JPS62115299A - 細胞培養物特に細菌培養物中のエリスロマイシン耐性因子を検出するためのプロ−ブ及び方法 - Google Patents
細胞培養物特に細菌培養物中のエリスロマイシン耐性因子を検出するためのプロ−ブ及び方法Info
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- JPS62115299A JPS62115299A JP61160683A JP16068386A JPS62115299A JP S62115299 A JPS62115299 A JP S62115299A JP 61160683 A JP61160683 A JP 61160683A JP 16068386 A JP16068386 A JP 16068386A JP S62115299 A JPS62115299 A JP S62115299A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、核酸、より詳細には、細胞培養物特に細菌培
養物中のエリス［１マイシン耐性因子を検出するための
プローブ及びかかるプローブを用いた検出方法に係る。
養物中のエリス［１マイシン耐性因子を検出するための
プローブ及びかかるプローブを用いた検出方法に係る。
抗生物質に対する細菌の耐Ｐ１を検出する問題はよく知
られている。１特定の抗生物質に対して多数の細菌が耐
性を獲得するようになったため、細菌の耐性の検出は臨
床医学においてその重要性を増しつつある。このため、
いかなる治療の場合にも特定の抗生物質を用いるときに
は、治療される患者の感染細菌中に該抗生物質に対する
獲得耐性が存在するか否かを検出するための予備テスト
をできるたけ行う必要がある。予備テストの結果が陽性
反応を示すと該抗生物質を臨床処方から除外しなければ
ならない。
られている。１特定の抗生物質に対して多数の細菌が耐
性を獲得するようになったため、細菌の耐性の検出は臨
床医学においてその重要性を増しつつある。このため、
いかなる治療の場合にも特定の抗生物質を用いるときに
は、治療される患者の感染細菌中に該抗生物質に対する
獲得耐性が存在するか否かを検出するための予備テスト
をできるたけ行う必要がある。予備テストの結果が陽性
反応を示すと該抗生物質を臨床処方から除外しなければ
ならない。
エリスロマイシンはダラム陰性閑によるある種の感染症
の予防及び治療に有効であることが近年認識された抗生
物質である（Ａ、Ａｎｄｒｅｍｏｎｔ等、Ａｎｎ、１ｎ
ｓｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ、 Ｐａｒｉｓ、 １３２Ｂ（１
９８１）４１９−４２７及びＡ。
の予防及び治療に有効であることが近年認識された抗生
物質である（Ａ、Ａｎｄｒｅｍｏｎｔ等、Ａｎｎ、１ｎ
ｓｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ、 Ｐａｒｉｓ、 １３２Ｂ（１
９８１）４１９−４２７及びＡ。
Ａｎｄｒｅｍｏｎｔ等、Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、
、＋４８（１９８３）５７Ｌ５８７）。
、＋４８（１９８３）５７Ｌ５８７）。
この感染症はしばしば胃腸管を冒し激しい下痢を起こす
。従って例えば患者の便から病原物質を単離し得る。
。従って例えば患者の便から病原物質を単離し得る。
他の抗生物質で行なわれているようにエリスロマイシン
耐性の有無検出を従来の方法、即ち病原細菌のエリスロ
マイシン耐性の表現形質の検出によって行うことら可能
である。即ち、病原細菌を含むと予想される生物サンプ
ル、この場合には下痢便サンプルを培養した後に、エリ
ス〔１マイシンの静菌性と殺菌性ｌの変化を検出する。
耐性の有無検出を従来の方法、即ち病原細菌のエリスロ
マイシン耐性の表現形質の検出によって行うことら可能
である。即ち、病原細菌を含むと予想される生物サンプ
ル、この場合には下痢便サンプルを培養した後に、エリ
ス〔１マイシンの静菌性と殺菌性ｌの変化を検出する。
これらの □方法は確かに有効ではあるが、その重大な
欠点は、表現型の十分な検出を達成するためには、初期
採取サンプル中に存在する細菌フローラの予備培養物を
調製して病原物質を単離するのに長期間を要することで
ある。ごのように長期間を要するため、緊急な治療を要
し速やかな処置が必要な場合に役に立たない。
欠点は、表現型の十分な検出を達成するためには、初期
採取サンプル中に存在する細菌フローラの予備培養物を
調製して病原物質を単離するのに長期間を要することで
ある。ごのように長期間を要するため、緊急な治療を要
し速やかな処置が必要な場合に役に立たない。
原因病原物質に含まれており抗生物質に対する耐性の原
因となる遺伝子配列と適当なプローブとシ をハイブリダイゼーヨンさせる方法の使用はこれまで提
案されていなかった。この方法は以下の如き特有の利点
を有する。
因となる遺伝子配列と適当なプローブとシ をハイブリダイゼーヨンさせる方法の使用はこれまで提
案されていなかった。この方法は以下の如き特有の利点
を有する。
一感度がよい、従って細菌培養期間の短縮、時には細菌
培養の省略が可能であり、病原物質（サン＝４＝ プル）に直接使用し得る。
培養の省略が可能であり、病原物質（サン＝４＝ プル）に直接使用し得る。
一結果を表現型から遺伝型に転移できるので細菌（病原
物質）の同定が不要である。
物質）の同定が不要である。
しかし乍ら以下の理由からこの方法の実用化が遅れてい
る。
る。
−ある種の病原物質については処理が難しい。特に、
−ある種のサンプル特に性的感染疾患の場合には少数細
菌相に対する処理が難しい。
菌相に対する処理が難しい。
−また、所定の耐性の形質の遺伝子不均質性の存在に関
する知識が不十分である。
する知識が不十分である。
例えば、テトラサイクリン耐性の決定基の不均質性（１
３，１６ｎｄｅｚ等、（１９８０）、Ｐｌａｓｍｉｄ
９．９９−１０８）及びマクロライド−リンコサミド−
ストレプトグラミン−Ｂタイプの抗生物質に対する耐性
の決定基の不均質性（Ｏｕｎｉｓｓｉ等、（１９ｇ２）
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８２、Ｄ、Ｓｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔ
ｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒ。
３，１６ｎｄｅｚ等、（１９８０）、Ｐｌａｓｍｉｄ
９．９９−１０８）及びマクロライド−リンコサミド−
ストレプトグラミン−Ｂタイプの抗生物質に対する耐性
の決定基の不均質性（Ｏｕｎｉｓｓｉ等、（１９ｇ２）
、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８２、Ｄ、Ｓｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔ
ｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒ。
ｂｉｏｌｏｇｙ、 ｐ、１６７−１６９）は既に認識さ
れている。
れている。
本発明は、エリスロマイシンのラクトン環を加水分解し
得るエステラーゼをコードするａ−ｒ、ｇｌ＋遺伝子の
少なくとも一部を含むヌクレオチドブ【Ｊ−プリスロマ
イシン耐性因子が高い確実性で検出できるという知見に
基づく。ｃ−ｒＯ，Ａ遺伝子のヌクレオチド配列（１０
３２個の塩基対を含む）を以下に示す。
得るエステラーゼをコードするａ−ｒ、ｇｌ＋遺伝子の
少なくとも一部を含むヌクレオチドブ【Ｊ−プリスロマ
イシン耐性因子が高い確実性で検出できるという知見に
基づく。ｃ−ｒＯ，Ａ遺伝子のヌクレオチド配列（１０
３２個の塩基対を含む）を以下に示す。
一ピー
（１０３２個の塩基対の読取り枠を含む）この配列を６
１ｋｂのプラスミドｒｌｌＴ’ｌ１００から１１′（離
した。ごのプラスミドが大腸菌に強力なエリス【Ｊマイ
ソン耐性を与える能力をらっことは認識されていた。ｅ
ｒｇＡ遺伝子のヌクレオチド配列から推定されたエリス
ロマイシンエステラーゼのポリペプチド鎖の分子量は３
７７６５であり、これはドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）で
実験的に決定された値（約４３０００）と一致する。
１ｋｂのプラスミドｒｌｌＴ’ｌ１００から１１′（離
した。ごのプラスミドが大腸菌に強力なエリス【Ｊマイ
ソン耐性を与える能力をらっことは認識されていた。ｅ
ｒｇＡ遺伝子のヌクレオチド配列から推定されたエリス
ロマイシンエステラーゼのポリペプチド鎖の分子量は３
７７６５であり、これはドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）で
実験的に決定された値（約４３０００）と一致する。
このプラスミド自体は、供与者から実験室で単離され（
２■／ｍｅより高い投与量で）エリスロマイシン及びそ
の他の抗生物質例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、
ストレプトマイシン等に高度な耐性をもっ大腸菌からｊ
ｌ’ｔ ｆｉｌｌされた。
２■／ｍｅより高い投与量で）エリスロマイシン及びそ
の他の抗生物質例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、
ストレプトマイシン等に高度な耐性をもっ大腸菌からｊ
ｌ’ｔ ｆｉｌｌされた。
岨遺転子の１２ｊ？ Ｉ−ｐ．謬ｔ−１部位の間から採
取された７２０塩基対の挿入物を含む遺伝子内プローブ
を使用し、異なる属に所属する病原細菌由来の多シ 数のコロニーに対するハイブリダイゼご１ンテストを実
施して検出の再現性を試験した。遺伝子の高度の安定性
は、プラスミドｐｌＰ１１００の単離に用いられた初期
宿主大腸菌ＢＭ２１９５中でプラスミドｐｌｐＨ００が
安定であること、及び、このプラスミドが別の大腸菌細
胞に１０−’の高い頻度で転移する能力をもっこと、ま
た転移された大腸菌細胞中でも極めて安定であることに
よって得られる。この挙動により、プラスミドｐｌＰＩ
１００の複製及び転移のための装置が大腸菌に特に適
していることが示唆される。
取された７２０塩基対の挿入物を含む遺伝子内プローブ
を使用し、異なる属に所属する病原細菌由来の多シ 数のコロニーに対するハイブリダイゼご１ンテストを実
施して検出の再現性を試験した。遺伝子の高度の安定性
は、プラスミドｐｌＰ１１００の単離に用いられた初期
宿主大腸菌ＢＭ２１９５中でプラスミドｐｌｐＨ００が
安定であること、及び、このプラスミドが別の大腸菌細
胞に１０−’の高い頻度で転移する能力をもっこと、ま
た転移された大腸菌細胞中でも極めて安定であることに
よって得られる。この挙動により、プラスミドｐｌＰＩ
１００の複製及び転移のための装置が大腸菌に特に適
していることが示唆される。
岨遺転子の単離条件及び配列決定に関しては後述する。
従って生物サンプル中特に便サンプル中のエリスロマイ
シン耐性因子の存在を検出するための本発明方法の特徴
は、該ザンブル又は該ザンプルに含まれる核酸と町−ｏ
．！遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチド配列を
含有するプローブとを接触させ、該ヌクレオチド配列が
サンプル中に存在すると予想される対応する耐性因子を
コードする核酸とハイブリダイゼーションできるような
接触条件を用いることである。
シン耐性因子の存在を検出するための本発明方法の特徴
は、該ザンブル又は該ザンプルに含まれる核酸と町−ｏ
．！遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチド配列を
含有するプローブとを接触させ、該ヌクレオチド配列が
サンプル中に存在すると予想される対応する耐性因子を
コードする核酸とハイブリダイゼーションできるような
接触条件を用いることである。
上記における「ｅｒｅＡ遺伝子の少なくとも一部」なる
表現は、該遺伝子の内部に存在するより短いヌクレオチ
ド配列全てを意味する。但し、該ヌクレオチド配列は、
該ヌクレオチド配列を含むブロー、シ ブを使用したハイブリダイゼーヨンアストにおける被検
サンプル中の遺伝子の存在の認識能力の特異性に関し特
有の明白な応答を与えるに十分な長さをもつ配列に限る
。ヌクレオチド配列が、岨遺転子の内部に存在する配列
の少なくとも１つの内部でのヌクレオチドの予想順序と
等しい順序で例えば１５以上好ましくは５０個のヌクレ
オチドを含むときに特に特異性が得られる。「崩遺転子
のるような前記配列とのハイブリダイゼーション可能な
ヌクレオチド配列を含む全てのプローブを意味する。
表現は、該遺伝子の内部に存在するより短いヌクレオチ
ド配列全てを意味する。但し、該ヌクレオチド配列は、
該ヌクレオチド配列を含むブロー、シ ブを使用したハイブリダイゼーヨンアストにおける被検
サンプル中の遺伝子の存在の認識能力の特異性に関し特
有の明白な応答を与えるに十分な長さをもつ配列に限る
。ヌクレオチド配列が、岨遺転子の内部に存在する配列
の少なくとも１つの内部でのヌクレオチドの予想順序と
等しい順序で例えば１５以上好ましくは５０個のヌクレ
オチドを含むときに特に特異性が得られる。「崩遺転子
のるような前記配列とのハイブリダイゼーション可能な
ヌクレオチド配列を含む全てのプローブを意味する。
本発明はまた新規な物として、特に適当な制限酵素によ
って開裂されてプラスミドｐ＋ｐ＋ｉｏｏから単離され
た１５００個以下の塩基対を含むヌクレオチド配列に係
る。この配列は（う−ｒ−ｔ！、Ａ−遺伝子自体の全部
又は一部を含む１、本発明（Ｊまた新規な物として、前
記ヌクレオチド配列とプラスミドｐｌｐＨ００にとって
は外来の核酸との間に形成された全ての組換体ＤＮＡに
係る。特に、本発明は、（実坑遺伝子の一部によって修
飾され特に大腸菌中で容易に複製及び増幅し得るファー
ジ、コスミド又はプラスミドのタイプのベクターに係る
。
って開裂されてプラスミドｐ＋ｐ＋ｉｏｏから単離され
た１５００個以下の塩基対を含むヌクレオチド配列に係
る。この配列は（う−ｒ−ｔ！、Ａ−遺伝子自体の全部
又は一部を含む１、本発明（Ｊまた新規な物として、前
記ヌクレオチド配列とプラスミドｐｌｐＨ００にとって
は外来の核酸との間に形成された全ての組換体ＤＮＡに
係る。特に、本発明は、（実坑遺伝子の一部によって修
飾され特に大腸菌中で容易に複製及び増幅し得るファー
ジ、コスミド又はプラスミドのタイプのベクターに係る
。
最後に本発明は、前記の組換体又は非組換体ＤＮＡから
産生され得るラベルプローブに係る。このラベルプロー
ブは特に、放射性元素でラベルされた＝１１− は基とを結合させることによってラベルされたプローブ
を意味する。本発明の付加的特徴は、崩遣↓ 転子の同定及び単離条件及びハイブリダイゼーヨンテス
トで使用される条件に関する以下の記載より明らかにさ
れるであろう。以下の記載を理解するために添付図面を
参照されたい。
産生され得るラベルプローブに係る。このラベルプロー
ブは特に、放射性元素でラベルされた＝１１− は基とを結合させることによってラベルされたプローブ
を意味する。本発明の付加的特徴は、崩遣↓ 転子の同定及び単離条件及びハイブリダイゼーヨンテス
トで使用される条件に関する以下の記載より明らかにさ
れるであろう。以下の記載を理解するために添付図面を
参照されたい。
更に明細書の末尾の図面に関する詳細な説明にも十分に
注意されたい。
注意されたい。
岨遺転子の同定及び単離に使用される材料の種類及び方
法に関して以下に説明する。
法に関して以下に説明する。
材料及び方法
（ａ）細菌株
細菌株のソース及び特性を以下の表１に示す。
鼾
菌株 重要な遺伝子型
大腸菌に１２Ｃ６００ｔｈｒ、 ｌｅｕ、 ｔｈｉ、
１ａｃＹ、ｔｏｎＡｔｒＡ 大腸菌ＢＭ６９４ 原栄養性、肛拮大腸菌に１
２ＡＲ１０６２リ■−１切且、月す２、ゾ±、シ１工、
ｍｔｌ、 ｈｓｄｓ バクテリオファージ旧３ｍｐ８又はＭＩ３ｍｐ９（２）
を使用し配列決定すべきＤＮＡ断片を大腸菌ＪＭＩＯＩ
（１）にトランスフェクトする。
１ａｃＹ、ｔｏｎＡｔｒＡ 大腸菌ＢＭ６９４ 原栄養性、肛拮大腸菌に１
２ＡＲ１０６２リ■−１切且、月す２、ゾ±、シ１工、
ｍｔｌ、 ｈｓｄｓ バクテリオファージ旧３ｍｐ８又はＭＩ３ｍｐ９（２）
を使用し配列決定すべきＤＮＡ断片を大腸菌ＪＭＩＯＩ
（１）にトランスフェクトする。
（ｂ）ｔ＠Ｊ
寒天（Ｄｉｒｃｏ）と脳−心インフコージＥｌンブロス
とを使用する。Ｍｕｅｌ Ｉｅｒ−１１ｊｎｔｏｎ寒天
でプラークの感受性テストを行う。全てのインキコベー
ションを３７℃で行う。
とを使用する。Ｍｕｅｌ Ｉｅｒ−１１ｊｎｔｏｎ寒天
でプラークの感受性テストを行う。全てのインキコベー
ションを３７℃で行う。
（ｃ）プラスミド
このテストで使用したプラスミドを後記の表■に示す。
ｐＢＲ３２９中のＴ’ｓｔ１部位を以下のごとく除去す
る。
る。
ｐＢＲ３２９のプラスミドＤＮＡを、ＰｓｔＩで直線化
し、形質転換によって大腸菌に導入し、テトラサイクリ
ン及びクロラムフェニコールに耐性でアンピシリンに耐
性でないことによって選択する。Ｌ１ユＩによる開裂に
耐性のプラスミドを選択しｐＢＲ３２９Δ（Ｐｓｔ Ｉ
）と指称する。
し、形質転換によって大腸菌に導入し、テトラサイクリ
ン及びクロラムフェニコールに耐性でアンピシリンに耐
性でないことによって選択する。Ｌ１ユＩによる開裂に
耐性のプラスミドを選択しｐＢＲ３２９Δ（Ｐｓｔ Ｉ
）と指称する。
（ｄ）吋Ｍ（ハ）」」
ｐｌＰｌｌｏｏのプラスミドＤＮＡの単離及びｐＢＲ３
２２とこれに由来のプラスミドのＤＮＡの大量単離との
ためには参考文献（３Ｘ４）に記載の方法を用いる。
２２とこれに由来のプラスミドのＤＮＡの大量単離との
ためには参考文献（３Ｘ４）に記載の方法を用いる。
制限切断したＤＮＡ断片を０．８％の低温ゲル化アガロ
ースを収容した水車プレート（２０ｘ ２０ｘ Ｏ，７
ｃｍ）又は５％のアクリルアミドと０．２５％のビスア
クリルアミドとを収容した鉛直プレート（２０Ｘ ４０
Ｘ Ｏ，３ｃｍ）でゲル電気泳動にかける。ＤＮＡ断片
をＭａｎｉａｔｉｓ等（１９８２Ｘ５）の方法で精製す
る。
ースを収容した水車プレート（２０ｘ ２０ｘ Ｏ，７
ｃｍ）又は５％のアクリルアミドと０．２５％のビスア
クリルアミドとを収容した鉛直プレート（２０Ｘ ４０
Ｘ Ｏ，３ｃｍ）でゲル電気泳動にかける。ＤＮＡ断片
をＭａｎｉａｔｉｓ等（１９８２Ｘ５）の方法で精製す
る。
（ｆ）ＤＮＡ配列決定−
ＤＮＡ断片をバクテリオファージＭ１３ｍｐ９及びＭ１
３ｍｐ８でクローニングし、Ｓａｎｇｅｒ等（６）のチ
ェイン・ターミネーション法で配列決定する。ＤＢＣＯ
ＭＰ及びＤＢＵＴＩＬのコンピュータプログラム（Ｓｔ
ａｄｅｎ（７））によって完全ＤＮＡ配列を作成する。
３ｍｐ８でクローニングし、Ｓａｎｇｅｒ等（６）のチ
ェイン・ターミネーション法で配列決定する。ＤＢＣＯ
ＭＰ及びＤＢＵＴＩＬのコンピュータプログラム（Ｓｔ
ａｄｅｎ（７））によって完全ＤＮＡ配列を作成する。
（ｇ）ミニセルの変可
Ｄａｖｉｓ等の方法（４）でプラスミドを形質転換に上
りＡＲ１０６２菌に導入してミニセルを産生し、Ｒａｍ
ｂａｃｈ及びＨｏｇｎｅｓｓの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Δｃａｄ、ｓｃ１．ＵｓＡ、 ７４（１’９７７）
、５０５１．５０４５）でミニセルを調製する。
りＡＲ１０６２菌に導入してミニセルを産生し、Ｒａｍ
ｂａｃｈ及びＨｏｇｎｅｓｓの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Δｃａｄ、ｓｃ１．ＵｓＡ、 ７４（１’９７７）
、５０５１．５０４５）でミニセルを調製する。
（３５Ｓ）Ｌ−メチオニンでポリペプチドをラベルし、
ドデシル硫酸す）・リウムを含むポリアクリルアミドで
電気泳動にかける。これにはＵ、に、Ｌａｅｍｍｌｉの
方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７．６８０−６８５（１，９
７０））を用いる。
ドデシル硫酸す）・リウムを含むポリアクリルアミドで
電気泳動にかける。これにはＵ、に、Ｌａｅｍｍｌｉの
方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７．６８０−６８５（１，９
７０））を用いる。
（ｈ）駄
制限エンドヌクレアーゼ（Ｂａｇ−ＩＩ Ｉ 、 Ｖｃ
旦Ｒ１、時ａｌＴ、旧」工ｄｌｌＩ、■↓■及びシリ−
３Δ）、ｌ）ＮへポリメラーゼＩ（大きい断片）、バク
テリオファージＴｌｌ ＤＮＡリガーゼ及び子ウシアル
カリフ１スファターゼを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｃｌｍ）の処方通りに使用する。
旦Ｒ１、時ａｌＴ、旧」工ｄｌｌＩ、■↓■及びシリ−
３Δ）、ｌ）ＮへポリメラーゼＩ（大きい断片）、バク
テリオファージＴｌｌ ＤＮＡリガーゼ及び子ウシアル
カリフ１スファターゼを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｃｌｍ）の処方通りに使用する。
シグマリゾチー１１を使用する１、
（ｉ）化学物質−
〔α−９２Ｐ〕デオキシアデノシン５°−トリホスフェ
−ト、トリエチルアンモニウム塩及び（３５Ｓ）Ｌ−メ
チオニンはＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
Ａｍｅｒｓｈａｍのもの、デオキシヌクレオシドトリ
ホスフェート、ジデオキンヌクレオシドトリホスフエー
ト及びバクテリオファージＭ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ
９ＲＰのＤＮＡはＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのも
の、バクテリオファージλｃ１８５７Ｓａｍ７のＤＮＡ
はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒのもの、Ｍ１３ペンタデカマー
は旧ｏ１ａｂｓのもの、５ＤＳ−ＰＡＧＥの分子量ラベ
ルはＬＫＢのもの、抗生物質アンピシリンはＢ ｒ ｉ
ｓ ｌ ｏ １ 、’ クロラムフェニコール及びエ
リスロマイシンはＲｏｕ −５ｓｅｌ−（ｌｃｌａｆ、
ストレプトマイシン及びテトラザイクリンはＰｆｉｚｅ
ｒのものを使用する。
−ト、トリエチルアンモニウム塩及び（３５Ｓ）Ｌ−メ
チオニンはＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
Ａｍｅｒｓｈａｍのもの、デオキシヌクレオシドトリ
ホスフェート、ジデオキンヌクレオシドトリホスフエー
ト及びバクテリオファージＭ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ
９ＲＰのＤＮＡはＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのも
の、バクテリオファージλｃ１８５７Ｓａｍ７のＤＮＡ
はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒのもの、Ｍ１３ペンタデカマー
は旧ｏ１ａｂｓのもの、５ＤＳ−ＰＡＧＥの分子量ラベ
ルはＬＫＢのもの、抗生物質アンピシリンはＢ ｒ ｉ
ｓ ｌ ｏ １ 、’ クロラムフェニコール及びエ
リスロマイシンはＲｏｕ −５ｓｅｌ−（ｌｃｌａｆ、
ストレプトマイシン及びテトラザイクリンはＰｆｉｚｅ
ｒのものを使用する。
１６一
実施例１
（ａ）プラスミドｐｌＰ１］００のエリスロマイシン耐
性の決定基の分子クローニング プラスミドｐｌＰ１１００（Ｔｒａ＋、１ｎｃＸ、 Ａ
ｐ Ｅｍ Ｇｍ Ｓｍ。
性の決定基の分子クローニング プラスミドｐｌＰ１１００（Ｔｒａ＋、１ｎｃＸ、 Ａ
ｐ Ｅｍ Ｇｍ Ｓｍ。
６１ｋｂ）とプラスミドｐＢＲ３２２（Ａｐ Ｔｃ、４
．３６ｋｂ）とのＤＮＡを混合し＾ｖａＩエンドヌクレ
アーゼで消化し結合する。産生物を形質転換によって大
腸菌に導入しクローンをエリスロマイシン（２００ｉ／
＋＋＋ｆ７）で選択スる。アンピシリン、エリスロマイ
シン及びストレプトマイシンに耐性の形質転換体のプラ
スミド含有物を（８）に記載のアガロースゲルでの粗細
菌溶解物の電気泳動で分析する。最小のハイブリッドを
もつ形質転換体の１つのプラスミドＤＮＡをＡｖａ Ｉ
で消化しｐｌｐＨ００の３．５ｋｂの挿入物を精製し返
り−３八で部分消化する。得られた制限断片を、Ｂａｍ
ＨＩで消化したｐＢＲ３２２でクローニングし形質転換
体をエリスロマイシンで選択し次にストレプトマイシン
で複製する。アンピシリンとエリスロマイシンとだけに
耐性の形質転換体のプラスミド含有物をアガロースゲル
電気泳動にかげて分析する。最小ハイブリッドｐＡＴ６
３のＤＮＡを精製し、エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ、
都−ｏｌｉ １ 、 Ｐｓｔ Ｉ又は１ｌｉ３．ｄｎ
ｌ及びＢａｍ、、ｌ［ｌで消化後にアガロースゲル電気
泳動にかけて分析する。プラスミドｐＡＴ６３はｐ旧（
３２２とｐ Ｉ Ｐ １１００のＤＮＡの１．６６ｋｂ
の挿入物とから成る（第１図、表ＩＩ ）。
．３６ｋｂ）とのＤＮＡを混合し＾ｖａＩエンドヌクレ
アーゼで消化し結合する。産生物を形質転換によって大
腸菌に導入しクローンをエリスロマイシン（２００ｉ／
＋＋＋ｆ７）で選択スる。アンピシリン、エリスロマイ
シン及びストレプトマイシンに耐性の形質転換体のプラ
スミド含有物を（８）に記載のアガロースゲルでの粗細
菌溶解物の電気泳動で分析する。最小のハイブリッドを
もつ形質転換体の１つのプラスミドＤＮＡをＡｖａ Ｉ
で消化しｐｌｐＨ００の３．５ｋｂの挿入物を精製し返
り−３八で部分消化する。得られた制限断片を、Ｂａｍ
ＨＩで消化したｐＢＲ３２２でクローニングし形質転換
体をエリスロマイシンで選択し次にストレプトマイシン
で複製する。アンピシリンとエリスロマイシンとだけに
耐性の形質転換体のプラスミド含有物をアガロースゲル
電気泳動にかげて分析する。最小ハイブリッドｐＡＴ６
３のＤＮＡを精製し、エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａ、
都−ｏｌｉ １ 、 Ｐｓｔ Ｉ又は１ｌｉ３．ｄｎ
ｌ及びＢａｍ、、ｌ［ｌで消化後にアガロースゲル電気
泳動にかけて分析する。プラスミドｐＡＴ６３はｐ旧（
３２２とｐ Ｉ Ｐ １１００のＤＮＡの１．６６ｋｂ
の挿入物とから成る（第１図、表ＩＩ ）。
ＥｃｏＲＩ ／即ｎｄｌｌ！ テ消化したｐＡＴ６３（
７） ＤＮＡ断片（１７５０ｂｐ）とＩ泗ｕ Ｉ ／均
す、Ｉで消化しノこｐ訂６３のＤＮＡ断片（９７０ｂｐ
）とをｐＵＣｇ中でザブク「ノーニングする。これら断
片はエリスロマイシンに耐性でない。
７） ＤＮＡ断片（１７５０ｂｐ）とＩ泗ｕ Ｉ ／均
す、Ｉで消化しノこｐ訂６３のＤＮＡ断片（９７０ｂｐ
）とをｐＵＣｇ中でザブク「ノーニングする。これら断
片はエリスロマイシンに耐性でない。
（ｂ）ｅｒｅＡ遺伝子のインビト【１挿入による失活プ
ラスミドｐＡＴ６３のＤＮＡを叩ｎ、ｄ ＩＩＩと世Ｉ
ＩＩとによって消化する。完全βａｕ３Ａ挿入物（第１
図）を含む２ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、１ｌｌｎｄＴ
ＩＩと１３ａｍｌｌＩとによって消化しておいたＩ）ｎ
Ｒ３２９Δ（じ且−（■）（表ＩＩ ）中でクローニン
グする。エリス［Ｊマイシン及びクロラムフェニコール
に耐性でありテトラザイクリンに耐性でない形質転換体
を耐性に基づいて選択する。形質転換体の１つのプラス
ミドｐＡＴ６４を精製しＰｓｔＩで消化し、脱ホスホリ
ル化しバクテリオファージλ（９）の１６４ｂｐのＰｓ
ｔ １断片の精製Ｔ）ＮＡと混合し、結合段階で処理し
形質転換によって大腸菌に導入し、クロラムフェニコー
ルに耐性でエリスロマイシンに耐性でないクローンを選
択する。形質転換体のプラスミドＤＩＩＡを精製し、Ｐ
ｓｔ Ｉエンドヌクレアーゼで消化後にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけて分析する。プラスミドｐＡＴ
６５はｐＡＴ６４と１６４ｂｐのＤＮＡ挿入物とから成
る。
ラスミドｐＡＴ６３のＤＮＡを叩ｎ、ｄ ＩＩＩと世Ｉ
ＩＩとによって消化する。完全βａｕ３Ａ挿入物（第１
図）を含む２ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、１ｌｌｎｄＴ
ＩＩと１３ａｍｌｌＩとによって消化しておいたＩ）ｎ
Ｒ３２９Δ（じ且−（■）（表ＩＩ ）中でクローニン
グする。エリス［Ｊマイシン及びクロラムフェニコール
に耐性でありテトラザイクリンに耐性でない形質転換体
を耐性に基づいて選択する。形質転換体の１つのプラス
ミドｐＡＴ６４を精製しＰｓｔＩで消化し、脱ホスホリ
ル化しバクテリオファージλ（９）の１６４ｂｐのＰｓ
ｔ １断片の精製Ｔ）ＮＡと混合し、結合段階で処理し
形質転換によって大腸菌に導入し、クロラムフェニコー
ルに耐性でエリスロマイシンに耐性でないクローンを選
択する。形質転換体のプラスミドＤＩＩＡを精製し、Ｐ
ｓｔ Ｉエンドヌクレアーゼで消化後にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけて分析する。プラスミドｐＡＴ
６５はｐＡＴ６４と１６４ｂｐのＤＮＡ挿入物とから成
る。
（Ｃ）ミニセル中のエリスロマイシンエステラーゼの分
析 プラスミドｐＢＲ３２２とｐＡＴ６３とを大腸菌ＡＲ１
０６２に導入しミニセルを産生させる。ミニセルを精製
しポリペプチドをラベルした後に、５ＤＳ−ＰＡＧＥで
タンパク質を分析する。エリスロマイシンエステラーゼ
に対応すると思われる推定分子量約４３０００のバンド
がＩ）ＡＴ６３で観察されｐＢＲ３２２では観察されな
い（第４図）。
析 プラスミドｐＢＲ３２２とｐＡＴ６３とを大腸菌ＡＲ１
０６２に導入しミニセルを産生させる。ミニセルを精製
しポリペプチドをラベルした後に、５ＤＳ−ＰＡＧＥで
タンパク質を分析する。エリスロマイシンエステラーゼ
に対応すると思われる推定分子量約４３０００のバンド
がＩ）ＡＴ６３で観察されｐＢＲ３２２では観察されな
い（第４図）。
（ｄ）ｐＡＴ６３の挿入物のヌクレオヂド配列プラスミ
ドｐＡＴ６３の２ｋｂのｊｌ ｉ ｎｄ ＩＩＩ −Ｂ
ａｍ−ＨＴ断片の精製ＤＮＡ（第１図）を種々の制限エ
ンドヌクレアーゼによって別々に消化し、複製形のバク
テリオファージＭ１３ｍｐ９又はＭ１３ｍｐ８中で分子
クローニングする。
ドｐＡＴ６３の２ｋｂのｊｌ ｉ ｎｄ ＩＩＩ −Ｂ
ａｍ−ＨＴ断片の精製ＤＮＡ（第１図）を種々の制限エ
ンドヌクレアーゼによって別々に消化し、複製形のバク
テリオファージＭ１３ｍｐ９又はＭ１３ｍｐ８中で分子
クローニングする。
各実験において任意に選択したクローンの挿入物をチェ
イン・ターミネーシコン法で配列決定する。
イン・ターミネーシコン法で配列決定する。
配列決定の方法が第１図に示されている。オーバーラツ
プ挿入物をもつクローンから得られたＤＮＡ鎖及び／又
は両方向でクローニングされた同じ挿入物をもつクロー
ンから得られたＤＮＡ鎖との双方について全部の配列決
定を行う。コンピュータ解析によって得られた完全ヌク
レオチド配列を第２図に示す。この配列は１３８Ｇ塩」
１（対から成り、ｊｌｉｒ３ｄ■部位から１２４ｈｐＨ
１ｌｌ１間し）こ約＋５０ｂｐの配列が決定できなかっ
た（第１図）。
プ挿入物をもつクローンから得られたＤＮＡ鎖及び／又
は両方向でクローニングされた同じ挿入物をもつクロー
ンから得られたＤＮＡ鎖との双方について全部の配列決
定を行う。コンピュータ解析によって得られた完全ヌク
レオチド配列を第２図に示す。この配列は１３８Ｇ塩」
１（対から成り、ｊｌｉｒ３ｄ■部位から１２４ｈｐＨ
１ｌｌ１間し）こ約＋５０ｂｐの配列が決定できなかっ
た（第１図）。
（ｅ）エリスロマイシンエステラーゼをコードする遺伝
子の同定 配列決定された各ＤＮＡ鎖（第３図）の３つの読取り枠
中の終了コドン（ＴＡＧ、 ＴＧＡ、 ＴＡＡ）の位置
はエステラーゼの１つの読取り枠が存在することを示す
。
子の同定 配列決定された各ＤＮＡ鎖（第３図）の３つの読取り枠
中の終了コドン（ＴＡＧ、 ＴＧＡ、 ＴＡＡ）の位置
はエステラーゼの１つの読取り枠が存在することを示す
。
この領域は２４４位置のＴＡＡコドンから１２７９位置
のＴＡＧコドンまで伸びる。
のＴＡＧコドンまで伸びる。
このＤＮＡ断片がタン５くり質をコードする領域に対応
するか又はコードしない領域に対応するかを検査するた
めに統計的テストを使用した（１０）。コードする確率
は９２％でありこれは予想どおりである。２４７位置の
ＡＴＧコドンは、この読取り枠の最初の２００個のヌク
レオチド中のＢＲＳタイプ配列を直前に含む唯１つのイ
ニシエータ（ＡＴＧ、 ＧＴＧ、 ＴＴＧ）である。こ
のＡＴＧコドンから１０塩基対上流に推定ＲＢＳコンセ
ンザス配列（ＡＡＡＧＧＣＡＴ）が存在する（第２図参
照）。
するか又はコードしない領域に対応するかを検査するた
めに統計的テストを使用した（１０）。コードする確率
は９２％でありこれは予想どおりである。２４７位置の
ＡＴＧコドンは、この読取り枠の最初の２００個のヌク
レオチド中のＢＲＳタイプ配列を直前に含む唯１つのイ
ニシエータ（ＡＴＧ、 ＧＴＧ、 ＴＴＧ）である。こ
のＡＴＧコドンから１０塩基対上流に推定ＲＢＳコンセ
ンザス配列（ＡＡＡＧＧＣＡＴ）が存在する（第２図参
照）。
保存されにくいこの配列は、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ
（３’ −ＯＨＡＵＵＣＣＵＣＣ５’ ）の３’ ０１
１末端をもつ８個の塩基（下線部分）のうじの４個のみ
に相補性をもつ。
（３’ −ＯＨＡＵＵＣＣＵＣＣ５’ ）の３’ ０１
１末端をもつ８個の塩基（下線部分）のうじの４個のみ
に相補性をもつ。
推定ＲＢＳ配列と１６３リポソームＲＮＡの３’−０１
１末端との間の最も安定な構造の相互作用の自由エネル
ギ（ΔＧ）は、Ｔ Ｉ Ｎ０ＣＣＯ等（１１）に記載の
方法で計算すると−８，４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
１末端との間の最も安定な構造の相互作用の自由エネル
ギ（ΔＧ）は、Ｔ Ｉ Ｎ０ＣＣＯ等（１１）に記載の
方法で計算すると−８，４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
この値は多くの大腸菌遺伝子についての計算値の平均（
−９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と同様である。
−９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と同様である。
クローニングとエリスロマイシンエステラーゼの推定サ
イズとの結果は、肛（１部位（第１図）がｅｒｅＡ構造
遺伝子（第２図）中に存在することを示す。
イズとの結果は、肛（１部位（第１図）がｅｒｅＡ構造
遺伝子（第２図）中に存在することを示す。
このことは、翻訳が２４７位置のＡ１’Ｇコドンから開
始され枠中の別のＡ ’ｌ’ Ｇコドンがｊ’、ＳＬ１
部位から下流に位置することによって傍証される。
始され枠中の別のＡ ’ｌ’ Ｇコドンがｊ’、ＳＬ１
部位から下流に位置することによって傍証される。
このＡＴＧコドンから１２７９位置のＴＡＧコドンまで
伸びるヌクレオヂド配列は、アミノ酸組成に換算すると
分子１ｉ３７，７６５をもつ３４４個のアミノ酸のタン
パク質をコードし得る。この値は５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって推定された分子量４３．０
００と一致する。
伸びるヌクレオヂド配列は、アミノ酸組成に換算すると
分子１ｉ３７，７６５をもつ３４４個のアミノ酸のタン
パク質をコードし得る。この値は５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって推定された分子量４３．０
００と一致する。
実施例１に基づいて第１図から第４図に関してより詳細
に以下に説明する 第１図はプラスミドｐＡＴ６３中の１．６６ｋｂ挿入物
の制限マツプを示す。ベクター及び挿入物のセグメント
が、夫々白い部分及び黒い部分で示されている。
に以下に説明する 第１図はプラスミドｐＡＴ６３中の１．６６ｋｂ挿入物
の制限マツプを示す。ベクター及び挿入物のセグメント
が、夫々白い部分及び黒い部分で示されている。
ベクター／挿入物接合の５ａｕ３Ａ制限部位は位置０と
定義される。左側に示されたエンドヌクレアーゼによる
制限開裂で得られたＤＮＡ断片をバクテリオファージＭ
１３に由来のベクター中でクローニングする。矢印は配
列決定反応の方向及び範囲を示す。サイズはｂｐで示さ
れる。
定義される。左側に示されたエンドヌクレアーゼによる
制限開裂で得られたＤＮＡ断片をバクテリオファージＭ
１３に由来のベクター中でクローニングする。矢印は配
列決定反応の方向及び範囲を示す。サイズはｂｐで示さ
れる。
第２図はエリスロマイシンエステラーゼをコードする遺
伝子を含むｔａｇａｂｐの断片のＤＮＡ配列を示す。番
号はプラスミドｐＡＴ６３挿入物の左側の最初のＨｐａ
１１部位から始まる。エリスロマイシンニステラーゼ
をコードする領域は枠で囲まれている。
伝子を含むｔａｇａｂｐの断片のＤＮＡ配列を示す。番
号はプラスミドｐＡＴ６３挿入物の左側の最初のＨｐａ
１１部位から始まる。エリスロマイシンニステラーゼ
をコードする領域は枠で囲まれている。
推定されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＲＢＳ）配
列が太い文字で示されている。
列が太い文字で示されている。
第３図は、プラスミドｐＡＴ６３中の配列決定された１
３８６ｂｐの断片の開始コドン（Ａ ’ｒ Ｇ ）と終
了コドン（ＴＡＡ、 ＴＡＧ、 ＴＧＡ）とを示す。番
号はプラスミドｐＡＴ６３の挿入物の左側の最初の町）
ａ、 １１部位から始まる。
３８６ｂｐの断片の開始コドン（Ａ ’ｒ Ｇ ）と終
了コドン（ＴＡＡ、 ＴＡＧ、 ＴＧＡ）とを示す。番
号はプラスミドｐＡＴ６３の挿入物の左側の最初の町）
ａ、 １１部位から始まる。
両方のＤＮＡ鎖の３つの読取り枠の開始コドン（下向き
の線）と終了コドン（上向きの線）とが示されている。
の線）と終了コドン（上向きの線）とが示されている。
矢印はエリスロマイシンエステラーゼの構造遺伝子を示
す。
す。
第４図はＳＤＳ〜ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分離後にミニセル実験で（３６Ｓ）Ｌ−メヂオニンで
ラベルしたポリペプチドのオートラジオダラムを示す。
る分離後にミニセル実験で（３６Ｓ）Ｌ−メヂオニンで
ラベルしたポリペプチドのオートラジオダラムを示す。
矢印はエリスロマイシンエステラーゼを示す。
本発明のヌクレオヂド配列を含むプローブは公知のいず
れかの方法で、被検サンプル中のエリスロマイシン耐性
因子の有無を検出するためのインビトロ診断テストで使
用され得る。例えば、コロニーハイブリダイゼーソヨン
法の使用が可能である。この方法では、ヒトの便に由来
の細菌から予め得られたＤＮＡの変性後にこのＤＮＡの
部分サンプルを二ｌ・ロセルロース膜に付着させ、通常
条件下で各校とプローブとのハイブリダイゼーションを
行わせ、１ｉｉｊ記条件下で形成されたハイブリッドを
検出する。
れかの方法で、被検サンプル中のエリスロマイシン耐性
因子の有無を検出するためのインビトロ診断テストで使
用され得る。例えば、コロニーハイブリダイゼーソヨン
法の使用が可能である。この方法では、ヒトの便に由来
の細菌から予め得られたＤＮＡの変性後にこのＤＮＡの
部分サンプルを二ｌ・ロセルロース膜に付着させ、通常
条件下で各校とプローブとのハイブリダイゼーションを
行わせ、１ｉｉｊ記条件下で形成されたハイブリッドを
検出する。
またレプリカハイブリダイゼーション法を使用すること
も可能である。この方法は制限酵素によるＤＮＡの処理
後に得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分
離し、アルカリ変性後に適当な膜に移し通常条件下でプ
ローブとのハイブリダイゼーションを行う。ＤＮＡの予
備発現は必ずしも行わなくてもよい。ＤＮＡがプローブ
に接近できる状態にするだけでよい。
も可能である。この方法は制限酵素によるＤＮＡの処理
後に得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分
離し、アルカリ変性後に適当な膜に移し通常条件下でプ
ローブとのハイブリダイゼーションを行う。ＤＮＡの予
備発現は必ずしも行わなくてもよい。ＤＮＡがプローブ
に接近できる状態にするだけでよい。
本発明が上記の実施態様及び実施例に限定されないこと
は上記の記載からも明らかであろう。逆に本発明は、そ
の変形の全てを包含する。
は上記の記載からも明らかであろう。逆に本発明は、そ
の変形の全てを包含する。
参考文献目録を以下に示す。
ｅｒｅＡ遺伝子を含むプラスミドを導入１刀こ大腸菌の
菌株は１９８５年６月５０付で１−４５４としてパリ、
パスツール研究所のｌａ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓＣｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅＭｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＯｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されてい
る。
菌株は１９８５年６月５０付で１−４５４としてパリ、
パスツール研究所のｌａ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌｅ ｄｅｓＣｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅＭｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＯｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されてい
る。
参考文献
（１） Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｔｅｃｈ、 Ｂｕｌｌ、
１ （１９７９） ４３−４４゜（２） Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ １９ （１９８２）
２６９−２７６゜（３） Ｌａｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕ
ｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、 １８２ （１９８１）３９０−４０８゜ （４） Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｏ！ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ Ｈ，Ｙ、、 １９８０゜（
５） Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ、 １９８２．
Ｄ、１４９−１８６゜（６） Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ
ａｌ、、 Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、 ＵＳＡ、 ７４ （１
９７９） ５４６３−５４６７゜（７） ５ｔａｄｅｎ
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ８ （１９８０）
３６７３−３６９４゜（８） Ｂｉｒｂｏｉｍ ｅ
ｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、７
（１９７９） １５１３−１５２３゜（９） Ｓａｎｇ
ｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、 １
６２ （１９８２）、 ７２９−７７３゜（１０） Ｆ
ｉｃｋｅｔｔ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１０ （１９８２） ５３０３−５３１８゜（１１）
Ｔｉｎｏｃｃｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅ
ｗ Ｒｉｏｔ、 ２４６ （１９７３） ４０−４１゜
（１２） Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｔ、、 Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ Ｒｅｖ、 ４０ （１９７６） １６８−１
８９゜
１ （１９７９） ４３−４４゜（２） Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ １９ （１９８２）
２６９−２７６゜（３） Ｌａｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕ
ｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、 １８２ （１９８１）３９０−４０８゜ （４） Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｏ！ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ Ｈ，Ｙ、、 １９８０゜（
５） Ｈａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ、 １９８２．
Ｄ、１４９−１８６゜（６） Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ
ａｌ、、 Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、 ＵＳＡ、 ７４ （１
９７９） ５４６３−５４６７゜（７） ５ｔａｄｅｎ
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ８ （１９８０）
３６７３−３６９４゜（８） Ｂｉｒｂｏｉｍ ｅ
ｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、７
（１９７９） １５１３−１５２３゜（９） Ｓａｎｇ
ｅｒ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、 １
６２ （１９８２）、 ７２９−７７３゜（１０） Ｆ
ｉｃｋｅｔｔ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１０ （１９８２） ５３０３−５３１８゜（１１）
Ｔｉｎｏｃｃｏ ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅ
ｗ Ｒｉｏｔ、 ２４６ （１９７３） ４０−４１゜
（１２） Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｔ、、 Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ Ｒｅｖ、 ４０ （１９７６） １６８−１
８９゜
第１図は別のプラスミドに挿入されｅｒｅＡ−遺伝子を
含むプラスミドｐ１１’１１００に由来の１．６６ｋｂ
の挿入物の制限マツプ、第２図は前記挿入物中に存在す
る核酸配列を示し完全ｅｔｃＡ遺伝子の配列を枠で囲ま
れた部分で示した図、第３図は第１図の１．６６ｋｂの
挿入物の配列決定に使用される方法の説明図、第４図は
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離実験後に得られた［： ”Ｓ）
Ｌ−メチオニンでラベルしたポリペプチド（エリスロマ
イシンエステラーゼを含む）のオートラジオダラムであ
る。 図面の浄さく内容１ ＦＩＧ、１ ：変更なし） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ 菊−−ｍ− ２５，７−−−
含むプラスミドｐ１１’１１００に由来の１．６６ｋｂ
の挿入物の制限マツプ、第２図は前記挿入物中に存在す
る核酸配列を示し完全ｅｔｃＡ遺伝子の配列を枠で囲ま
れた部分で示した図、第３図は第１図の１．６６ｋｂの
挿入物の配列決定に使用される方法の説明図、第４図は
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離実験後に得られた［： ”Ｓ）
Ｌ−メチオニンでラベルしたポリペプチド（エリスロマ
イシンエステラーゼを含む）のオートラジオダラムであ
る。 図面の浄さく内容１ ＦＩＧ、１ ：変更なし） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ 菊−−ｍ− ２５，７−−−
Claims (4)
- （１）ヒトの便の如きサンプル中のエリスロマイシン耐
性因子をインビトロで検出するために、該サンプル中に
存在する核酸と下記の配列をもつｅｒｅＡ遺伝子の少な
くとも一部を含むヌクレオチドプローブとを接触させる
ことを特徴とする方法：【遺伝子配列があります】 - （２）プローブが￥ｅｒｅＡ￥遺伝子の全部又は一部を
含む組換体ＤＮＡであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - （３）プラスミドｐＩＰ１１００から単離された１５０
０個以下の塩基対を含んでおり￥ｅｒｅＡ￥遺伝子自体
の全部又は一部を含むヌクレオチド配列。 - （４）特許請求の範囲第３項に記載のヌクレオチド配列
から成る挿入物によって修飾されていることを特徴とす
る組換体ベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8510454A FR2584419B1 (fr) | 1985-07-08 | 1985-07-08 | Sonde et procede pour la detection de facteurs de resistance a l'erythromycine dans des cultures cellulaires, notamment bacteriennes |
| FR8510454 | 1985-07-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62115299A true JPS62115299A (ja) | 1987-05-26 |
Family
ID=9321091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61160683A Pending JPS62115299A (ja) | 1985-07-08 | 1986-07-08 | 細胞培養物特に細菌培養物中のエリスロマイシン耐性因子を検出するためのプロ−ブ及び方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0209451A1 (ja) |
| JP (1) | JPS62115299A (ja) |
| FR (1) | FR2584419B1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| EP2322667A3 (en) | 1999-09-28 | 2011-10-26 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved gene and its use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes for microorganisms. |
-
1985
- 1985-07-08 FR FR8510454A patent/FR2584419B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-07-08 JP JP61160683A patent/JPS62115299A/ja active Pending
- 1986-07-08 EP EP86401517A patent/EP0209451A1/fr not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2584419A1 (fr) | 1987-01-09 |
| FR2584419B1 (fr) | 1987-11-13 |
| EP0209451A1 (fr) | 1987-01-21 |
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