JPS6167489A - 枯草菌の固定化細胞、固定化方法及び７‐β‐アシルアミドセフアロスポラン酸からの３‐アセトキシ基の脱離に対する生成物の使用 - Google Patents
枯草菌の固定化細胞、固定化方法及び７‐β‐アシルアミドセフアロスポラン酸からの３‐アセトキシ基の脱離に対する生成物の使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は枯草菌（３ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
）の固定化細胞、その製造方法及び可逆的に保護された
７−β−アシルアミドセファロスポラン酸からの７−β
−アシルアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エム
−４−カルボン酸の製造に対する固定化製品の使用に関
するものである。
）の固定化細胞、その製造方法及び可逆的に保護された
７−β−アシルアミドセファロスポラン酸からの７−β
−アシルアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エム
−４−カルボン酸の製造に対する固定化製品の使用に関
するものである。
７−アミノセファロスポラン酸からの３−アセトキシ基
の化学的脱離は不可能であるが、たとえば枯草菌細胞か
ら単離した酵素アレチルエステラーゼは、可溶性の形態
及び固定化形態の両方で、脱離のために使用されること
は公知である。
の化学的脱離は不可能であるが、たとえば枯草菌細胞か
ら単離した酵素アレチルエステラーゼは、可溶性の形態
及び固定化形態の両方で、脱離のために使用されること
は公知である。
しかしながら、開示されているすべての方法は、以下の
欠点を有し、それが工業的規模におけるそれらの使用を
限定する。
欠点を有し、それが工業的規模におけるそれらの使用を
限定する。
（１）酵素アセチルエステラーゼは著るしく濃縮しであ
る場合にのみ適度な酵素活性を有している。
る場合にのみ適度な酵素活性を有している。
（２）不純な酵素製品の活性は蛋白分解的劣化により急
速に低下する。
速に低下する。
（３）可溶性酵素は一回しか使用することができず、且
つある種の環境においては、生成物を汚染する。
つある種の環境においては、生成物を汚染する。
（４）限外一過において゛固定化″酵素は、不活性化の
ために、迅速にその活性を失なう。
ために、迅速にその活性を失なう。
（５）たとえばベントナイトのような、酵素担体として
用いられる材料は単に酵素の物理的吸着を許すのみであ
り、それが恒常的な使用において、酵素担体からの酵素
活性の連続的な低下をみちびく。
用いられる材料は単に酵素の物理的吸着を許すのみであ
り、それが恒常的な使用において、酵素担体からの酵素
活性の連続的な低下をみちびく。
（６）たとえば、粉末状棟瓦、粉末状酸化ジルコニウム
のような低多孔度の担体へ及びガラス粒子へのｅ素の共
有結合は、担体当りの低い酵素活性の生体触媒をみちび
く。
のような低多孔度の担体へ及びガラス粒子へのｅ素の共
有結合は、担体当りの低い酵素活性の生体触媒をみちび
く。
かくして、大きな苦労なしに製造することができ且つ工
業的な使用に対して特に適する、７−β−フルジアミド
−３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エム−４−カルボ
ン酸の製造のための、活性で且つ安定な生物触媒に対す
る要望が存在していた。
業的な使用に対して特に適する、７−β−フルジアミド
−３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エム−４−カルボ
ン酸の製造のための、活性で且つ安定な生物触媒に対す
る要望が存在していた。
かくして本発明は固定化枯草菌細胞から成る生物触媒に
関するものである。
関するものである。
公知の固定化方法の中で、グルコースイソメラーゼに対
して、米国特許第４．２１２．９４３号に記されてる、
下記のプロセス原理が、枯草菌細胞の酵素活性を維持し
ながら物理的に安定な生体触媒を製造するために、もつ
とも有利であることが確かめられた： １、ケブラコタンニン及び／又はベッツ（３ｅｔＺ）１
１８０−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン
／１−クロロ−２，３−エポキシプロパン共重合体（米
国特許第３．９１５゜９０４号及び米国特許第３．９５
３．３３０号）の形態にある、高度に陽イオン性の、液
状高分子凝集剤−の添加による細菌細胞の凝集又は析出
。
して、米国特許第４．２１２．９４３号に記されてる、
下記のプロセス原理が、枯草菌細胞の酵素活性を維持し
ながら物理的に安定な生体触媒を製造するために、もつ
とも有利であることが確かめられた： １、ケブラコタンニン及び／又はベッツ（３ｅｔＺ）１
１８０−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン
／１−クロロ−２，３−エポキシプロパン共重合体（米
国特許第３．９１５゜９０４号及び米国特許第３．９５
３．３３０号）の形態にある、高度に陽イオン性の、液
状高分子凝集剤−の添加による細菌細胞の凝集又は析出
。
２、ポリエチレンイミン及びグルタルアルデヒドを使用
する細菌ポリマーの架橋及び硬化。
する細菌ポリマーの架橋及び硬化。
３、細菌ポリマーの乾燥及び磨砕。
本発明は、細胞の沈殿及び固定化のために、沈殿剤のタ
ンニン及びベッツ１１８０並びに架橋剤のポリエチレン
イミン及びグルタルアルデヒドを、特定の量比で、枯草
菌細胞懸濁物（醗酵培養液）、細菌性ポリマー、に添加
し、それを灰色のスポンジ状沈殿として分離させ、溶液
から吸引と共に一過し、循環空気オーブン中で４０℃に
おいて乾燥し、かくして取得した固体褐色組成物を歯付
きの円盤磨砕機中で種々の粒度に磨砕することを特徴と
する、固定化枯草菌細胞の製造方法に関するものである
。
ンニン及びベッツ１１８０並びに架橋剤のポリエチレン
イミン及びグルタルアルデヒドを、特定の量比で、枯草
菌細胞懸濁物（醗酵培養液）、細菌性ポリマー、に添加
し、それを灰色のスポンジ状沈殿として分離させ、溶液
から吸引と共に一過し、循環空気オーブン中で４０℃に
おいて乾燥し、かくして取得した固体褐色組成物を歯付
きの円盤磨砕機中で種々の粒度に磨砕することを特徴と
する、固定化枯草菌細胞の製造方法に関するものである
。
分析の結果、驚くべきことに、何回も使用することがで
きる安定で且つ酵素的に活性な生体触媒を調製するため
には、下記の量の範囲内に保つことが重要であるという
ことが示された：低ポリエチレンイミン含量（４重量％
溶液の容量で〈０．５％）の４重量％タンニン溶液（＜
２容量％）という低い容量割合、同じくベッツ／グルタ
ルアルデヒドの低い容量割合（６重量％のベッツと２．
２容量％のグルタルアルデヒド溶液から成る混合物容量
でく５．５％）を用いて得た生体触媒の触媒活性は、僅
か２回の使用後に、酵素活性化、ｌ！ｌＩ菌細胞および
基質損耗並びに生成物の分解のために、急激且つ不可逆
的に低下する。
きる安定で且つ酵素的に活性な生体触媒を調製するため
には、下記の量の範囲内に保つことが重要であるという
ことが示された：低ポリエチレンイミン含量（４重量％
溶液の容量で〈０．５％）の４重量％タンニン溶液（＜
２容量％）という低い容量割合、同じくベッツ／グルタ
ルアルデヒドの低い容量割合（６重量％のベッツと２．
２容量％のグルタルアルデヒド溶液から成る混合物容量
でく５．５％）を用いて得た生体触媒の触媒活性は、僅
か２回の使用後に、酵素活性化、ｌ！ｌＩ菌細胞および
基質損耗並びに生成物の分解のために、急激且つ不可逆
的に低下する。
それに対して、２〜８容量％タンニン溶液（４重量％の
タンニン溶液）、０．５〜５容量％のポリエチレンイミ
ン溶液（４重量％のポリエチレンイミン溶液）及び２．
０〜５．５容量％のベッツ／グルタルアルデヒド溶液（
６重量％のベッツと２．２容量％のグルタルアルデヒド
溶液）という容量割合によって、安定な生体触媒が得ら
れる。
タンニン溶液）、０．５〜５容量％のポリエチレンイミ
ン溶液（４重量％のポリエチレンイミン溶液）及び２．
０〜５．５容量％のベッツ／グルタルアルデヒド溶液（
６重量％のベッツと２．２容量％のグルタルアルデヒド
溶液）という容量割合によって、安定な生体触媒が得ら
れる。
生体触媒の活性と有用な寿命のためには、ベッツ／グル
タルアルデヒド溶液の割合は＾いことが必須である。
タルアルデヒド溶液の割合は＾いことが必須である。
また本発明は、保護基の脱離後に、新しい半合成セファ
ロスポリンを与えるために用いることができる可逆的に
保護された７−β−アシルアミド−３−ヒドロキシメチ
ルセフ−３−エム−４−力ルボン酸の製造に対する、本
発明に従かう方法によって製造した生体触媒の使用に関
するものである。
ロスポリンを与えるために用いることができる可逆的に
保護された７−β−アシルアミド−３−ヒドロキシメチ
ルセフ−３−エム−４−力ルボン酸の製造に対する、本
発明に従かう方法によって製造した生体触媒の使用に関
するものである。
調製した生体触媒に対する適当な基質は、たとえば、フ
ェニルアセトアミド−３−アセトキシメチル−はツー３
−ニムー４−カルボン酸、７−β−［Ｎ＝−ｔ−ブトキ
シカルボニル −フェニルグリシン−アミド−３−アセトキシメチル−
セフ−３−エム−４−カルボン酸及び３−アセトキシ基
を有するその他の可逆的に保護されたセファロスポラン
酸のような、文献によって公知の化合物である。
ェニルアセトアミド−３−アセトキシメチル−はツー３
−ニムー４−カルボン酸、７−β−［Ｎ＝−ｔ−ブトキ
シカルボニル −フェニルグリシン−アミド−３−アセトキシメチル−
セフ−３−エム−４−カルボン酸及び３−アセトキシ基
を有するその他の可逆的に保護されたセファロスポラン
酸のような、文献によって公知の化合物である。
後者は生体触媒を用いて、バッチ方式又は連続的に、反
応を誘起することができる。基質に対して言及すること
ができる好適な濃度範囲は重量で１〜２０％であり、好
適ｐＨ範囲は６〜８であり、且つ好適温度範囲は２０〜
４０℃である。
応を誘起することができる。基質に対して言及すること
ができる好適な濃度範囲は重量で１〜２０％であり、好
適ｐＨ範囲は６〜８であり、且つ好適温度範囲は２０〜
４０℃である。
驚くべきことに、生体触媒を数回使用する場合に、７−
β−アシルアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エ
ム−４−カルボン酸の収率は、一定値達するまで増大し
た。はとんど同一量の枯草菌ＡＴＣＣ６６３３の細菌懸
濁液〈７５〜９０容吊％）を用いる場合ですら、本発明
に従って調製した生成触媒は、反応成分の量の異なる比
率を用いて調製した生体触媒の３倍に至るまでの活性を
有していることが見出されたことも驚くべきことである
。
β−アシルアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エ
ム−４−カルボン酸の収率は、一定値達するまで増大し
た。はとんど同一量の枯草菌ＡＴＣＣ６６３３の細菌懸
濁液〈７５〜９０容吊％）を用いる場合ですら、本発明
に従って調製した生成触媒は、反応成分の量の異なる比
率を用いて調製した生体触媒の３倍に至るまでの活性を
有していることが見出されたことも驚くべきことである
。
本発明による生体触媒は、生成物の大きな損失をさける
ためには、１０〜２０倍の容量の水又はｐＨ６〜７の緩
衝液によって、注意深く洗浄しなければならない。
ためには、１０〜２０倍の容量の水又はｐＨ６〜７の緩
衝液によって、注意深く洗浄しなければならない。
本発明による生体触媒は７−β−アシルアミドセファロ
スポラン酸の製造に対して、活性の低下なしに少なくと
も２０回は使用することができる。
スポラン酸の製造に対して、活性の低下なしに少なくと
も２０回は使用することができる。
生体触媒の酵素的活性は高圧液体クロマトグラフィーに
より（付属書参照）又は酸性酢酸エチル抽出物の蒸発後
の生成物の秤量によって、定量することができる。
より（付属書参照）又は酸性酢酸エチル抽出物の蒸発後
の生成物の秤量によって、定量することができる。
酵素反応において得られる３−ヒドロキシメチル基の構
造を実証するために、それをドイツ特許公開筒２，９１
４．０００号に従ってテトラヒドロフラン中でジクロロ
ホスホリルイソシアナートを用いてカルバモイル化し、
且つ文献中のものと同一のカルボモイル誘導体に転化さ
せた。
造を実証するために、それをドイツ特許公開筒２，９１
４．０００号に従ってテトラヒドロフラン中でジクロロ
ホスホリルイソシアナートを用いてカルバモイル化し、
且つ文献中のものと同一のカルボモイル誘導体に転化さ
せた。
７−β−７シルアミド保護基は、３−ヒドロキシメチル
基の化学的誘導体化ののちに、Ｎ′−ｔ−ブトキシカル
ボニル基の場合におけるように、文献から公知の如く酸
を用いて除去することができ、あるいは７−β−フェニ
ルアセトアミド保護基の場合におけるようにドイツ特許
公開筒２，３５５、０７８号に従って大腸菌からの固定
化したペニシリンアシラーゼを用いて脱離することがで
きる。
基の化学的誘導体化ののちに、Ｎ′−ｔ−ブトキシカル
ボニル基の場合におけるように、文献から公知の如く酸
を用いて除去することができ、あるいは７−β−フェニ
ルアセトアミド保護基の場合におけるようにドイツ特許
公開筒２，３５５、０７８号に従って大腸菌からの固定
化したペニシリンアシラーゼを用いて脱離することがで
きる。
付 属 内
７−β−７エニルアセトアミドー３−アセトキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸及び７−β−７エニ
ルアセトアミドー３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エ
ム−４−カルボン酸の定量のための分析的高圧液体クロ
マトグラフィ一方法袋 置： ヒユーレット−パ
ラカード１０８４Ｂ固定相： リクロソーブＲ Ｐ
１８ （２５０ｍｍ ｘ４ｍｍ、 ５μｍ１メルク
、ダルムスタット〉 移動相： １アンプルのｐ）−１４緩衝液（メルク
、ダルムスタット、Ｎｏ、 ９８８４ ）と３６０１の
アセ１−二トリルを水で 希釈して２１ とする。
−セフ−３−エム−４−カルボン酸及び７−β−７エニ
ルアセトアミドー３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エ
ム−４−カルボン酸の定量のための分析的高圧液体クロ
マトグラフィ一方法袋 置： ヒユーレット−パ
ラカード１０８４Ｂ固定相： リクロソーブＲ Ｐ
１８ （２５０ｍｍ ｘ４ｍｍ、 ５μｍ１メルク
、ダルムスタット〉 移動相： １アンプルのｐ）−１４緩衝液（メルク
、ダルムスタット、Ｎｏ、 ９８８４ ）と３６０１の
アセ１−二トリルを水で 希釈して２１ とする。
流 速： ２ ｍｌ／分
オーブン温度 ４５℃
注入量 １０μｍ
波 長 ２４０ ｎｍ減 衰
２６ ７−β −フェニル アセトアミド −３−アセトキシ セファロスポラ ン酸の濃度： １０１１１（１／ｍ１７−β −フ
ェニル アセトアミド−３− アセトキシメチル 一セフー３−エム −４−カルボン酸に 対する保持時間： ５．０４分 １−β −フェニル アセトアミド−３− ヒドロキシメチル 一セフ −３−エム −４−カルボン酸に 対する保持時間：２．５分 実施例 １ 枯草菌ＡＴＣＣ６６３３の固定化細胞の調製１．２５１
の４重量％タンニン溶液、０．５１の濃度４％ポリエチ
レンイミン（ＰＥ Ｉ ６００、分子量約３０．０００
〜４０．０００）、濃度５０％水溶液（セルバ、ハイデ
ルベルグ）及び３Ｉのベッツ／グルタルアルデヒド溶液
［溶液１：１Ｎ ＮａＯＨによりｐｔ−１９，０に調
節した１０００１の脱イオン水中の１２０ｇのベッツポ
リマー（ベッツ１１８０、等モルのエビクロロヒドリン
とＮ、Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミンから調
製したカチオン性ポリマー）；溶液２：１Ｎ ＮａＯ
ＨによりｐＨ９，０に調節した１０１００Ｏの脱イオン
水中の１７８１の濃度２５％グルタルアルデヒド溶液、
使用前に溶液１と２を容量比１：１で混合する）を連続
的に、攪拌と共に、枯草菌ＡＴＣＣ６６３３の２５１の
細菌懸濁液に加える。細菌沈殿物を１５分攪拌したのち
、ｒ紙を付した吸引ｒ過器（直径２５〜３（Ｍｍ）を用
いて吸引ｒ過する。
２６ ７−β −フェニル アセトアミド −３−アセトキシ セファロスポラ ン酸の濃度： １０１１１（１／ｍ１７−β −フ
ェニル アセトアミド−３− アセトキシメチル 一セフー３−エム −４−カルボン酸に 対する保持時間： ５．０４分 １−β −フェニル アセトアミド−３− ヒドロキシメチル 一セフ −３−エム −４−カルボン酸に 対する保持時間：２．５分 実施例 １ 枯草菌ＡＴＣＣ６６３３の固定化細胞の調製１．２５１
の４重量％タンニン溶液、０．５１の濃度４％ポリエチ
レンイミン（ＰＥ Ｉ ６００、分子量約３０．０００
〜４０．０００）、濃度５０％水溶液（セルバ、ハイデ
ルベルグ）及び３Ｉのベッツ／グルタルアルデヒド溶液
［溶液１：１Ｎ ＮａＯＨによりｐｔ−１９，０に調
節した１０００１の脱イオン水中の１２０ｇのベッツポ
リマー（ベッツ１１８０、等モルのエビクロロヒドリン
とＮ、Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミンから調
製したカチオン性ポリマー）；溶液２：１Ｎ ＮａＯ
ＨによりｐＨ９，０に調節した１０１００Ｏの脱イオン
水中の１７８１の濃度２５％グルタルアルデヒド溶液、
使用前に溶液１と２を容量比１：１で混合する）を連続
的に、攪拌と共に、枯草菌ＡＴＣＣ６６３３の２５１の
細菌懸濁液に加える。細菌沈殿物を１５分攪拌したのち
、ｒ紙を付した吸引ｒ過器（直径２５〜３（Ｍｍ）を用
いて吸引ｒ過する。
湿った細菌性ポリマーを４０℃の循環空気乾燥中で金属
板で恒量となるまで乾燥する。乾燥した細菌性ポリマー
を歯付きの円盤磨砕機を用いて磨砕したのち、ふるいに
かける。
板で恒量となるまで乾燥する。乾燥した細菌性ポリマー
を歯付きの円盤磨砕機を用いて磨砕したのち、ふるいに
かける。
ふるいにかけたのちに、ふるい画分く６３０μ（６，０
９９） 、６３０〜２００μ（１１５，’９９（＋＞及
び２００μ（３５，８６ｇ＞を有する１６８．２５！Ｊ
の細菌性ポリマーを取得する。ふるい分は後の全収率は
１５７．９４ｇ （９３，５％）で、１１１ニユートン
の圧縮率を有している。
９９） 、６３０〜２００μ（１１５，’９９（＋＞及
び２００μ（３５，８６ｇ＞を有する１６８．２５！Ｊ
の細菌性ポリマーを取得する。ふるい分は後の全収率は
１５７．９４ｇ （９３，５％）で、１１１ニユートン
の圧縮率を有している。
実施例 ２
枯草菌の細菌性ポリマーを用いる７−β−フェニルアセ
トアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エム−４−
カルボン酸の製造 ５ｇの７−β−フェニルアセトアミド−３−アセトキシ
メチル−セフ−３−エム−４−カルボン酸を５００１の
水中に溶解して、実施例１による細菌性ポリマー６７．
５ｇを使用して２５℃の温度でｐＨ７，Ｏ（２Ｎ Ｎ
Ｈｓを用いて一定に保つ）において８時間開裂させる。
トアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エム−４−
カルボン酸の製造 ５ｇの７−β−フェニルアセトアミド−３−アセトキシ
メチル−セフ−３−エム−４−カルボン酸を５００１の
水中に溶解して、実施例１による細菌性ポリマー６７．
５ｇを使用して２５℃の温度でｐＨ７，Ｏ（２Ｎ Ｎ
Ｈｓを用いて一定に保つ）において８時間開裂させる。
懸濁物を吸引ｒ過し、細菌性ポリマーを脱イオン水によ
って３回洗浄したのち、乾燥する。６６．７４ｇ （９
８゜９％）の使用した細菌性ポリマーを回収する。
って３回洗浄したのち、乾燥する。６６．７４ｇ （９
８゜９％）の使用した細菌性ポリマーを回収する。
）Ｐ液を脱イオン水により約１１に希釈し、ＨＣｌによ
ってｐＨを４に調節し、その溶液を、３’００ｍ１の酢
酸エチルによって１回、次いで２００１の酢酸エチルに
よって２回抽出する。
ってｐＨを４に調節し、その溶液を、３’００ｍ１の酢
酸エチルによって１回、次いで２００１の酢酸エチルに
よって２回抽出する。
有機相を合わせ、４０ｍ１のＨｓＯで洗浄し、Ｎａ２５
ＯＡ上で乾燥したのち、ロータリーエバポレーター上で
約２０１に濃縮する。残留物を吸引ｒ過したのち、乾燥
する。
ＯＡ上で乾燥したのち、ロータリーエバポレーター上で
約２０１に濃縮する。残留物を吸引ｒ過したのち、乾燥
する。
３回使用したのちに、下記の収率の７−β−フェニルア
セトアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エムカル
ボン酸を取得する。
セトアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エムカル
ボン酸を取得する。
消費
Ｎ８口
１回目の開裂 １１Ｙ ｆｆｌ ＝ １，５５０ （４
３，４％） ３７６ｍ１２回目の開裂 収ｆｆｉ ＝
２．３１（１（６４，６％） ７８０ｍ１３回目の
開裂 収量＝ ２．７４（Ｊ （７６，６％） ９８
８ｍ１実施例 ３ ７−β−フェニルアセトアミド−３−ヒドロキシメチル
セフ−３−エム−４−カルボン酸の製造に対する細菌性
ポリマーの多重使用 ７−β−フェニルアセトアミド−３−アセトキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸の１０重量％の水溶
液を、実施例１によって調製した枯草菌の細菌性ポリマ
ー４５０ｇを使用して、７の一定ｐｉ−ＩＮＲ度２５％
のアンモニア溶液によって中和）において２５℃で２２
時間攪拌することによって、開裂させる。生体触媒をｒ
別し、水で洗浄し、水溶液をｐｉ−１２に酸性化したの
ち、酢酸エチルによって抽出する。酢酸エチルの蒸発後
に、７−β−フェニルアセトアミド−３−ヒトＯキシメ
チルセフー３−エム−４−カルボン酸の重量を計り、さ
らにその生体触媒を開裂に対して数回使用する。
３，４％） ３７６ｍ１２回目の開裂 収ｆｆｉ ＝
２．３１（１（６４，６％） ７８０ｍ１３回目の
開裂 収量＝ ２．７４（Ｊ （７６，６％） ９８
８ｍ１実施例 ３ ７−β−フェニルアセトアミド−３−ヒドロキシメチル
セフ−３−エム−４−カルボン酸の製造に対する細菌性
ポリマーの多重使用 ７−β−フェニルアセトアミド−３−アセトキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸の１０重量％の水溶
液を、実施例１によって調製した枯草菌の細菌性ポリマ
ー４５０ｇを使用して、７の一定ｐｉ−ＩＮＲ度２５％
のアンモニア溶液によって中和）において２５℃で２２
時間攪拌することによって、開裂させる。生体触媒をｒ
別し、水で洗浄し、水溶液をｐｉ−１２に酸性化したの
ち、酢酸エチルによって抽出する。酢酸エチルの蒸発後
に、７−β−フェニルアセトアミド−３−ヒトＯキシメ
チルセフー３−エム−４−カルボン酸の重量を計り、さ
らにその生体触媒を開裂に対して数回使用する。
釆Ｊ１江−二Ｌ
７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカルボニルアミド］−
３−ヒドロキシメチルセフ−３−エム−４−カルボン酸
の製造 ７−β−［Ｎ ’−−ｔ−ブトキシカルボニルアミド］
−３−アセトキシメチル−セフ−３−エム−４−カルボ
ン酸の１０重量％水溶液を、実施例１に従って固定化し
た６３３ｇの枯草菌細胞を用いて、７．０の一定ｐＨ（
１１度２５％のＮ１−１３溶液を用いて一定に保った）
において２５℃で１６時間開裂させることによって、７
−β−［Ｎ′’ｔ−ブトキシカルボニルアミド メチルセフ−３−エム−４−カルボン酸を取得する。後
者を実施例３におけるようにして単離する。
３−ヒドロキシメチルセフ−３−エム−４−カルボン酸
の製造 ７−β−［Ｎ ’−−ｔ−ブトキシカルボニルアミド］
−３−アセトキシメチル−セフ−３−エム−４−カルボ
ン酸の１０重量％水溶液を、実施例１に従って固定化し
た６３３ｇの枯草菌細胞を用いて、７．０の一定ｐＨ（
１１度２５％のＮ１−１３溶液を用いて一定に保った）
において２５℃で１６時間開裂させることによって、７
−β−［Ｎ′’ｔ−ブトキシカルボニルアミド メチルセフ−３−エム−４−カルボン酸を取得する。後
者を実施例３におけるようにして単離する。
生成触媒の ７−β−［Ｎ−−ｔ−ブトキシ ７−
β−［Ｎ−−ｔ−ブトキシ使用回数 −カルボニル
−アミド］−カルボニル−アミド］−３−３−アセトキ
シメチル−セフ ヒドロキシメチル−ヒフ−３−エム
−４−カルリボン醗の量 −エム−４−カルボン酸の
収（° 吊 １ １４．９ ８．９
（理論の６１．３％）２ ４５．０
２７，０ （理論の６７．５％）３
１００．０ ６１，７
（理論の６９．５％）４ １００．０
７６．５ （理論の８６．２％）５
５６．８ ５０．０ （
理論の９９．１％）叉Ｊ１糺−」し ７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカルボニル］−Ｄ−（
α〉−フェニルグリシンアミド−３−ヒドロキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸の製造 ７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカルボニル］−Ｄ−（
α）−フェニルグリシンアミド−３−アセトキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸の６重量％の水溶液
を、濃度２５％のＮＨ３溶液により ｐＨ７，０に調節
し、実施例１に従って固定化した６３３ｇの枯草菌の細
胞を用いて、７゜０の一定ｐＨ（１度２５％のＮＨａ溶
液を用いて一定に保つ〉において２５℃で１６時間開裂
させることにより、７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカ
ルボニル］ −Ｄ−（α）−フェニルグリシンアミド−
３−ヒドロキシメチル−セフ−４−エム−４−カルボン
酸を取得する。これを実施例３に記すようにして単離す
る。
β−［Ｎ−−ｔ−ブトキシ使用回数 −カルボニル
−アミド］−カルボニル−アミド］−３−３−アセトキ
シメチル−セフ ヒドロキシメチル−ヒフ−３−エム
−４−カルリボン醗の量 −エム−４−カルボン酸の
収（° 吊 １ １４．９ ８．９
（理論の６１．３％）２ ４５．０
２７，０ （理論の６７．５％）３
１００．０ ６１，７
（理論の６９．５％）４ １００．０
７６．５ （理論の８６．２％）５
５６．８ ５０．０ （
理論の９９．１％）叉Ｊ１糺−」し ７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカルボニル］−Ｄ−（
α〉−フェニルグリシンアミド−３−ヒドロキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸の製造 ７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカルボニル］−Ｄ−（
α）−フェニルグリシンアミド−３−アセトキシメチル
−セフ−３−エム−４−カルボン酸の６重量％の水溶液
を、濃度２５％のＮＨ３溶液により ｐＨ７，０に調節
し、実施例１に従って固定化した６３３ｇの枯草菌の細
胞を用いて、７゜０の一定ｐＨ（１度２５％のＮＨａ溶
液を用いて一定に保つ〉において２５℃で１６時間開裂
させることにより、７−β−［Ｎ −−ｔ−ブトキシカ
ルボニル］ −Ｄ−（α）−フェニルグリシンアミド−
３−ヒドロキシメチル−セフ−４−エム−４−カルボン
酸を取得する。これを実施例３に記すようにして単離す
る。
Ｎ−−ｔ−ブトキシカルボニル
オロ酢酸を用いて公知の方法で酸脱離を加えることがで
きる。 − 支ＬｆＬｆ ７−α−アミノ−３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エ
ム−４−カルボン酸の固定化ペニシリンアシラーゼを用
いる製造 実施例３に従って製造した１３８．７ｇの７−β−フェ
ニルアセトアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エ
ム−４−カルボン酸を脱イオン水中に３重Ｍ％溶液とし
て溶解し、９バツチとして、それぞれの場合にドイツ特
許公開第２．３５５。
きる。 − 支ＬｆＬｆ ７−α−アミノ−３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エ
ム−４−カルボン酸の固定化ペニシリンアシラーゼを用
いる製造 実施例３に従って製造した１３８．７ｇの７−β−フェ
ニルアセトアミド−３−ヒドロキシメチルセフ−３−エ
ム−４−カルボン酸を脱イオン水中に３重Ｍ％溶液とし
て溶解し、９バツチとして、それぞれの場合にドイツ特
許公開第２．３５５。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
沈殿及び固定化のために、沈殿剤タンニン及びベッツ（
Ｂｅｔｚ）１１８０並びに架橋剤ポリエチレンイミン及
びグルタルアルデヒドを、枯草菌懸濁物に対して添加す
ることを特徴とする枯草菌細胞の固定化方法。 ２、容量使用割合が、２〜８容量％のタンニン溶液（タ
ンニンの重量で４％の溶液）、０．５〜５容量％のポリ
エチレンイミン（ポリエチレンイミンの重量で４％の溶
液）及び２．０〜５．５容量％のベッツ／グルタルアル
デヒド（ベッツの重量で６％とグルタルアルデヒドの容
量で２．２％の溶液）であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３、固定化に対して醗酵培養液を直接に使用することを
特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
。 ４、特許請求の範囲第２項記載の方法によって取得する
ことができる固定化枯草菌。 ５、特許請求の範囲第４項記載の生物学的材料から成る
安定な生体触媒。 ６、可逆的に保護された７−β−アシルアミドセファロ
スポラン酸類を７−β−アシルアミド−３−ヒドロキシ
メチル−セフ−３−エム−４−カルボン酸類へ変換する
ための特許請求の範囲第４項記載の生物学的材料の使用
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3432060.1 | 1984-08-31 | ||
| DE19843432060 DE3432060A1 (de) | 1984-08-31 | 1984-08-31 | Immobilisierte zellen von bacillus subtilis, immobilisierungsverfahren und verwendung des praeparats zur abspaltung der 3-acetoxygruppe aus 7-ss-acylamido-cephalosporansaeuren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6167489A true JPS6167489A (ja) | 1986-04-07 |
Family
ID=6244370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60190982A Pending JPS6167489A (ja) | 1984-08-31 | 1985-08-31 | 枯草菌の固定化細胞、固定化方法及び７‐β‐アシルアミドセフアロスポラン酸からの３‐アセトキシ基の脱離に対する生成物の使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173206A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6167489A (ja) |
| DE (1) | DE3432060A1 (ja) |
| DK (1) | DK398085A (ja) |
| ES (1) | ES8609470A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0453499A (ja) * | 1990-06-19 | 1992-02-21 | Shionogi & Co Ltd | デアセチル―７―アミノセファロスポラン酸の製造法 |
| US5281525A (en) * | 1990-04-27 | 1994-01-25 | Shionogi & Co., Ltd. | Cephalosporin acetylhydrolase gene from Bacillus subtilis |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5512454A (en) * | 1994-02-03 | 1996-04-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Enzymatic acylation of 3-hydroxymethyl cephalosporins |
| NO301445B1 (no) * | 1994-07-13 | 1997-10-27 | Petroleum Geo Services As | Anordning for sleping |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Also Published As
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