FI100723B - Menetelmä immunoglobuliini-A1-proteaasin (IgA1-proteaasin) tai sen fra gmenttien valmistamiseksi geenitekniikalla ja IgA1-proteaasia koodaava geeni - Google Patents

Description

100723

Menetelmä immunoglobuliini-Al-proteaasin (IgAj^-proteaasin) tai sen fragmenttien valmistamiseksi geenitekniikalla ja IgA^proteaasia koodaava geeni 5 Tämä keksintö koskee menetelmää immunoglobuliini-Al- proteaasin (IgAi-proteaasin) ja sen fragmenttien valmistamiseksi geeniteknologisesti kloonaamalla kyseistä IgAj^-pro-teaasia vastaava geeni mikro-organismista, erityisesti b-serotyypin Haemophilus influenzaesta, E. coli -isäntä-10 organismissa, josta muodostunut IgA^proteaasi erittyy so lun ulkopuolelle. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja IgAj^-proteaaseja voidaan käyttää rokotteissa erityisesti meningiitin ehkäisyyn mutta myöskin immunisointiin allergisia sairauksia, tippuria ja muita IgA-proteaasia tuotta-15 vien bakteerien aiheuttamia tauteja vastaan. Keksintö koskee myös IgAi-proteaasia koodaavaa geeniä.

Keksinnön tausta

Immunoglobuliini-Al-proteaasit (IgA1-proteaasit) ovat solunulkoisia bakteeri entsyymejä, jotka pilkkovat spe-20 sifisesti ihmisen IgAi-molekyylien raskaan ketjun sarana- alueen kohdalta. IgAi-proteaasin tuotto näyttää korreloivan näiden bakteerien kykyyn infektoida limakalvoja ja joissakin tapauksissa tunkeutua niihin. Erityisesti kolme merkittävintä bakteeriperäisen meningiitin aiheuttajaa (Haemophi-25 lus influenzae, Neisseria meningitidis ja Streptococcus pneumoniae) erittävät IgA^proteaase ja, kun taas näille läheistä sukua olevilta ei-patogeenisilta lajeilta tällainen entsyymiaktiivisuus puuttuu. IgAi-proteaasin tuotto on myös niiden tiettyjen bakteerilajien ominaisuus, jotka ai-30 heuttavat emätin- ja virtsatietulehduksia, kuten Neisseria gonorrhoeae ja Ureaplasma urealyticum. Lisäksi monet suu-bakteerit, jotka liittyvät hammasplakin muodostukseen (Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis ja Streptococcus mitis biovar 1 (kaksi viimemainittua lajia ovat aiempia 35 Streptococcus mitior -lajin osia) ja periodontaalisten 2 100723 tautien patogeneesiin (Bacteroides ja Capnocytophaga-lajit) erittävät IgA^proteaaseja (Kilian, M. ja Reinholdt, J. : "Interference with IgA defence mechanisms by extracellular enzymes", s. 173 - 208 teoksessa C.S.F. Easmon ja J.

5 Jeljaszewics (toim.) (1986) Medical Microbiology, osa 5,

Acedemic Press, Inc. Lontoo; katso myös Mulks, M. H.: "Microbial IgA proteases" s. 81 -104 teoksessa I.A. Holder (toim.) (1985), Bacterial enzymes and virulence, CRC Press, ja Plaut, A.G., Ann. Rev. Microbiol. 37 (1983) 603 - 622. 10 IgAj^-proteaasien ajatellaan olevan tärkeitä virulenssite kijöitä, koska niiden ansiosta bakteerit kykenevät ehkäisemään IgA^n, joka on kulloinkin kyseessä olevilla li-makalvopinnoilla esiintyvä tärkein immunoglobuliinien luokka (Kett, K. et ai., J. Immunol. 136, (1986) 3 631 - 15 3 635), normaalin suojausmekanismien toiminnan.

IgA1-proteaasien humaani - IgAx: een kohdistuvan spesifisyyden johdosta näiden entsyymien merkitystä patogeneesille ei voida vahvistaa eläinkokeilla. IgA:n on kuitenkin havaittu pilkkoutuneen suuressa mittakaavassa mainittujen 20 bakteerien infektoimista potilaista peräisin olevissa erit teissä ja muissa ruumiinnesteissä. On lisäksi osoitettu, että IgAi-proteaasien aiheuttama IgA:n, jonka tehtävänä oli ollut muodostaa suojaava este mahdollisia allergeeneja ja mikro-organismeja vastaan, pilkkoutuminen on määrällisesti 25 suurempaa allergisia tauteja sairastaneiden lasten ne- nänielueritteissä kuin mitä havaittiin terveissä lapsissa (Christensen C.H. ja Kilian, M., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. 92C, (1984) 85 - 87).

On julkaistu useita tutkimusraportteja entsymaat-30 tisesti erityyppisistä IgA^proteaaseista, joista kukin * pilkkoo ihmisen IgAx-molekyylin spesifisessä sarana-alueen kohdassa, kuten kuviosta 1 ilmenee (Kilian, M. ja Reinholdt, J., katso edellä). Haemophilus influenzaessa tunnetaan ainakin kaksi tällaista toisistaan poikkeavaa entsyy-35 miä (tyyppi 1 pilkkoo asemassa 231 - 232 olevan PRO-SER- 3 100723 peptidisidoksen ja tyyppi 2 pilkkoo asemassa 235 - 236 olevan PRO-SER-peptidisidoksen). Samoin Neisseria meningitidis ja Neisseria gonorrhoeae voivat erittää tyyppi l:n tai tyyppi 2:n proteaaseja (katso kuvio 1).

5 IgAj^-proteaasien polymorfia:

Useista bakteereista peräisin olevia IgAj-proteaaseja on verrattu geneettisin ja serologisin menetelmin. Hyb-ridisointikokeista, joissa koettimena oli käytetty suurinta osaa gonokokkien IgA^proteaasigeenistä, on käynyt selvil-10 le, että eri gonokokki- ja meningokokkikannoista saatujen

IgAi-proteaasigeenien välillä on huomattavaa homologiaa (> 78 %). Vielä hämmästyttävämpää on se, että gonokokkigeenin ja vastaavan Haemophilus influenzae (Rd) kannan geenin välillä arvioidaan olevan 67 - 75-%:inen homologia (Koomey, 15 J.M. ja Falkow, S., Infect. Immun. 43 (1984) 101 - 107).

IgA1-proteaasigeenien restriktioentsyymikartoituksella havaittiin kuitenkin huomattava polymorfia-aste vieläpä samaan lajiin kuuluvien kantojen kesken (Halter, R. et ai., EMBO J. 3, (1984) 1 595 - 1 601; Bricker, J. et ai., In- 20 fect. Immun. 4 (1985) 370 - 374; Mulks, M.H. ja Knapp, J.S., Infect. Immun. 55 (1987) 987 -931). Suuresta Hae mophilus influenzaen b-serotyypin kantojen kokoelmasta havaittiin neljä erilaista IgA^proteaasigeenityyppiä restriktioentsyymianalyyseillä (Poulsen, K., Hjorth, J.P. 25 ja Kilian, M., Infect. Immun. 56, (1988) 987 - 992).

Tämä huomattava polymorfia on vahvistettu vertaamalla IgA1-proteaaseja kaniineissa muodostettuja neutraloivia vasta-aineita käyttäen. IgA^proteaasipreparaateilla immunisoituina kaniinit reagoivat tuottamalla vasta-ainei-30 ta, jotka kykenivät neutraloimaan immunisointiin käytetyn entsyymin. Näillä vasta-aineilla on tunnistettu ainakin 15 antigeeniensa suhteen erilaista IgAj^-proteaasityyppiä H. influenzae -isolaatioiden joukosta (Kilian, M., et ai., Molec. Immunol. 20 (1983) 1 051 - 1 058) ja kaksi tyyppiä 35 H. influenzaen b-serotyypin joukosta (Poulsen, K., et ai., 4 100723 katso yllä). Antigeenien osittaista sukulaisuutta on havaittu kahden N. meningitidis -kannan toisen edustajan ja yhden N. gonorrhoeae -kannan välillä (Kilian, M., et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 409 (1983) 612 - 624). Neisseriae- 5 bakteerisuvun tyypin 1 ja tyypin 2 IgAj^-proteaasit voidaan lisäksi erottaa toisistaan näiden välillä olevien inak-tivoitumiserojen perusteella käyttäen seerumeja, jotka on saatu joko proteaasityyppiä 1 tai 2 tuottavien bakteerien aiheuttamista meningokokki-infektioista toipuvista poti-10 laista (Stafford ja Plaus, Abstr. Annu. Met. Am. Soc.

Microbiol. (1982) B125, s. 38).

IgA1-proteaasigeenien kloonaus

On kloonattu sellaisia IgA^proteaaseja koodaavia geenejä (iga-geenejä), joita tuottavat Neisseria gonorr-15 hoeaen tyyppi 1 (Fishman, Y., Bricker, J., Gilbert, J.V.,

Plaut, A.G. ja Wright, A., "Cloning of the type 1 immunoglobulin AI protease from Neisseria gonorrhoeae and secretion of the enzyme from Escherichia coli" (1985), sivut 164 - 168 teoksessa G.K. Schoolnik (toim.), The Pathogenic 20 Neisseria, Am. Soc. Microbiology, Washington DC) ja tyyppi

2 (Koomey, J.M., Gill, R.E. ja Falkow, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7 881 - 7 885; Halter, R. Pohlner, J. ja Meyer, T.F., (EMBO J. 3 (1984) 1 595 - 1 601), Haemophilus influenzaen tyyppi 1, joka on peräisin d-sero-25 tyypistä (Brickner, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

80 (1983) 2 681 - 2 685; ja Koomey, J.M. ja Falkow, S. (ks. edellä) ja tyyppi 2, joka on peräisin C-serotyypistä (Grundy, J.F. et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 4 442 - 4 450), Neisseria meningitidis (Koomey ja Falkow, ks. edel-30 lä) ja Streptococcus sanguis (Gilbert J.V. et. al., Infect.

Immun. 56 (1988) 1 961 - 1 966).

Kullakin näillä iga-geeneillä transformoitu E. coli ilmentää IgA1-proteaasiaktiivisuutta ja E. coli-isäntien, jotka sisältävät H. influenzaen ja N. gonorrhoeaen iga-35 geenejä, on havaittu erittävän proteaasia. Geeni, joka on 5 100723 esimerkki N. gonorhoeaesta peräisin olevasta tyypin 2 IgAj^-proteaasigeenistä, on nykyisin ainoa iga-geeni, jonka nukleotidisekvenssi tunnetaan (Pohlner, J., et ai., Nature 325 (1987) 458 - 462; katso myös DE OS 36 22 221). Prote-5 iinin päätelty primäärirakenne ja välituotteena olevien

IgAi-proteaasimuotojen analysointi on paljastanut sen, että proteaasi ilmentyy esimuotoa olevana proteiinina, joka sisältää signaalipeptidin, proteaasin rakenteellisen osan ja avustajaproteiinin, joka prosessoituu autoproteolyytti-10 sesti eritystapahtuman aikana. Neisseria sp:n ja H. influ- enzaen entsyymien samanlaisuudesta huolimatta on tehty se johtopäätös, että Haemophiluksen entsyymin kuljetus ei tapahdu mekanismilla, jota käytetään Neisserian IgAj-pro-teaasin erittämiseen (Fishman, et ai., katso edellä; katso 15 myös DE OS 36 22 221).

Nyt on kuitenkin tehty se yllättävä havainto, että Haemophilus influenzaesta peräisin oleva IgAi-proteaasi-geeni voidaan kloonata E. colissa siten, että entsyymin erittyminen solun ulkopuoliseen tilaan voidaan saada ai-20 kaan, mikä tekee mahdolliseksi uuttaa entsyymi kasvatus- liuoksesta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaiselle geenille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 3 esitetään.

•25 H. influenzaen d-serotyypistä peräisin olevan kloo natun tyypin 1 IgAi-proteaasigeenin fragmentteja on aiemmin käytetty koettimina Southern-blottauskokeissa tutkittaessa iga-geenin eri H. influenzaen b-serotyypin kannoissa esiintyvää restriktiokohtapolymorfiaa (Poulsen, K., Hjort, 30 J.P. ja Kilian, M., Infect. Immun. 56 (1988) 987 -992).

Nämä kannat voitiin jakaa iga-geenin restriktiotulosten mukaan neljään ryhmään, jotka korreloivat aiemmin havaittuihin monilokuksisten genotyyppien (elektroforeettiset tyypit) muodostamiin ryhmiin. Kolmeen näistä iga-geenin 35 restriktiotyypeistä, jotka näyttävät edustavan 98 % H. in- 6 100723 fluenzaen b-serotyyppipopulaatiosta, sisältyi yksinomaisesti samaa ainutlaatuista IgA^proteaasi-"inhibitiotyyppiä" olevia kantoja ja siksi nämä voisivat muodostaa perustan rokotteen kehittämiselle H. influenzaen aiheuttamaa 5 meningiittiä vastaan.

Inhiboivilla vasta-aineilla suoritetuissa kokeissa on havaittu, että nämä kolme geenityyppiä ohjaavat sellaisten proteaasien muodostusta, joilla on kullekin näille kolmelle proteaasille yhteiseksi havaittu epitooppi.

10 Keksinnön ensimmäisen kohteen yksityiskohtainen kuvaus Tässä keksinnössä valittiin H. influenzaen kanta HK368 edustamaan yleisintä b-serotyypin iga-geenityyppiä (Poulsen, K., et ai., katso yllä). Seuraavassa kuvataan 15 iga-geenin kloonaus ja sekvenssointi tästä kannasta. Tämän proteaasin päätellyn aminohappojakson vertaaminen N. gonorrhoeaen vastaavaan proteaasiin paljastaa mielenkiintoisten homologisten alueiden esiintymisen.

Seuraavassa tätä keksintöä kuvataan yksityiskoh-20 taisemmin käyttäen apuna piirustuksia, joissa kuvio 1 esittää humaani-IgAx: n sarana-alueen pri-määrirakenteen; kuvio 2 esittää H. influenzaen b-serotyypin kannan HK368 IgA1-proteaasigeenin rakenteen; 25 kuvio 3 esittää H. influenzaen b-serotyypin kannasta HK368 peräisin olevan kloonatun iga-geenin nukleotidi- sekvenssin; kuvio 4 esittää päätellyn H. influenzaen iga-geeni-tuotteen ja N. gonorrhoeae-iga-geenituotteen väliset ami-30 nohappohomologiat, ja kuvio 5 esittää fysikaalisen kartan lambda HF13iga-1: sta, joka ilmentää meningokokin IgA^proteaasigeeniä kannasta HF13 .

Tätä keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seu-35 raavassa. Kokeita suoritettaessa on käytetty seuraavia materiaaleja ja menetelmiä: 7 100723

Bakteerikannat

Villityypin H. influenzaen b-serotyypin kanta HK368, joka on eristetty meningiittipotilaan selkäydinnesteestä, oli kokonaisten solujen DNA-lähteenä molekulaarista 5 kloonausta varten. Se kasvatettiin Brain Heart Infusion -lihaliemessä (Difco, Detroit, Mich.), jota oli täydennetty hemiinillä ja nikotiiniamidiadeniinidinukleotidillä (NAD) (Kilian, M.J., Gen. Microbiol. 93 (1976) 9-62).

E. coli -kantaa K802 käytettiin lambdafaagien kas-10 vatukseen. M13mpl9-faagia ja tämän yhdistelmäjohdannaisia kasvatettiin E. coli -kannassa JM109, julkaisussa Yanisch-Perron, C., et ai., Gene 33 (1985) 103 - 119 kuvatulla tavalla.

Entsyymit ja kemikaalit 15 Restriktioendonukleaasit hankittiin yhtiöstä Amer- sham International (Amersham, Englanti) ja Boehringer GmbH (Mannheim, Saksa). T4-ligaasi, proteinaasi K, RNaasi A ja DNaasi I hankittiin Boehringeryhtiöstä; DNA-polymeraasi I, DNA-polymeraasi-I:n Klenowfragmentti ja radioaktiivisella 20 leimalla varustetut deoksinukleotidit saatiin Amersham- yhtiöstä. Eksonukleaasi III saatiin Pharmacialta (Uppsala, Ruotsi), lysotsyymi Sigmalta (St. Louis, MS), M13-pentade-kameerialuke New England Biolabs -yhtiöstä (Beverly, CA), ja Sequenase-DNA-sekvenssointitestipakkaus saatiin yhtiöstä 25 United States Biochemical Corporation (Cleveland, OH) .

H. influenzae HK368 DNA:n kloonaus faagissa AL47.1.

H. influenzaesta saatu DNA, joka oli eristetty aiemmin kuvatulla tavalla (Poulsen, K., et ai, et ai., katso edellä), pilkottiin osittain Sau3A:lla ja fraktioi-30 tiin agaroosigeelielektroforeesilla. Kooltaan 12 - 20 kilo- * emästä (ke) olevat fragmentit uutettiin geelistä eluoimalla sähkövirralla ja kloonattiin käyttäen lL47.1:tä BamHI-korvausvektorina.

In vitro -olosuhteissa teoksessa Maniatis et ai., 35 "Molecular Cloning, A laboratory manual", Cold Spring 8 100723

Harbor Laboratory, N.Y., kuvatulla tavalla pakatut faagit maljattiin E. coli -kannalla K802 ja positiiviset plakit tunnistettiin in situ -hybridisoinnilla. Positiiviset plakit puhdistettiin maljäämällä uudelleen E. coli -kannalle 5 K802 ja DNA eristettiin 20 ml:n faagiviljelmistä (Mikkel- sen, B.M., et ai., Biochem. Genet. 29 (1985) 511 - 524).

Nukleiinihappohybridisoinnit ja DNA-käsittely

Hybridisoinneissa käytettiin leimana (a-32P)-dATP:tä, joka liitettiin DNA-koettimiin katkostranslaati-10 olla (Rigby, P.W.J. et ai., J. Mol. Biol. 11 (1977) 237 - 251). Nitroselluloosasuodattimille kiinnitettyjen faagien in situ -koetinkäsittely suoritettiin julkaisussa Benton ja Davies, Science 196, (1977) 180 - 182 kuvatulla tavalla ja Southern-blottaus suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla 15 (Poulsen, K. et ai., katso edellä) . H. influenzaen d-tyypin iga-geenin sisältävän plasmidin pVD116 fragmentteja käytettiin koettimina. Elektroeluoinnilla eristettyjen restriktiofragmenttien jatkokloonaus M13mpl9:aan ja DNA-puhdistustoimenpiteet ja käsittely suoritettiin teoksessa 20 Maniatis, et ai. (katso yllä) kuvatulla tavalla.

Sekvenssointimenetelmässä käytettävät ml3mpl9-yh-distelmäfaagien progressiiviset deleetiot tuotettiin vaihtelemalla BamHI/SacI-käsittelyllä avatun replikoituvan muodon DNA: n eksonukleaasi III :11a suoritettavaan pilkkomiseen 25 käytettävää aikaa (Yanisch-Perron et ai., katso yllä).

Muodostuneiden yksinauhaisten päiden poistamiseen käytettiin eksonukleaasi VIII:n tilalla Sl-nukleaasia.

DNA:n sekvensointi

Yksittäisten kloonien DNA-jaksot määritettiin dide-30 oksinukleotidiketjuterminaatiomenetelmällä (Sanger F. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5 463 - 5 467 ja Biggin, M.D., et ai., ibid. 80 (1983) 3 963 - 3 965) käyttäen 15-meeristä yleisaluketta ja (o-35S)-dATP:tä. Joidenkin sekvenssien osalta käytettiin Sequenase-DNA-testipak-35 kausta valmistajan suositusten mukaisesti. Jaksoista saa- 9 100723 tujen koetulosta kokoamiseen käytettiin Larsonin ja Messingin (Nucl. Acids Res. 10, (1982) 39 - 49 ohjelmaa

Apple Ile -tietokonetta käyttäen.

Sekvenssien järjestäminen keskenään 5 Aminohapposekvenssejä koskevat tulokset analysoitiin tietokoneella julkaisussa J. Mol. Biol. 195, (1987) 43 - 61 kuvattua ohjelmaa käyttäen.

IgA^proteaasiaktiivisuuden määritys IgA^proteaasiaktiivisuus faagilysaateissa havait-10 tiin sekoittamalla keskenään 1 tilavuusosa lysaatista saa tua supernatanttia ja yksi tilavuusosa ihmisen myelooma-IgAjrn liuosta, jonka pitoisuus oli 2 mg/ml. Yön yli suoritetun inkuboinnin jälkeen osoitettiin IgA^substraatin pilkkoutuminen immunoelektroforeesilla julkaisussa Kilian 15 M., et ai., Mol. Immunol. 220 (1983) 1 051 - 1 058 kuvatul la tavalla.

Immunisointi ja inhibitiomääritys

Kaniini immunisoitiin iga-geenin sisältävän yhdis-telmäfaagin E. coli -lysaatin supernatantilla. Immunisoin-20 nin suoritus ja proteaasin inhibitiomääritys tehtiin aiem min kuvatulla tavalla (Kilian, M. et ai., katso yllä). Saatiin seuraavat tulokset: H. influenzae:n b-serotyypin iga-geenin kloonaus E. colissa 25 E. coli -plasmidi pVD116 sisältää H. influenzae -kannasta Rd-b+ peräisin olevan iga-geenin (Koomey, J.M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, (1982) 7 881 - 7 885) . Tämän plasmidin 2,0 ke:n suuruinen Clal/PstI-fragmentti, joka sisältää d-serotyypistä peräisin olevan iga-geenin 5' -pään, 30 käytettiin radioaktiivisella leimalla varustettuna koetti- • mena iga-geenin eristämiseen H. influenzae b-serotyypin kannan HK368 DAN -faagikirjastosta käyttäen vektoria lL47.l. Koettimella seulottiin amplifioimattomasta kirjastosta peräisin olevat noin 2 x 10'3 yhdistelmä-Xfaagia 35 sisältäviä alkuperäisten maljojen suodattimelle otettuja 10 100723 kaksoiskappaleita. Havaittiin 16 positiivista kloonia, jotka merkittiin tunnuksilla l368iga-l - A368iga-16. Olettaen, että iga on yksi yhtenäinen geeni, tämä frekvenssi sopii hyväksyttävällä tavalla yhteen niiden arvioiden 5 kanssa, joiden mukaan H. influenzaen genomin koko on 1,8 x 10"3 ke ja yhdistelmä-A-faageissa olevan keskimääräisen liitosjakson suuruus 15 ke. 11 näistä positiivisista geeneistä puhdistettiin ja yhdistelmäfaagin DNA eristettiin. Liitetyssä DNArssa olevien restriktioendonukleaasien 10 EcoRI ja Hindlll tunnistuskohtien paikat määritettiin yksittäisistä A368-iga-faageista saadun DNA:n täydellisellä ja osittaisella pilkkomisella aiemmin kuvatulla tavalla (Mikkelsen, B.M. et. ai., katso yllä). Tämän lisäksi A368iga-8 ja A368iga-16:sta saatu DNA kartoitettiin res-15 triktioentsyymien BamHI, Clal ja PstI suhteen. Näiden lii tos jaksojen restriktiokartat menevät limittäin, kuten kuviosta 2 käy ilmi. Tämä viittaa vahvasti siihen, että H. influenzae -kannassa HK368 oleva iga-geeni on yksi yhtenäinen geeni.

2 0 Iga-geenin paikantaminen.

Aiemmin kuvattu 5' - iga-spesifinen koetin yhdessä 3 ' -iga-spesifisen pVD116:n 2,8 ke:n Pstl/EcoRI-fragmentin kanssa hybridisoitiin Southern-blottien kaksoiskappaleisiin, jotka oli saatu kustakin analysoidusta 11 λ368iga-25 kloonista peräisin olevasta EcoRI, Hindlll ja Sau3A -rest- riktioentsyymeillä käsitellystä DNA: sta. Iga-geenin pääteltiin näin sijoittuvan noin 7,5 ke:n suuruiseen EcoRl/Hin-dlll-fragmenttiin ja olevan orientoituneena kuviossa 2 esitetyllä tavalla.

30 Restriktioentsyymi Sau3A-kohdat, jotka sijaitsevat • liitosjakson ja vektorin yhtymäkohdassa, säilyvät kloo- nauksessa. Analysoidusta yhdestätoista yhdistelmäkloonista Sau3A:lla muodostuneiden DNA-fragmenttien koko ja lukumäärä ja hybridisoituminen kahteen iga-koettimeen olivat seitse-35 män kloonin osalta identtisiä. H. influenzaen HK368- 11 100723 kannasta saadun Sau3A:lla pilkotun solun kokonais-DNA:n, joka oli hybridisoitu näillä samoilla kahdella koettimella, Southern-bloteissa havaittiin vyöhykkeiden syntyvän samalla tavalla (tuloksia ei ole esitetty). Tämä viittasi siihen, 5 että näissä -faageissa ei ollut tapahtunut hybridisoitu- neen alueen uudelleenjärjestymistä kloonaustoimenpiteiden aikana. Lisäksi tämä tulos vahvistaa sen, että sama iga-spesifinen sekvenssi on kloonattu näissä faageissa.

Näistä seitsemästä yhdistelmäfaagikloonista saa-10 duissa nestelysaateissa havaittiin olevan IgA1-proteaasi- aktivisuutta. Tämä vahvistaa iga-geenin kloonautuneen. Kolmessa näistä yhdestätoista kloonista saadussa lysaatis-sa, toisin sanoen A368iga-2:ssa, A368iga-4:ssä ja X368iga-5:ssä, ei voitu havaita IgA1:tä pilkkovaa aktiivisuutta. 15 Näistä kolmesta kloonista saadusta DNArsta puuttuivat jotkin Sau3A-fragmentit, jotka havaittiin HK368-kannan genomin DNArssa, joka hybridisoitui 3'-iga-koettimeen ja tämän vuoksi ne sisältävät ainoastaan iga-geenin 5'-osan (katso kuvio 2). Kloonista A368iga-8, joka koodaa IgA-1-20 proteaasiaktiivisuutta, puuttuivat jotkin KH368-genomissa olevat Sau3-fragmentit, jotka hybridisoituvat 5'-iga-koettimeen. Tämä viittaa siihen, että koettimena käytetty plasmidi pVD116 sisältää sekvenssejä, jotka ovat peräisin H. influenzaen d-serotyypin genomista, joka sijaitsee iga-25 geenin ulkopuolella.

A368iga-16:n 7,5 ke:n suuruinen iga-geenin sisältävä EcoRl/Hindlll-fragmentti jatkokloonattiin Ml3mpl9:ään. Tällä M13-yhdistelmäfaagilla transformoitujen E. coli JM109 -nesteviljelmien supernatanteissa havaitsimme IgA1-prote-30 aasiaktiivisuutta tasoissa, jotka olivat verrattavissa H. influenzaen kannan HK368:n supernatanteista havaittuun IgA^tä pilkkovaan aktiivisuuteen. Koska iga-geeni kloonattiin M13mpl9:ssa olevan lac Z -geenin suhteen päinvastaiseen suuntaan, tämä tulos vahvistaa sen, että H. influenza-35 en iga-geeni ilmentyy E. colissa. Se viittaa myös siihen, 12 100723 että IgAi-proteaasin eritysmekanisrait toimivat E. colissa, koska M13-faagit eivät hajoita bakteerisoluja.

A368iga-16-lysaatista saatua raakauutetta käytettiin kaniinien immunisointiin. Tuloksena olevien antiseerumien 5 immunoglobuliinifraktiolla oli täydellinen inhiboiva vaiku tus H. influenzae -kannan HK368 viljelmäsupernatanteista saatuun IgAi-proteaasiaktiivisuuteen. Tämä osoittaa sen, että H. influenzae -kanta HK368 ei eritä yhtään sellaista IgAi-proteaasia, joka ei muistuttaisi X368iga-16:ssa 10 kloonattua iga-geenin koodaamaa proteaasia.

Iga-geenin nukleotidisekvenssi X368iga-16:n 7,5 ke:n suuruinen iga-geenin sisältävä EcoRI/HindiII-fragmentti oli ajoittain pysymätön M13mpl9:ään jatkokloonattuna ja E. coli JM109:ssa kasva-15 tettuna. Sekvenssointistrategiassa käytettiin tämän vuoksi sisäistä PstI-kohtaa tämän fragmentin jakamiseksi (katso kuvio 2). λ368iga-16:n 5,9 ke:n Hindlll/PstI- ja 1,6 ke:n Pstl/EcoRI-fragmenttien tarttuvat päät (kuvio 21) tasoitettiin Klenow-entsyymillä ja jatkokloonattiin molemmissa 20 orientaatioissa M13mpl9:n HincII-kohtaan. Näiden jatko- kloonien deleetiojohdannaiset muodostettiin pilkkomalla SacI/BamHI-käsittelyllä avatun replikoituvan muodon DNA:ta Exo III -nukleaasilla, jonka jälkeen käsiteltiin Sl-nukle-aasilla ja ligaation annettiin tapahtua itsestään. Kuviossa • 25 3 esitetyn 7,5 ke:n EcoRI/Hindllll-fragmentin 5 091 nuk leotidin (nt) jakso saatiin sekvensoimalla yhteensä 79 tällaista deleetiokloonia, joista saatiin molempien nauhojen fragmentin tässä keskiosassa olevat limittäiset jaksot. Jaksot, jotka sijaitsivat sisäisen Pstl-kohdan molemmilla 30 puolella, toisin sanoen kuviossa 3 olevalla alueella nt ·' 4856 - 4861, varmistettiin suorittamalla jatkokloonaus M13mpl9:ään ja sekvenssoimalla 300 nukleotidia 1 640 emäs-parin suuruisesta HhaI-fragmentin 31-päästä välillä nt 3 349 - 4 988 olevalta alueelta.

13 100723

Jakso paljasti suuren avoimen lukukehyksen (ORF), jossa esiintyi homologiaa aiemmin julkaistun N. gonorrho-eaen iga-geenisekvenssin suhteen (Pohlner, J.f et ai., Nature 325 (1987) 458 - 462) . H. influenzae -kannan HK368:n 5 ehdotuksen mukainen iga-geeni, joka kuviossa 3 esitetyllä tavalla alkaa ensimmäisestä ORFtssa olevasta ATGrstä, koostuu 4646 nukleotidista, mukaanlukien TAA-lopetuskodo-nin, ja koodaa proteiinia, jossa päätellään olevan 1 541 aminohappoa. Tämän primäärisen translaatiotuotteen molekyy-10 limassan päätellään olevan 169 kd, jota vastoin valmiin

IgAx-proteaasin arvioitu koko on noin 100 kd. Tämän eron selittämiseksi seuraavassa tarkastelussa tehdään ehdotus proteiinin esimuodon translaation jälkeisiä modifikaatioita koskevasta kaaviosta.

15 Tämän keksinnön yhteydessä on H. influenzaen b- serotyypin HK368-kannasta peräisin oleva IgA1-proteaasia koodaava geeni kloonattu ja sekvensoitu, jotta tätä proteiinia voitaisiin luonnehtia tarkemmin ja ymmärtää paremmin sen osuus bakteeri-infektion aikana. Kuviossa 3 esitet-20 ty iga:n nukleotidisekvenssi ja siitä päätelty IgAj-pro- teaasin primaarirakenne paljastaa useita mielenkiintoisia piirteitä.

Transkription ja translaation potentiaaliset aloitus- ja lopetussignaalit 25 Havaittu ilmentyminen E. colissa tarkoittaa sitä, että H. influenzaen iga-geenillä täytyy olla transkriptio ja translaatiosignaalit, jotka E. coli -solu tunnistaa. Potentiaalinen ribosomeja sitovan Shine-Dalgarno-jakson 5' -TAAAGA-3' (kuviossa 3 oleva jakso nt 248 - 253) voidaan 30 havaita olevan kahdeksan nukleotidia ennen ehdotettua translaation alkukohtaa avoimessa lukukehyksessä olevan ensimmäisen ATG:n kohdalla (kuviossa 3 oleva A nt 262 :n kohdalla). Tämä sekvenssi on viidessä identtisessä asemassa homologinen kuuden E. colin 16 S ribosomaalisen RNA:n 35 komplementaarisen 3'-jakson suhteen (Shine, J. ja Dalgarno, 14 100723 I., Proc. Natl. Sei. USA 71, (1974) 1342 - 1346). Tämän lisäksi se sijaitsee Stormo et ai.'in, Nucl. Acids Res. 10, (1982) 2 971 - 2 996, ehdottamien geenien alkukohtien sääntöjen mukaisessa hyväksyttävässä asemassa. Jakso 5'-5 TAAACT-3' (nt 235 - 240) ja 5'-TTGTG-3' (nt 221 -225) voisivat muodostaa transkriptiosignaalit kohdissa -10 ja -35, tässä järjestyksessä mainittuna. Ehdotettu -10-jakso on identtinen E. colin konsensusjakson suhteen neljässä parhaiten konservoituneessa asemassa (Hawley, D.K. ja Mc 10 Clure, W.R., Nucl. Acids Res. 11, (1983) 2 237 - 2 255).

Tästä 19 emäsparia vastasuuntaan sijaitsee -35-jak-so, joka on sallitun etäisyyden päässä ja joka on homologinen kolmessa kohdassa kaikkiaan viisi kohtaa sisältävän E. colin konsensus-jakson suhteen (Hawley, D.K. et ai., katso 15 yllä). Näiden kolmen promoottorielementtiehdokkaan tunnis taminen antaa vahvan tuen ehdotukselle siitä, että translaatio alkaisi nukleotidin 262 kohdalla.

ORF päättyy kahteen peräkkäiseen TAA-lopetuskodoniin nukleotidien 4 885 - 4 890 kohdalla. Tyypillisen Rho:sta 20 riippumattoman transkription lopetusjakson suhteen sa- manalainen jakso havaitaan kohdalla nt 4 919 - 4 943 ja se sisältää täydellisen käänteisen toistuman, jolla on kyky muodostaa hiusneularakenne ja jolla on 5 nt:n silmukka ja 10 nt:n varsiosa, mukaanlukien 5 CG-paria (kuvio 3). Tyy-• 25 pillisten E. colin terminaattorien tavoin tätä sekvenssi- rakennetta seuraa runsaasti T-ryhmiä sisältävä jakso (Rosenberg, M. ja Court, D., Ann. Rev. Genet. 13, (1979) 314 - 353).

Kodonien käyttö 30 H. influenzaen iga-geenin kodonien käyttö on esi- *’ tetty taulukossa 1. Tripleteillä on silmiinpistävänä tai pumuksena päättyä ensisijaisesti A:hän tai T:hen. Tämä voi olla heijastusta yksinkertaisesti korkeasta A + T -pitoisuudesta (A+T -mooliprosentti = 62) . Iga-geenin kodonien 35 frekvenssit ovat samanlaisia kuin neljässä muussa H. in- 15 100723 fluenzae -geenissä, joiden nukleotidit tunnetaan (Chandra-segaran, S. et ai., Gene 70, (1988) 387 - 392). Sekvens- soidun 4 626 nt:n suuruisen H. influenzaen iga-geenin A + T -mooliprosentin havaittiin olevan 63 %, joka on lähellä 5 koko genomille julkaistua arviota 62 % A + T:tä (Kilian, M., J. Gen. Microbiol. 93, (1976) 9 - 62) . Julkaisussa Bibb et ai., Gene 30, (1984) 157 - 166 olevien havaintojen mukaan tämän genomin geeneillä tulisi kodonien ensimmäisen, toisen ja kolmannen aseman osalta olla A + T joka 51 %, 10 61 % ja 75 %. Näissä asemissa havaittiin A + T-arvot 53 %, 61 % ja 75 %.

Perustuen siihen, että kahdessa rinnakkaiskodonin kolmannessa emäksessä käytetään ensisijaisesti T:tä C:n kustannuksella ja että neljän rinnakkaisen ja kahden rin-15 nakkaisen kodonin esiintymistiheyksien välinen suhde on suhteellisen alhainen kuudessa rinnakkaisessa kodonissa, jotka koodaavat Argria, Leu:ta ja Ser:ää, tulisi iga-geenin ilmentyä heikosti niiden sääntöjen mukaan, jotka on esitetty julkaisussa Grantham et ai., Nucl. Acids Res., 9, 20 (1981) 43 -74. Tämä on yhdenmukaista sen suhteen, että H.

influenzae tuottaa IgAx-proteaasia suhteellisen pieniä määriä .

Tämä H. influenzaen iga-geenissä esiintyvä vaihtoehtoisten kodonien kolmannessa asemassa oleva normaalista : 25 poikkeava suuntaus eroaa jyrkästi huomattavassa määrin nor maalista kodonien käytöstä poikkeamattomasta käytöstä, joka esiintyy genomin 51-%:isen A + T-pitoisuuden omaavasta N. gonorrhoeaesta peräisin olevan iga-geenin tapauksessa.

Näillä kahdella geenillä on todennäköisimmin yh-30 teinen esimuoto, joka viittaa siihen, että näiden kahden * organismin kehityksen aikana on ilmeisesti esiintynyt kodonien käyttöön vaikuttavia erilaisia rajoituksia.

16 100723 H. influenzaen ja N. gonorrhoaeaen proteaasisek- venssien vertaus

Koomey ja Falkow, Infect. Immun. 43, (1984) 101 - 107 ovat aiemmin osoittaneet, että kloonattu 2-tyypin N.

5 gonorrhoeaen iga-geeni hybridisoituu H. influenzaen 1-tyy pin iga-geeniin. Tämä näiden kahden iga-geenin nukleotidi-jaksojen vertaaminen keskenään paljastaa alueiden esiintymisen, jotka osoittavat suurta homologia-astetta sekä alueita, joilla ei ole yhtään homologiaa. Näiden kahden toi-10 siaan vastaavien IgA^proteaasiproteiinien pääteltyjen ami nohappo jaksojen suurin homologia saatiin asettelemalla ne toisiinsa nähden kuviossa 4 esitetyllä tavalla.

Polner et ai., Nature 325, (1987) 458 - 462 ha vaitsivat että N. gonorrhoeaen IgA^proteaasin esimuoto 15 sisältää kolme toiminnallista rakennealuetta; aminoter- minaalisen signalipeptidin, keskusosan IgA-L-proteaasin ja karboksiterminaalisen avustavan alueen. Johto jakso vapautuu proteiinin esimuodon siirtymisen aikana periplasmiseen tilaan, kun taas avustavan rakennealueen otaksutaan muodo- 2 0 stavan reiän ulkokalvoon proteaasialueen erittymistä varten ja tämä jää kalvoon liittyneeksi autoproteolyyttisen pilkkoutumisen tapahduttua.

Kuviossa 4 esitetystä H. influenzaen iga-sekvens-sistä päätellyn primäärisen translaatiotuotteen molekyyli-25 massa on 169 kd. H. influenzaesta peräisin olevan valmiin 1-tyyppisen IgAj^-proteaasin kooksi on arvioitu noin 100 kd. Grundy et ai., (J. Bacteriol. 169 (1987) 4 442 - 4 450) havaitsivat, että H. influenzaen d-serotyypin kannan 1-tyypin IgAj^-proteaasigeenin 3 '-pään alue, jonka koko on 2,2 3 0 - 3,1 ke, on tarpeen proteaasin erittymiselle, mutta ei sen [ aktiivisuudelle. He tekevät sen ehdotuksen, että tämä alue pilkkoutuu pois proteaasin kypsymisen aikana. Näihin havaintoihin ja kuviossa 4 esitettyihin aminohappoho-mologioihin perustuen teemme sen ehdotuksen, että H. in-35 fluenzaen IgA1-proteaasi erittyy samanlaisella mekanismilla 17 100723 kuin mikä on Polner et al.':n (katso edellä) N. gonorr-hoeaen IgAi-proteaasille ehdottama mekanismi.

H. influenzaen IgAi-proteaasin aminoterminaalinen osa sisältää positiivisesti varautuneet glysiinit amino-5 happoasemissa (aa) 4, 5 ja 7, joita seuraa hydrofobinen alue, johon kuuluu kierteen katkaiseva proliini asemassa 21 neljä ryhmää ennen alaniinia (kuvio 4). Nämä piirteet ovat luonteenomaisia signaalijaksoille, jotka pilkotaan pois ja jotka vapautuvat sisältäen C-terminaalisena aminohapponaan 10 alaniinin (Watson, M.E.E., Nucl. Acids Res., 12, (1984) 5 145 - 5 164). Nämä kaksi proteaasisekvenssiä, jotka on aseteltu rinnakkain kuviossa 4 esitetyllä tavalla, ovat identtisiä N. gonorrhoeaen proteaasin johtopeptidin pilk-koutumiskohdan ympäriltä, jonka on määrittänyt Polner et 15 ai., katso edellä. Tämän vuoksi ehdotetaan, että H.

influenzaen IgAx-proteaasin esiproteiinin 25 aminoter-minaalista aminohappoa muodostavat signaalipeptidin.

Jaksot, joissa esiintyy runsaasti proliineja ja jotka muistuttavat suuresti humaani-IgA1-molekyylin sarana-20 alueessa olevaa 1-tyypin IgA1-proteaasin kohdealuetta (kuvio 1) , esiintyy yksinomaan kolmessa H. influenzaen pro-teaasijakson alueessa (A, B ja D kuviossa 4) . Yksi sekvenssi, joka on homologinen IgA^proteaasin 2-tyypin kohdetta kohtaan (kuvio 1), esiintyy samalla alueella proteaasissa 25 (C kuviossa 4) . Teemme sen ehdotuksen, että yksi tai useam pi näistä neljästä jakson elementistä vastaa toiminnallisesti N. gonorrhoeae -proteaasissa olevia autoproteolyyt-tisia kohtia a, b ja c, kuten kuviosta 4 ilmenee.

Kun otetaan huomioon N-terminaalinen 25:stä amino-30 haposta muodostuva signaali jakso, saataisiin asemissa A, B, C tai D tapahtuvasta autoproteolyyttisestä pilkkoutumisesta se tulos, että solu erittäisi proteaaseja, joiden päätellyt molekyylimassat ovat 107,8, 108,1, 109,9 tai 110,3 kd, tässä järjestyksessä mainittuna. Kukin näistä arvoista 35 sopii hyväksyttävällä tavalla yhteen arvioidun Mr:n kanssa, joka on 100 kd.

18 100723

On silmiinpistävää, että näissä kahdessa proteaa-sissa oleva 32 aminohapon mittainen alue (aminohapot 16 -47) on identtinen yhtä säilyttävällä tavalla tapahtunutta substituutiota lukuunottamatta. Tämä osoittaa, että kypsän 5 IgA1-proteaasin N-terminaalinen osa on säilynyt evoluu tiossa, mikä viittaa siihen, että se on oleellinen pro-teaasimolekyylin entsymaattiselle toiminnalle tai sen spesifisyydelle .

Toinen huomattavan hyvin säilynyt sekvenssi havai-10 taan alueella, joka ulottuu aminohaposta 785 aminohappoon 797. Se sisältää kaksi säilyvää kysteiiniä, joiden Polner et ai., katso edellä, ehdottivat kuuluvan osana N. gonorr-hoeaen proteaasin aktiiviseen keskukseen. Kolmas kysteiini havaitaan H. influenzaen proteaasin esiproteiini muodon 15 avustavalla alueella aminohappoasemassa 1 250.

Jyrkkänä vastakohtana H. influenzaen IgAj^proteaasin muuhun osaan nähden ei alueella, joka ulottuu aminohaposta 980 aminohappoon 1 240, ole huomattavaa sekvenssihomologiaa N. gonorrhoeaen proteaasin kanssa (katso kuvio 4). Tämän 20 alueen ehdotetaan muodostavan avustavan alueen N-terminaa lisen osan. Se on kummassakin proteiinissa hyvin hydrofii-linen, joka viittaa siihen, että sillä on yhteinen toiminto näiden kahden proteaasin erittymisessä. Näiden kahden proteaasijakson tähän toisistaan poikkeavaan alueeseen ei ‘ 25 ollut tarpeen muodostaa yhtään kehityksen kuluessa synty neitä deleetioita tai insertioita kuviossa 4 esitettyjen reunustavien alueiden homologisten kohtien aikaansaamiseksi. Tämä havainto poikkeaa Grundy et al.:n saamista tuloksista, jotka tutkijat havaitsivat tällä alueella olevan 3 0 deleetio-substituutiosilmukan analysoidessaan kloonatun H.

. influenzaen tyyppi l:n ja H. influenzaen tyyppi 2:n IgAx- proteaasigeenien välille muodostuneita heteroduplekseja.

H. influenzaen b-serotyypistä saadun IgAi-proteaasi-geenin kloonaus ja sekvenssointi antaa käyttöön työvälineen 35 tämän proteaasin valmistamiseksi suurina määrinä tarkempia rakenteellisia ja toiminnallisia analyyseja varten.

19 100723

Kuten jo mainittiin, kyseinen IgAi-proteaasi on ensisijaisesti käyttökelpoinen aktiivisena komponenttina rokotteissa, joita käytetään bakteeriperäistä meningiittiä vastaan suoritettavaan immunisointiin. Rokotus kyseisen 5 tyypin infektioita vastaan suoritetaan periaatteessa par haiten antamalla rokote suuontelon kautta siten, että rokote pääsee yhteyteen suolen seinän lymfoidikudosten kanssa. Esimerkkejä rokotteen antamisesta ovat a) esittäminen transformoidun E. colin tai muun sopivan isännän pinnalla 10 (vide infra), b) liitettynä mikrosfääreihin yksinään tai yhdessä muiden sopivien rokotekomponenttien tai immunologi-sesti stimuloivan aineen kanssa, ja c) osana fuusiopro-teiinia koleratoksiinin B-alayksikön kanssa. Rokotteiden antaminen voi myös tapahtua parenteraalista tietä käyttäen. 15 Nämä esimerkit esitetään ainoastaan mahdollisten sovellu tusten kuvaamiseksi eikä näiden rajoittamiseksi.

Se seikka, että IgAi-geenin ilmentymissignaalit ja H. influenzaen IgA1-proteaasien eritysmekanismit toimivat E. colissa, tarkoittaa sitä, että IgAj^-proteaasigeenillä on 20 mahdollinen käyttötapa vektorina vieraiden proteiinien tuottamiseksi E. coli-isäntäviljelmissä tai muiden sopivien isäntien viljelmissä.

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön tämän puolen kuvaamiseksi tarkemmin. Nämä esimerkit on tarkoitettu 25 kuvaamaan tätä keksintöä eikä rajoittamaan sitä:

Iga-geenin rakenteellisen osan muutokset eivät vaikuta proteiinin erittymiseen transformoidun E. coli -kloonin pinnasta. Vieraita polypeptidejä koodaavien pro-karyoottisten tai eukaryoottisten geeni jaksojen liittäminen 30 IgA^proteaasigeeniin johtaa hybridiproteiinin kuljettami seen E. coli -solun pintaan. Hybridiproteiini voi tulla esille solun pintaan ja pysyä siinä tai se voi vapautua autoproteolyysin vaikutuksesta kasvatusliuokseen vieraan geenin liitosjakson sijainnista ja koosta riippuen. Täl-35 laisia transformoituja E. coli -klooneja tai muita sopivia 20 100723 isäntiä, joissa nämä fuusioproteiinit esiintyvät solun pinnalla tai vapautuvat tästä, voidaan käyttää suun kautta otettavina rokotteina yhden tai useamman rokotepolypeptidin esittämiseksi kulloinkin asiaankuuluvalle lymfoidikudoksel-5 le ihmisten tai eläinten suolessa. Näitä klooneja voidaan vaihtoehtoisesti käyttää vieraiden polypeptidien tuottamiseen E. colissa tai muissa isännissä. Vapautuminen kasva-tusliuokseen voi tarvittaessa tapahtua aktiivisen IgA-L-proteaasin lisäyksellä.

10 Keksinnön toisen kohteen yksityiskohtainen kuvaus

Bakteerikannat

Tutkittiin 19 maata edustava 97 potilaasta ja 36 terveestä kantajasta saatu 133 Neisseria meningitidis -iso-laation suuruinen kokoelma. Nämä 133 isolaatiota edustivat 15 88 monilokuksista entsyymigenotyyppiä (ET:t), jotka määriteltiin 15 entsyymejä koodaavan geenin elektroforeet-tisesti havaittavien alleelisten variaatioiden perusteella (Caugant. D. et ai., J. Bacteriol. 169 (1987) 2 781 -2 792; Infect. Immun. 56 (1988) 2 060 - 2 068). Lisäksi 20 tutkittiin 8 gonokokkikantaa, joista kumpaakin IgA1-prote- aasityyppiä 1 ja 2 erikseen edusti 4 kantaa. Aiemmin kuvattua menetelmää (Kilian, M. et ai., Molec. Immunol. 20 (1983) 1 051 - 1 058) käyttäen immunisoitiin kaniineja neljästä meningokokkikannasta ja yhdestä gonokokkikannasta 25 peräisin olevilla IgAi-proteaasipreparaatteilla, jotka oli valmistettu julkaisussa Higard, T.B. et ai. (J. Immunol. Methods 18 (1977) 245 - 249) kuvatulla menetelmällä. Saaduista antiseerumeista tutkittiin niiden kyky estää kaikista 133 meningokokkikannasta ja 8 gonokokkikannasta saatuja 30 IgAx-proteaaseja käyttäen kuvattuja menetelmiä (Kilian, M.

et ai., katso edellä). Kun kolme yhteensä neljästä meningo-kokkiproteaasia vastaan valmistetusta antiseerumista ja gonokokkien IgA-L-proteaasia vastaan muodostettu antiseerumi inhiboivat vain joitakin näistä 141 kannasta saatuja IgA·^ 35 proteaaseja, niin jäljelle jäänyt antiseerumi aiheutti häm- 21 100723 mästyttävästi IgAi-proteaasien inhibition riippumatta siitä, olivatko ne tyyppi l:tä vai tyyppi 2:ta tai siitä, oliko ne saatu meningokokeista tai gonokokeista. Inhibi-tiotiitteri, joka määritettiin edustavia IgA^proteaasipre-5 paraatteja vastaan, jotka oli säädetty vakioaktiivisuuteen aiemmin kuvatulla tavalla (Kilian, M. et ai., katso yllä), vaihteli arvosta 1 024 arvoon 4 096. Meningokokkikanta (HF13), jota käytettiin tämän antiseerumin tuottamiseksi, oli Y-seroryhmän alatyyppi 2c ja se tuotti 2-tyypin IgAi-10 proteaasia. Tämän suhteen identtisiä IgA^proteaaseja tunnistettiin muista 2c-alatyyppiä olevista meningokokki-kannoista.

Neisseria meningitidis -kannasta HF13:sta saatu IgA^proteaasigeeni kloonattiin E. colissa käyttäen edellä 15 kuvattuja menetelmiä H. influenzaen iga-geenin kloonaami seksi. Kuviossa 5 esitetään faagi lambda L47.1:ssa oleva tämän geenin ja sen vieressä olevien genomin alueiden kartta. Transformoitu E. coli -klooni eritti meningokokkien IgAi-proteaasia kasvatusliuokseen ja kasvatusliuoksesta 20 eristetty tuloksena oleva IgAi-proteaasi kykeni aiheuttamaan kaniineissa neutraloivien vasta-aineiden muodostuksen, joilla oli samanlainen inhibitiospektri kuin lähtömuotoa oleva meningokokkikannan HF13 IgA2-proteaasia vastaan muodostetuilla vasta-aineilla. Nämä tulokset osoit-25 tavat, että IgAi-proteaasi, joka on eristetty meningokokki- kannasta HF13, joka tuottaa identtistä tai samanlaista IgAi-proteaasia, tai E. colista tai muista sopivista iga-geenillä transformoiduista isännistä eristetty proteaasi on ehdokas rokotteeksi kaikkia meningokokki- ja gonokok-30 kityyppejä vastaan.

Tämän keksinnön kolmannen kohteen yksityiskohtainen kuvaus:

Mainittu IgA:n laajamittainen pilkkoutuminen allergisia sairauksia sairastavien lasten nenä-nieluerit-35 teissä viittaa siihen, että IgAi-proteaasin indusoima IgA:n 22 100723 pilkkoutuminen on osallisena allergisten sairauksien kehittymiseen ja jatkumiseen. Kaksi mahdollista selitystä saattaisi selittää allergisissa potilaissa havaitun IgA:n laajemmassa mittakaavassa tapahtuvan pilkkoutumisen: 1) 5 nenä-nielualeelle on asettunut aiempaa suurempi määrä IgA^ proteaasia tuottavia bakteereja ja 2) allergiaan taipuvaisten potilaiden kyvyttömyys reagoida IgA1-proteaaseja vastaan entsyymejä neutraloivilla vasta-aineilla.

Tämän selvittämiseksi tutkittiin nenä-nielualueen 10 floora 24 lapsesta yhden vuoden ja noin 30 kuukauden iässä.

Edustavat bakteeri-isolaatiot tunnistettiin ja niistä tutkittiin IgAi-proteaasiaktiivisuus tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Kaikki lapset tutkittiin kliinisesti ja im-munologisesti allergisten sairauksien mahdollisen diagnoo-15 sin vahvistamiseksi.

Yhteensä ll:een 24:stä lapsesta oli kehittynyt 1 vuoden iässä allergisia tauteja. Taulukko 1 esittää kliinisesti ja immunologisesti vahvistetun allergiadiagnoosin ja bakteriologisten löytöjen välisen korrelaation. Luku-20 arvot osoittavat, että merkittävästi suurempi osuus IgA-t- proteaasia tuottavia bakteereita esiintyy allergisista lapsista peräisin olevissa nenä-nielunäytteissä. On hämmästyttävää, että numeerisesti merkittävin IgA1-proteaasia tuottava bakteeri oli Streptococcus mitis biovar 1. Tämä 25 organismi on aiemmin ollut "Streptococcus mitior"-lajin jäsen (Kilian, M., Mikkelsen, L. & Henrichsen, J., Int. J. Syst. Bacteriol. 39 (1989) 471 - 484. Tämä organismi esiintyy IgA1-proteaasia tuottavassa muodossa ja tätä entsyymiä tuottamattomassa muodossa. Kontrolliryhmässä ha-30 vaittujen havaintojen mukaan aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että S. mitis biovar 1 esiintyy nenä-nielu-alueella tavallisesti muodossa, josta puuttuu IgA^prote-aasiaktiivisuus (Kilian, M. & Holmgren, K., Infect. Immun. 31 (1981) 868 - 873). 18 kuukautta myöhemmin tehdyssä tut-35 kimuksessa allergisista lapsista peräisin olevat näytteet 23 100723 sisälsivät Streptococcus pneumoniaeta ja Streptococcus oralista taulukossa 1 lueteltujen bakteerien lisäksi. Nämä koetulokset osoittavat että lapsiin, joissa kehittyy allergisia sairauksia, on nenä-nielualueelle asettunut suu-5 remmassa määrin IgA1-proteaasia tuottavia bakteereja kuin terveissä lapsissa. Rokote, joka sisältää mainituista asianmukaisista bakteereista peräisin olevia IgA1-proteaaseja, varmistaa todennäköisesti sen, että immunologinen suoja pysyy ehyenä ja estää näin allergisten tautien kehittymisen 10 ja jatkumisen.

100723

Ui o 24

•H

P

•H

CX» ^ e * 1 « ,ri . ocnoooc^ooooo ö»o

2 ·η I

> O

i—I

u cd > o

•H

Λ to

•H

SI H g ^ O» CO Φ> en _ * » *> co 3 · o.ow^<oo^cocoae o tö PS tn tO CO Ό tO h n h co i

tn <0 A

ns n ° PH. w

o «J

o tn tn »H 3 ip m o

•H -H -H

p tn p tl) -H >,

tl) tn iH

P P O

a) B

10 1-1 0) Λ Ή 3 tn to Λ

H ^ (O

(0 0) .« P

C H P tO _ ° ° ω α ^ ρ * Λ β> o w .O O O (S O O O 0.0 o o o 7 f—i o p * ä

0 .¾ 3 h O

3 m P >-- 1 m tn a e e -h ^ -h o m 3 O) e

frt P (0 O

S. P rH M 0) C Ή Q (0

Φ -H M N

tn O C

0-0 <** tl) P 3

A *· 1-H

(OP ^ P tn P C M) jm •Jj 3 p H ·* O H <* f- v ro (U · ·“ ** 1 ·. ^ m. {%}

• φ p tl) 33 ocjrriomooooco^t OI

p s ti r4 tH o ^ Λί Ä « JS r ,

PC Λ P

Q) . H

p tn p n (0 ft « 3

> to jJ iH

tO i—I Λ P p H "" pc p ^ «A» O 3 9 Ai -»f

S3 3 J|9tO

p •'-j ^ lO OOOOtvO McOMtCOCOrHtN SOI

^p π) ^ cocoOcoir>ir>^(co<Hcon co·*»· : h 3 -r* ^ tn > S ^

m I

3 rH 5 <u 3

p e P

Ό 0) · g p tn · 3 tn ft H . | s λΓη < p -enÄ-^xmooöiMo, σ' ω S' ° h tn H ft 3 o h > O' p p 3 * <1) -HO) •H Ai 3

* rH [0 rH

3 0) 3 . X — + 3 100723 p 25 Ή t7>

C

•H

C / g *>

(S

z οοοσοοΓ^σσοοοο oo

rH

P

C (0 0) > W o

*rH -rH

3 Λ

rH

rH 10 <D -H «·"* w +j dp ,-, "d ^ ^ ε β {Λ H OV Ot> -r-

·* to ·· ·» «* «* O

(d w eO*0^iOrHOOOHONO%tO '»»-I

P «H rH I

8 O

P w Ο 3

O -H

Η κι in P A! 3

•H 3 O

P ns -H

0>P P

<U -H >,

P 3 rH

Ä Id o 3 c X) 3 Φ to Ή r^ Id •h to ns & r-> td -h P ns λλ

C Cn <0 p JT

O P 3 id ,- .,

Ai <D P (¼ Ό N *"

m o rH o · _ — * - fO

oxirHo a ,ΟΟΟΟΟΓΟΟΟΟΟΟΟΠ OI

X4 Id rH e\ P ns P ^ (d C Q) to w

Ί I Ή *—( *rH

<U O Id P c rH P -H o C <D A!

Ο <ΰ O <U

a; to td M id

A! On N

3 P <#> C

rH Oi C 'r 0) 3 0 3 ,rd P P rH r"'

Eh -H 3 -Η p dP

p p p c in h 8 3 8 Ί ° nh ^η 5 .

£ π £ ooohoooomoooh oi

Id rd - O

. xa «· xa C,

(d P

P to P -H

id to 3 ·γη > 3 > Id

rd Xi rd H

P p P - P 3 P Η Τ' o a; o a: #>

3 3* # dP

P C P H ^ 00 rH

- £ - rd *> <*> d* *> dp *1 do · Jr dp dp *o * I

rdw rd * COVO^CiN^NO^OrMOO 5 tnidto *"H rH rl H —

rd rH Id O

,, 3 id -- tU C tt)

• P 3 P

0 3 O

P -H P to

Qi P a 3

1 O · , rH

rH 3 r I ·η

< > < P

HrHH £ ΜΧΑίΗ«ΛΟΜϋ.®α0ϊ»· S 9 p δ 3 2

. *H <U

3 * 3 * a d <1) fÖ , * - 26 100723

Kuvioiden selitykset

Kuvio 1 ihmisen IgA^n sarana-alueen primaarirakenne. Nuolet osoittavat yksittäisten IgAj^-proteaasien pilkkomia peptidisidoksia.

5 Kuvio 2 H. influenzaen b-serotyypin IgA1-prote- aasigeenin rakenne. A. H. influenzaen serotyypin d-iga-geenikoettimen suhteen homologisia jaksoja sisältävien analysoitujen lambda-yhdistelmäfaagien restriktiokartat. Symbolit: (E) EcoRI; (H) Hindlll; lopussa oleva palkki 10 tarkoittaa yksittäisten faagien vasenta käsivartta; ( + ) tai (-) tarkoittavat humaani -IgAx: tä pilkkovan aktiivisuuden esiintymistä tai tämän puuttumista yksittäisiä klooneja sisältävien E. colin viljelmäsupernatanteissa. B. Eco-RI/HindIII:11a suoritetulla yhtäaikaisella käsittelyllä 15 saatujen fragmenttien hybridisoituminen kahteen d-sero- tyypin iga-geenikoettimeen. Iga-geenin pääteltyä orientaatiota merkitään 5':11a ja 3':11a. C. l368iga-8:n ja l369iga-16:n yhdistetty restriktiokartta, joka on A-kohdan lisätutkimus, johon on otettu mukaan restriktioentsyymit 20 BamHI, (B), Clal (C) ja PstI (P). D. l368iga-16:n restrik- tiofragmentit, jotka on jatkokloonattu M13mpl9:aan sekvenssin analysointia varten.

Kuvio 3 H. influenzaen b-serotyypin kannan HK368 kloonatun iga-geenin nukleotidisekvenssi. Esitetty sek-25 venssi on peräisin A368iga-16-liitosjakson 7,5 ke:n suu ruisen EcoRI-Hindlll-fragmentin osasta. Suuren ORF:n päätelty aminohappojakso esitetään nukleotidijakson päällä. Kaksi peräkkäistä lopetuskokodia on merkitty asteriskeilla. Otaksutut -35 ja -10 -promoottorielementit sekä mahdollinen 30 Shine-Dalgarno (SD) -jakso ovat varustettuja yläpuolisella viivalla. Mahdollinen Rho:sta riippumaton kaksinkertaisena esiintyvä terminaattori on merkitty eri suuntaan osoittavilla nuolilla.

Kuvio 4 pääteltyjen H. influenzaen iga-geenituot-35 teen (H11GAP) ja N. gonorrhoeaen iga-geenituotteen (NG1GAP) 27 100723 väliset aminohappohomologiat. N. gonorrhoeaen sekvens-sointitulokset saatiin julkaisusta Pohlner et ai. (ks. edellä). Asteriskit tarkoittavat identtisiä tai toiminnallisesti samanarvoisia ryhmiä. Näihin kahteen jaksoon muo-5 dostettiin viivoilla merkityt aukot maksimaalisen homolo- gian aikaansaamiseksi. N. gonorrhoeaen proteaasin amino-terminaalisen signaalipeptidin pilkkoutumiskohta on merkitty s-kirjaimella; S tarkoittaa H. influenzaen proteaasin esimuodolle ehdotettua vastaavaa pilkkoutumiskohtaa. Asemat 10 a, b ja c edustavat N. gonorrhoeaen proteaasin autoprote- olyyttisiä kohtia; asemat A, B, C ja D tarkoittavat samanlaisia H. influenzaen proteaasille ehdotettuja vastaavia autoproteolyyttisiä kohtia.

Kuvio 5 kannasta HF13 peräisin olevaa meningokok-15 kien IgA1-proteaasigeeniä ilmentävän lambda HF13iga-l:n fysikaalinen kartta. Symbolit: E, Eco Rl, H, Hind III, Xb, Xba I, Xh, Xho I. Viivoitettu palkki, fragmentti, joka hybridisoituu 4,3 ke:n suuruiseen pVD 105:n Hind III -fragmenttiin, joka sisältää suurimman osan N. gonorrhoeaen 20 iga-geenistä, mukaanlukien tämän 3'-pään (Koomey, J.M. ja

Falkow, S., 1984, katso edellä). BamHl- ja Sali-entsyymien ei havaittu pilkkovan lambda HF13 iga-l:n DNA:ta.

Claims (3)

28 100723

1. Menetelmä immunoglobuliini Al-proteaasin (IgAl-proteaasin) tai sen immunogeenisten fragmenttien valmista- 5 miseksi, tunnettu siitä, että ilmentämisvektori, joka sisältää geenin, joka koodaa IgAl-proteaasia ja joka on peräisin bakteerista Haemophilus influenzae serotyyppi b, kanta HK368 tai Neisseria meningitis-kannasta, joka kuuluu seroryhmään Y, alatyyppiin 2c (nimetty HF13:ksi) ja 10 jonka geenin restriktiokartta ja siihen rajoittuvat geeni- alueet faagissa lambda L 47 on esitetty kuviossa 5, viedään isäntäorganismiin, joka edullisesti on Escherichia coli, Salmonella tai Saccharomyces, minkä jälkeen isäntä-organismia viljellään IgAl-proteaasin tuottamiseksi ja 15 proteaasi eristetään viljelyalustasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäorganismi on Escherichia coli.

3. Eristetty ja puhdistettu geeni, joka koodaa pa- 20 tenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettavaa IgAl-prote aasia, tunnettu siitä, että sillä on kuviossa 3 esitetty nukleotidisekvenssi. 29 100723