染に使った。複製型分子（ＲＦ）ＤＮＡをつくり重鎖
成熟ファージのプラス鎖形と同一配向で挿入フラグメン
トを有しているクローンを同定した。このようなりロー
ンから一重鎖ファージＤＮＡをつくり、ｍ１ｌＶｓαと
命名した。

ｖ−ｓｉｓのコドン１−６６を正確に除くために、本質
的にシラーの２ブライマー法に従ってオリゴヌクレオチ
ド指令突然変異誘発を行なった（シラーら、マニュアル
・フォア・アドバンスト・テクニークス・イン・モレキ
ュラー・クローニング・コース、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８３年）。オリゴヌク
レオチドＺＣ１３０（３’　　へＧへへへＣＣＴＡＴＴ
ＴＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＡ５　’　　）をアプライド
・パイシステムズ３８０−　Ａ　　ＤＮＡ合成器上で合
成した。ＺＣ１３０５０ｐｍｏｌをキナーゼ緩衝液（Ｂ
ＲＬ）１０μβ中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ４
単位で３７℃で４５分キナーゼ化した。酵素を６５℃で
１０分加熱して不活性化した。

ｍｌ　Ｉ　ＶＳα０．５ｐｍｏｌを記載の条件（シラー
ら、上記）を使い、キナーゼ化ＺＣ１３０１ｐｍｏｌお
よび一般配列プライ’？　　（ＢＲＬ）１．５ｐｍｏｌ
とアニーリングしたが、ただしアニーリング混合物をま
ず６５℃に１０分加熱し、３７℃に１０分上げ、ついで
氷で迅速に冷した。ついでアニーリングした混合物をシ
ラーら（上記）が記載のようにタレナウボリメラーゼで
処理し、円形デュプレックスＤＮＡをつくり出した。延
長混合物の部分を使って、Ｅ、コリに１２ＪＭ１０１細
胞を形質転換した。

得られたファージプラークを、ニトロセルロース濾過器
上に移し、ついで３２ｐホスホリル化ＺＣ１３０で６５
℃でハイブリッド形成することにより、適当な欠失のた
めにふるった。正しく並置した配列は、使った厳重なハ
イブリッド形成温度で放射性プローブと安定なデュプレ
ックスを形成した。ふるった形質転換細胞の約１％はオ
ートラジオグラフィによりプラスの信号を与えた。クロ
ーンをプラーク精製し、制限酵素分析用にＲＦＤＮＡを
つくった。５つの単離物は１９５ｂｐ〜１４５０ｂｐ　
ｌ１ｉｎｄ　ｍ　−Ｂｇｌ　Ｕフラグメントの大きさに
予期の減少を示した（第４図）、２の単離物のＤＮＡ配
列分析により、正しい融合結合がなされたことが確かめ
られ、そこで適当な翻訳読みフレームを維持した。この
ファージの一つをｍ１ｌＶｓ２αと命名した。

実ＭＵ津１ 酵母表現ベクター Ａ、　プラスミｔ’ＹＥｐＶｓｚとＹＥｐＶＳ　２　α
（７）構成。

酵母複製ベクターＹＥｐ１３（ブローチら、ジーン、８
巻、１２１頁、１９７９年）を、実施例２および３に記
載のｖ−ｓｉｓ誘導構成物用の表現ビークルとして使っ
た。ＹＥｐ１３は２ミクロンの複製原と酵母ＬＥＵ２遺
伝子を含む多複製染色体外プラスミドである。これはロ
イシンに欠けた合成培地で発育させるとき、欠陥染色体
しＥＵ２遺伝子を有する酵母細胞株中のプラスミドの選
択を可能にする。酵母に表現された異通転子に酵母ター
ミネータ−配列を加えると、ｍＲＮＡの有効な転写終結
とポリアデニル化を確実にする。ｖ−ｓｉｓ表現単位ｖ
ｓαとＶＳ２αを、予めｙＥｐ　１３にクローニングし
たＴＰ（ターミネータ−フラグメン１−に隣接して置い
た（下記）。

プラスミドｐ２７０　（第５図参照）は、酵母トリオー
スホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）Ｊ転子の転写タ
ーミネータ−領域を含む。これは次の方式で構成された
。酵母ＴＰＴターミネーターフラグメントはプラスミド
ｐＦＧ１から得た（アルバー、カワサキ、上記）。これ
はＴＰＩ遺伝子の末端から二番目のアミノ酸コドンから
約７００塩基対下流のＥｃｏＲ１位置まで囲んでいる。

まずプラスミドをＥｃｏＲＩで切り、ついで端をＤＮＡ
ポリメラーゼＩ　（フレナラフラグメント）でプラント
し、合成Ｒａｍ　ＨＩリンカ−（ＣＧＧＡＴＣＣへ）を
加え、プラスミドｐ１３６をつくるため再連結反応させ
ることにより、ＢａＩＩＨ１位置をｐＦＧｌのこの独特
のＥＣＱＲ１位置の代りに置きかえた。ついでＴＰＩタ
ーミネータ−をｐ１３６からＸｂａ　　Ｉ−Ｂａｍ　Ｈ
Ｉフラグメントとして切出した。このフラグメントを、
Ｘｂａ　　ＩおよびＢａｇ　ＨＩ　Ｔ：線状化しである
ＹＥｐ１３（ブローチら、上記）に連結反応させた。生
成プラスミドはｐ２１３として知られている。ついでプ
ラスミドを旧ｎｄｌＩＩで消化し、生成末端をＤＮＡポ
リメラーゼｌ　（フレナラフラグメント）でプラントし
、Ｔ、ＤＮＡリガーゼを使って綿状分子を再環化するこ
とにより、旧ｎｄｌｌ［位置をｐ２１３のＴＰＩターミ
ネータ−領域から除去した。

一方、プラスミドｐＭ２２０　　（下記参照）をＸｂａ
■とＢａＩＩＩＨ１で消化し、ＴＰＩターミネータ−フ
ラグメント（〜７００ｂｐ）を精製し、このフラグメン
トをＸｂａ　　ＩおよびＢａＩＩＨｒ消化ＹＥｐ　１３
に挿入することにより、ｐ２７０を構成できる。

第６図を参照すると、プラスミド１）２７０ＤＮＡをＸ
ｂａ　　Ｉで消化し、凝集性ベクタ一端の再連結反応を
防ぐために子牛アルカリ性ボスファターゼで処理した。

夫々ｐＶＳαおよびｍ１ｌＶｓ２αのＸｂａ　　Ｉ消化
、アガロースゲル精製により、ｖ−ｓｉｓ表現単位ＶＳ
αおよびＶＳ２αをつくった。単離フラグメントの各々
を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ４０単位の存在でホスファタ
ーゼ化ｐ２７０ベクターのほぼ等モル量と連結反応させ
、連結反応混合物をＥ、コリに一１２ＲＲ１中に形質転
換させた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性コロニ
ーからつくり、３°ｖ−ｓｉｓ配列に隣接したＴＰＴタ
ーミネータ−を有するクローンを同定するために制限酵
素分析を行った。ゲル電気泳動後３．３ｋｂまたは３．
１ｋｂＢｇｌＩＩ’７ラグメントの存在は、夫＆　ＹＥ
ｐＶＳ　αおよびＹＥｐＶＳ　２αの正しい配向を示し
た。

１１、ＶＳ２α表現単位のｐｃＰＯＴへの挿入酵母培養
から最大の蛋白質生産を達成するためには、宿主細胞中
で著しく安定に保たれる表現ビークルを使うのが望まし
い。プラスミドｐｃＰＯＴはこのような好ましい表現ビ
ークルである。

ｐｃｐｏ’ｒで形質転換したＥ、コリＩＩＢＩＯＩは、
受入番号３９６８５でアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに預けられている。プラスミドｐｃｐｏ
’ｒは２ミクロンの円形ゲノム（ハートレー、ドネルソ
ン、ネーチャー、２８６巻、８６０頁、１９８０年）、
Ｅ、コリプラスミドｐＢＲ３２２複製および選択配列、
解糖酵素トリオースホスフェートイソメラーゼを符号化
したシゾサツカロミセス・ボムベＤＮＡ配列（ＰＯＴＩ
）からなっている。ｐｃｐｏ’ｒ中のＰＯＴＩ遺伝子の
存在は、炭素源としてグルコースを使う非選択的培地で
発育中、適当な宿主バックグラウンドでブラスミドの安
定な維持を確保する。

Ｓ、セレビシェＴＰＩプロモーターを使ってｐｃＰＯＴ
中のＶＳ２α配列の表現を制御した。プラスミドｐＭ２
２０はＭＦα１シグナル配列に融合したＴＰＩプロモー
ターを含む。ｐＭ２２０で形質転換したＥ、コリＲＲＩ
は、受入れ番号３９８５３でアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに預けられている。

第７図を参照すると、プラスミドｐＭ２２０をＢｇｌ　
　ＩＩとＢａｍ＋　ＩＩ　ｒで消化し、０．９％アガロ
ースゲルを通し電気泳動し、２．２ｋｂＴＰＩブロモ−
９−１ＭＦα１遺伝子フラグメントを抽出した。精製フ
ラグメントをＰｓｔ　　Ｉで消化し、生成１ｋｂＢｇｌ
−Ｐｓｔ　　Ｉフラグメントをアガロースゲル精製した
。

プラスミドＹＥｐＶＳ　２　ｃｘをＰｓｔ　　ＩとＢａ
ｍ　ＨＩで消化し、１．８　ｋｂＭ　Ｆ　ａ　１　／ｖ
−ｓｉｓ　／　Ｔ　Ｐ　Ｉターミネータ−融合フラグメ
ントをゲル単離した。プラスミドｐ　ＣＰ　ＯＴＧＢａ
ｍ　ＨＩで消化し、子牛アルカリ性ホスファターゼで処
理し、フェノール／ＣｌＩＣ＃　ｆｆ抽出し、ついでア
ガロースを通し電気泳動で精製し、ゲルから抽出し、Ｅ
　ｔＯＨで沈殿させた。

上記の３の単離したフラグメント（第７図）のほぼ等モ
ル量を１２℃で一夜連結反応させ、連結反応混合物を使
ってＥ、コリに一１２細胞株ＤＨＩ（ハナハン、口０、
メセルソン、翫、ジャーナル・モレキュラー・バイオロ
ジー、１６６巻、５７７頁、１９８３年）をアンピシリ
ン耐性まで形質転換した。プラスミドＤＮＡを形質転換
細胞からつくり、制限消化分析を使って挿入フラグメン
トの配向を確かめた。〜１５００ｂｐ　　ＢａｎＩＨＩ
　−５ａｌ■フラグメントの存在は、ＴＰＴターミネー
タ−フラグメントのＢａｌ１ｌＨＩ凝集性端が第７図に
示すように配向していることを示す。反対の配向はＢａ
ａ　ＨＩ／ｂｇｌ　ＩＩ融合をつくり出し、Ｂａｌ１ｌ
ＨＩで開裂されず、そこでこのフラグメントを生じない
。

８００ｂｐ　Ｓｐｈ　Ｉフラグメントは、ＴＰＩプロモ
ーターとｖ−ｓｉｓフラグメントがＰｓｔ　　１位置で
適当に融合していることを示す（第７図）。このプラス
ミドをｐＨ？−２と命名した。

Ｃ０プラスミドｐＶＳＢの構成 ｐＶＳ２αにより符号化した生成物は本物の人間ＰＢＧ
Ｆ　　Ｂ鎖より大きいから、また一層小さい生成物は形
質転換した酵母宿主細胞で一層高い表現水準を生じるか
ら、３゛端で先を切ったｐＶＳ２のｖ−ｓｉｓ配列から
なるベクターを構成した。この配列により符号化したポ
リペプチドはｐ２８″１のアミノ酸６７〜１７５からな
り、ＰＤＧＦのＢ鎖に相同である。

この“Ｂ鎖”配列を含む表現ベクターは、ｐＶＳ２α表
現単位のエレメントを部分ｖ−ｓｉｓ遺伝子およびｐ２
Ｂ＊ｉｓのアミノ酸１５８〜１７５を符号化した合成二
重鎖ＤＮＡフラグメントと結合することにより構成され
た。この合成フラグメントは、１３ｖ−ｓｉｓコドンの
多くに対し好ましい酵母コドンをおき代え、また符号化
配列の端にストップコドンを供給するように工夫された
。このベクターの構成は第８図と第９図に例示されてい
る。

プラスミドｙｃｐｖｓ　２　αをＰｓｔ　　ＩとＢａｍ
　ＨＩで消化し、部分Ｍｌ’ｉ’αｌ、ｖ−ｓｉｓ　、
　ＴＰ　Ｔクーミネーター配列からなる１、　８　ｋｂ
フラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製した。

図１に示したポリリンカーからなるプラスミドｐＩＣ１
９Ｒ（Ｊ、ローレンス・マーシュ博士、ユニバージティ
ー・オブ・カリフォルニア、イルビンから得られる）を
ｐＵｃ１９の旧ｎｄＩｕ位置に挿入しくノランダーら、
ジーン、２６巻、１０１〜１０６頁、１９８３年）、Ｐ
ｓｔ　ＩとＢａｍ　ＨＩで消化し、ベクターフラグメン
トをゲル精製し、ｐＶＳ２αからの１．８ｋｂフラグメ
ントに結合し、プラスミドｐＶＳ２αＴを得た。

図　　１ ＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡ
ＧＣＴＣＧＣＧ八八ＡＧＣＴＴＥｃｏＲＩ　　Ｅｃｏ　
　五−」麩ＩＩ　Ｓａｃ　　へへ　　Ｈｉｎｄ　　［Ｉ
Ｃ１ａ　Ｉ　　Ｘｂａ　Ｉ　　Ｘｂｏ　Ｔ　Ｎｒｕ　１
プラスミドルＭ２２０をｂｇｌ　　ＩＩとＰｓｔ　　Ｔ
で消化し、ＴＰＩプロモーターおよびＭＦｃｋ：ｌ配列
の５゛部分からなる約１ｋｂフラグメントを単離し、ｂ
ｇｌ　　ＩＴ＋Ｐｓｔ　　Ｉ消化ＰＩＣ１９Ｒでクロー
ニングした。

得られたプラスミドをＣ１ａ　Ｉ　＆Ｐｓｔ　　Ｉで消
化し、ＴＰＩプロモーターＭＦα１フラグメントをゲル
精製した。ついでプラスミドｐＶｓ２αＴをＣ１ａ■と
Ｐｓｔ　　Ｉで切り、ＴＰＩプロモーター−ＭＦα１フ
ラグメントに結合した。２．６ｋｂ　　Ｃ１ａＩ　−Ｂ
ａｍ　ＨＩフラグメントの存在により正しい構成が同定
され、ｐＴＶＳ２αＴと命名された。

プラスミドｐＶＳα１０μｇを完結までＸｍａ　　Ｉと
ｓｐｈ　　Ｔで消化した。またｖ−ｓｉｓ配列の大部分
からなる生成した約４．９　ｋｂベクターフラグメント
を、アガロースゲル電気泳動により゛精製し、ＤＮＡを
抽出し、ＥＬＯｌｌで沈殿させた。

ｖ−ｓｉｓ配列に対し新しい３′末端を供給するために
、アプライド・バイオシステムズ　モデル３８０−Ａ　
　ＤＮＡ合成器上で合成したオリゴヌクレオチドから二
重鎖ＤＮＡフラグメントを構成した。オリゴヌクレオチ
ドＺＣ２９９（第１表）０、１　ｐｍｏｌを、４０ｍＭ
　ＮａＣｊ！を含む１０μｅ中のオリゴヌクレオチドＺ
Ｃ３００等モル量と６５℃で５分加熱した。

第　　１　　表 ＺＣ２９９：Ｓ′ＴＡＡＧ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＣＧ
ＴＴ　ＧＣＣＧＣＧ　ＧＣＴＡＧＡ　　ＧＣＴ　　ＧＴ
Ｔ　　ＡＣＣＴＡＡ　　ＴＣＴ　　ＡＣＡ３　′ＺＣ３
００：”　　ＧＴＡＣＡ　　ＴＴＣＡＣＡ　　ＣＴＴ　
　ＴＡＧ　　ＣＡＡ　　ＣＧＧ　　ＣＧＣＣＧＡ　　Ｔ
ＣＴ　　ＣＧＡ　　ＣＡＡ　　ＴＧＧ　　ＡＴＴ　　Ａ
ＧＡ　　ＴＣＴ　　ＧＧＣＣ”ついで混合物を３７℃で
５分培養し、室温に冷した。精製した４、９ｋｂベクタ
ーフラグメント０．２ｐｍｏ　ｌを加え、混合物を１２
℃で１８時間連結反応させ、アンピシリン耐性までＥ、
コリＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ該６９４）を形質転換するの
に使った。ＤＮＡはアンピシリン耐性コロニーがらっ（
す、ＢｇＩ　　ｎとＸｂａ　　１で消化した。アガロー
スを通し電気泳動後、約７５０ｂｐ　　Ｂｇｌ　ＩＩ　
　Ｘｂａ　　Ｉの損失と約５００および２６０！甲の２
個の一層小さいフラグメントの出現により、望むクロー
ン（ｐＶＳαＢとして知られる）を同定した。

プラスミドｐＴＶＳ２αＴ約８μｇを１０μｌ容量中で
Ｘｂａ　　Ｉで完結まで消化した。容量をＢｇｌ■緩衝
液で４０μｌまで増し、Ｂｇｌ　　■６単位を加え、混
合物を３７℃で培養した。１０μβ試料を１５分および
３０分で５０ｍＭＥＤＴＡを含む停止緩衝液に除去し、
残り２０μβを４５分で停止した。生成混合物を０．７
％アガロースを通し電気泳動により分離した。約４．６
ｋｂ　　Ｂｇｌ　　Ｈ−Ｘｂａ　　ｌベクターフラグメ
ントを切り、ゲルから抽出し、ＥｔＯＨで沈殿させた。

プラスミドｐＶＳαＢをＢｇｌ■とＸｂａ　Ｉで消化し
、合成３″末端とストップコドンを含む約２６０ｂｐフ
ラグメントをアガロースを通し電気泳動により単離し、
ついでゲルから抽出し、Ｅｔｏｌｌで沈殿させた。

ｐＶｓ２αＴからの４．６ｋｂ　　Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｘ
ｂａ　１ベクターフラグメントとｐＶｓαＢからの２６
０ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｕ　−Ｘｂａ　　ｒフラグメントを、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ−存在で室温で７時間連結反応させ
た。反応混合物をアンピシリン耐性までＥ、コリＨＩ３
１０１を形質転換するのに使った。ＤＮＡを形質転換細
胞からつくり、望む挿入物の存在はアガロースゲル上で
５５０ｂｐ　　Ｐｓｔ　　Ｉ　−Ｘｂａ　　１バンドに
対しふるいわけることにより確かめた。正しい配置をも
つプラスミドをｐＶｓＢと命名した。

Ｄ、　　ｐＭＰＯＴ２の構成 酵母中にｖ　−ｓ　ｉ’ｓ誘導の表現のために、酵母２
ミクロンＤＮＡからのＲＥＰｌ、ＲＥＰ２、ＲＥＰ３、
ｏｒｉ配列およびＳ、ボムベトリオースホスフェートイ
ソメラーゼ（ＰＯＴＩ）遺伝子からなる安定な表現ベク
ターを構成した。ＰＯＴＩ遺伝子は、酵母宿主がトリオ
ースホスフェートイソメラーゼに対して欠陥のあるとき
、複雑な培地内で発育している形質転換酵母宿主にプラ
スミド維持を与える。

ＰＯＴＩ遺伝子はプラスミドｐＦＡＴＰＯＴから得た。

ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換したＳ、セレビシェ細胞株Ｅ
１８は、受入れ番号２０６　Ｑ　’、＋　ご７’＼ＴＣ
Ｃに預けられている。常法で宿主細胞からプラスミドを
精製できる。プラスミドをＳａｌ　Ｉ　とＢａｍ　ＨＩ
で消化することによりＰＯＴＩ配列をｐＦＡＴＰＯＴか
ら除去した。

この〜１６００ｂｐフラグメントを、Ｓａｌ　Ｉ　とＢ
ａａＨｌで消化することによりまず線状にしであるｐｌ
ｃ１９Ｒに連結反応させた。生成プラスミドのＲａｍ　
ＨＩ、Ｐｓｔ　　Ｉ　、Ｓａｔ　１位置を２工程で破壊
し、プラスミドｐｌｃＰＯＴ”を得た。Ｐｓｔ　　Ｉお
゛よびＳａｌ　Ｉで切ることによりＰｓｔ　ＩとＳａｌ
　１位置を除去し、ＤＮＡポリメラーゼ■　（タレナラ
フラグメント）で突出たＰｓｔＩ３’を消化しタレナラ
フラグメントを突出たＳａｔ　Ｔ　　５”に挿入するこ
とにより末端をプラントした。ついでプラント末端を連
結反応させた。ついでプラスミドをＢａ＋ｍ　ＨＩで切
り、ＤＮＡポリメラーゼ！　（フレナラフラグメント）
を末端に挿入し、プラント末端を再連結反応させること
により、Ｂａｎ＋　Ｈ１位置を除去した。

プラスミドＹＥｐ３（ブローチら、ジーン、８巻、１２
１−１°該頁、１９７９年）とＣ１／１から２ｕ配列を
得た。ＥｃｏＲＩで部分消化によりｐＭＢ９配列を除去
し、ＥｃｏＲＩ−切断ｐＢＲ３２２で置換することによ
り、ｐＪＤＢ２４８（ベフグズ、ネーチャー、２７５巻
、１０４〜１０９頁、１９７８年）からＣ１／１を構成
した。

Ｐｓｔ　１とＸｂａ　　Ｉで消化し、ゲル精製すること
により、ＹＥｐ　１３からＲＥＰ　３およびｏｒｉ配列
を除去した。Ｘｂａ　Ｉと　ｓｐｈ　Ｉで消化し、ゲル
精製することにより、Ｃ１／１からＲＥＰ２を得た。つ
いで２フラグメントを、プラスミドｐＵｃＲＥＰ　２．
３をつくるためＰｓｔ　　Ｉとｓｐｈ　Ｉで線状にしで
あるｐＵｃｌ８（ノランダーら、ジーン、２６巻、１０
１〜１０６頁、１９８３年）に結合した。

ＥｃｏＲＩとＸｂａ　　Ｉで消化し、１７０４ｂｐフラ
グメントのゲル精製によって、Ｃ１／１からＲＥＰ　１
を得た。ＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　　Ｉフラグメントを、
ＥｃｏＲＩとＸｂａ　　Ｉで線状にしであるｐＵｃｌ３
中にクローニングした。生成プラスミドをｐＵＣ１３＋
ＲＥＰ１と命名した。ｐＵｃｌ　３＋ＲＥＰ１プラスミ
ドを旧ｎｄＩＩで切り、ＥｃｏＲＩリンカ−（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズから得た）の存在で連結反
応させた。ついでＲＥＰ　１遺伝子を約１７２０ｂｐの
ＥｃｏＲＩフラグメントとして除去した。このＥｃｏＲ
Ｉフラグメントを、ＥｃｏＲＩとＸｂａ　　Ｉで線状に
しであるｐｌｃ７　　（ｐＵＣ８の１１ｉｎｄＩ［［位
置に挿入した図１に示したポリリンカー配列からなる）
中にクローニングした。生成プラスミドをｐｌｃＲＥＰ
　Ｉ　Ｎｏ　９と命名した。

最終表現ベクターｐＭＰＯＴ　２を構成するために、ｐ
ｒｃｐｏ’ｒ”を部分１１ｉｎｄＩｒｌ消化および完全
Ｓｓｔ　　Ｉ消化により線状にした。プラスミドｐＵｃ
ＲＥＰ　２．３を１１ｉｎｄｌｒ［と５ｓｔｌで切り、
ＲＥＰ２　、ＲＥＰ３　、ｏｒｉ配列からなるフラグメ
ントをゲル精製し、線状にしたｐｒｃｐｏ’ｒ”に結合
した。ＲＥＰ２　、ＲＥＰ３、ｏｒｉ　５ＰＯＴＩ　、
ａｍｐ’配列からなる生成プラスミドをｐＭＰＯＴ　　
ｌと命名した。ついでＲＥＰＩをｐＩＣＲＥＰ　Ｉ　Ｎ
ｏ　９からＢｇｌ　ＩＩ　−Ｎａｒ　　Ｉフラグメント
として除去し、Ｂｇｌ　　ｎとＮａｒ　Ｉで開裂しであ
るｐＭＰＯＴｌに連結反応させた。この連結反応生成物
をｐＭＰＯＴ２と命名した（ＡＴＣＣに預けた、受入れ
番号２０７４４）、プラスミドｐＭＰＯＴ　２をＣ１ａ
　ＩとＢａｍ　ＨＩで消化し、ベクターフラグメントを
上記のように精製した。

Ｅ、　　ｐＭＰＯＴ２へのｖ−ｓｉｓ表現単位の挿入１
、　ｐ　Ｍ　Ｐ　ＯＴ　２へのＶＳα表現単位の挿入プ
ラスミドｐＶＳα約１０μｇを２０μｌの容量中で完結
までＢｓｔＥｎで消化した。Ｐｓｔ　Ｉ５単位を加え、
混合物を３０分培養し、ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
た。止めた反応混合物を直ちに１％アガロースゲルを通
し電気泳動し、約５ｏｏｂｐの部分Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｂｓ
ｔ　Ｅ　ＩＩバンド（大部分ＭＦα１プレプロ配列とｖ
−ｓｉｓ　５　’部分からなる）を切り、ゲルから抽出
し、ＥｔＯｌｌで沈殿させた。

プラスミドｐＴＶｓ２αＴをＰｓｔ　　ＩとＢｓｔ　Ｉ
Ｉで完結まで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し
た。生成約４．８ｋｂベクターフラグメントおよび８０
０ｂｐ　Ｐｓｔｌ　　Ｂｓｔ　Ｅ■フラグメントを、Ｔ
、ＤＮＡリガーゼの存在で室温で６時間連結反応させ、
連結反応生成物をＥ、コリＩＩＢＩＯＩをアンピシリン
耐性まで形質転換するのに使った。

挿入物の存在を示す約１４５０ｂｐ　　Ｂｇｌ　　ＩＩ
フラグメントを含んでいるプラスミドを同定した。

これをｐＴＶＳαと命名した。

プラスミドｐ　Ｔ　Ｖ　Ｓ　ｒＸをＣ１ａ　ＩとＲａｍ
　ＨＩで完結まで消化し、ＶＳα配列を含む約２．９ｋ
ｂフラグメントをアガロースを通し電気泳動で単離し、
ゲルから抽出し、Ｅ　ｔＯＨで沈殿させた。約２．９ｋ
ｂ　　Ｃ１ａＩ　　Ｂａａ　ＨＩ　　ＶＳフラグメント
を、ｐＶＳ２αｍ（下記）に対し、記載のようにＣ１ａ
　ＩおよびＢａｇ　ＨＩ消化ｐＭＰＯＴ２と連結反応さ
せた。２．９　ｋｂ　Ｃ１ａ　Ｔ　−Ｒａｍ　ＨＩ挿入
物を含むプラスミドを同定し、ｐＶｓαｍと命名した。

２、ＭＰＯＴ２へのＶＳ２αの表現単位の挿入プラスミ
ドｐＴＶＳ　２　ｅｘ　Ｔ　ｆ１３ａａ＋　ＨＩ緩衝液
中Ｃ１ａ　ＴおよびＢａｎ　Ｈｒで完結まで消化した。

緩衝液を高い塩まで調節しくマニアチスら、上記）、Ｄ
ＮＡをＰｖｕ　１で完結まで消化した。これはベクター
配列を２回切り、ＶＳ２α配列を含む約２、７ｋｂ　　
Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｂａｎ　ＨＩフラグメントをアガロース
ゲル上で分割を可能にする。このフラグメントを０．９
％アガロースを通し電気泳動し、抽出し、Ｅｔｏｌｌで
沈殿させた。ついでフラグメントをＴ、ＤＮＡリガーゼ
の存在でＣ１ａ　Ｉ　−ＢａｇＨ１消化ｐＭＰＯＴ　２
と１３℃で２０時間連結反応させた。連結反応したＤＮ
Ａをアンピシリン耐性までＥ、コリＨＢＬＯＩを形質転
換するのに使い、プラスミドＤＮＡは生成コロニーから
つくった。プラスミドを２．７ｋｂ　　Ｃ１ａ　Ｉ　−
Ｂａｏ＋　ＨｌＶＳ２αフラグメントを含むと同定され
、ｐＶＳ２αｍと命名した。

３、　　ｐＭＰＯＴ２へのＶＳＢ表現単位の挿入プラス
ミドｐＶｓＢをＣ１ａ　ＩとＢａ＋＊　Ｈ１で消化し、
“Ｂ鎖”表現単位を含む２．２ｋｂフラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動で精製し、Ｈｔｏｌｌで沈殿させた
。フラグメントをＴ、ＤＮＡリガーゼの存在で室温で一
夜連結反応させ、反応混合物をアンピシリン耐性までに
Ｅ、コリＩ（ＢＩＯＩを形質転換するのに使った。ＤＮ
Ａを形質転換細胞からつくり、挿入物の存在はＣ１ａ　
ＩとＢａｅ＊　ＨＩで消化し、アガロースゲル電気泳動
により立証した。生成表現ベクターをｐＶＳＢｍと命名
した。

天］ｌ引影 酵母形質転換；ｖ−ｓｉｓ転写の分析 Ｓ２セレビシ工細胞株Ｅ８−１　ＩＣ（ＭＡＴαＩｅｕ
２−３．１１２ｐｅｐ４　３ｉ交雑Ｅ２−７８（ＡＴＣ
Ｃ２０６８９）　ｘｃＫ　１００　［ＡＴＣＣ２０６８
９）の半数体分離物）をプラスミドＹＥｐｖＳα、ＹＥ
ｐＶＳ２ｃｒ、ｐ２７０、ｐ−１１７−２、ｐｃＰＯＴ
で形質転換した。形質転換細胞を選び、ロイシンに欠け
た合成培地に保った。

Ｓ、セレビシェ細胞株Ｅｌ　１−３Ｃ（ＡＴＣＣ受入れ
番号２０７２７）（ＭＡＴｃｔｐｅｐ　４−３ｔｐｉｌ
）をプラスミドｐｃｐｏ’ｒとｐ−１１７−２で形質転
換した。形質転換細胞を選び、ＹＢＰＤ中に保った。

第８図を参照すると、ｖ　　ｓｉｓ関連ｍＲＮＡ転写物
の存在は、電気泳動およびつぎの全ＲＮＡのハイブリッ
ド形成分析により確かめられた。細胞株Ｅ８−Ｉ　ＩＣ
中の上記形質転換細胞からの全ＲＮＡは、マニアナイス
ら（上記）により記載のようにグアニジウムチオシアナ
ート抽出によりつくり、次の変形をした。１００ｍｊ！
培養物を１×１０８細胞／ｍ７！の密度まで発育させた
。細胞を遠心分離でベレット化し、＋＋２０で３回洗い
、グアニジウム溶菌溶液’１ｍｌを加え、ついで丁度メ
ニスカス下まで０．５　＊■ガラスピーズを加えた。バ
ーストの間の氷で冷して、管を３回１分間施回させた。

溶液をピペットでとり除き、記ｉ！２（マニアナイスら
、上記）のようにＣｓＣｌ−ｚを通し遠心分離によりＲ
ＮＡを単離した。プラスミド形質転換細胞ｐ２７０、Ｙ
ＥｐｖＳα、ＹＥｐＶＳ２１ｍ’、ｐｃＰＯＴ、ｐ　１
１７−２からのＲＮＡ１５μｇを、トーツスにより記載
（ＰＮＡＳ、７７巻、５２０１頁、１９８０年）のよう
に、グリオキシル化し、０．９％アガロースゲルを通し
電気泳動し、ニトロセルロースに移した。ｐＶｓＩｓ／
Ｐｓｔからの精製Ｐｓｔ　［ｖ−ｓｉｓフラグメントを
ニックトランスレーションし、浦ｊ４’ｊ　２”ｊ結合
ＲＮＡにハイブリッド形成し、ハイブリッド形成種をオ
ートラジオグラフィで検出した（第１０図）。ＹＥｐＶ
Ｓαからの〜１９００ｂｐ、　ＹＥｐ　ＶＳ　２αから
の〜１６５０ｐｂ、ｐＨ７−２からの〜ｔ７ｏｏｐｂの
転写バンドは、ｖ−ｓｉｓ融合構成物の転写を確かめ、
構成における転写の開始と停止の信号の使用を確かめた
。負の対照１）２７０（！：Ｉ）ＣＰＯＴでは、ｖ−ｓ
ｉｓ関運関与転写出されなかった；プラスミドｐ　ＶＳ
αｍＳｐ　ＶＳ　２　ｅｘｍ、、ｐＶｓＢｍ　、。

ｐＭＰＯＴ２を使いＳ、セレビシェ細胞株Ｅ１８を形質
転換した。細胞株Ｅ１Ｂは、細胞株Ｅｌｆ−３Ｃ（ＡＴ
ＣＣ隘２０７２７）と△ｔｐｉ２９の交雑によりつくっ
た二倍体である。ロススタイン（メソドロジー・イン・
エンチモロジー、１０１巻、２０２−２１０頁、１９８
３年）によって本質的に記載のように、細胞株Ｅ２−７
８（ＡＴＣＣＮｌ１２０６８９）のトリオースホスフェ
ートイソメラーゼ遺伝子を分裂することによりΔｔｐｉ
２９はつくられる。

去」ｕｌｌ 酵母により表現されたｓｉｓ関連生成物の分析およびバ
イオアッセイ Ａ、酵母培地の濃縮 ＹＥｐ　１３およびｐｃｐｏ’ｒ誘導ｖ−ｓ誘導槽成を
有する形質転換細胞を、適当な培地で３０℃で（１，２
Ｎ培養）、回転空気振とう器で２２゜ｒｐｍでかきまぜ
て、静止相まで発育した。培養物を収穫し、細胞を遠心
分離で除き、培地を疎水性の分子−を結合するＣ−８セ
フアロース（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ
、アブサラ、スエーデン）カラム上で濃縮した。本物の
人間ＰＤＧＦは高度に陽イオン的で疎水性の蛋白質であ
る（ヘルディンラ、ＰＮＡＳ、７６巻、３７２２頁、１
９７９年、ライネス、ロス、上記）　、　５ｉｓ−関連
の推定上の酵母生成物は類似の特性をもつことが期待さ
れた。ｓｉｓ生成物の予期された疎水特性を利用し、分
泌が予期された酵母培地から濃縮した。Ｃ−８カラムに
結合した分子を、適当な疎水性溶剤でマトリックスから
溶出した。

形質転換した酵母培養物からの廃発育培地を５％Ｅｔｏ
ｎに調節し、２〜３ｍ１１分の流量で８ｍＩＣ−８セフ
アロースカラムを通した。ついでカラムを５％ＥｔＯＨ
１００ｍｊ！で２０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＮＨ４Ｈ
ＣＯ３）中に洗った。

結合物質を２０％プロパツールで２０ｍＭＮＩＩＪＣＯ
３中に溶出し、溶出液を１−２　ｍ　ｌフラクションに
集めた。２８０ｎｍの光吸収（Ａｚａ。

１、４．＝　１．　Ｏｔｒｙ蛋白質／　ｍ　Ｉｔ　）に
より、またはローリ−らの方法（ジャーナル・バイオロ
ジカル・ケミストリー、１９３巻、２６５頁、１９５１
年）によって、フラクションの蛋白質含量を分析した。

濃縮フラクションを集め、凍結乾燥し、ついでＰＢＳ（
Ｕン酸塩緩衝生理的食塩水、ｐＨ７，４）５００〜７０
０μｌに再懸濁した。

ＰＯＴＩ選択下（炭素源としてグルコース）発育した細
胞株Ｅ−１１−３Ｃ中の形質転換細胞ｐＨ７−２は、培
地でＰＤＧＦ様物質のかなり高水準を生じることが期待
され、そこで濃縮なしでＰＢＳに対し培地を透析後分析
した。

形質転換細胞ｐＶｓαｍ、ｐＶｓ２αｍ、ｐＶＳＢｍ、
ｐＭＰＯＴ２からの培地試料を、ＣＭ−’セファデック
スに吸着し、１ＭＮａｃｊ！で１Ｍ酢酸、ｐｌ＋４．５
に溶出することにより濃縮した。濃縮培地を０．１　Ｍ
酢酸、ｐＨ７に対し透析し、濃縮物中のＰＤＧＦ様物質
の量をＥＬＩＳＡで決定した。

Ｂ、酸素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＩｊＳＡ　
）によるＰＤＧＦ様物質の検出。

酵母形質転換細胞によるＰＤＧＦ様物質の表現をＥＬＩ
ＳＡでしらべ、精製人間ＰＤＧＦで展開した標準曲線と
比較することにより定量した（ライネス、ロス、上記）
。典型的標準曲線は次のようにしてつくった。

精製した人間ＰＤＧＦ、ＰＢＳ中２．５ｎｇ／ｍ７！を
、イムロン■　（ダイナチク・ラボラトリーズ社）９６
ウエルマイクロタイタープレート（１００μｌ／ウエル
）と共に４℃で一夜培養した。このコーティング溶液を
除き、ＰＢＳ中の０．１％ラビットアルブミン１００μ
ｌ／ウエルを加え、プレートを３７℃で一時間培養した
。

精製ＰＤＧＦ試料（０，１〜４０ｎｇ／ｍＡりを、０．
０５％トイン２０と１　ｍｇ／　ｍ　ｌラビットアルブ
ミン（ＲＳ　Ａ）を含むＰＢＳ中の山羊ａｎｔｉ−ＰＤ
ＧＦ　Ｉ　ｇＧ　（５／Ｊ　ｇ／ｍｌ　と共に別々に培
養した。マイクロタイタープレートを０．９％ＮａＣｌ
１　、０．０５％トイン２０で５回洗い、かわかし、各
試験溶液１００μｌをマイクロタイターウェルに加え、
３７℃で２時間培養した。

前のようにプレートを洗い、０．０５％トイン２０と１
ｍｇ／ｍ／Ｒ５Ａを含むＰＢＳ中で１対１０００にうす
めたペルオキシダーゼ抱合ブタ抗山羊ＴｇＧ（タボ−社
）を３７℃で２時間で加えた。プレートを前のように洗
い、０．０１２％過酸化水素（Ｈ２０□）を含む新しく
つくった０、０４％０−フェニレンジアミン（１００μ
ｌ／ウエル）を室温で５０分で加え、４　Ｎ　１ｈｓＱ
。

（５０μｌ／ウエル）を加えることにより反応を５０分
で止めた。ダイナチクプレートスキャナーを使い、４９
２ｎｍの吸光度を測定した。各試験点は３回測定し、平
均上標準誤差としてプロットした。酵母培地のＣ−８溶
出液および未濃縮培地試料をＰＢＳでうすめ、記載のよ
うに分析し、ＰＤＧＦ標準曲線と比較した。第２表は代
表的な一連の実験の分析結果のまとめである。第１１図
は測定したＣ−８溶出液試料容量範囲のＩＦ、ＬＩＳＡ
を示し、精製ＰＤＧＦからの標準曲線と比較した用量−
反応曲線を生じている。

ＭＰＯＴ構成物に対する生のＥＬ　Ｉ　ＳＡデータは示
してないが、第１３図と第１４図に示したようにラジオ
レセプターおよびマイトジェネシスアッセイデータに合
体しである。

Ｃ，ＰＤＧＦに対するラジオレセプターアッセイ（ＲＲ
Ａ） ＰＤＧＦに対するラジオレセプターアッセイ（ボウエン
−ホープ、ロス、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー、２５７巻、５１６１頁、１９８２年）は、酵母
中の生物学的活性ＰＤＧＦ様物質の検出に特異な敏感な
（０，２〜２ｎｇ／ｍｊ！　ＰＤＧＦ）方法である。こ
のアッセイでは、ＰＤＧＦ様物質が、細胞表面ＰＤＧＦ
受容体上の結合位置に対し精製した放射性標識１２５＋
ＰＤＧＦと競争する能力を試験する。

結果を精製した未標識ＰＤＧＦで得られる標準曲線と比
較して解釈する。他のアッセイ法（たとえばＥＬＩＳＡ
）で得られた結果との比較は、結合した物質の定量の他
に受容体／配位子相互作用の強さを示す。アッセイは次
のように行なう。ニスクール２４ウエルクラスタートレ
ー中の１．５Ｘ１０’細胞／２ｃｉ培養ウエルを、１％
人間血漿誘導血清（ＰＤＳ）で補足したダルベンコス変
性イーグルズ培地（ＤＭＥＭ）中で平板培養することに
より、二倍体人間繊維芽細胞のサブ集密的細胞単層をつ
くる。培養物を氷トレー上にセットし、水冷結合リンス
（２５ｍＭＨＥＰＥＳでｐＨ７，４に緩衝し、０．２５
％［３ＳＡを補足したハムの培地Ｆ−１２）で一度すす
ぐ。

結合培地中の試験物質１ｍ６／ウエルを加え、培養物を
冷却室で振とうプラントホーム上で３〜４時間培養した
。トレーを氷上に置き、吸引し、冷結合リンスで一度す
ずぎ、０．５　ｎｇ／　ｍ　１１２５＋−ＰＤＧＦを含
む１ｍ１／ウ工ル結合培地と上記のように１時間培養す
る。結合リンスの４回すすぎで標識付けを終らせ、可溶
化緩衝液で抽出することにより細胞会合した１２５Ｉ−
ＰＤＧＦを決定する。０．０．０５．０．１．０．２．
０．４．０．８　ｎｇ／　ｍ　１の精製ＰＤＧＦを使い
標準曲線を得、試験試料をこれらの値と比較する。

酵母Ｃ−８溶出液および１×培地試料に対しＲＲＡで得
た結果を第２表に示す。

さらに、プラスミドｐＶｓαｍ、ｐＶｓ２αｍ　ｓｐＶ
ＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を含む酵母形質転換細胞からのＣ
Ｍ−セファデックス培地濃縮物によるＰＤＧＦ受容体結
合を、本物のＰＤＧＦと比較した。第１３図に示したよ
うに、結果を精製未標識ＰＤＧＦで生じた標準曲線と比
較することにより解釈した。ｖ−ｓｊｓ構成物で形成転
換した培養物からの培地は、ＰＤＧＦ受容体への結合に
対し１２５＋　　　ＰＤＧＦと競争することがわかる。

ｐＭＰＯＴ２で形質転換した酵母細胞からの培地は、受
容体結合に対し放射性標識ＰＤＧＦと競争しない。

Ｄ、マイトジェネシスアッセイ 培養においてＤＮＡ合成と細胞発育を刺激するＰＤＧＦ
の能力は、その定義と発見の基礎であった。ＰＤＧＦに
応答する培養細胞のＤＮＡ中に３Ｈ−チミジンを合体す
ること（ライネス、ロス、メソドロジー・イン・エンチ
モロジー・１０９巻、印刷中）は、酵母中に生じるＰＤ
ＧＦ様分子の生物学的活性を示す好ましい方法である。

１０ｍＭ酢酸中の試験試料（１００μｌ／ウエル）を、
２ＣＩａコスタール２４−ウェル培養皿中のマウス３Ｔ
３細胞の静止培養物（ｌ　ｍ　１１中２〜３Ｘ１０”細
胞／ウェル）に加える。４〜５日細胞を１０％血清中で
平板培養し、培地をこかつさせることによって、静止試
験培養物を得ることができる。試験試料を２０時間でウ
ェルから除去し、２ｕＣｉ／ｍ／の〔３Ｈ〕−チミジン
と５％（容量／容量）子牛血清を含む新しい培地０．５
　ｍ　ｌ　／ウェルでおきかえる。３７℃でさらに２時
間培養後、培地を吸引し除き、ウェルを水冷５％ＴＣＡ
　１　ｍｊ！で２回洗い、混合し０．２５Ｎ　ＮａＯＨ
０，８ｍｌ中でＴＣＡ−不溶物質を可溶化し、５ｍｌア
クアゾル中のこの溶液０．６　ｍ　ｌを液体シンチレー
ションカウンターで数えることにより、細胞を収穫する
。対照ウェル（１０ｍＭ酢酸のみ１００μｌ）以上の倍
刺戟を決め（ふつうは３０〜５０倍最大刺戟）、精製Ｐ
ＤＧＦ調製物を使って得た標準曲線と比較する。

第２表は酵母中に生じたＰＤＧＦ様物質に対するマイト
ジェネシスアッセイで得た結果を示し、上記アッセイ法
によって測定したＰＤＧＦ様物質の活性を比較しである
。第１２図はり１１７−２の形質転換Ｅｌ　１−３Ｃお
よびｐＶｓα形質転換Ｅ８−１１Ｃからの濃縮培地によ
り引出されたマイトジェン応答を示し、精製人間ＰＤＧ
Ｆで得たものと比較しである。

第 ｐＶｓα／Ｅ８−Ｉ　ＩＣ２，０１ ｐＶＳ２α／Ｅ８−１１Ｃ１６，０１ ｐＨ？−２／Ｅｌｌ−３Ｃ１，４゜ １×培地 ｐＨ７−２／Ｅｌｌ−３Ｃ− １１Ｂ８　　　　　４．６　　　　１０２１　　　　　
８６４　　　　１６〜９７　　　３１０Ｌ　　　　　　
１２０　　　　１３．９　　　　８７４．２　　　　０
，１８　　　　　２．５さらに、プラスミドｐＶｓαｍ
、ｐＶｓ２αｍ。

ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を含む酵母形質転換細胞から
のＣＭ−セファデックス濃縮物により引出されたマイト
ジェン応答を、本物のＰ　Ｄ−Ｃ；　Ｆで得たものと比
較した。第１４図を参照すると、ｖ　−５ｉｓ構成物で
形質転換した培養物からの培地は、静止３Ｔ３細胞によ
る３Ｈ−チミジンのとりあげを刺戟した。上でわかるよ
うに、静止３Ｔ３細胞による３Ｈ−チミジンの取り上げ
は、マイトジェン刺戟のしるしとされている。ｐＭＰＯ
Ｔ２で形質転換した酵母細胞からの培地は、マイトジェ
ン活性を示さなかった。

示したデータから、ここで構成した酵母細胞からの発育
培地は、本物の人間ＰＤＧＦと同一の生物学的活性を有
することが明らがである。さらに、これらの活性はＰＯ
ＴＩ選択下で発育したｐＨ？−２形質転換細胞株Ｅｌ　
１−３Ｇからの非−ａ縮（１×）培地中で容易に検出で
きる。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル分
別物質のつぎのマイトジェネシスア、セイによって、Ｖ
ＳＢ調製物はさらに特徴づけられる。ゲルの３０キロダ
ルトン領域からＶＳＢマイトジェン活性の９０％が回収
される（第１５図）。

これはこの表現単位が著しく均一で同様に十分にプロセ
シングされた物質を生じることを示している。この意味
で、ＶＳＢ蛋白質は全く不均一な上記のＶＳ２αおよび
ＶＳα蛋白質よりすぐれている。さらに、ＶＳＢ物質は
正の化学誘引物質であり、ＰＤＧＦ生物学的活性の全ス
ペクトルを有し得ることを示している。

上記から、本発明の特別の具体化を例示の目的で記載し
てきたが、本発明の精神と範囲から離れることなく種々
の変形を行なうことができる。したがって本発明は特許
請求の範囲による以外は制限を受けない。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１Ａ図はＳＳｖのプロウィルスのゲノムの
模式的な制限酸素地図である。第１Ｂ図はＳＳｖゲノム
のｖ−ｓｉｓ域によって一コード化されたヌクレオチド
配列及び予測アミノ酸配列を示す、第２図はＭＦα１プ
ロモーターを有し、及びｖ　　ｓｉｓ遺伝子の上流に分
泌信号配列を有するプラスミドの構造を例示する。第３
図はプラスミドｐ１９２の構造を例示する。第４図はア
ミノ末端６６　Ｖ−ｓｉｓコドンの欠失変異誘発を指令
されたオリゴヌクレオチドを例示する。第５図はプラス
ミドｐ２７Ｑの構造を例示する。第６図はＴＰＩターミ
ネータ−の上流のｖ−ｓｉｓ発現単位の挿入を例示する
。第７図はＴＰＩプロモーターによるＭＦαｌプロモー
ターの代替及びｐｃＰＯＴベクターの中でのＶＳ２αの
構造体の含有を例示する。 第８図はプラスミドｐＴＶＳ２αＴの構造を例示する。 第９図はＢ鎖発現単位ＶＳＢの構造及びそのｐＭＰＯＴ
２ベクターの中への導入を例示する。 第１０図は一ツク翻訳（ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅ
ｄ　）　ｖ　−５ｉｓ遺伝子フラグメントを用いて探査
された各種プラスミドにより形質転換された酵母宿主か
ら単離された全ＲＮＡの電気泳動分析及びそれに続く雑
種形成分析を示す。第１１図はプラスミドｐＶｓα、ｐ
Ｖｓ２α、ｐ　１１７−２　及ヒｐｃＰＯＴを含有する
酵母の形質転換体からの濃縮培地のＥＬＩＳＡの結果を
示す。第１２図は純化ＰＩ）ＣＦと比較された場合のプ
ラスミドｐＶＳα及びｐＨ？−２を含有する酵母の形質
転換体がらの濃縮培地の有糸分裂促進活性の投与応答曲
線である。 １．−　Ｈな≦） ）−１／ｌ　　　　（ｊ　）ＣＪ　ｌ！Ｉ　　　　Ｃｊ
　ＯＬ ＜−１−ｏＪｌ：ｆｃＪｏ− Ｑ−〇− υ−〜（ＪＳ−ロー　　　Φａ （ＪＯＪ　　　　ｔＯＬＪｃＬ＋　　　　　　＋り　　
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＋　　　Φｅｌ　　　（ＩＪ（ｅ　　　　Ｌ）ｔ／ｌ　
　　　（Ｊロー　　　トづ　　　Ｑ：　　　Φ−〜（−
（’−Ｌ１１−（Ｊ　　　　ロ＞　　　　（）−ＣＪ（
０’ｌωロ　　　ロー　　　φＣｊ　ｅ　　　　ＬＪ　
ｒ−Ｌ）　４１　　　　（：Φ　　ｈ＜Ｃｎ　　　　υ
ｏ　　　ロく−　　　ヒζ　　　←−＋ｒ−ＯＬＩ　Ｌ
　　　　（Ｊ−寵υΦ　　　ロ＞　　　　（−＜−（ｎ
Ｌ）（：　　　　Ｌ）氏旨′；　　尊乏、５″　　　＜
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Ｌ）　Ｌ　　　　（ｊψ　　ｈ＋＋ψ　　　Ｃ）　　　
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＞　　　　（４ＬＩＬ　　　　Ｏ（ｊ　ＣＤ　　　　（
１−（−の１−　（Ｊ　　　　（ｊ　ＬＩ　　　　Ｌｌ
　（ＬＩＮ（ｊ−（Ｊｏ　　　　Ｃ！＋１／ｌ　　　　
（ｊｔ／ｌ　　　　（ｊＣＣ％Ｊ（ＪＰ−ｃｐωトづ　
　　Ｑ（訃）　　　噺）　　　已；　　ま目；＜：１＜
５〉　　　ロー （Ｊ　ＩＡ　　　（′ｃ″　φ０１　　　（Ｊｌ／ｌ　
　　（ＪＬ　　　５？　　　Ｗ−（ｊ　＞　　　　（Ｊ
　Ｌ　　　Ｏ：ｌ　Ｌｌ　１−　　　　φ為　　　ＱΦ
ト（Ｊ　　　　（Ｊ（１”−Ｌｌ＜　　　　１−（Ｊ　
　　　）−ｔ／ｌ　　　　（Ｊ＜Ｌ）　Ｏ（Ｊ　’Ｉ　
　　　Ｃｊｌ−＜ｍ　　　〜）−Ｌ　　　　Ｌｌ　２Ｌ
ｌ（Ｊ　Ｓ−＜５　％　　　トｆｃＩ　　　（Ｊ−Ｑ’
ｌ　Ｌ）　Ｊニー　　　ト１１ｊ　　　＜（Ｊｌ　　　
　１−ＣＪ　　　　（ｊ＞　　　　Ｃｊ（０）（１−（
ｊ＞　　　　ＩＪ−内部の浄−（内容に変更なし） ０．２　　　　０．４　　　　０．６　　　　０．８　
　　　　　＋、０ｆ ＱＱ）　　　史　　　丈　　　輿　　　　ＱＱＬＩ ビ Ｑ 〇− 二 ｎ　Ｏ 臼ト 工

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）真核生物細胞内で生物学的に活性なＰＤＧＦ類似
   因子の発現及び分泌を指示し得るＤＮＡ構成体において
   、該ＤＮＡ構成体がＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又
   は）ＰＤＧＦと同様の有糸分裂促進活性を有するタンパ
   ク質をコードする遺伝子であって真核生物細胞からの該
   タンパク質の分泌を指令し得る信号配列をコードする該
   遺伝子をその下流に伴う転写プロモーターを含有するこ
   とを特徴とする前記のＤＮＡ構成体。
2. （２）真核生物細胞が酵母細胞であり、プモーター及び
   信号配列が酵母に由来するものである特許請求の範囲第
   １項記載のＤＮＡ構成体。
3. （３）遺伝子がシミアン腫瘍ウィルスのｖ−ｓｉｓ遺伝
   子又はその誘導体であって生物学的活性のタンパク質を
   コードするものである特許請求の範囲第１項記載のＤＮ
   Ａ構成体。
4. （４）シミアン腫瘍ウィルスのｖ−ｓｉｓ遺伝子の誘導
   体がＰＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なタンパク質をコード
   するｖ−ｓｉｓ遺伝子の部分的遺伝子である特許請求の
   範囲第３項記載のＤＮＡ構成体。
5. （５）遺伝子が生物学的活性タンパク質をコードし、Ｐ
   ＤＧＦに対応するヒトのｃＤＮＡ遺伝子又はその部分的
   遺伝子である特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ構成体
   。
6. （６）生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の製造方法に
   おいて、 真核生物細胞内で生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の
   発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ構成体であってＰＤＧ
   Ｆと実質上同じ構造及び（又は）ＰＤＧＦと同様の有糸
   分裂促進活性を有するタンパク質をコードすると共に真
   核生物宿主細胞からの該タンパク質の分泌を指令し得る
   信号配列をコードする遺伝子をその下流に伴う転写プロ
   モーターを含有する該ＤＮＡ構成体を真核生物宿主細胞
   の中へ導入し； 該真核生物宿主細胞を適切な培地の中で生育させ；そし
   て 該真核生物宿主細胞から該遺伝子にもとづくタンパク質
   製品を単離することを特徴とする前記の方法。
7. （７）真核生物細胞が酵母細胞であり、プロモーター及
   び信号配列が酵母由来のものである特許請求の範囲第６
   項記載の方法。
8. （８）遺伝子がシミアン腫瘍ウィルスのｖ−ｓｉｓ遺伝
   子又はその誘導体であって生物学的活性タンパク質をコ
   ードするものである特許請求の範囲第６項記載の方法。
9. （９）シミアン腫瘍ウィルスのｖ−ｓｉｓ遺伝子の誘導
   体がＰＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なタンパク質をコード
   するｖ−ｓｉｓ遺伝子の部分的遺伝子である特許請求の
   範囲第８項記載の方法。
10. （１０）遺伝子が生物学的活性タンパク質をコードし、
    ＰＤＧＦに対応するヒトのｃＤＮＡ遺伝子又はその部分
    的遺伝子である特許請求の範囲第６項記載の方法。
11. （１１）特許請求の範囲第６〜１０項のいずれか１項記
    載の方法によって得られる生物学的に活性なＰＤＧＦ類
    似因子。
12. （１２）特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項記載
    のＤＮＡ構成体を用いて形質転換させた真核生物細胞。
13. （１３）ＤＮＡ構成体がプラスミドｐＶＳＢｍである特
    許請求の範囲第１２項記載の真核生物細胞。
14. （１４）哺乳動物細胞群の生育促進方法において、特許
    請求の範囲第１〜５項のいずれか１項記載のＤＮＡ構成
    体を用いて形質転換させた真核生物細胞によって発現さ
    れた生物学的活性のＰＤＧＦ類似因子を有する細胞群を
    恒温培養することを特徴とする前記の方法。
15. （１５）酵母の中で複製可能であって酵母のトリオース
    ホスフェートイソメラーゼプロモーターを含有するＤＮ
    Ａ構成体において、 酵母プロモーターが酵母交配フェロモンアルファ因子を
    コードする遺伝子の信号配列をその下流に伴い、該信号
    配列がＰＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なタンパク質をコー
    ドするｖ−ｓｉｓ遺伝子の部分的遺伝子及び酵母トリオ
    ースホスフェートイソメラーゼターミネーターをその下
    流に夫々伴うことを特徴とする前記のＤＮＡ構成体。
16. （１６）プラスミドｐＶＳＢＭ。
17. （１７）真核生物細胞内で生物学的に活性なＰＤＧＦ類
    似因子の発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ構成体におい
    て、該ＤＮＡ構成体がＰＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なタ
    ンパク質をコードするＤＮＡ配列をその下流に伴う転写
    プロモーターを含有し、該タンパク質がＰＤＧＦと実質
    上同じ構造及び（又は）同じ有糸分裂促進活性を有する
    と共に真核生物細胞からのタンパク質分泌を指令する信
    号配列を有することを特徴とする前記のＤＮＡ構成体。
18. （１８）生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の製造方法
    において、 真核生物細胞内で生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の
    発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ構成体であってＰＤＧ
    ＦのＢ鎖に実質上相同なタンパク質をコードするＤＮＡ
    配列をその下流に伴う転写プロモーターを含有し、該タ
    ンパク質がＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又は）同じ
    有糸分裂促進活性を有すると共に真核生物細胞からのタ
    ンパク質分泌を指令する信号配列を有する該ＤＮＡ構成
    体を真核生物宿主細胞の中へ導入し； 該真核生物宿主細胞を適切な培地の中で生育させ；そし
    て 該真核生物宿主細胞から該遺伝子にもとづくタンパク質
    製品を単離することを特徴とする前記の方法。
19. （１９）哺乳動物細胞群の生育促進方法において、真核
    生物細胞内で生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の発現
    及び分泌を指令し得るＤＮＡ構成体であってＰＤＧＦの
    Ｂ鎖に実質上相同なタンパク質をコードするＤＮＡ配列
    をその下流に伴う転写プロモーターを含有し、該タンパ
    ク質がＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又は）同じ有糸
    分裂促進活性を有すると共に真核生物細胞からのタンパ
    ク質分泌を指令する信号配列を有する該ＤＮＡ構成体を
    用いて形質転換させた真核生物細胞によって発現された
    生物学的活性のＰＤＧＦ類似因子を有する細胞群を恒温
    培養することを特徴とする前記の方法。