JPS62209101A

JPS62209101A - エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングステイフオリアの細胞培養物からの免疫刺激作用性ポリサツカライド、その製造方法及びこれを含む製剤

Info

Publication number: JPS62209101A
Application number: JP61280949A
Authority: JP
Inventors: ヒルデベルト　ヴアーグネル; マインハルト　ハー・ツエンク; ホルゲル　オツツ; ベルント　ブリユンメル
Original assignee: BAT Cigarettenfabriken GmbH
Current assignee: British American Tobacco Germany GmbH
Priority date: 1985-11-27
Filing date: 1986-11-27
Publication date: 1987-09-14
Anticipated expiration: 2009-06-15
Also published as: EP0225496B1; GR3005297T3; ATE76434T1; JPH0645643B2; DE3685411D1; US4857512A; EP0225496A2; ES2039193T3; DE3541945A1; EP0225496A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はエキナセアプルプリア［Ｅｃｈｉｎａｃｅａｐ
ｒｕｐｕｒｅａ（Ｌｉｎｎｅ）Ｍｏｅｎｃｈｌマタハエ
キ−ｊ−ｔ　７７　ングステイフォリア［Ｅｃｈｉｎａ
ｃｅａ　ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ（Ｄｅ　Ｖａｎｄｏ
ｌｌｅ月の細胞培養物からの新しい免疫刺激作用性ポリ
サッカライド、その製造方法ならびにこのポリサッカラ
イドを含有する薬剤に関係する。

［従来の技術］治療的概念としての免疫刺激は医学界で以前から知れて
いる。一般に治療的概念としての免疫刺激とは、それ自
体ごく僅かな抗原作用を有するかまたは抗原作用を全く
有しないが、非特異的または特異的な方法で身体に固有
な防御機構を誘発しうる物質の注入を意味する。現在の
知識によると、多くの物質が免疫防御を刺激しうるちの
であり、特に例えばＡＩ（ＯＨ）ｘ、ＭＱＳＯ４、ベリ
リウム、マイコバクテリアを添加した、または添加しな
い植物油、ならびに一連の植物成分のような種々の物質
を挙げることができる。これに関連して特に、その免疫
刺濫作用が集中的にｒｔｌｆ究されているレクチン物質
群に言及する。レクチン（フィトヘマグルチン）は植物
性蛋白質すなわち糖蛋白質でおる。免疫刺激作用を有す
る伯の植物成分としては、高級植物、低級及び高級菌類
、地衣類ならびに藻類からポリサッカライドが単離され
、研究されている。一連の免疫刺激全体については、例
えばＣｈｅｄ　ｉｄ、　Ｌ等の［免疫刺激（Ｉｍｍｕｎ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）　ＪＳｐｒｉｎｇｅｒ出版社
（ハイデルベルグ、ニューヨーク）　１９８０年：　　
（ｔｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ、）１．）の「ポリサッ
カライドの構造と免疫特異性（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａ
ｎｄｌｌｌｌｍｔＪｎＯＩＯ（］１Ｃａｌ　５ｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｔｙｏｆ　ｐｏ＋ｙｓａｃｃａ−ｒｉｄｅｓ）
　Ｊ　Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｌｅ　ｄ　ｃｈｅｍ、ｏｒ
ｇ、Ｎａｔｕｒｓｔ。

４２巻、２８８頁（１９８２）　；　Ｄｒｅｗｓ、Ｉｌ
、の［免疫刺激の可能性（）ｌｏｇｌｉｃｈｋｅｉｔ　
ｄｅｒ　Ｉｍｍｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）　ＪＳｗ
ｉｓｓ　Ｐｈａｒｍａ　２，９．　（４９）（１９８０
）によって、詳細に）ホベられている。

免疫刺激性物質の正確な作用機構は、多くの場合、現在
までに決定的には解明されていない。

これらの物質は一般に、免疫適格細胞の増殖に特に影響
を与えるが、記憶反応を後に残さない。

このことは、免疫刺激性物質の作用対象としてマクロフ
ァージ及び顆粒球ならびにＴ−及びＢ−リンパ球が重要
であることを意味する。免疫刺激物の作用は直接的また
は間接的な方法で、例えば補体系を介してまたはリンパ
球を介して、インク、−フエロンまたはりボゾーム酵素
（例えば、リンホキン、コロニー刺激性因子等）の産生
を介して、ならびにマクロ及びミクロ食細胞の増大を介
して行われる。この場合に、非特異的及び特異的な防御
機構のために常に、カスケード効果及び幾つかの防御系
の同時緩衝を考慮すべきである。

医学界では、混合感染症、慢性、持続性、化学療法耐性
の細菌感染症及びウィルス感染症の治療ならびに危険状
態にある患者における偶発的な感染症の予防、悪性疾患
の治療及び成る範囲での自己免疫疾患の治療も特に、免
疫刺激の好ましい用途であると判明している。免疫増殖
抑制療法におけるこの療法に関連する免疫抑制を一部代
償するために、免疫刺激を同様に用いることもできる。

植物系出発物質からポリサッカライドの単離に関しては
、文献に一連の抽出方法が挙げられでいる。Ｗｈｉｓｔ
　Ｉｅｒ、　Ｒ，Ｌ、　、　５ａｎｎｅｌ　Ｉａ、　Ｊ
、　Ｌ、　、　ｒ炭水化物化学における方法（）ｌｅｔ
ｈＯｄｓ　ｉｎ　ｃａｒｂｏ−ｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）Ｊ　ｍ集者：　Ｗｈｉｓｔｌｅｒ、　Ｒ
，Ｌ、　。

Ｂｅｍ１　ｌ　ｌｅｒ、Ｊ、Ｎ、　、Ｖ巻、３４〜３６
頁、ＡＣａｄ（４ｍ１ｃＰｒｅｓｓにニューヨーク＞　
（１９６５）　：　Ｔｏｍｏｄａ　Ｈ，。

Ｓｈ　ｉｍａｄａ、　Ｋ、　、　Ｓａ　ｉ　ｚｏ、　Ｙ
、　、　Ｓｕｇ　ｉ　、　）１．　、　Ｃｈｅｍ、　Ｐ
ｈａｒｍ。

Ｂｕ　ｌ　ｌ　、　２Ｂ（１０）、　２９３３頁（１９
８０）。

問題の植物系物質をポリサッカライドの種類に応じて、
冷水、熱水、食塩水溶液、稀薄な酸もしくは苛性アルカ
リ溶液、またはジメチルスルホキシドによって抽出する
。このようにして得られた溶液から一般に、重金属塩ま
たは第四アンモニウム塩で錯塩を形成し、アルコールに
よる沈澱によってポリサッカライド粗フラクションを１
ｑる。次にポリサッカライド粗フラクションをイオン交
換、ゲル濾過及びパイオアフイニテイクロマトグラフイ
によって分離する。

天然の植物系出発物質からポリサッカライドを公知の方
法によって単離する場合には、次のような欠点に不可避
に直面することになる。抽出時に同時に生成する親油性
付随物質（例えばばクロロフィル）は分離が困難である
か、または有機溶剤による時間のかかる抽出後に初めて
分離が可能であることが判明している。天然の植物系出
発物質の性状に依存して、同一の植物材料でも精製法が
異なると、再三再四、質的にも量的にも異なる組成のポ
リサッカライド粗フラクションを得る。ざらに重大な欠
点は特定の種類のポリサッカライドの単離に不可避なア
ルカリ性または酸性の抽出剤の使用が絶対に必要でおる
ことである。この抽出剤の使用によって、ポリサカライ
ドの一次、二次または三次構造が変化して、免疫刺激作
用に影響を与える。

［発明が解決しようとする問題点］本発明の目的は、前記欠点を有さず、高級植物から簡単
で効果的なポリサッカライド′ｆＡａを可能にするよう
な、高級植物からのポリサッカライド製造法を提供する
ことである。

本発明の他の目的は、ヒトの治療に用いるために免疫刺
激剤を含む製剤を提供することでおる。

［問題点を解決するための手段］本発明では、出発物質として植物系細胞培養物を用いる
が、これを用いることの特別な利点は常に一定の化学的
組成と収率で目的生成物が得られることにある。ざらに
、細胞培養物を用いる場合には前記親油性付随物質が生
成しないかまたはごく僅少の割合で生成するにすぎない
。

細胞培養物の他の利点は、目的のポリサッカライドが細
胞を囲む培地中に直接生ずるので、次の精製を比較的簡
単な方法で実施できることである。これには、多聞のポ
リサッカライドを培地中に析出することによる、植物系
細胞の特別な機能が関係する。

本発明の方法の他の利点は、ポリサッカライド単随時間
が短縮され、一部では強力な抽出剤による出発物質の処
理が避けられるため、加工の範囲における目的生成物の
人為構造物の形成が排除されることである。

以下では、エキナセアプルプレアから誘導された植物系
細胞培養物を調製する方法と次にこの細胞培養物から免
疫刺激性ポリサッカライドを得る方法を例示する。

［実施例］細胞培養物を調製するための出発物質としては、エキナ
セアプルプレア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａｐｕｒｐｕｒｅａ
）またはエキナセアアングステイフオリア（Ｅｃｈｉｎ
ａｃｅａ　ａｎａｕｓｔｉｆｏｌｉａ）生活体から無菌
の幼芽、葉、花、茎または根部分を用いて、最初にこれ
を固体培地上で刺激してカルスを形成させた。

このために、エキナセアプルプレアの幼芽、葉、花、茎
又は根部分を寒天含有リンスマイヤースコーク（Ｌｉｎ
ｓｍａｉｅｒ　Ｓｋｏｏｇ）培地［ｔｌｉｎｓｍａｉｅ
ｒ、Ｆ、）１．、Ｆ、Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｌｏ、Ｐ
Ｉａｎｔ、１８゜１００（１９６５月に移植し、この培
地にオキシン例えば、２，４−ジクロルフェノキシ酢酸
、を添加して２４℃において１４〜２８日間インキュベ
ートした。

オキシンは質的に変化しつる。「植物培養ハンド７ツク
（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ）Ｊ　　（編集者：　０ａｖｉｄ、　Ａ、　Ｅｖａｎ
ｓ、　Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍ　Ｒ，５ｂａｒｐ。

Ｐｈ１ｌｌｉｐ　Ｖ、Ａｍｍ１ｒａｔＯ及びＹａｓｕｙ
ｕｋｉ　Ｙａｍａｄａ、　１巻）Ｈａｃｍｉｌｌａｎ　
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、Ｈａｃｍｉｌｌａｎ社の
１部門にューヨーク）に述べられているように、他の培
地を用いて、カルス培養物及び細胞培養物を製造するこ
ともできる。

最初のカルスが約１４日後に形成された復に、これを液
体培地に移す。この細胞培養物は懸濁培養物であり、こ
れを１文または１．５９．の工−レンマイヤーフラスコ
に液体培地約２５０ｍ　ｌまたは１０００ｍ　ｌととも
に入れ、１００回転／分で娠とうする。２２〜２８℃に
おいて約１４日間インキュベ−１〜した後に懸濁培養物
を濾別する。細胞残渣を重量測定のために凍結乾燥し、
濾別した培地を再使用する。

Ａ）細胞培養基からのポリサッカライドの単離以下に述
べる操作の全ては、他に記載しないかぎり、４〜８℃に
おいて実施する。

ａ）ポリサッカライド−粗フラクションの単離全体で２
０１の細胞懸濁培養物から細胞と細胞成分を濾別し、残
渣を蒸溜水黴で後洗浄する。。

細胞残渣を重量測定のために冷凍し、凍結乾燥する。こ
れによって凍結乾燥した細胞材料約２７０（Ｊが得られ
る。一緒にした濾液（２Ｈ）に、絶えず撹拌しながら、
３倍量のエタノール（９５％）を３１ずつまでの少量ず
つ加える。−晩装置して形成された沈澱を先ず最初に注
意してデカンテーションし、次に上澄液の遠心分離によ
って分離する（１０，０００回転二分／３０分間）。一
緒にした遠心分離物を蒸溜水４文中に溶かし、水冷しな
がら１５％トリクロロ酢酸を７．５％の最終濃度になる
までゆっくりと〃■え、１時間後に遠心分離す、る。ゲ
ル状沈澱を廃棄し、透明な上）σを分け、３倍量のエタ
ノール（９５％）を加えて沈澱を形成ざＵる。形成され
た沈澱を１２時間後に遠心分離し、一緒にして、最初か
ら入れられた量の１７２０の酢酸ナトリウム溶液（２％
）中に入れる。この溶液を４℃において８時間随伴して
から濾過する。次に濾液に１倍量のエタノール（９５％
〉を加え、１２時間放置し、生成した沈澱を遠心分離し
、１／１０１の蒸溜水に入れ、脱イオンに対して２日間
透析してから凍結乾燥する（１：１沈澱）。

エタノールによる最後の１：１沈澱の上澄に１．５倍量
のエタノール（９５％）を加え、４８時間放置する。次
に沈澱を遠心分離し、蒸溜水中に溶解し、４８時間透析
し、凍結乾燥する。次の収量、すなわち１：１沈澱：２
ｇ、凍結乾燥した細胞成分に基づいて約１％、１：４沈
澱：１ｇ、凍結乾燥した細胞成分に基づいて約０．５％
が得られる。

凍結乾燥残渣　２７０Ｃ１ｂ）次にポリサッカライド粗フラクションを単離するた
めに、トリクロロ酢酸沈澱を省略して短縮した方法を説
明する。

全体でｉｏｘの細胞懸濁培養物から細胞成分を濾別し、
残渣を蒸溜水で後洗浄する。細胞残渣を重■測定のため
に再び凍結乾燥しく凍結乾燥した細胞物質　約１２０（
］）　、一緒にした濾液に３倍量のエタノール（９５％
）を少量ずつ加える。

生成した沈澱を先ず第一に注意してデカンテーションし
、次に遠心分１（ｉｏ、ｏｏｏ回転／分、３０分間）、
によって上澄液から分離する。一緒にした遠心分離物を
蒸溜水に溶かし、不溶な成分を遠心分離しく　１０．０
００回転、３０分間）、上澄液に１倍量のエタノール（
９５％）を加える。生成した沈澱を１２時間後に遠心分
離し、次に遠心分離物を蒸溜水に溶かし、この溶液を脱
イオン水に対して４８時間透析し、次に凍結乾燥する。

１：１沈澱の上澄に１．５倍量のエタノール（９５％）
を加え、生成した沈澱を４８時間後に遠心分離しく　ｉ
ｏ、　ｏｏｏ回転／分、３０分間）、蒸溜水中に溶かし
、脱イオン水に対して４８時間透析してから凍結乾燥す
る（１：４沈澱）。

収量：１：１沈澱：１．５ｇ、凍結乾燥細胞材料基準で約１．
２％１：４沈ｉｌＱ：０．７ｇ、凍結乾燥細胞材料基準で約
０．５％凍結乾燥残渣：　１２０ｇＢ）中性ポリサッカライドと他の３種類のポリサッカラ
イド（Ｂ−Ｄ）の１：１沈澱からの製造ａ）前分離例えばアセテート型のＤＥＡＥ−セファロース■ＣＬ−
６Ｂ−カラムのような陰イオン交換カラムに１：１沈澱
の水溶液を供給する。水性溶出液中に、右旋性の中性ポ
リサッカライドフラクション（Ａ＞が１浄られる。酸性
ポリサッカライドフラクシヨンの溶出は０〜０．１５Ｍ
のＮａＣｌ勾配によって行われる。

約０．２ＭのＮａＣｌ濃度の場合には、左旋性ポリサッ
カライドフラクション（Ｂ）が溶出し、約０．４Ｍの塩
濃度の場合には、他の２種類の右旋性ポリサッカライド
フラクション（Ｃ，Ｄ）が得られる。

ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィとゲル濾過とによる
中性ポリリーラカライドＡの精製なお存在する酸性ポリ
サッカライド部分を分離するために、実施例ａ）で得た
ポリサッカライドフラクションＡに対して先ず第一に、
例えばり、Ｅ　Ａ　Ｅ−セファロース■ＣＬ−６８とＤ
ＥＡＥ−トリスアクリル■Ｍによる陰イオン交換クロマ
トグラフィを行い、両刀ラムをＨ２Ｏで溶出する。この
ようにして精製した中性フラクションＡを次に、セファ
クリル■Ｓ　−４００によるゲル濾過によってさらに精
製する。これによって、旋光性を有しない低分子量成分
を右旋性ポリサッカライドから分離することができる。

精製したポリサッカライドＡを均一性に関して検査し、
分子量を測定する。

収率：凍結乾燥細胞材料１００ＣＩ基γ１（で約０．０
７％Ｃ）　’ｌ　：４ｉ尤澱からのポリ１ノツカライド
ＥとＦの′ｌＪ造ａ）前分離ＤＥＡＥ−セファ０〜ス＠ＣＬ−６８による陰イオン交
換クロマトグラフィによって、水性溶出液中に右旋性ポ
リサッカライド（Ｅ）が得られる。約０．２ＭのＮａＣ
Ｉ　６度による溶出によると、左旋性の酸性ポリサッカ
ライド（ポリサッカライド（Ｆ　）　ｌｆｉｍられる。

ｂ）ポリサッカライドフラクションＥと「の精製ポリサッカライドＥは、例えば溶離剤として０．２ＭＮ
ａＣｌ溶液を用いるウルトロゲル（旧ｔｒｏｇｅｌ　）
　＠Ａ　ＣＡによるゲル濾過によって精製する。ポリサ
ッカライドＥはカラムの排除容積中に存在し、旋光性を
有しない低分子量の付随物質はフラクション領域または
カラムの全容積中に存在する。酸性ポリサッカライド「
に対しては、例えばＤＥＡＥ−トリサクリル（ＴｒｉＳ
ａＣｒｙ＋　）　＠Ｍによる第２陰イオン交換クロマト
グラフイを行う。純水によって溶出すると、溶出液中に
ごく微量の痕跡が存在する。０．２ＭのＮａＣｌ　濃度
では比較的対照的なピークとしてポリサッカライド「が
）打出する。次に両ポリザッカライドに対して、溶離剤
として０．２ＭＮａＣ１溶液を用いるセファクリル（Ｓ
ｅｐｈａｃｒｙｌ　）＠３４００によるゲル濾過をさら
に行う。

収率：ポリサッカライドＥ　　Ｏ，１８％ポリサッカラ
イドＦ０．１４％（それぞれ凍結乾燥細胞材料１００ｇ基Ｑ）Ｄ）添付図
の方法による中性ポリサッカライドと酸性ポリサッカラ
イドとの工業的分離１、細胞懸濁液を濾過または遠心分
離によって、細胞残渣と細胞を含まない培地とに分離し
、細胞残渣を廃棄した後に、最初の細胞懸濁液量の約１
５〜８５徂量％を通常占める無細胞培地を、下記の５に
述べるように、脱蛋白することができる（工程１．１）
。ここではこの段階を省略することができるが、工程５
では実施しなければならない。

２、細胞フラグメントまたは蛋白質析出による残留濁り
は貫流分離装置、特にヂャンパーセパレータまたはトレ
ーセパレータでの清澄化によって除去し、分離した固体
を廃棄する。工程１．１で脱蛋白が実施されていない場
合には、この段階を省略することができる。

３、コロイド状溶解成分ならびに高分子伍化合物（分子
量＞１０’ダルトン〉はマイクロ濾過によって濾過する
（工程３）。孔度≧０．１μｍの管状または毛管状モジ
ュールのポリスルホン膜を用いるのが好ましい。この場
合に分離限界〉１０５ダルトンの限外濾過膜を選択する
こともできる。

４、高い収率を得るために、前記最少量に達した保持物
に対して、脱イオン水による透析濾過を実施する。浸透
物と透析濾過物を一緒にし、保持物を廃棄する。

一緒にした浸透物を先ず最初に限外濾過によって濃縮し
く出発■と装置サイズとに応じて、濃縮係数１０〜５０
０）、次に１００μｓ／ｃｍより低い導電率に達するま
で、脱イオン水によって透析濾過する。浸透物は廃棄す
る。

濃縮に用いる膜はｉｏ、　ｏｏｏダルトン以下の分離限
界を有するべきである。管状、毛管状またはラセン巻ぎ
状モジュールのポリスルホンまたはセルロースアセデー
ト製膜を用いるのが好ましい。

透析濾過の代りに、透析またはゲル濾過を選択すること
もできる。

５、濃縮保持物に対しては、１．１ですでに実施しない
かぎりは、脱蛋白を行う。このために２種類の方法が用
いられる。

５．１．９０℃〜１３０℃の温度に加熱５．２．冷却１
多に濾過または遠心分離によって沈澱を分離する。又は５．１．　　ｌ−リクロロ酢酸（ＴＣＡ＞を７．５重Ｇ
％の濃度になるまで溶液に添加５．２．　４℃に少くとも１２時間放置５．３．沈澱を
濾別または遠心分離５．４．導電率＜１００μｓ／ｃｍになるまで清澄化溶
液を脱イオン水に対して透析６、弱陰イオン交換体において濃縮保持物を最初に溶離
剤として水を用いて溶出して、ポリナツカライドフラク
ションＡに相当する中性ポリサッカライドフラクション
を１洋、次に０〜４モル液の塩勾配（酢酸ナトリウム、
ＮａＣ１等）によって溶出して、酸性ポリサッカライド
フラクション（ポリサッカライドフラクションＦに相当
）を得る。

７、各フラクションを必要に応じて、５に述べたように
、脱蛋白する。

８、各フラクションに対して、４に述べたように、限外
濾過と透析濾過とを行う。

９、次に生成物を凍結乾燥、真空乾燥または噴霧乾燥に
よって乾燥する。

１りられる叔母はその都度の醗酵沈積物の質に依存して
、各フラクションに対して最初の懸濁液■基準で約１０
〜１００Ｄｐｆｆｌになる。

Ｅ）単離ポリサッカライドの構造ａ）ポリサッカライドＡとＥ１、分子量測定ポリサッカライドＡとＥの分子量測定は溶離剤として水
または０．２Ｍ　　ＮａＣｌ溶液を用いるレフアクリル
（Ｓｅｔ）ｈａｃｒｙｌ　）　＠３４００によるゲルク
１」７１〜グラフイならびに１−ＩＰＩＣによって行う
。

使用した＋ｌＰ　Ｌ　Ｃ系：ａ＞　　／、／−Ｐｏｒａｓｉｌ−Ｇｐｃ−６０十μｍ
ＢＯｎｄａ（］（！ｌ　　Ｅ　１２５ｂ）　ｕ−Ｂｏｎ
ｄａｑｅｌ　［１２５＋５−Ｂｏｎｄａｑｅｌ　Ｅ　５
００ｒａ、　ＷａｔｅｒＳ。

緩衝系：　　０．２Ｍまたは０．５Ｍリン酸塩緩衝液１
）Ｉ−ｆ＝６．０対照物質：　Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ　１０．Ｔ　４０．丁
７０．Ｔ　１１０゜Ｔ　５００．Ｔ　２０００この方法によってポリサッカライドＥの平均分子量は１
００００（範囲：　５〜１５０００）及びポリサッカラ
イドＡの平均分子量は２５０００（範囲：２０〜３００
００）と測定された。

２、構　造両ポリＩナッカライドは０．１：０．４：１：１．５の
比のフコース、ガラクトース、キシロース、及びグルコ
ースから構成されるフコカラクトキシログルカンである
。

ポリサッカライドの主鎖は、約６５％までがＣ−６位置
で分岐している（１→４）−β−結合グルコース単位か
ら成る。

側鎖はかなり種々な組成であり、３糖果位の最大鎖長を
有する。最も簡単な場合には、末端キシロースがグルカ
ン骨格のＣ−６に直接結合している。しかし、この他に
ガラクトース（１→２）−キシロース−、フコース−（
１→２）−ガラクトース−（１→２）−キシロース−及
びガラクトース−（１→２）−ガラクトース−（１→２
）−キシロース側鎖も存在する。単離したオリゴサツカ
ライドに基づいて、ポリサッカライドの大部分かへブタ
及びデカサツカライドの繰り返し単位から構成されてい
ると推定することかできる。

ポリサッカライドＡもポリサッカライドＢも約８％まで
アセチル化されている。

ポリサッカライドＡとＥの基本構造： α−Ｆｕｃ ↓ ｂ）ポリ（ナラカライドＦの基本（ｖＪ構造、実施例ａ
）に述べたように、ポリサッカライドＦの平均分子口は
使用した緩衝系に応じて、１５０００（範囲：　　６５
０００〜８５０００）　（０，５Ｍリン駿塩緩衝液ｐｔ
−１６．０）または１１０，０００（範囲：　１０００
００〜１２００００）　（０，２Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ
６，０）と測定された。

ポリサッカライドＦはｒｅＬｉ生アラ生アラビラガラク
タン。この基本骨格はラムノガラクツロナンによって相
互に結合されている（１→３）β−結合ガラクトース鎖
から成っている。

（１→３）−β−ガラクタン鎖のガラクトース単位は１
つおきにＣ−６原子を介して、（１→６）−β−ガラク
トース側鎖と結合する。これはまたほぼ７０％までＣ−
３位置において末端アラビノースと結合する。

このポリサッカライド成分の他に、ざらに長く、強く分
岐した（１→５）−α−アラビナン鎖が検出される。こ
のアラビナン部分はアラビノガラクタン部分またはラム
ノガラクツロナン部分に結合することができる。

ポリサッカライドＦのアラビノガラクタン部分の構造Ｇａ１ｐ　　　　　　　　Ｇａ１ｐ ↑β ａｌｐポリサッカライドＦのラムノガラクツロナン部分の基本
構造ポリサッカライドＦのアラビナン部分の基本Ａｒａｒ（
Ｓ←１）Ａｒａｒ（５←１１Ａｒａｆ（５１α ↑α Ｆ）単離ポリサッカライドの薬理学的作用今まで物質の
免疫刺激作用を検査するための特異的試験方法は存在し
なかったので、単核系の機能状態及び能力に対する化合
物または植物エキスの影響ならびにＴ−リンパ球及びＢ
−リンパ球の刺激可能性の測定を可能にするような、進
歩的なインビトロ及びインビボ方法が今日まで用いられ
ている。

ａ）　Ｂｒａｎｄｔによる顆粒球テスト［Ｂｒｎａｄｔ
、　ｈ、　、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　、　ｔｌａｅｍａ
ｔｏｌ　（別巻）２（１９６７）］Ｂｒａｎｄｔによる顆粒球テストでは、インビトロ実験
においてヒト血清から得た顆粒球フラクションによって
食細胞化した酵母細胞数または細菌数を顕微鏡下で測定
する。特定のポリサッカライドフラクションによる食作
用増加％を測定する。

表’ｌ　　Ｂｒａｎｄｔによる顆粒球テストにおける単
一のポリサッカライドフラクションによる食作用増加％ ”　　ＰＳ−ポリサッカライドｂ）免疫刺激性物質の作用を測定するための他のテスト
は、いわゆるカーボンクリアランステス１〜でおる。こ
の方法では動物の血液からの炭素粒子除去速度を分光測
光法によって測定する。

この除去速度が食作用活性の尺度である［Ｂｉｏｚｚｉ
、Ｇ、、Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｂ、、Ｈａｌｐｅｒｎ
、Ｂ、Ｎ、、Ｂｒ。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｐａｔｌｌｏｆ、３４　巻、４４１頁（１
９５３）　］。

次の表２では、細胞培養物からのポリサッカライドフラ
クションがマウスの炭素除去に及ぼす影響を示す。

表２　マウスの炭素除去に対する細胞培養物からのポリ
サッカライドフラクションの影響類　回帰係数は各マウ
スの肝臓と肺臓重量及び体重を顧慮して、ＤＲＥＷＳ（
１１５）により修正免疫学的研究では、顆粒球テスｉ−
の培地からの１：１沈澱生成物はに４沈澱生成物よりも
明白に高い食作用速度を示した。同じ活性の玲異が１：
１または１：４沈澱生成物から単離した各成分において
も認めることができた。

ポリサッカライドＡエタノールによる１：１沈澱から単離したポリサッカラ
イドＡは１：４沈澱からのポリサッカライドＥに比べて
、顆粒球テストとカーボンクリアランステストとで一致
して、明白に高い免疫刺激性を示した。

ポリサッカライドＦポリサッカライドＦは用いたデス１−系において他の被
検アラビノガラクタンと同様に、中程度、にのみ活性で
あることが判明したが、ＴＮＦテスト（肘瘍壊死囚子テ
スト）では明白な作用を示した。

Ｃ）腫瘍細胞に対する直接の細胞毒性に関するマクロフ
ァージ活性化は次の文献により測定した：ｒｍｍｕｎｉｔｙ　４６巻、８４５頁（１９８４）。

、この実験でポリサッカライドＡは２Ｘ１０５個の、マ
クロファージにつき６〜５０μｑの希釈度までにおいて
、２Ｘ１０５個のマウスｔｉｌｔ腔マクロファージをＰ
８１５腫瘍細胞に対する完全細胞毒性までに活性化した
。

本発明によるポリサッカライドは、一般には併用投与が
好ましいとしても、純品としてまたは製剤として投与す
ることもできる。特に、次のような組成物としての複合
剤が有利である：（１）本発明によるポリサッカライド
を単独または互いに組合せて含有し、（２）このために適した一種類以上の結合剤、キャリヤ
ー及び／または他の助剤、ならびに（３）他の治癲的イ
１効物質を任意に含有する組成物キャリヤ、結合剤及び／または助剤は、組成物または製
剤の他の成分と調和し、被治療生体に不利な影響を与え
ないように、薬剤学的及び薬学的に適合しうるちのでな
ければならない。

これらの組成物には、経口投与または非経口投与（皮下
、皮内、筋肉内及び静脈内投与を含める）に適した組成
物を全て含むが、最高に適した投与経路は患者の症状に
依存する。

組成物は一回投与但として存在する。組成物の製造は製
薬界でそれ自体公知の方法を用いて行われる。全ての方
法には、本発明によるポリリーラカライド（すなわち、
有効物質）をキトリヤー、結合剤及び／または助剤（こ
れらは補助成分である）と混合するか、または一体化す
る段階が含まれる。一般に、有効物質に液状キレリヤー
もしくは微粒状キャリヤーまたは両方を密接に混合し、
次に必要な場合には得られた生成物を好ましい投与形態
にすることによって、組成物を製造する。経口投与に適
した本発明による組成物はそれぞれ本発明による有効物
質の所定量を含む、カプセル剤、カシェ剤または錠剤の
ような一定徂単位として、ならびに粉剤または顆粒剤と
して、液剤または水性もしくは非水性の懸濁液として、
または流動性水中油滴型乳剤もしくは流動性油中水滴型
乳剤として提供される。

有効物質は巨丸剤またはペースト剤としても存在しうる
。

錠剤は任意に１種類以上の通常の助剤を加えて、プレス
または成形によって製造することができる。

非経口投与に適した組成物は水性媒質または非水性媒質
中の無菌注入溶液、酸化防止剤、緩衝液、細菌増殖抑制
剤及び、ヒ１−生体を顧慮して組成物を等仮性にする溶
解物質を含有する。

さらに本発明によるポリ１ノ°ツカライドは懸濁剤及び
増粘剤を含みうる、水性媒質または非水性媒７１中の無
菌懸濁液として存在しうる。組成物は例えばアンプルま
たは密封ビンの形態で１回投与量または数回投与母とし
て存在するか、あるいは凍結乾燥形として保存して、使
用直前に例えば注入用に適した水のような、無菌の液状
キャリヤーを加えて投与することのみが必要であるよう
にする。上記種類の無菌の粉剤、顆粒剤及び錠剤から、
使用直前に注入溶液及び懸濁液を調製することができる
。

本発明による製剤は前記成分の他に、いま問題の組成物
に適した他の成分を含有することもできる。従って、例
えば経口ルートで投与されるべき製剤は香料を含有する
ことができる。

投与に適した有効物買足はその都度の治療領域に依存し
て変化する。一般に一回投与組成物の有効物質濃度は全
組成物の５〜９５％である。

このことは−回投与の場合に、体重１ｋ（］につき１１
〜５０ｍの母に相当する。しかし、この用量は使用する
用途、患者の症状及び治療領域に依存して広範囲に変動
しうる。

【図面の簡単な説明】

図は中性ポリサッカライドと酸性ポリサッカライドとの
工業的分離を図示した工程図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）平均分子量１０，０００（範囲：５０００〜１５
０００）を有し、次の基本構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有することを特徴とする免疫刺激作用を有するポリサ
ッカライド。
（２）平均分子量２５，０００（範囲：２００００〜３
００００）を有し、次の基本構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有することを特徴とする、免疫刺激作用を有するポリ
サッカライド。
（３）０．２Ｍリン酸塩緩衝液を用いた場合に平均分子
量が１１０，０００（範囲：１００，０００〜１２０，
０００）であり、次の部分：ａ）次式のアラビノガラクタン部分： ▲数式、化学式、表等があります▼ ｂ）次式のラムノグラクツロナン部分： ▲数式、化学式、表等があります▼ からその基本構造が本質的に構成されることを特徴とす
る、免疫刺激作用を有するポリサッカライド。
（４）エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングス
ティフォリアから単離することを特徴とする特許請求の
範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のポリサッカライ
ド。
（５）次の段階、すなわちａ）エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングステ
ィフォリアの無菌化した幼芽、葉、花、茎又は根部分である植物系出発物質を出発物質として用い、ｂ）培地でカルスを形成させ、Ｃ）形成したカルスから細胞懸濁液用の一次細胞をそれ
自体公知の方法によって得、ｄ）２２〜２８℃に１２〜２０日、好ましくは１４日間
放置した細胞培養物を濾別し、細胞残渣を重量測定のた
めに凍結乾燥し、ｅ）細胞培養物上澄に２〜４倍量、好ましくは３倍量の
エタノールを加え、ｆ）生成した沈澱を遠心分離によって分離し、次に蒸溜
水中に入れ、ｇ）１５％トリクロロ酢酸を７．５％の最終濃度になる
まで加え、放置し、次に遠心分離し、ｈ）遠心分離後に
得られた上澄に３〜６倍量好ましくは４倍量のエタノー
ルを加え、生成した沈澱を１２時間の放置時間後に遠心分離し、次に
２％酢酸ナトリウム溶液中に入れ、この溶液を８時間撹拌してから濾過し、ｉ）濾液に
０．５〜１．５倍量、好ましくは１倍量のエタノールを
加え、１２時間放置し、生成した沈澱を遠心分離し、最
初の量の１／８〜１／１０の蒸溜水中に入れ、脱イオン
水に対して２日間透析し、次に凍結乾燥し、ｊ）最初のアルコール沈澱の上澄に１．５倍量〜２．５
倍量、好ましくは２倍量のエタノールを加え、溶液を４
８時間放置し、沈澱を遠心分離し、蒸溜水に溶かし、溶
液を脱イオン水に対して４８時間透析し、次に凍結乾燥すること、を特徴とする、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれ
かに記載のポリサッカライドの製造方法。
（６）次の段階、すなわち、ａ）細胞懸濁培養物を濾別し、ｂ）濾液に２〜４倍量、好ましくは３倍量のエタノール
を加え、生成する沈澱を最初はデカンテーシヨンによって、次に遠心分離によって分離し、ｃ）遠心分離物を水中に溶かし、不溶性成分を遠心分離
し、上澄に０．５〜１．５倍量、好ましくは１倍量のエ
タノールを加え、４８時間放置し、ｄ）生成した沈澱を遠心分離し、次に蒸溜水に溶かし、
溶液を脱イオン水に対して４８時間透析し、次に凍結乾
燥し、ｅ）最初のエタノール沈澱の上澄に１．５〜２．５倍量
、好ましくは２倍量のエタノールを加え、１２時間放置
し、生成した沈澱を遠心分離し、次に蒸溜水中に溶かし
、脱イオン水に対して４８時間透析し、次に凍結乾燥すること、を特徴とする、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれ
かに記載のポリサッカライドの製造方法。
（７）エタノールによる１：１沈澱からのポリサッカラ
イドに対して、ａ）水溶液からの陰イオン交換クロマトグラフィを行い
、ｂ）溶離剤としてＨ＿２Ｏを用いて、最初のポリサッカ
ライドフラクシヨンを単離し、ｃ）０〜０．１５ＭのＮａＣｌ勾配によって他の酸性ポ
リサッカライドの溶出を行う、ことを特徴とする、ポリサッカライドを精製するための
特許請求の範囲第５項または第６項記載の方法。
（８）１：１沈澱からの中性ポリサッカライドを次の精
製段階、すなわちａ）ポリサッカライドに対して先ず第一に、溶離剤とし
てＨ＿２Ｏを用いる陰イオン交換クロマトグラフィを行
い、ｂ）一緒にしたポリサッカライド含有フラクシヨンに対
して他の陰イオン交換クロマトグラフィを行い、Ｈ＿２Ｏで溶出し、ｃ）一緒にしたポリサッカライドフラクシヨンを溶離剤
としてＨ＿２Ｏまたは０．２ＭＮａＣｌを用いるゲルクロマトグラフィによってさらに精製すること、によって単離することを特徴とする特許請求の範囲第５
項または第６項記載の方法。
（９）１：４沈澱からのポリサッカライドを次の精製段
階、すなわちａ）先ず第一に陰イオン交換クロマトグラフィによって
溶離剤としてＨ＿２Ｏを用いて中性ポリサッカライドを
分離し、ｂ）０〜０．４ＭのＮａＣｌ濃度勾配を用いて酸性ポリ
サッカライドを溶出し、ｃ）溶離剤として０．２ＭＮａＣｌまたはＨ＿２Ｏを用いたゲル濾過クロマトグラフィによって、
中性ポリサッカライドをさらに精製し、ｄ）偶然に存在する中性ポリサッカライドを分離するた
めに、最初にＨ＿２Ｏを用いて、酸性ポリサッカライド
に新たな陰イオン交換クロマトグラフィを行い、次に０〜０．４ＭのＮａＣ
ｌ勾配を用いて酸性ポリサッカライドを溶出し、ｅ）両ポリサッカライドに対して、溶離剤として０．２
ＭＮａＣｌ溶液を用いた新たなゲル濾過クロマトグラフ
ィを行う、によって単離することを特徴とする特許請求の範囲第５
項または第６項記載の方法。
（１０）ポリサッカライドを沈澱させるためにアセトン
、硫酸アンモニウム、セチルトリメチルアンモニウムブ
ロミド、Ｃａ＿２Ｃｌ＿２またはフェーリング溶液を用
いることを特徴とする、特許請求の範囲第５項または第
６項記載の方法。
（１１）次の段階、すなわちａ）エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングステ
ィフォリアの無菌化幼芽、歯、花、茎、又は根部分の植物系出発物質を出発物質として用い、これを寒天含有培地でカルス形成させ、生成したカルスから細胞懸濁液用の一次細胞をそれ自体公知の方法によって得、細胞懸濁培養物を２２〜２８℃において１
２〜２０日、好ましくは１４日間放置した後に濾別し、
細胞残渣を廃棄し、ｂ）細胞フラグメントまたは蛋白質析出による培地の残
留濁りを貫流分離装置、特にチャンバセパレータまたはトレーセパレータにおける清澄化によって除去し、分離した固体を廃棄し、ｃ）コロイド状溶解成分または高分子化合物（分子量＞
１０＾６ダルトン）をマイクロ濾過によって除去し、こ
のときに好ましくは孔度≧０．１μｍの管状または毛管状モジュールのポリス
ルホン膜または分離限界＞１０＾５ダルトンの限外濾過
膜を用い、ｄ）予定最少容量に達した場合の保持物を脱イオン水に
よって透析濾過し、浸透液と透析濾過液を一緒にし、保持物を廃棄し、一緒にした浸透液を限外濾過によって濃縮し（出発量と装置サイズに応じて濃縮係数１０〜５００）
、次に１００μｓ／ｃｍより低い導電率に達するまで脱
イオン水によって透析濾過し、浸透液を捨て、ｅ）次の段階、すなわちｅ、１、９０〜１３０℃の温度に加熱し、ｅ、２、冷却後に沈澱を分離するために濾過もしくは遠
心分離するか、またはｅ、１、溶液に７．５重量％濃度になるまで、トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、ｅ、２、４℃に少くとも１２時間放置し、ｅ、３、沈澱を濾過または遠心分離し、ｅ、４、透明な溶液を導電率＜１００μｓ／ｃｍになる
まで脱イオン水によって透析することによって濃縮保持物に対して脱蛋白を行い、ｆ）弱陰イ
オン交換体における濃縮保持物を中性ポリサッカライド
（明細書記載のポリサッカライドＡに相当）を得るために、溶離剤として水を用いて溶出し、次に酸性ポリサッカライド（ポリサッカライドＦに相当）を得るために０〜４モル液の塩勾配（酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ等）によって溶出し、ｇ）各フラクシヨンを上記ｅ）におけるように任意に脱
蛋白し、ｈ）各フラクシヨンに対して、ｄ）におけるように限外
濾過及び透析濾過を行い、ｉ）次に生成物を凍結乾燥、真空乾燥または噴霧乾燥に
よって乾燥させること、を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか
に記載のポリサッカライド製造方法。
（１２）段階ｅ）の脱蛋白を段階ａ）に続いて実施する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（１３）段階ｄ）で分離限界１００００ダルトン以下の
管状、毛管状またはラセン巻き状モジュールのポリスル
ホンまたはセルロースアセテート製膜を用いることを特
徴とする、特許請求の範囲第１１項または第１２項記載
の方法。
（１４）段階ｄ）で、透析濾過の代りに、透析またはゲ
ル濾過による脱塩を行うことを特徴とする特許請求の範
囲第１１項〜第１３項のいずれかに記載の方法。
（１５）通常の薬剤学的に適合するキャリアまたは助剤
の他に、特許請求の範囲第１項〜第４項に記載のポリサ
ッカライドを含有することを特徴とする製剤。
（１６）ヒトの治療法において免疫属節剤または免疫モ
ジュレータとして用いられことを特徴とする特許請求の
範囲第１１項記載の製剤。
（１７）ヒトの治療法においてＴＮＦ（腫瘍壊死因子）
の活性化及び／または適格細胞からの放出のために用い
られることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の
製剤。