JPS6193199A - 抗インタ−フエロン−γモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１孟久五亙分１ 本発明は、インターフェロン−Ｔのｉ！！や定量に有用
な抗インターフェロン−Ｔモノクローナル抗体に関する
。

従来の技術 ヒトリンパ球から得られるインターフェロン−γあるい
は組換えＤＮＡ技術により得られる非グリコシル化イン
ターフェロン−Ｔでマウスを免疫し、得られる肺細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られるハイブリド
ーマを用いて抗インターフェロン−Ｔモノクローナル抗
体を製造することは公知である。（Ｎａｔｕｒｅ、虱２
５Ｂ　（１９８２）。

ＥＭＢＯＪ、、２．１５２７　（１９８３）、　Ｊ、　
８ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　　２５９（７）、　４３０
１　（１９８４）、　Ｊ、　ｌ＋ｎｎ＋ｕｎｏｌ、、皿
（３）、　１３００発明が解決しようとする問題点 組換えＤＮＡ技術の発達により、ヒトインターフエロン
ーＴを微生物たとえば大腸菌により製造し大量に供給す
ることが可能となった。組換えＤＮＡ技術により製造し
た非グリコシル化インターフェロン−Ｔの確実な評価ふ
よび薬剤としての開発のために、優れた精製手段および
簡便で高精度の定量法が求められている。

非グリコシル化インターフェロン−Ｔに対するモノクロ
ーナル抗体を用いることによって該インターフェロン−
Ｔを精製、定量できることは知られている。しかしイン
ターフェロン−γは起源によって、アミノ酸組成が異な
る種々のものが存在し、既知のモノクローナル抗体を新
規に見出された他のインターフェロン−Ｔに応用するこ
とは困難である。

問題点を解ゞするための手段 本発明者は、第１表で示される非グリコシル化インター
フェロン−γについて精製、定量などに使えるモノクロ
ーナル抗体を得るべく研究した。

その結果、第１表で示される非グリコシル化インターフ
ェロン−Ｔでマウスを免疫して得られる牌細胞とマウス
の骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させて１辱られるハ
イブリドーマが、該非グリコシル化インターフェロン−
ｒに対して反応するモノクローナル抗体を生成し、該モ
ノクローナル抗体はそのｔＩ！ｉ製、定量に使用するこ
とができることを見出し本発明を完成した。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のモノクローナル抗体の製造は次のとおりに行う
。

（１）　　免疫化動物細胞の調製 マウス、ラットなどを第１表で示される非グリコシル化
インクーフェロンーγで免疫して、その動物から牌細胞
を調製する。

該非グリコシル化インターフェロン−Ｔは、特願昭５８
−４２０４２に記載の方法で製造したものを使用する。

免疫の方法は、８〜１０週令のマウスの皮下あるいは、
静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジユバント〔例えば
、７０インドの完全アジユバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　
Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ＾ｄｊｕｖａｎｔ　）あるいは、水酸
化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに
該非グリコシル化インターフェロン−Ｔ５Ｘ１０ゝ〜１
０’１０／匹を投与する。以後１〜２週問おきに、該非
グリコシル化インターフェロン−Ｔを２〜１０回投与す
る。

各免疫後１週間で、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗
インターフェロン−Ｔ抗体価を以下に示す固相法による
酵素免疫測定法で調べる。

抗体価の測定法は、固相酵素免疫測定法く酵累免疫測定
法：医学書院刊１９７８年）によった。

９６穴のＥＩＡ用プレー）　［Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ社（米）製］に、特異抗原〔非グリコシル化イ
ンターフェロン−Ｔが１０６１ｕ／ｌＴｌ１となるよう
に、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）／フォスフェート
バッファー・セイライン（ＰＢＳ）（リン酸２ナトリウ
ム１．８３ｇ、　　リン酸１カリウム０．２１ｇ、食塩
７．６５　ｇ　、蒸留水１！。

ｐ　Ｈ７，２）で希釈した溶液、交差反応をみる場合に
は、非グリコシル化インターフェロン−Ｔのかわりに他
の抗原あるいはＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いる〕を１００
μｍ／穴づつ分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレー
ト穴底面にコートさせ、その後１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液
２００μｍ／穴を分注し、４℃で一晩放置して、プレー
ト底面上の蛋白質結合性残基をＢＳＡでコートする。上
記プレートをレジン水でよく洗浄後、第１抗体として、
段階希釈した試料（マウス血清、ハイプリドーマ培養上
清、粗精製モノクローナル抗体）を１００μｍ／穴分注
し、４℃で一晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ−Ｎａ
Ｃｊ！溶液で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギの
抗マウスイムノグロブリンＦ（ａｂ’Ｌａ　−ウレアー
ゼ結合物（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒ１ｅｓオーストラリア（Ｃ３Ｌ）社製
、代理店アルタケミカル〕の１００倍希釈液を１００μ
ｌ／穴分注し、室温で２時間放置する。レジン水で洗浄
後、ウレアーゼ基質液（Ｃ３Ｌ社製１代理店アルタケミ
カル）１００μｍ／穴を分注し、室温で１０〜３０分放
置後、１％メルチオレート２０μｌを加え反応を停止す
る。６００ｎｍで比色定量し、抗体価を算出する。非グ
リコシル化インターフェロン−Ｔに対する抗体価が、正
常マウス血清の１０’倍以上（６００ｎｍでのＯＤ値）
になったマウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。

細胞融合に供するために、免疫マウスに融合処理の３〜
４日前に、非グリコシル化インターフ、Ｃｌ７−ｒを５
　Ｘ　１０’　〜１０’　１０／匹腹腔内に投与し、追
加免疫後、膵臓を摘出し、牌細胞を調製する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨′Ｍ腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を
使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂ
ＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３　　Ａｇ３
−１１１　（Ｐ３−１１１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｔｏｐ
ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ　　８１１？　（１９７８）　〕、　
　Ｐ　３−ＮＳ　Ｉ／ｌ−Ａｇ４．１　　（ＮＳ−１ン
　　〔εｕｒｏｐｅａｎ　　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６５１１−５１９　（１９７６）
　〕、　Ｓ　Ｐ　２１０−Ａｇ　１４　（ＳＰ−２）　
　（Ｎａｔｕｒｅ　２７６、２６９−２７０　　（１９
７８）　　）　、　　Ｐ　３−Ｘ　６３−Ａｇ３．６５
３（６５３）　　（Ｊ、　　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＹ　　
１２３．　１５４８−１５５０（１９７９＞）、Ｐ、３
−Ｘ６３−Ａｇ３　　（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ　２５
６．４９５−４９７　（１９７５）　）などが用いられ
る。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地ＣＲＰＭ
ｒ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭン、２−メ
ルカプトエタノールＸ　１　０−５Ｍ）　、ジェンクマ
イシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）
（１０％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニ
ン（１５μｇ　／ｍｌ　）を加えた培地〕で、継代する
が、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当
日２Ｘ１０’以上の細胞数を確保する。

（３）細胞融合 （１）テ免疫Ｌり７ウスｌ，：５　Ｘ　１　０’　〜１
　０’　ｌｔｌ／匹の非グリコシル化インターフェロン
−Ｔを復腔内投与し、３〜４日後にＩＩＩｌｌｍｌを摘
出し、牌細胞を調製する。この牌細胞と（２）で得られ
る骨髄腫細胞をＭＥＭ培地（日水製薬社！りまたはＰＢ
Ｓでよく洗浄し、細胞数が、胛細胞二骨髄腫細胞＝５〜
ｌＯ：１になるように混合し、遠心分離にかける。上清
を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌しなが
らポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１０００〜４００
０）１〜４ｇ，ＭＥＭ培地１〜４ｍ１，ジメチルスルホ
キノド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）　０．
　５　〜１．　０　ｍｌの混液０．　１−１．０ｍｌ／
　１　０’牌細胞を加え、０．５〜１０分後にＭＥＭ培
地０．５〜３ｍｌを加える。その後０，５〜２分毎にＭ
ＥＭ培地０．５〜３ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を
３０〜６０ｍ１加える。

遠心後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地５０〜２　０　０ｆｆｌｌを加え、メスピペット
でゆるかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養用プレー
トに半容量／穴づつ分注し、３〜７％ＣＯ２インキユベ
ータ−中、３５〜４０℃で１０〜３０時間培養する。培
養プレートに半容量／穴のＨＡＴ培地〔正常培地にヒポ
キサンチン（１０−’〜１０−’Ｍ）、チミジン（１０
−’〜１０−’Ｍ）およびアミノプテリン（１０−”〜
１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに１０〜３０
時間培養する。以後１〜３日間日間１０註同量のＨＡＴ
培地を加え、ＣＯ１インキニベーター中、３５〜４０℃
で１０〜１４日間培養すコロニー状に生育してきた融合
細胞の認められる穴について、上浦半容量を捨て、ＨＴ
培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）を
同量加え、以後１〜３日間日間１０註３０ＨＴ培地で３
〜４日培養後、培養上清の一部をとり上記の酵素免疫測
定法により、抗インターフェロン−Ｔ抗体価を測定する
。

抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗インターフェロン−Ｔモノクローナル抗
体産生ノ飄イブリドーマ株として選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製 ブリスタン処理した８〜１０週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
に（３）で得られた抗インターフ・エロンーＴモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０’個／
匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは
腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心して
固形分を除去後、５０％硫安，４０％硫安塩析をし、Ｐ
ＢＳ（１）Ｈ７．２）で１〜２日間透析する。この透析
画分を粗精製モノクローナル抗体とじて精製、定量用に
供することができる。

さらに精製が必要な場合には、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム、プロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔
し、ＩｇＧ画分を集める。

モノクローナル抗体の抗ウィルス活性の中和活性は、２
　０　０〜５　０　０１０／ｍｌのイア　９　−　７　
ｚロンとモノクローナル抗体とを３７℃で３０分間イン
キニベートした後、ＰＬ−Ｓｉｎｄｂｉｓ　Ｖｉｒｕｓ
を用いる定量系で、インターフェロンの残存活性を求め
る方法で測定する。

抗体のインタイブ、サブクラスの決定は、Ｏｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ法（免疫学実験人間、生物化学実験法１５，
学会出版センター刊、ｐ７４．　１９８１年）によって
行う。

蛋白質の定量は、フォーリン法右よび２８０ｎｍでの吸
光度［１．４　ＣＯＤ２ａｏ　）−イムノグロブリン１
ｍｇ／ｍｌ）より算出する。

かくして、ＫＭ−４８と命名したハイプリドーマ株から
得られるモノクローナル抗体ＫＭ−４８は、ＩｇＣｚ　
に属することを同定した。

ＫＭ−４８の抗原特異性、インターフェロン中和活性は
実施例１の（５）、（６）に示すとおりである。

本発明のモノクローナル抗体を用いる非グリコンル化イ
ンターフェロン−Ｔの精製方法・を示せば次のとおりで
ある。

本発明のモノクローナル抗体１０ｍｇをＰＢ５１〜１０
ｍ１にとかしＣＮＢｒ活性化セファロース−４Ｂ　（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）などの担体１ｍｌと反応させ、固定化モノクローナル
・抗体を得る。この固定化モノクローナル抗体をカラム
に充填後、これに非グリコシル化インターフェロン−γ
（５Ｘ１０’　　１０以下）を含む溶液を通塔する。こ
の操作で９５〜１００％の非グリコシル化インターフェ
ロン−γがカラムに吸着される。溶媒、たとえば、７Ｍ
尿素とＩＭ　　ＮａＣｆとを含む溶液（ｐＨ７，０＞で
溶出すると、吸着量の約８０％の非グリコシル化インタ
ーフェロン−Ｔが溶出する。−回の通塔により約５．０
００倍の精製が可能である。これに対して、熱等により
失活させた非グリコシル化インターフェロン−Ｔは全く
、本抗体カラムに吸着されない。

本発明のモノクローナル抗体は面相サンドウィッチ法に
よる酵素免疫測定法などにより非グリコシル化インター
フェロン−ｒを定量するために使用できる。

−Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｄｅ　［ｕｎｉｖｅｒｓａｌ］
　　算ｉ　　Ａ実施例１゜ （１）免疫マウス牌細胞の調製 ８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（静岡県実験動物農業協
同組合）Ｉ（１匹にアジュバントとして水酸化アルミニ
ウムゲル２ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン（千葉
県血清研究所）ＩＸＩＯ’細胞／匹と抗原として第１表
の非グリコシル化インターフｚ０７−ｒ６．５ｘｌ　Ｏ
’　ＩＩ／匹ｔ−腹腔的投与し免疫した。

以後、２運問おきに、該非グリコシル化インターフ、ｏ
ンーＴ６．５Ｘ１０’ｌＵ／匹を腹腔内に投与し、２回
目以降の免疫をかけた。３回目の免疫ｐｉ降、免疫の５
〜７日後に眼底節ＫＭより採血し、血清中の抗インター
フェロン−Ｔ抗体価を前記の固相法による酵素免疫測定
法で調べた。

３回免疫以降１０匹全例で抗体価が認められたが、Ｉｇ
Ｇクラスのモノクローナル抗体を効率よ＜１尋るために
、さらに４回、つごう７回の免疫を行った。

７回目の免疫後、非グリコシル化インターフェロン−７
６，５Ｘ１０’ｌＵ／匹を腹腔的投与して追加免疫し、
３日後このマウスから肺細胞を調製して細胞融合に用い
た。

（２）　　マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｌを正
常培地ＣＲＰＭＩ−１６４０にグルタミン１．５ｍＭ、
２−メルカプトエタノール５Ｘ４０−５Ｍ、ジェンタマ
イシンｌＯμｇ　／ｍｌおよび牛胎児血清０．　ｌ　ｍ
ｌ　／ｍｌを加えた培地〕に培養し、４日後に２ＸｌＯ
’以上の細胞を辱だ。

（３）ハイブリドーマの作製 ＭＥＭ　（田水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス牌
細胞Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ＠個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−０１
　２Ｘ１０’個を混合し、１．２０　Ｏｒｐｍで５分間
遠心分離にかけた。

沈殿として得られた肺細胞とＰ３−Ｌｌｌの混合した細
胞群をよくほぐした後、攪拌しながら３７℃、ポリエチ
レングリコール−１，０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ
、ＭＥＭ２ｍｌおよびＤＭＳＯ０，７ｍｌの混液０．５
ｍｌを加え、１分後にＭＥＭｌｍｌを加えた。その後Ｍ
　Ｅ　Ｍ　ｌ、　ｍｌを１分毎に５回加えた後、ＭＥＭ
を全容量が５０ｍ１となるように加え乳。９００ｒｐｍ
で遠心分離後、上？身を捨て、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地ｔ　ｏ　Ｑｍｌを加え、ｌ　９ｍｌメス
ピペットでゆるやかに細胞を懸濁した。

懸濁液を２４穴培養用プレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ社（米）製〕に１ｍ１／穴づつ分注し、５％
Ｃ○２インキコベークー中、３７℃で２４時間培養した
。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地〔上記正常培
地にヒポキサンチン１０−’Ｍ、チミジン１．５　Ｘ　
１０−５Ｍおよびアミノプテリン４Ｘ１０−’Ｍを加え
た培地〕を加え、さらに２４時間培養した。培養上清１
ｍｌを捨て、あらたにＨＡＴ培地培地１奢ｌえ、３７℃
でさらに２４時間培養した。培養上清１ｍｌを揄で、Ｈ
ＡＴ培地培地１奢ｌえ、３７℃でさらにｌＯ〜１４日間
培養した。

コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上ｆｉ１ｍｌを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨＡＴ培地よ
りアミノプテリンを除いた培地〕を１ｍｌ加えて３７℃
で培養した。以後２日間同様にＨＴ培地への交換を行い
、培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、抗イン
ターフェロン−Ｔ抗体価を上記の固相酵素免疫測定法に
より測定した。

抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰返し、安定して抗体価の認められた
クローンを抗インターフェロン−ｒモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株としてＫＭ−４８を選択した。

（４）モノクローナル抗体の部分精製 ブリスクン処理Ｃ２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈ
ｙｌ−ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ　）　　０．５ｍｌ　／
匹を腹腔内投与し、２週間飼育する。〕した８週令ＢＡ
ＬＢ／ｃ雌マウスに上記で辱られたハイプリドーマ株各
４×１０６細胞／匹を復腔内注射した。１０〜２１日後
にハイプリドーマ株は腹水癌化する。１０〜２１日後に
腹水のたまったマウスから腹水（４〜１０ｍ１）を採取
し、遠心分離して固形分を除去した。上清を５０％硫安
塩析、４０％硫安塩析し、ｐＢＳ（ｐＨ７，２＞で、２
日間透析した。これを粗精製モノクローナル抗体とした
。

（５）粗精製モノクローナル抗体の抗原特異性固相酵素
免疫測定法により、粗ｖＩｔＡモノクローナル抗体の抗
原特異性を測定した。抗原としては第１表の非グリコシ
ル化インターフェロン−ｙ　（ＨＩＦＮ−７）組換えＤ
ＮＡ技術非グリコシル化インターフェロン−β（ＨＩＦ
Ｎ−β）。

ナマルバ由来ヒトインターフェロン−α（ＨＩＦＮ−α
）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。結果を
第２表にしめす。

第　　　　２　　　　表 ＩＩＩＦＮ−ｒ 免疫マウス血清　Ｘｌ０−”　　０．５３８　０．０１
０　０．０４３　０．０１０（６）粗精製モノクローナ
ル抗体のインターフェロン中和活性 上記中和活性測定法により、粗精製モノクローナル抗体
のＨＩＦＮ−ｒおよびＨＩＦＮ−α中和活性を測定した
。

結果を第３表に示す。

第　　　　３　　　　表 正常マウス血清　　　　０．０　　　　０・ＯＩＦＮ−
ｒ 免疫マウス血清　　　　９５．０　　　　２Ｊ第２表、
第３表に示したごとく、本発明で得られる抗インターフ
ェロン−Ｔモノクローナル抗体は、第１表の非−グリコ
シル化インターフェロン−Ｔに特異的な結合能および中
和活性を有している。このことからＫＭ−４８のモノク
ローナル抗体は、第１表の非グリコシル化インターフェ
ロン−Ｔに特異的なモノクローナル抗体であるといえる
。

（７）モノクローナル抗体の０頚 ０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学
実験法１５．学会出版センター刊　ｐ７５　１９８１年
）でＫＭ−４８の抗体のインタイブを調べたところ、抗
体がＩｇＧクラスに属するモノクローナル抗体であり、
さらにＫＭ−４８はＩｇＧＩ　クラスの抗体であると同
定された。

実施例２゜ 実施例１で得られた抗インターフェロン−Ｔモノクロー
ナル抗体ＫＭ−４８の１０ｍｇ／ＰＢＳをＣＮＢｒ活性
化セファ０−ス４　Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製＞　１ｍｌと反応させ、固定化
モノクローナル抗体を（尋た。この固定化モノクローナ
ル抗体をカラムに充填し、そのカラムに２ＸｌＯ’ＩＵ
の非グリコシル化インターフェロン−Ｔを含んだ培養抽
出物５ｍｌを通塔したところ、２．０７　Ｘ１０″　Ｉ
Ｕ（９６，８％）の非グリコシル化インターフェロン−
γがカラムに吸着した。

次にＰＢＳで洗浄後７Ｍ尿素とＩＭ　　ＮａＣ１とを含
む溶液で溶出したところ、１．６６　Ｘ　１０６■（吸
着量の５０％）の非グリコシル化イタンーフェロンーＴ
が溶出した。この−回の通塔により、非グリコシル化イ
ンターフェロン−Ｔが約５．０００倍精製された。

一方熱等により失活させた非グリコシル化インターフェ
ロン−Ｔは、全く本抗体カラムに吸着しなかった。

上記方法により溶出した非グリコシル化インターフェロ
ン−γは、２０倍容のＰＢＳ中に一気に希釈することに
より、抗ウィルス活性のある分子として、回収できた。

実施例３、 第１表の非グリコシル化インターフェロン−γをウサギ
に免疫して得た、抗非グリコシル化インターフェロン−
Ｔウサギ抗血清を、第１抗体として、１００μｇ　／ｍ
ｌの濃度で９６穴ＥＩＡ用プレート（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ社（米）製〕に１０１］μｌ／穴づつ分
注した。４℃で２４時間放置し、プレートの穴の底面に
第１抗体をコートした。ついで、プレート穴の底面の蛋
白結合基の残りを覆うため、１％牛血清アルブミン／Ｐ
ＢＳを２００μ！／穴づつ分注し、４℃で２４時間放置
した。レジン水でよく洗浄後、０．１〜５００１０／ｎ
＋ｌの非グリコンＵ　　ル化インターフェロン〜Ｔを１
００μ２／穴づつ分注し、室温に２時間放置した。

レジン水でよ（洗浄後、第２抗体として西洋ワサビペル
オキシグーゼを結合させたＫＭ−４８モノクロ一ナル抗
体１００μｇ／ｍｌの１００μｆ／穴分注し、室温にて
２時間放置した。レジン水を用いてよく洗浄後、基質液
〔０−フェニレンジアミン４０ｍｇ、　リン酸・クエン
酸緩衝液（ｐＨ５，１）１０　（１ｍｌ、３０％Ｈｏｏ
ｔ　４０ｍＤを１５０μＡづつ各穴に加え、室温で３０
分間放置し、酵素反応を行わせた。２ＭＨ２ＳＯ，５０
μβ　を加えて反応を停止させた。

比色計にてプレートの４９２μｍでの吸光度を測定した
。その結果、第１図に示すとおり、非グリコシル化イン
ターフェロン−ｒの含有量と４９２μｍの吸光度は直線
的な比例関係がある。

従って、本発明のモノクローナル抗体は、固相サンドウ
ィッチ法による酵素免疫測定法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）によ
る非グリコシル化インターフェロン−γの定量に使用す
ることができる。熱等により、失活させた非グリコシル
化インターフェロン−ｒを抗原として同様の系でＥＬ　
Ｉ　ＳＡを行ったが、全く反応しなかった。

発明の効果 本発明のモノクローナル抗体を用いて、第１表に示した
非グリコシル化インターフェロン−Ｔを効率よく精製し
、高感度、簡便、迅速に定量することができる。

【図面の簡単な説明】

第１ｒｇ：ｉは非グリコシル化インターフェロン−γの
含有量と４９２μｍの吸光度の関係を示す。 ′１ｆＪ１　　　図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１表で示される非グリコシル化インターフェロ
   ン−γに対する抗インターフェロン−γモノクローナル
   抗体。
2. （２）第１表で示される非グリコシル化インターフェロ
   ン−γでマウスを免疫して得られる脾細胞とマウスの骨
   髄腫細胞とを通常の方法で融合させ、得られるハイブリ
   ドーマを培地に培養するか、またはマウスの腹腔内に移
   植して腹水癌化することにより、培養液中または腹水中
   に抗インターフェロン−γモノクローナル抗体を生成蓄
   積させ、該培養液または腹水から該モノクローナル抗体
   を採取することを特徴とする抗インターフェロン−γモ
   ノクローナル抗体の製造法。
3. （３）特許請求の範囲第１項記載の抗インターフェロン
   −γモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマ
   トグラフィーにより、非グリコシル化インターフェロン
   −γ含有物質から該非グリコシル化インターフェロン−
   γを単離することを特徴とする非グリコシル化インター
   フェロン−γの精製法。
4. （４）特許請求の範囲第１項記載の抗インターフェロン
   −γモノクローナル抗体を用い、固相サンドウィッチ法
   による酵素免疫測定法により、非グリコシル化インター
   フェロン−γを定量する方法。