JPS6162864A - 抗原の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特定の化学反応に触媒作用を有する有機化合
物の検出方法に係り、特に免疫反応を利用して、煩雑な
分離精製手段を施すことなく、分析素子上において、特
定の化学反応に触媒作用を有する有機化合物を検出する
方法に関する。

〔従来の技術〕

種々の化合物が共存している検体中の特定の化学反応に
触媒作用を有する有機化合物を定量的に検出するだめに
は、通常、目的とする有機化合物をクロマトグラフィー
、遠心分離、塩析、ゲル沖過、電気泳動等により分離精
製した後に、分光吸収測定法、蛍光測定法、核磁気共鳴
法、比色法等の方法により、定量的に測定することが行
われている。

血液、体液、尿、糞便等中の含有有機化合物を定量的に
検知することは、病理診断上重要であり、簡便、迅速に
行われることが要求されており、分離精製を簡便化する
か、又は不要化する工夫がなされている。

目的有機化合物のみが因子となる反応を選択し、種々の
化合物が共存するまま該反応を生じさせ、該反応により
消費する又は生成する成分を物理的に測定することが一
般的に行わｉてい　　□るが、同様な反応を起す共存化
合物との識別が困難であり改良が望まれている。その例
として糞便中のヘモグロビンの測定を挙げることができ
る。

潰瘍、癌種、結核、チフス等の消化管の潰瘍性機転を引
起す疾患の診断、治療上、糞便中の潜血を検出するとと
け重要であシ、検査法には、分光調法、触媒法、ヘミン
結晶試験法等がある。

そのなかで操作が簡便であることよ抄触媒法が最も利用
されている。触媒法はヘモグロビン及びその分解物の持
つペルオキシダーゼ様触媒活性を用い、過酸化水素の存
在下、呈色反応を生じさせる方法であり用いる試薬によ
り、フェノールフタレイン法、０−トリジン法、グアヤ
ツク法、ベンジジン法、ピラミドン法等が知られている
。これらの呈色反応はヒトのヘモグロビンやその分解物
以外に、赤味の肉、豚の血をまぜたソーセージ等に含ま
れる獣魚肉由来のへモグロにン及びその分解物並びにあ
る種の野菜治療ｉ品のうちオキシダーゼ作用を有するも
の及び無機塩類等によっても触媒作用を受けるので、し
ばしば縦隔性反応が起る。テストス、ライドの形で入手
できる触媒法を用いた、糞便中の潜血検出用市販テスト
例えばフエカテストでは、被検者は検査前２〜３日間は
獣鳥肉類及びその加工品、魚介類及びその加工品、生野
菜、メロン、なし、柑きつ類の皮等の果物類、その他を
食することが禁じられている。これらの禁止事項は被検
者にとって煩しく、それを守っても完全に偽のボジテプ
反応を除外することができず、結腸癌、直腸癌等の診断
のためには、糞便潜血検査後、結腸鏡あるいは直腸鏡の
ような時間と費用のかかる検査が必要となっている。

特開昭５４−１５８９９５号公報に固定化抗ヘモグロビ
ン抗体を平板上にセットしたヘモグロビン測定キットが
記載されており、平板としてスライドグラスを用いた例
が述べられているが、共存物との分離が困難であると共
に定量精度もよくない。また、該方法は糞便中のヘモグ
ロビンの測定のような共存物が多種に及ぶ条件下のヘモ
グロビン測定は意図していない。

特開昭５６−１０６１５４号公報には、ヒトヘモグロビ
ンに対する特異抗体を固相に結合して使用し、試料糞便
中のヒトヘモグロビンを免疫学的抗原抗体反応によシ該
抗体に結合させて単離し、それによシ該抗体に結合した
ヒトヘモグロビンを測定することを特徴とする糞便中の
ヘモグロビン又はヘモグロビン分解産物の検出方法が記
載されている。

該方法によれば濾紙等の吸着材物質に糞便中に含まれて
いる血液由来ヘモグロビン及び／又はヘモグロビンの分
解産物を吸着させ、それよシ抽出した検体液とヒトヘモ
グロビンに対する特異抗体を結合した固相とを接した状
態でインキユヘートシ、検体液をデカンテーションする
。

該固相に対してサンドイツチ法で酵素免疫測定法（エン
ザイム・イムノアッセイ、以下Ｅ工Ａと略記する）を試
みるか、検体液と同時に酵素標識ヒトヘモグロビンを用
いて、競合法Ｅ’ＩＡを行うか、グアヤツク反応を行う
ことにより、ヘモグロビンを検知している。該方法にお
いて、ヒトヘモグロビンに対する特異抗体を結合した同
相は、ポリエチレン製キュベツト、ボール、リング、円
盤等が述べられているが、検体液中テインキュベーショ
ン、デカンテーション後の洗浄と煩しい作業を行うこと
は同様である。

特開昭５８−２３７９６号公報には、触媒法に用いた後
、糞便中に含まれている血液由来ヘモグロビンを吸着し
た濾紙等の材料をそのま１用いて免疫学的にヘモグロビ
ンを検出する方法が開示されている。該方法は、触媒法
に用いた後の吸着材料を用いた他は特開昭５６−１０６
１５４号公報記載の方法と同じである。ヘモグロビンに
対する特異抗体を結合した固相はビーズであるが、検体
液中でのインキュベーション、デカンテーション後の洗
浄と煩しい操作を必要としている。

特開昭５８＝−２０５８５４号公報には、変性度の異々
るヒトヘモグロビンのそれぞれに対する特異抗体を固定
化した潜血反応検査用固定化抗体に関して記載されてい
る。該公報によると、特異抗体を固定化したポリビニル
アルコールやセルロース等のプレート、シート又は繊維
を、少量の糞を懸濁させた検体液中に浸漬し、・インキ
ュベーションして取出し生理食塩水で洗浄［７て試料を
得る。該試料を触媒法で発色させる。

該方法も、検体液中でのインキュベーション、デカンテ
ーション後の洗浄と煩しい操作を必要としている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

それらを改良した特願昭５９−２８５７１号の発明では
、検査上の操作及び疑陽性、陰性反応等が改良されてい
るが、洗浄の操作において、検体を適用した領域内に洗
浄液を滴下するために、洗浄液を適用した中心部付近が
十分に洗浄されず、その領域内に疑陽性、陰性物質が残
存するために正確な判定を下すことが難しい。

本発明の目的は、酵素、ヘモグロビン等の特定の反応に
対して触媒作用を有する有機化合物（抗原）の簡便な検
出方法を提供することにあシ、更に詳しくは、核検出方
法における検体と固定化抗体との反応において、未反応
成分を効率よく検体適用領域外に拡散させる洗浄方法を
提供することＫある。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明を概説すれば、本発明は抗原の検出方法に関する
発明であって、液体不浸透性支持体上に抗体が固定化さ
れた担体を含有する多孔性層を少なくとも一層有する分
析素子に、検体を適用し、分析素子中の固定化された抗
体と検体中の抗原とを反応させた後、未反応成分を洗浄
によって、該検体を適用領域外に拡散させ、次いで抗体
と結合した抗原を触媒として分光特性に変化を生ずる成
分を含有する反応液を、該検体を適用した領域に適用し
て分析素子上で分光特性に変化を生じさせ、その変化を
測定する抗原の検出方法において、洗浄液を毛管現象に
よって、分析素子中に展開させることにより洗浄を行う
ことを特徴とする。

本発明によれば、検体よりもたらされた抗原と分析素子
中の固定化された抗体との反応の未反応成分を検体を適
用した領域外に効率よく拡散させることができる。

本発明の洗浄方法は、有機化合物の混合物の分離技術で
ある薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフ
ィーにおいて、展開溶媒を展開させ、混合物を分離する
場合と、同様の原理に基づくものであり、この場合、展
開溶媒が、洗浄溶液であり、分析素子の一部が、洗浄溶
液槽中に浸漬しており、毛管現象により洗浄液が、分析
素子中を移動、展開し、未反応成分を検体適用領域外に
拡散させるという方法である。洗浄溶液槽は分析素子中
にあってもよいし、また、洗浄溶液槽に分析素子を入れ
てもよい。また展開の方向はどちら方向でもよいが、展
開距離の長い方が好ましい。

分析素子での洗浄は、その操作上、最少の洗浄量で最大
の洗浄効果をあげることがもつとも好しいことである。

検体を適用した中心部に、洗浄液を滴下する場合が、洗
浄液量が最少−ｈ先と思われるが、前に述べたように、
中心部に未反応物が残存し、疑陽性、陰性反応が起ると
いう欠点がみられる。洗浄液量の増量も考えられるが、
分析素子の洗浄液の許容量は、素子を構成している担体
等の素材の性質、使用柑、又（寸分析素子の膜厚等によ
って一部に規定できないにしても、限度があることけ変
りない。

このように洗浄液を展開させて、洗浄する方法は、分析
素子の洗浄液の許容量内で最大の洗浄効果を得るもので
ある。またこれらの方法は、ペーパークロマトグラフィ
ー、薄層クロマトクラフィーと同じ原理を利用するもの
であるので、未反応成分を洗浄液の展開と同時に展開し
て行くのでその洗浄効果は大きいと推定される。

本発明でいう液体不浸透性支持体とは水不透過性膜を意
味し特に素材に限定はない。例えば酢酸セルロース、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及びポリ
ビニル化合物（例えばポリスチレン）のようなポリマー
材料あるいはガラス、セラミックス、金属並びに樹脂被
覆紙等を挙げることができる。該支持体は光透過性の方
が支持体側より分光的変化を測定可能であるために好ま
しい。

本発明で使用する抗体は、その由来を特に限定されるも
のではなく、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られ
る抗体を含む血清より抗体゛の精製法として従来公知の
方法である（右田俊介編「免疫化学」中山書店第７４〜
８８頁参照）、硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウ
ム沈殿法、セファデックスゲルによるゲルＶ過法、イオ
ン交換セルロースクロマトグラフィー法、電気泳動法等
によって提供される。

また抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）肺臓細
胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから航程細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっても良い
。

本発明で担体とは、検体に不溶性で検体と接触した状態
で構造状態が保たれる固体を意味し、物理的方法、又は
化学的方法によシ抗体を固定化できれば素材には限定さ
れない。担体の例としては、紙、セルロース、ガラス繊
維、不織布及び織布、各種有機重合体繊維（ポリアミド
、ポリエチレン、ポリプロピレン等）、粒状有機重合体
物、その他フィルム形成材料等を挙げることができる。

これら担体の例と一部重複するが、特開昭４９−５３８
８８号、同５５−９０８５９号、同５７−６７８６０号
、同５７−１２５８４７号、同５７−１９７４６６号、
同５Ｂ−７０１６１号各公報等に記載されている展開層
構成材料を担体としても良い。

担体を含有する層は、被検物質である酵素やヘモグロビ
ン等が、層中の担体表面に固定化された抗体と自由に接
触可能な多孔性の層である。

各々の孔の大きさは短径が５μｍ〜３００μ濯のものを
用いることが好ましく、担体を層に形成する方法は、特
開昭４９−５３８８８号、同５５−９０８５９号、同５
７−６７８６０号、同５７−ｊ２５８４７・号、同５７
−１９７４６６号、同５８−７　［１１６１号各公報に
おいて展開層を形成するために述べられている方法を用
いることができる。また特開昭５８−２１４８５４号公
報に記載されている粒子結合体を担体として用いること
が可能であシ、特開昭５８−２１４８５４号公報に記載
されている方法により、本発明の方法に一用いることが
好適である抗体が固定化された担体を含有する多孔性層
を形成することが可能である。担体への抗体の固定化は
、物理的方法でも化学結合を形成させることにより行っ
ても良い。

物理吸着法としては、抗体を水又は適当な緩衝液に溶解
させ、これに前記担体を浸漬して吸着させることができ
る。

との際の緩衝液としては、００１〜１Ｍ程度の適当々緩
衝液を用いることができる。また、吸着させる物質の濃
度は０．０　Ｏ１〜１．０％の範囲で用い、表面を十分
に清浄にした担体を浸漬し吸着させる。

上記吸着のための温度は、室温又はそれ以下が好捷しく
、時間は１０〜１００時間が好ましい。得られた担体は
、分離の抜水又は緩衝液で洗浄し、吸着にあずからなか
った抗体を取去ることが好ましい。

化学結合を用いる方法としては、抗体を本発明に係わる
担体上の官能基と直接又は多官能性試薬を用いて結合す
ることが可能である。これらの方法は、例えば千畑一部
編「固定化酵素」（１９７５年講談社刊）に記載されて
いる酵素等の固定化技術を応用することができる。−例
を挙げれはジアゾ化法、アミド法、アルキル化法、グル
タルアルデヒド法及びヘキサメチレンジイソシアネート
法等がある。

当然のことながら、抗体を結合させた担体を用いて多孔
性層を作製することもでき、また、あらかじめ層を作製
した後、抗体を結合することもできる。更に本発明に係
わる担体には、必要に応じて免疫反応における非特異的
反応を排除する目的で、測定すべき免疫反応に関与し々
いタンパク質を担持することが可能である。これらの代
表的々例としては哺乳動物の正常血清タンパク質、アル
ブミン、ゼラチン及びその分解物等が挙げられる。

これらの担持方法は前述と同じように物理吸着法及び化
学結合法を適宜用いることができる。

本発明における反応液とは、抗体に結合した抗原を触媒
として分光特性の変化を生じる成分を含む液をいう。分
光特性の変化とは、可視光に対する吸光度の変化のみな
らず、紫外光、赤外光に対する吸光度の変化も意味する
し、蛍光等吸収波長と異なる光の発光、吸光を伴わない
発光も意味する。更には消光も意味する。例えば、ヘモ
グロビンを検出対象とする場合は反応液は基本的には過
酸化水素と、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下で
着色物質を生成するか又は色変化をする化合物を含んで
いれば良い。

このような化合物又は組成物の例としては、特開昭４９
−５０９９１号公報に開示されている、（ａ）０−ジア
ニシジン又はその酸塩、ｌｂｌ　ｏ−）リジン又はその
酸塩、（Ｃ）ｏ−フェニレンジアミン又はその酸塩、（
ｄ）グアヤク、（θ）アドレナリン、（ｆｌフェノール
フタレイン、（ω２，２′−アジノジ（３−−１１４ル
ペンゾテアソリン−６−スルホン酸）アンモニウム塩、
（６）フェロシアン化物、＋１１４−アミノアンチピリ
ン、その置換誘導体又はそれらの酸塩とフェノール又は
ナフトール又はそれらの誘導体との組合せ、特開昭５０
−１３７１９２号公報に開示されている、 （１）アニリン及びその誘導体、０−トルイジン、ｐ−
）ルイジン等のモノアミン類、 （２）　　ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジメチ
ル−ｐ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジエチルフェ
ニレンジアミン、ベンジジン（ｉｌｌないしは褐色を呈
する）、ジアニシジン（緑変ないし褐変）等のジアミン
類、 （３）　　フェノールそれ自体（黄色を呈する）、チモ
ール、ｎ−、ｍ−、及びｐ−クレゾール（それぞれ緑黄
色、桃色、乳白懸濁を呈す）、アルファーナフトール（
深紅色を呈する）、ベーターナフトール（自沈を生ずる
）等のフェノール類、 （４）　　カテコール、グアヤコール（橙色を呈する）
、オーシノール、ピロガロール（赤色又は黄色ヲ呈ｔル
）　、Ｔ）、Ｔ）−ジヒドロキシジフェニル及ヒフロロ
グルシノールのようなポリフェノール類、 （５）サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のよう々
芳香族の酸、 （６）　　ロイコマラカイトグリーン（マラカイトグリ
ーンヲ呈スル）、ロイコフェノールフタレイン（アルカ
リ性媒質中で使うことが望ましい）のようなロイコ染料
、 （７）　　２．６−シクロロフエノールインドフエノー
ルのような着色染料、 （８）　　エピネフリン、フラボン類、チロシン、ジヒ
ドロキシフェニルアラニン（橙赤色を呈する）及びトリ
プトファンのような種々の生化学物質、 （９）その他、グアヤゴム、グアヤコン酸、ヨウ化カリ
ウム、ヨウ化ナトリウム及び他の水Ｉｉ性ヨウ化物、並
びにビリルビン（緑色を帯びた色とｈる。）のようた物
質、 叫　２，２′−了ジノジて３−エチル−６−ス１１、ベ
ンゾチアゾリン）又はその塩、及び３　、３７−ジアミ
ツベンジジンのような特殊染料、ａメ４−アミノアンチ
ピリン、その置換誘導体又はその酸塩と１，７−シヒド
ロキシナフクレン又はその誘導体との組合せ、 を挙げることができる。

洗浄液としては、未反応成分を、検体を適用ｌまた領域
の周辺部へ拡散可能であれば、組成には限定は々い。基
本的には水で良い。洗浄性を増加させるために界面活性
剤ガ添加されている方が好ましい。有利に用いられる界
面活性剤としては、トライＩ・ン＠ｘ−１ｎｏ（ローム
アンドハース社製オクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール）、サーファクタント１０１■（オリーン社製１
、ノニルフェノキシポリグリシドール）等の非イオン性
界面活性剤を挙げることができる。

ある種の酵素が患者の血清や尿中で増加することが知ら
れており、癌等の診断や予後の経過の判定上重要性が増
加しつつある。本発明の方法はこれらの酵素の検知方法
としても有用である。これらの酵素として、γ−グルタ
ミルトランスフェラーゼアイソエンザイム、アルドラー
ゼアイソエンザイム、アルカリホスファターゼ、アシド
ホスファターゼ、ピルビン酸キナーゼ、ターミナルデオ
キシヌクレオテジルトランスフエラーゼ等を挙げること
ができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

なお、第１図は、本発明の洗浄方法の一例を示す模式図
である。第１図中、１は検出素子、２は検体を適用した
領域そして６は洗浄液を意味する。

実施例１ （１）　　セルロース繊維への抗ヒトヘモグロビンの固
定化 ν紙粉末Ｃ！（３００メツシュ以上、東洋ν紙■製）　
ｓ　ｏ　ｔ、　　１．４−ブタンジオールジグリシジル
エーテル〔関東化学（株）製〕７５　ａｔ、ＮａＢＨ４
〔和光紬薬（株）製−〕２２ｍ９／を含む［１，６Ｍ　
’ＮａＯＨ溶液７５−を混合し、４０℃で５．５時間が
くはんし、活性化を行った。

ガラス濾過器上で、活性化濾紙粉末Ｃを５，０００−ハ
どの蒸留水で洗浄した後、３ｏｏ−の０．５Ｍ　、Ｎａ
ＨＯＯｌ−Ｎａ、００．緩衝液（ｐＨ１ｐ、ｏ）　　に
溶解したウサギ抗ヒト）モグロビン抗体〔マイルス（株
）社製〕０．仝ｔと４０℃で１４時間反応させた。

更に反応液を除いた後、１Ｍ）＋７スー塩酸緩衝液６０
ロー（ｐＨａｏ）と４０℃で１４時間反応させた。０．
５Ｍ酢酸緩衝液、０．５　Ｍ　ＮａＨＣＪＯ，溶液、Ｐ
ＢＳ　（ＩＪン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した後、凍結
乾燥を行い、抗ヒトヘモグロビン固定化濾紙粉末Ｃを得
た。反応液の吸収量変化（２８０ｎｍ）より、７０ｙｎ
ｇｌｔＦ紙粉末ｃの抗ヒトヘモグロビンが固定化されて
いることが分った。

（ＩＩ）　　潜血検出素子の作成 透明な厚さ１８０μｍの下引き済、ポリエチレンテレフ
タレート支持体上に下記組成の混合物を塗布した。

前記抗ヒトヘモグロビン固定化濾紙粉末ＣＩ９／１０ｈ
− トライトンＸ−１００（ロームアンドハース社製）　　
　　　　　　　　　５　ｏｖ／　１００ｍスポリビニル
アルコール（ＮＭ−４４日本合成化学工業（株）製）　
　　　　　　　２０９／１００倒２コポリ（スチレン−
グリシジルメタクリレート）モノマー重量比　９０：１
０　　２０■／１ｏｏω重得られた塗布物を２．０　ｆ
ｆｉ　Ｘ　４．０　（’Ｉｌｌの長方形に裁断し、その
上に２．０α角に裁断した濾紙（東洋濾紙Ａ１）を重ね
検出素子とした。

（ＤＩ）検出 新鮮な人糞のみ（サンプル番号１）、１ｏ。

２の新鮮な人糞を、それぞれ２１ｍ１のヒト血液（２）
、１０Ｉｎ９のミオグロビン（３）、１０ｍｇのヘマチ
ン（４）、２　ｍｌのヒト血液及び２００■のアスコル
ビン酸（５）で処理し、均質化したサンプルを調製する
。

これらの大便サンプルをヘラの先に採り、（■）で作成
した検出素子の濾紙上に適用し、３７℃で１０分間イン
キュベートした後、濾紙と分離１７、第１図のようにし
て、洗浄液として２００μｌの５％トライトンＸ−１０
０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）を展開し、未反応
物を検体適用領域外に拡散させた。更に５％＆Ｏｚを含
むｏ−トリジン−エタノール−酢酸混合液を便サンプル
を適用した領域の中心部付近滴下し、２分後の△ 色調変化を目視で観察した。また比較例として洗浄液を
便サンプルを適用した領域の中心部付近に滴下し、その
抜上と同じ発色液を加えたものとした。結果を下記表１
に示す。

これらの結果から明らかなように本発明の洗浄方法は、
未反応物を便サンプル適用領域外に確実に拡散させるこ
とができ、この方法に従って行われる検出方法は、判定
を誤シ難いことがわかる。

〔発明の効果〕

以上説明したように１本発明方法によれば検体中の特定
物質を十分に洗浄することが可能となり、妨害物質の影
響力＜、簡便に正確な判定ができるという顕著な効果が
奏せられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の洗浄方法の一例を示す模式１：検出素
子、２：検体を適用１．た領域、５：洗浄液

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、液体不浸透性支持体上に抗体が固定化された担体を
   含有する多孔性層を少なくとも一層有する分析素子に、
   検体を適用し、分析素子中の固定化された抗体と検体中
   の抗原とを反応させた後、未反応成分を洗浄によって、
   該検体を適用領域外に拡散させ、次いで抗体と結合した
   抗原を触媒として分光特性に変化を生ずる成分を含有す
   る反応液を、該検体を適用した領域に適用して分析素子
   上で分光特性に変化を生じさせ、その変化を測定する抗
   原の検出方法において、洗浄液を毛管現象によって分析
   素子中に展開させることにより洗浄を行うことを特徴と
   する抗原の検出方法。