JPS62208281A - クレアチナ−ゼの製造法 - Google Patents
クレアチナ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS62208281A JPS62208281A JP61048247A JP4824786A JPS62208281A JP S62208281 A JPS62208281 A JP S62208281A JP 61048247 A JP61048247 A JP 61048247A JP 4824786 A JP4824786 A JP 4824786A JP S62208281 A JPS62208281 A JP S62208281A
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- Japan
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- creatinase
- dna
- strain
- culture
- manufactured
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、クレアチナーゼの製造法に関する。
クレアチナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎａｓｅ） （クレア
チン・アミジノヒドロラーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ ａｍ
ｉｄｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ）とも呼ばれている〕
は、クレアチンに作用して尿素とザルコシン（５ａｒｃ
ｏｓｉｎｅ ）に加水分解する酵素であり、その反応式
は次のとおりである。
チン・アミジノヒドロラーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ ａｍ
ｉｄｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ）とも呼ばれている〕
は、クレアチンに作用して尿素とザルコシン（５ａｒｃ
ｏｓｉｎｅ ）に加水分解する酵素であり、その反応式
は次のとおりである。
クレアチナーゼ
クレアチン＋Ｈ２０
尿素＋ザルコシン
そしてこのクレアチナーゼは、血清、尿中等のクレアチ
ン含有物中のクレアチン定量用酵素として極めて有用な
ものである。
ン含有物中のクレアチン定量用酵素として極めて有用な
ものである。
従来、クレアチナーゼは、例えばフラポパクテリウＡ
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、クレアチ
ナーゼ生Ｍ能を有スる菌株を、クレアチニン、クレアチ
ン、またはこれらの混合物の存在下で培養し、培養物よ
りクレアチナーゼを採取することにより製造されている
（特公昭５２−８３９５号公報）。
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、クレアチ
ナーゼ生Ｍ能を有スる菌株を、クレアチニン、クレアチ
ン、またはこれらの混合物の存在下で培養し、培養物よ
りクレアチナーゼを採取することにより製造されている
（特公昭５２−８３９５号公報）。
しかし、上記のクレアチナーゼの製造法によるときには
、培地中に高価なりレアチニン、クレアチン等を添加す
ることが必須要件であるため、上記のクレアチナーゼ製
造法は、経済的に不利であり、また製造操作も煩雑にな
る等の問題があった。
、培地中に高価なりレアチニン、クレアチン等を添加す
ることが必須要件であるため、上記のクレアチナーゼ製
造法は、経済的に不利であり、また製造操作も煩雑にな
る等の問題があった。
そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、クレアチナーゼをフードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたクレアチナ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養すると、培地中に
、クレアチニン、クレアチン、またはこれらの混合物を
全く添加することなしに、効率よくクレアチナーゼが生
産されること等の知見を得、本発明を完成した。
検討した結果、クレアチナーゼをフードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属に属する菌株に含ませたクレアチナ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養すると、培地中に
、クレアチニン、クレアチン、またはこれらの混合物を
全く添加することなしに、効率よくクレアチナーゼが生
産されること等の知見を得、本発明を完成した。
即ち、本発明はクレアチナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを含み、クレアチナーゼ生産能を有するエッシェリ
シア属に属する菌株を、培地に培養し、培養物よりクレ
アチナーゼを採取することを特徴とするクレアチナーゼ
の製造法である。
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを含み、クレアチナーゼ生産能を有するエッシェリ
シア属に属する菌株を、培地に培養し、培養物よりクレ
アチナーゼを採取することを特徴とするクレアチナーゼ
の製造法である。
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、クレアチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡの調製について述べる。
ＮＡの調製について述べる。
フラボバクテリウムＵ−１８８［微工研菌寄第２９２２
号（ＦＥＲＭ Ｐ−ＮＬ２９２２）コ株を、特公昭５
２−８３９５号公報記載の方法と全く同様にして培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば３０００ ｒ、
ｐ、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００ ｒ、
ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分
離してフラボバクテリウムＵ−１８８株＋７）菌体を得
る。
号（ＦＥＲＭ Ｐ−ＮＬ２９２２）コ株を、特公昭５
２−８３９５号公報記載の方法と全く同様にして培養し
、培養物を得る。この培養物を、例えば３０００ ｒ、
ｐ、ｍ、以上、好ましくは８０００〜１００００ ｒ、
ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠心分
離してフラボバクテリウムＵ−１８８株＋７）菌体を得
る。
この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。
バイオフィズ、アクタ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。
ＡＣｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）コ
、ケー・ニス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ ）の方
法ロバイオケム、ジェイ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
） 、第６４巻、第４０５頁（１９５６年）コ等の方法
により染色体ＤＮＡを得ることができる。
、ケー・ニス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ ）の方
法ロバイオケム、ジェイ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、
） 、第６４巻、第４０５頁（１９５６年）コ等の方法
により染色体ＤＮＡを得ることができる。
ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えば５ａｕ３ＡＩ（東洋紡績社製）を、温度
３０″Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１０
ユニツ）／ｄで２０分以上、好ましくは１〜２時間作用
させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。
限酵素、例えば５ａｕ３ＡＩ（東洋紡績社製）を、温度
３０″Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１０
ユニツ）／ｄで２０分以上、好ましくは１〜２時間作用
させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。
このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
の７ガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈殿法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にクレ
アチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が
含まれる）を得る。
の７ガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈殿法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にクレ
アチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が
含まれる）を得る。
一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２ＤＮＡ ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（
ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）社製］などが好ましい。
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドｐＢＲ３
２２ＤＮＡ ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（
ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）社製］などが好ましい。
上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばＢａｍ Ｈｌ （宝酒造社製）を、温度３
０°Ｃ以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１０〜１００
０ユニツ） ／ ａｔで１時間以上、好ましくは２〜３
時間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得
る。
、例えばＢａｍ Ｈｌ （宝酒造社製）を、温度３
０°Ｃ以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１０〜１００
０ユニツ） ／ ａｔで１時間以上、好ましくは２〜３
時間作用させて消化し、切断されたベクターＤＮＡを得
る。
ついで、上記のようにして得たフラボバクテリウムＵ−
１８８由来で、クレアチナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡ
を混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（二ニー
・イングランド・バイオ・ラプス社製） 、Ｔ４ＤＮＡ
！＋ガーゼ（べ−リンガ−・マンハイム社製）など、好
ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好
ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニットで
１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換
え体ＤＮＡを得る。
１８８由来で、クレアチナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡ
を混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（二ニー
・イングランド・バイオ・ラプス社製） 、Ｔ４ＤＮＡ
！＋ガーゼ（べ−リンガ−・マンハイム社製）など、好
ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜３７°Ｃ１好
ましくは４〜１６°Ｃ１酵素濃度１〜１００ユニットで
１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組み換
え体ＤＮＡを得る。
この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌ＨＢＩＯＩ （ＡＴＣＣ３３６９４
） 、大腸菌ＤＨＩ （ＡＴＣＣ３３８４９） 、大腸
菌χ−１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４） 、などを形質
転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この
形質転換はディー・エム・モーリソ７ （Ｄ、Ｍ、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ）の方法［メソヅ・インｅエンザイモロジ
−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）
、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）コに
より行なうことができる。また形質導入はビー・ホーン
（Ｂ、Ｈｏｈｎ ）の方法ロメソゾ・イン・エンザイモ
ロジー第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）］
によって１行なうことができる。
、好ましくは大腸菌ＨＢＩＯＩ （ＡＴＣＣ３３６９４
） 、大腸菌ＤＨＩ （ＡＴＣＣ３３８４９） 、大腸
菌χ−１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４） 、などを形質
転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この
形質転換はディー・エム・モーリソ７ （Ｄ、Ｍ、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ）の方法［メソヅ・インｅエンザイモロジ
−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）
、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）コに
より行なうことができる。また形質導入はビー・ホーン
（Ｂ、Ｈｏｈｎ ）の方法ロメソゾ・イン・エンザイモ
ロジー第６８巻、第２９９〜３０９頁（１９７９年）］
によって１行なうことができる。
そして、上記菌株よりクレアチナーゼ生産能を有する菌
株なスクリーニングすることにより、クレアチナーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産
能ヲ有スルエツ’７ｚリシア属に属する菌株を得ること
ができる。
株なスクリーニングすることにより、クレアチナーゼを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産
能ヲ有スルエツ’７ｚリシア属に属する菌株を得ること
ができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ ）等の方法［ジェイ、バクテリオロジ−
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第１１６巻、第１
０６４〜１０６６頁（１９７３年）］、デー・ビー・ク
レウ−ｋ （Ｄ、Ｂ、Ｃｌｅｗｅ１１ ）の方法［ジエ
ー、バクテリオロジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁
（１９７２年）］などにより得ることができる。
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ ）等の方法［ジェイ、バクテリオロジ−
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第１１６巻、第１
０６４〜１０６６頁（１９７３年）］、デー・ビー・ク
レウ−ｋ （Ｄ、Ｂ、Ｃｌｅｗｅ１１ ）の方法［ジエ
ー、バクテリオロジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁
（１９７２年）］などにより得ることができる。
上記のようにして得られたクレアチナーゼをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産能を有する
エッシェリシア属に属する菌株を用いてクレアチナーゼ
を生産するには、この菌株を通常の固体培養法でｔ培養
してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養する
のが好ましい。
遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、クレアチナーゼ生産能を有する
エッシェリシア属に属する菌株を用いてクレアチナーゼ
を生産するには、この菌株を通常の固体培養法でｔ培養
してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養する
のが好ましい。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えハ酵ｆｆ
ｊエキス、ヘフトン、肉エキス、コーンステイープリカ
ーあるいは大豆もしくは小麦機の浸出液等の１種以上の
窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。
ｊエキス、ヘフトン、肉エキス、コーンステイープリカ
ーあるいは大豆もしくは小麦機の浸出液等の１種以上の
窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７゛Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。
ある。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７゛Ｃ
前後で４〜２４時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。
培養終了後、該培養物よりクレアチナーゼを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
は、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
例えば、常法により菌体な、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈殿物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品な得る。
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈殿物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品な得る。
更に、クレアチナーゼの精製品を得るには、例、ｔ ハ
Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−セルロース（ジ・エチル・アミノ・エ
チル・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス（ジ・エチル・アミノ・エチル・セファデ
ックス、スウェーデン国）・アルマシア社製） 、ＱＡ
Ｅ−セファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社
製）等のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製す
るか、またセファデックスＧ−２００（スウェーデン国
、ファルイシ７社１１）、セファロース６Ｂ（スウェー
デン国、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハ
イトロキシルアパタイト（米国バイオラッド社製、バイ
オゲルＨＴ）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実
施することにより、高度に精製されたクレアチナーゼ標
品を得ることができる。
Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−セルロース（ジ・エチル・アミノ・エ
チル・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス（ジ・エチル・アミノ・エチル・セファデ
ックス、スウェーデン国）・アルマシア社製） 、ＱＡ
Ｅ−セファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社
製）等のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製す
るか、またセファデックスＧ−２００（スウェーデン国
、ファルイシ７社１１）、セファロース６Ｂ（スウェー
デン国、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハ
イトロキシルアパタイト（米国バイオラッド社製、バイ
オゲルＨＴ）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実
施することにより、高度に精製されたクレアチナーゼ標
品を得ることができる。
上記精製手段により得られる精製クレアチナーゼの理化
学的性質は、特公昭５２−８３９５号公報記載のクレア
チナーゼの理化学的性質と全く同様である。
学的性質は、特公昭５２−８３９５号公報記載のクレア
チナーゼの理化学的性質と全く同様である。
上述しことから明らかな如く、本発明によれば、培地に
クレアチン、クレアチニン等を添加使用することなく、
クレアチナーゼを効率よく得ることができるので、本発
明は産業上極めて有用なものである。
クレアチン、クレアチニン等を添加使用することなく、
クレアチナーゼを効率よく得ることができるので、本発
明は産業上極めて有用なものである。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例
（１）フラボバクテリウムＵ−１８８株の染色体ＤＮＡ
の調製 フラボバクテリウムＵ−１８８（ＦＥＲＭ Ｐ−翫２
９２２）株を、Ｔ−Ｙ培地（１％（Ｗ／Ｖ）バクトート
リプト７ （Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ ［デイフ
ｘ （Ｄｉｒｃｏ）社製コ、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクト
ーイースト・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ）［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製コ、
０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣ１（ｐ）（７，２） ｌ １
００ ｄに接種し、温度３０℃で８時間振盪培養し、培
養物を得た。
の調製 フラボバクテリウムＵ−１８８（ＦＥＲＭ Ｐ−翫２
９２２）株を、Ｔ−Ｙ培地（１％（Ｗ／Ｖ）バクトート
リプト７ （Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ ［デイフ
ｘ （Ｄｉｒｃｏ）社製コ、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクト
ーイースト・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ）［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製コ、
０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣ１（ｐ）（７，２） ｌ １
００ ｄに接種し、温度３０℃で８時間振盪培養し、培
養物を得た。
この培養物を１０００ｏ ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間常法
により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｙを得たのち、
該菌体から斎藤、三浦の方法［バイオケム、バイオフィ
ズ、アクタ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、 ） 、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）
コにより染色体ＤＮＡを得た。
により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｙを得たのち、
該菌体から斎藤、三浦の方法［バイオケム、バイオフィ
ズ、アクタ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、 ） 、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）
コにより染色体ＤＮＡを得た。
ついで、この染色体Ｄ Ｎ Ａ ０．２ ｍｇ及び制限
酵素廻３Ａ！ （東洋紡績社製）１．４５ユニツトを
、１０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣ１％
ｌｏｍＭＭｇｓ０４及びｌ ｍＭジチオスレイトール含
有） （ｐＨ７，４）にそれぞれ混合し、温度３７°
Ｃで１時間反応させた。反応終了液を常法により０．７
％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処
理したものより、４〜８Ｋｂ（キロベースペアー）の大
きさのＤＮＡ断片を７−ル・シー・エイ・ヤング（Ｒ，
Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ ）等の方法［メンズ・イン・エンザ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ） 、第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９
年）コにより溶出して溶出物を得、これから常法により
フェノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して５
ａｕ３Ａ＋で消化されたフラボバクテリウムＵ −１８
８株の染色体ＤＮＡ断片１０μｙを得た。
酵素廻３Ａ！ （東洋紡績社製）１．４５ユニツトを
、１０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣ１％
ｌｏｍＭＭｇｓ０４及びｌ ｍＭジチオスレイトール含
有） （ｐＨ７，４）にそれぞれ混合し、温度３７°
Ｃで１時間反応させた。反応終了液を常法により０．７
％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処
理したものより、４〜８Ｋｂ（キロベースペアー）の大
きさのＤＮＡ断片を７−ル・シー・エイ・ヤング（Ｒ，
Ｃ，Ａ、Ｙａｎｇ ）等の方法［メンズ・イン・エンザ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ） 、第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９
年）コにより溶出して溶出物を得、これから常法により
フェノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して５
ａｕ３Ａ＋で消化されたフラボバクテリウムＵ −１８
８株の染色体ＤＮＡ断片１０μｙを得た。
（２）新規な組み換え体プラスミドｐＫＬＳ５１１ＤＮ
Ａの作製 プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ ［ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）社製］１０μ、Ｓ＋
と制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）１４０ユニツトを
５０ｍＭ ） ！Ｊス塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ
１、及び１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ４含有） （ｐＨ７，
４）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を
得、膣液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
殿処理して、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡを得たＯ ついで、このＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡＬｏμ１１上記（１）で得られた５ａｕ３
．ＡＩで消化されたフラボバクテリウムＵ−１８８株の
染色体ＤＮＡ断片ｌＯμｙ及び２ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）社製］を６．６ｍＭＭｇ
Ｃ１２，１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ ｍＭＡ
ＴＰを含有する６６ｍＭ ） リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）に添加し、温度１６°Ｃで１０時間反応し、ＤＮ
Ａを連結させた。
Ａの作製 プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ ［ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）社製］１０μ、Ｓ＋
と制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）１４０ユニツトを
５０ｍＭ ） ！Ｊス塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ
１、及び１０ ｍＭ Ｍｇ５Ｏ４含有） （ｐＨ７，
４）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を
得、膣液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
殿処理して、ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡを得たＯ ついで、このＢａｍＨＩで消化されたプラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡＬｏμ１１上記（１）で得られた５ａｕ３
．ＡＩで消化されたフラボバクテリウムＵ−１８８株の
染色体ＤＮＡ断片ｌＯμｙ及び２ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）社製］を６．６ｍＭＭｇ
Ｃ１２，１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ ｍＭＡ
ＴＰを含有する６６ｍＭ ） リス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）に添加し、温度１６°Ｃで１０時間反応し、ＤＮ
Ａを連結させた。
ついで、ディー・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ）の方法［メソヅ・イン・エンザイ
そロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ） 、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）
コで、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｈ８１０１株（Ａ
ＴＣＣ３３６９４）を、上記のように連結させたＤＮＡ
で形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン
感受性の形質転換株３２００株を得た。
そロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ） 、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）
コで、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｈ８１０１株（Ａ
ＴＣＣ３３６９４）を、上記のように連結させたＤＮＡ
で形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン
感受性の形質転換株３２００株を得た。
このようにして得られた形質転換株がクレアチ −ナ
ーゼ活性を有するか否かを以下のようにして試験した。
ーゼ活性を有するか否かを以下のようにして試験した。
各菌株を、０．２％（Ｗ／Ｖ）クレアチン（シグマ社製
）及び５０μｌ ／ ｍｅアンピシリンを含有スるＴ−
Ｙ培地５１Ｒｔに接種し、温度３０°Ｃで２４時間培養
して培養液を得た。これを３５０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０
分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％（Ｗ
／Ｖ）クレアチンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １ ｍｌに懸濁し、これに、２０μｌトル
エンを添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、
温度１００°Ｃで５分間加熱処理して反応停止液を得た
。
）及び５０μｌ ／ ｍｅアンピシリンを含有スるＴ−
Ｙ培地５１Ｒｔに接種し、温度３０°Ｃで２４時間培養
して培養液を得た。これを３５０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０
分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１％（Ｗ
／Ｖ）クレアチンを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １ ｍｌに懸濁し、これに、２０μｌトル
エンを添加し、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、
温度１００°Ｃで５分間加熱処理して反応停止液を得た
。
ついで、この液を常法により３５００ ｒ、ｐ、ｍ、で
１０分間遠心分離処理して反応液を得、この反応液に０
．３ユニツト／ ｍｅザルコシンオキシｙ−ゼ＜盛運製
薬社製） 、０．０７％（Ｗ／Ｖ）４−７ミノアンチビ
リン、０．２％（Ｗ／Ｖ）２．４−ジクロロフェノール
スルホン化溶液及び７０ユニツト／ ｍｅパーオキシダ
ーゼ（東洋紡績社製）をそれぞれ０、Ｌｍｔずつ添加し
、反応液が赤色に変化したものがクレアチナーゼ活性を
有する形質転換株である。
１０分間遠心分離処理して反応液を得、この反応液に０
．３ユニツト／ ｍｅザルコシンオキシｙ−ゼ＜盛運製
薬社製） 、０．０７％（Ｗ／Ｖ）４−７ミノアンチビ
リン、０．２％（Ｗ／Ｖ）２．４−ジクロロフェノール
スルホン化溶液及び７０ユニツト／ ｍｅパーオキシダ
ーゼ（東洋紡績社製）をそれぞれ０、Ｌｍｔずつ添加し
、反応液が赤色に変化したものがクレアチナーゼ活性を
有する形質転換株である。
このようにして得られたクレアチナーゼ活性を有する形
質転換株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ） ＨＢ１０１
（ｐＫＬｓ５１１）は、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第９９２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−９９
２）として寄託されている。
質転換株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ） ＨＢ１０１
（ｐＫＬｓ５１１）は、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第９９２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−９９
２）として寄託されている。
（３）組み換え体プラスミドｐＫＬｓ５１１ＤＮＡの単
離 トリプトン１％（Ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／
Ｖ）、及びＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地ｌ
ｊに、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時間前培
養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１（ｐ
ＫＬｓ５１１）の培養液２０ ｍｌを接種し、温度３７
°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコール０．２１を添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養液を得た。
離 トリプトン１％（Ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（Ｗ／
Ｖ）、及びＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地ｌ
ｊに、該培地を用い温度３７°Ｃで１６〜２４時間前培
養して得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１（ｐ
ＫＬｓ５１１）の培養液２０ ｍｌを接種し、温度３７
°Ｃで３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェ
ニコール０．２１を添加し、更に同一温度で２０時間培
養し、培養液を得た。
ついで、この培養液を、常法により１００００ ｒ、ｐ
、ｍ。
、ｍ。
で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを２０
ｍｌ ノ２５％（Ｗ ／ Ｖ ） ショ糖を含有す６
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、 （ｐＨ８，０）に懸濁し
たのち、更に、これに、リゾチーム１０■、０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０） ８ ｍｌ及び２０％（Ｗ
／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ゴをそれぞれ添加
し、温度６０℃で３０分間保温して溶菌し、溶菌液を得
た。
ｍｌ ノ２５％（Ｗ ／ Ｖ ） ショ糖を含有す６
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、 （ｐＨ８，０）に懸濁し
たのち、更に、これに、リゾチーム１０■、０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０） ８ ｍｌ及び２０％（Ｗ
／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ゴをそれぞれ添加
し、温度６０℃で３０分間保温して溶菌し、溶菌液を得
た。
この溶菌液に、５Ｍ ＮａＣ１溶液Ｌ３ｄを添加し、温
度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５００
０ ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、
常法によりフェノール抽出処理したのち、常法によりエ
タノール沈殿処理し、沈殿物を得た。
度４°Ｃで１６時間処理したものを常法により１５００
０ ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、
常法によりフェノール抽出処理したのち、常法によりエ
タノール沈殿処理し、沈殿物を得た。
ついで、この沈殿物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ ｍＭ ）リス塩酸緩衝
液６ ｍｌ （ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに塩
化セシウム６Ｉ及び１０ ｍｇ ／ ｄエチジウムブロ
マイド０．２屑ｌを添加したものを、常法により３９０
００ ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて平
衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドｐＫ
Ｌｓ５１１ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタ
ノールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち
、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ ） リス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化された組
み換え体プラスミドｐＫＬＳ５１１ＤＮＡ９５０μｙを
得た。
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ ｍＭ ）リス塩酸緩衝
液６ ｍｌ （ｐＨ７，５）に溶解し、更に、これに塩
化セシウム６Ｉ及び１０ ｍｇ ／ ｄエチジウムブロ
マイド０．２屑ｌを添加したものを、常法により３９０
００ ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて平
衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドｐＫ
Ｌｓ５１１ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタ
ノールを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち
、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ ） リス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化された組
み換え体プラスミドｐＫＬＳ５１１ＤＮＡ９５０μｙを
得た。
（４）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢＩＯＩ （ｐＫＬｓ
５１１）によるクレアチナーゼの生産及び該酵素の分離
、精製 トリプトン１％（Ｗ／Ｖ） 、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２ｇ
を撹拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注
し、常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組
成の培地で予め温度３７°Ｃで２４時間振盪培養した大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１ （ｐＫＬｓ５１
１）の培養液２０ ｗｇを接種し、温度３７°Ｃで８時
間通気撹拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３０
ｇを得た。
５１１）によるクレアチナーゼの生産及び該酵素の分離
、精製 トリプトン１％（Ｗ／Ｖ） 、酵母エキス０．５％（Ｗ
／Ｖ）、及び食塩０．５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２ｇ
を撹拌式小型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注
し、常法により高圧滅菌処理したものに、上記と同一組
成の培地で予め温度３７°Ｃで２４時間振盪培養した大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１ （ｐＫＬｓ５１
１）の培養液２０ ｗｇを接種し、温度３７°Ｃで８時
間通気撹拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体３０
ｇを得た。
この菌体な、１ｍＭ２−メルカプトエタノールを含有す
る０、０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８，０） １００ｔ
ｘｌに懸濁し、常法により超音波破壊処理したのち、１
５０００ ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠心分離処理
し、クレアチナーゼの粗酵素液１２０ ｔＩＩｌ （０
，８ユニツト／ ｍｅ ）を得た。
る０、０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８，０） １００ｔ
ｘｌに懸濁し、常法により超音波破壊処理したのち、１
５０００ ｒ、ｐ、ｍ、で３０分間通常の遠心分離処理
し、クレアチナーゼの粗酵素液１２０ ｔＩＩｌ （０
，８ユニツト／ ｍｅ ）を得た。
このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、ＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（予め１ ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する０、０５ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液で平衡化済み
のもの） （２Ｘ３０ ｃｍ）を通過させて非吸着区
分を得た。これを上記緩衝液で平衡化済みのＤＥＡＥ−
セファデックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０ ｃｍ）
に吸着させたのち、Ｏ〜１．５モルの食塩濃度勾配溶出
法で溶出することにより０．１〜０．３モルの食塩濃度
範囲でクレアチナーゼ含有溶出液を得た。
を用いて除核酸処理を施したものを、ＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（予め１ ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する０、０５ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液で平衡化済み
のもの） （２Ｘ３０ ｃｍ）を通過させて非吸着区
分を得た。これを上記緩衝液で平衡化済みのＤＥＡＥ−
セファデックスＡ−５０カラム（１，４Ｘ４０ ｃｍ）
に吸着させたのち、Ｏ〜１．５モルの食塩濃度勾配溶出
法で溶出することにより０．１〜０．３モルの食塩濃度
範囲でクレアチナーゼ含有溶出液を得た。
このクレアチナーゼ含有溶出液を、上記緩衝液で予め平
衡化済みのセファレース６Ｂカラム（２Ｘ １０８ ｃ
ｍ ）を通過させてクレアチナーゼ活性区分を分取し、
更に常法により濃縮したのち、凍結乾燥することにより
純化されたクレアチナーゼ粉末４３単位を得た。なお、
収率は４５％であった。
衡化済みのセファレース６Ｂカラム（２Ｘ １０８ ｃ
ｍ ）を通過させてクレアチナーゼ活性区分を分取し、
更に常法により濃縮したのち、凍結乾燥することにより
純化されたクレアチナーゼ粉末４３単位を得た。なお、
収率は４５％であった。
Claims (3)
- （１）クレアチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
み、クレアチナーゼ生産能を有するエッシェリシア属に
属する菌株を、培地に培養し、培養物よりクレアチナー
ゼを採取することを特徴とするクレアチナーゼの製造法
。 - （２）クレアチナーゼをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡが、フラボバクテリウムＵ−１８８株由来のＤＮＡ
である特許請求の範囲第１項記載のクレアチナーゼの製
造法。 - （３）ベクターＤＮＡが、プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａである特許請求の範囲第１項記載のクレアチナーゼの
製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61048247A JPS62208281A (ja) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | クレアチナ−ゼの製造法 |
| DE19873707172 DE3707172C2 (de) | 1986-03-07 | 1987-03-06 | Rekombiniertes DNA-Molekül, das ein Kreatinasegen codiert, rekombinanter Vektor, der diese DNA-Sequenz umfaßt, sowie Verfahren zur Herstellung von Kreatinase unter Verwendung eines Stammes vom Genus Escherichia, der diesen rekombinanten DNA Vektor enthält |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61048247A JPS62208281A (ja) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | クレアチナ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62208281A true JPS62208281A (ja) | 1987-09-12 |
Family
ID=12798108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61048247A Pending JPS62208281A (ja) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | クレアチナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62208281A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS528395A (en) * | 1975-07-07 | 1977-01-22 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Shock absorptive packaging |
| JPS61162170A (ja) * | 1985-01-04 | 1986-07-22 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
-
1986
- 1986-03-07 JP JP61048247A patent/JPS62208281A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS528395A (en) * | 1975-07-07 | 1977-01-22 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Shock absorptive packaging |
| JPS61162170A (ja) * | 1985-01-04 | 1986-07-22 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
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