JPS62161730A - 細胞増殖因子の産生誘発剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞増殖因子の産生誘発剤に関する。

（従来の技術） 従来、種々の細胞増殖因子について検討がなされている
。

本発明者は、先に、肝細胞増殖因子並びにＢ及び／又は
’ｌ’　ＩＪンバ球の増殖因子が小腸粘膜上皮細胞等よ
り産生されることを見出した（たとえば、特開昭ｊ♂−
６２７１ｔ号公報、特願昭に０−９ｔ！ｆｇ号）。

（発明が解決しようとする問題点） さらに、本発明者は、これらの増殖因子の効率的な取得
法について種々検討を行ない、その産生に７９７７球が
関与していることを見出し本発明に到達した。

（問題点を解決するための手段） すなわち、本発明の要旨は、肝臓に損傷を与えられた瀉
血動物より得られるＴ　リンパ球を有効成分とする細胞
増殖因子の産生誘発剤にある。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明において用いられる７９７７球は、肝臓に
伊傷を与えられた温血動物より得られる。この瀉血動物
としては、ラット、マウス、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ウ
サギ、ブタ、ウマ等が挙げられる。

〜上記損傷は、たとえば（イ）肝臓の一部組織を切除又
は穿刺等によって損傷するか、（ロ）門脈本幹もしくは
その肝葉に入る分岐部分の少なくとも一部を結紮するこ
とにより肝組織の一部を壊死させるか又は、（ハ）ウィ
ルス、バクテリア、アルコール等、による何らかの生理
的、化学的障害により付与される。

たとえば、上記（ロ）の場合について説明すると。

まず、瀉血動物の門脈本幹又はその肝葉に入る分岐部分
の少なくとも一部が結紮される。

門脈は、消化器と牌臓からの血液を集めて肝臓に運ぶ静
脈系であり、肝臓の各葉に、分岐して進入している。

この方法においては、この進入部分、すなわち、門脈の
肝臓各葉に入る分岐部、又は門脈本幹の一部又は全部を
絹糸等で結をする。結゛紮を部分的に行なう場合として
は、たとえば分岐部の／／／２〜．２／３程度を結紮す
る方法が挙げられる。

たとえば、２／３を結紮する場合としては、門脈本幹か
ら左葉、中葉、右葉に入る三つの部分のうちの二つを結
紮する方法が挙げられる。

上記結紮後、所定時間たとえば数時間以上経過した後に
、門脈の少なくとも一部を結紮した上記ウシ等の動物の
’ｌ”　リンパ球が常法により採取される。

Ｔリンパ球としては、通常胸腺、牌臓、バイエル氏リン
パ組織等の体り／パ組織中の’ｌ’　１７７７球が挙げ
られる。

７９７７球は、常法によ９３９７７球と分離して用いる
とともできるが、混合体として用いることもできる。こ
の７９７７球を有効成分とする産生誘発剤は、通常、注
射剤として用いることができ、上記でリンパ球に緩衝液
、ブドウ糖等の注射剤に常用されるものを添加して懸濁
液として用いるのが一般的である。この誘発剤を、たと
えば次のように用いることにより肝細胞増殖因子並びＫ
Ｂ及び／又はＴ　１７７７球の増殖因子を産生ずること
ができる。

すなわち、上記誘発剤を温血動物の静脈血管系内又は腹
腔内に注入する。この動物は肝臓に損傷を与えられてい
ない正常な動物が通常用いられる。注入量は通常、細胞
数本東／θ５〜５に７０６／／回程度であシ、濃度は細
胞数／×／ｌ）’−！×１０ｓ／−程度が一般的である
。

ついで所定時間；たとえばダ時間〜７日間程度１以上経
過した後に、この動物より血液を採取し、これより血清
が調製される。

たとえば、上記血液を室部で凝固させた後、遠心分離等
により、その上清を取得することにより目的とする血清
を得る。

上記方法においては、得られた血清をさらに加熱および
／又は透析することにより精製することができる。

加熱は通常ご０〜１０θ℃程度で／分以上行なわれ、熱
変性した高分子タンパクは沈澱除去される。

また、透析は、カルシウムを実質的に含有しない塩類溶
液を用いて行なわれる。

上記透析処理により、血清中の低分子量成分が除去され
る。

さらに、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等に
より精製することができる。

上記の方法により得られる増殖因子は、次のような性質
を有する。

ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動図は
、分子量約ｔ、ｏｏｏ〜％　＜１’、（７ｏ　ｏの範囲
に）ぐンドを有する。

ｂ）ｃｏｎＡ（コンカナバリンＡ）−１セフアロース”
クロマトグラフィーにより溶出される。

Ｃ）動物による種特異性を示さない。

次に本発明に係る増殖因子を用いた肝細胞並びにＢ及び
／又は’ｌ’　１７７７球の培養について説明する。

（１）肝実質細胞の培養 培養に際しては、たとえば、上記因子を含む上清液又は
緩衝液を、蛋白含量０．７〜／θ〜程度／罰とし、この
液を培地中に通常／へ／　Ｏｖｏｗ　％、好ましくは、
？〜ｊＶＯ１％の濃度になるように添加する方法が通常
採用される。

培地としては、特に制限されないがたとえばウィリアム
又はイーグル等の基本培地が用いられ、牛胎児血清等の
血清を培地に対し、Ｏ，Ｓ〜／　Ｏｖｏ１％程度添加し
て用いるのが好ましい。

培養は、常法によることができ、たとえばｊ％ｃｏ２−
タ！チ空気中、３７℃、ｐＨ７，θ〜７．５で／〜−週
間週間程度性上行れる。培地を必要に応じ更新すること
により培養が行なわれる。

肝実質細胞は、通常コラゲナーゼかん流法によって正常
又は肝臓に損傷を与えられた温血動物の肝臓から得られ
たものが用いられる。

特に好適には、瀉血動物の肝臓に損傷を与え、３時間程
度以上、好ましくは２０時間程度以上経過したその肝臓
を用い、これを直接コラゲナーゼかん流させた後、肝臓
を細切し、さらにコラゲナーゼ溶液で処理し、ついでろ
過。

遠心することにより取得する。

また、上記方法において、細切片のろ過、７回以上繰り
返すことによって、最も好ましい結果を得ることができ
る。

上記培養により、肝実質細胞は分裂・増殖し、コロニー
を形成する。

（１１）　　リンパ球の培養 培養に際しては、たとえば、上記因子を含む上清液又は
緩衝液を、蛋白含量０．／〜７０■程度／耐とし、この
液を培地中に通常／〜／　Ｏｖｏ１チ、好ましくは３〜
ｊ　ｖｏｗ％の濃度になるように添加する方法が通常採
用される。

培地としては、特に制限されないがたとえばＲＰＭ工／
１４ｔＯ（基本培地）等が用いられ、牛胎児血清等の血
清を培地に対し、θ、！〜／θＶＯｌチ程度添加して用
いるのが好ましい。

培養は、常法によることができ、たとえば５チＱＯ，−
９６％空気中、３７℃、ｐＨ７，０〜７．５で、２％時
間以上、通常λ日間〜２週間程度行なわれる。培養に際
して、Ｂ又は７９７７球は通常、ダＯ〜２００万ｃｅｌ
ｌ　／　ｄの濃度から選ばれる。

この培養法によれば、Ｂ　ＩＪ　７パ球及び／又はτリ
ンパ球の増殖、分化を効率的に行なうことができる。す
なわち、一旦獲得した抗体等の因子形成能を失わずに増
殖させうるので、たとえば抗体の大量産生を目的とする
３３　リンパ球及び／又はＴ　ＩＪンパ球の大量培養法
として有用である。

特に、ＴＩＪンパ球の場合には、活性化したＴ　Ｉ）ン
パ球を長期にわたって維持するのに有用である。

（実施例） 以下、実施例によや本発明をさらに詳細に説明する。

実施例／ スゲＶイタ　　　ドーリイ ｓｐｒａｇｕｅ　−ＤａＷ１１！１系（ＳＤ系）ラット
（約ｔ〜１０週齢）体重コク０〜コＳＯｔ、弘匹×ダ区
の肝臓を約−２／３切除し、ダ、？、／２及び２ダ時間
に上記再生肝ラットのひ臓及び胸腺を切シ出し、リン酸
−生理的食塩水緩衝液中で細切し、ビベンテイングによ
りリンパ球を採取した。ついでリン酸−生理的食塩水緩
衝液中に懸濁させ、低速遠心した後、さらにリン酸−生
理的食塩水に懸濁させ細胞数；（約／×１０８／／ＣＣ
）、細胞増殖因子の産生誘発剤を得た。

次に、との誘発剤を正常ラットの尾静脈に／ω注射した
。コメ時間後にラットの門脈血を採取し、室温で凝固さ
せ、％’Ｃで一晩放置した後、ｊ００×ｔで５分間遠心
し、その上清を血清とし念。

（Ａ）　　肝細胞の培養 得られ九血清をウィリアムス培地に！チ濃度で添加した
。

ついで、参考例／で得られた肝実質細胞を分離し、この
培地ベプレーテイングし、３７℃、！％Ｃｏ、−９！チ
空気の混５合ガスを通気しながら培養した（９ｔ？時間
ごとに培地を交換）。

ひ臓細胞及び胸腺細胞を注射し九ラット由来の血清を用
いた場合のいずれも、３〜ｊ日間経過稜、多数の細胞が
分裂増殖し、再集合してコロニー化しはじめ、大部分の
細胞はコロニーの中にと９こまれた。さらにコロニー内
の細胞が増殖し、コロニーが成長し、？日間経過後には
、細胞同志が密な結合を示し、コロニーの周辺にコラー
ゲン、脂質球、さらには胆汁系物質の分泌がみられた。

なお、ひ臓細胞由来の場合には、静注後約／コ時間経過
後、胸Ｗ由来の場合には、２餌時間経過後の血清が、肝
細胞増殖能が大きかった。

（Ｂｌ　　リンパ球の培養 （３９７７球及び’ｌ’　１７７７球の調製）ヒツジ赤
血球に対する抗体（ＢＲＢＯ）の／チ生理食塩水溶液０
．２．１をラットの尾静脈に注射し、３日後にＢＲＢＯ
に対して抗体を形成する細胞を牌譬より取シ出した（３
９７７球：Ｔリンパ球＃　ｔ　：　９ｔ）。

（３９７７球の培養） 上記の血清を用いて、上記８ＲＢＯ生成能を獲得した肺
臓由来の３１７７７球及び’Ｊ’　＋７ンパ球（４：４
ｔ）を培養した。

培？栄件：・ＲＰＭ工　／乙ダθ培地 （牛胎児血清４ｔ％添加） ・Ｊ″％ＣＯ２−９ｊチ空気中、３７℃、り日間 ・Ｂリンパ球初期濃度 ダＯ万ｃｅ１１／ゴ ・因子；蛋白５η／培地扉ｌ この培養の結果、 （１）　　ひ騨細胞由来の産生誘発剤を用いて得られた
血清の場合、 り口径の細胞数は染色法による計測によれば、 弘〜１時間後採取の血清：／ご０万ｃｅ１１〜／Ｊ、　
　　　　　　　　　　　、２’ｌＯ万ｃｅｌｌ／ｄコ９
ｔ　　　　　　　　　　　　コＱθ万ｃｅｌｌ／ｍであ
った。

（１１）胸！由来の場合 り口径の細胞数は１ ．２餌時間後採取の血清：　　、２ＵＯ万ｃｅｌｌ／Ｉ
Ｆｔｌであった。

なお、比較のために、上記方法において増殖因子を含む
血清を添加しないで培養（り日間）を行なったところ、 ｔｔｔｏ万ｃｅｌｌ／ｄの場合、はとんど消滅した。

（７９７７球の培！Ｉ） （１）胸陳由来の１９７７球２００　ｙ５ｃｅｘ１／ｌ
＃を用いて、上記と同様にして培養を行なったところ、
り口径には約２９ｔＯ万ｃｅｌｌ／ｍであり、開始時の
個数は維持されていた。

比較のために、因子を用いないで培養を行なったところ
、り口径には１０万ｃｅ１１／ｍｌ以下まで低下してい
た。

参考例／ （肝実質細胞の腑、ｉ！！り ♂週齢、体重約／ｓＯ９の８Ｄ系雄ラツトの肝臓の２／
３を切除し、−０時間経過した後、０．２１１１のネン
プタールをそのラットの腹腔内に注射して麻酔する。次
の腹部を刺毛し、／θチ塩化ベンザルコニウム液で身体
全体を消毒する（以後肝細胞分離掃作は撮とうと遠心分
靜以外は全て無？箱中で行ない無菌的に操作する。）。

ラットを手術用固定台に仰臥位に固定し、手術ハサミで
腹部の皮膚、腹筋の順に開腹する。

タイロード−ＰＢＳ液をしみ込ませた脱脂綿で腸を術者
の右側にかきよけ門脈を十分露出させる。門脈に縫合糸
のループをかけ、眼科用ハサミの先端を使って門脈に切
れ目を入れる。切開部にあらかじめ設置しておいた潅流
装置に前潅流緩衝液を流しながら溢れ出る血液をめがけ
てカニユーレを挿入し、すばやく縫合糸で結紮する。同
時に肝臓下の工大静脈を切断し洗浄液を流出させる。そ
のｔまＪ　Ｏｍｌ　／　ｈｒの流速で前潅流緩衝液を約
２００ｙｄ流した後、ポンプを止める。潅流液をタイロ
ード−１’ＢＥＩ液に変え、同一の流速で約１００−流
し洗浄した後、ポンプを止め、潅流液をコラゲナーゼ浴
液に変え、同一の流速で約３０肩１流す。コラゲナーゼ
が肝臓全体に浸透したところでポンプを止め、全肝臓を
慎重に摘出し、７２０１ｍガラスシャーレに移す。約コ
θゴのコラゲナーゼ溶液を加え、カミソリの刃を鉗子で
交叉させ肝臓を一２Ｗ角の大きさに細切する。細切した
組織をコラゲナーゼ溶液ごと／θＯ−容三角コルペンに
移し、密栓し、３２℃の恒温振とり機で７分間に／θθ
振とうの割合で／！分間振とうする。振とう後、未消化
の組織を細胞濾過器によって取シ除き、上から約１０＊
ｅのタイロード−ＰＢＳ液で未消化の組織を洗い、全て
のろ液を！Ｏｒｄ’ｌｆの遠沈管に集め、密栓後５０×
？、７分間遠心分離する。上清を捨て、新たにコＯｔｙ
ｔｅのタイロード−ＰＢＳ液を加えて洗浄し、ゆるやか
にピペッティングし密栓後、遠沈管を氷冷し、ｊｏｘｔ
、７分間遠心分離し上清を捨てる。再度、タイロード−
ＰＢＳ液を加え懸濁し、２重ナイロン布の小片で濾過し
、ろ液を新しい遠沈管に集めて密栓後、氷冷し、ｊＯ×
？、／分間遠心分離する。

上清を捨てた後、タイロード−ＰＢＳ液による洗浄を一
回繰シ返すことにより、肝実質細胞より比重の軽い非実
質細胞が取シ除かれ、肝実質細胞が分離される。

（発明の効果） 本発明に係る産生誘発剤は、効率よく細胞増殖因子を得
るのに有用である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）肝臓に損傷を与えられた温血動物より得られるＴ
   リンパ球を有効成分とする細胞増殖因子の産生誘発剤。