JPS61502514A

JPS61502514A - 成長関連ホルモン

Info

Publication number: JPS61502514A
Application number: JP60502712A
Authority: JP
Inventors: ナサンズ，ダニエル; リンザー，ダニエル　アイ．，エツチ
Original assignee: ザ　ジヨンズ　ホプキンズ　ユニバ−シイテイ
Priority date: 1984-06-28
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1986-11-06
Also published as: AU4492085A; US4767709A; WO1986000338A1; EP0190163A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】特表昭６１−５０２５１４　（２）成長関連ホルモン技術分野本発明はプロラクチン−成長ホルモン族の成長関連ホルモンであるゾロリフニリン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ　）　、プロリフニリンをコードしているＤＮＡ分子及びゾロリフニリンを生産する遺伝子工学的方法に関する。

発明の背景プロラクチン（ＰＲＬ　）　、成長ホルモン（ＧＨ）及び胎盤性ラクトダン（ＰＬ、又は絨毛性ンマトマモトロビンとも呼ばれる）は、構造、機能、免疫化学の密接に関連した、ポリペブチ−ホルモンの認識された一族を構成している。このプロラクチン−成長ホルモン族の３個は全て大きさが似ており（色々な種でアミノ酸が１９０−１９９個）であり、蛋白構造も似ている。

例えば各ホルモンは大体８５番目（ＧＨとＰＬ）又は９０番目（ＰＲＬ　）の遺伝子座に単一の相同トリプトファン残基と、２個の相同ジスルフィド結合を有している。この族の物質は皆それぞれ、この３個のホルモン間で類似している４個の内部領域を含んでいる。機能についてはこの３個のホルモンは皆乳腺刺激性及ヒ成長促進活性がある。このような構造及び機能の類似性が観察されることから、先祖にあたるホルモン遺伝子が複製されて発生したものと提唱されている。一般的な説明はミラーとエバーハルト（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ］ｉ：ｂｅｒｈａｒｄｔ　、）、エンドクリンレビュ−（Ｅ！ｎｄｏｃｒｉｎＲｅｖ、　）第４巻、９７−１３０頁（１９８３年）を参照。

このプロラクチン−成長ホルモン族のホルそンは医学的及び獣医学的に有用であるため、この族に属する新しいホルモンが同定できることは好ましい。

発明の要約本発明の目的は、ゾロリフニリン−成長ホルモン属の新しい一員である、哺乳類のゾロリフニリンを与えることである。

本発明の別の目的は、哺乳類のゾロリフニリンのアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ分子を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、原核細胞又は真核細胞で発現され得る哺乳類ゾロリフニリンのコード配列を含有するＤＮＡ分子を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、上記ＤＮＡ分子をインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で発現させて哺乳類ゾロリフニリンを産生ずる方法を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、哺乳類プロリフニリンのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子を作る方法を与えることである。

本発明のこれら及び他の目的は下記の１つ以上の実施態様により実現される。

ある実施態様において本発明は、哺乳類ゾロリフニリンのアミノ酸配列のイントロンのないコード配列を含有するＤＮＡ分子を与える。

本発明はまた、原核生物中で転写及び翻訳されて、哺乳類ゾロリフニリンのアミノ酸配列を含有する蛋白釦なりうるコード配列を有するＤＮＡ分子を与える。

また別の態様において本発明は、上記ＤＮＡ分子をインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で転写又は翻訳させて哺乳類プロリフニリンのアミノ酸配列を有するポリペプチドにして、このポリペプチドから（もしある場合は）リーダー配列を除去して、哺乳類ゾロリフニリンのアミノ酸配列を有する蛋白を得ることより成る、該蛋白の磁区方法を与える。

本発明のさらに別の実施態様は、ＡＴＣＣ受入れ番号筒３９７２１゛号で寄託された大腸菌株中に含まれるプラスミドＰＬＦ　−１を与える。

さらに別の実施態様において本発明は、（イ）哺乳類の最初の種の増殖又は繁殖している細胞から単離したｍＲＮＡよりｃ　ＤＮＡライブラリーを作り、（ロ）このｃＤＮＡライブラリーから、哺乳類の二番目の種のゾロリフニリンのコード配列の一部又は全部を含有するＤＮＡ分子の少なくとも一部とハイブリダイゼーションをするｃＤＮＡクローンを選択し、←→選択したＣ　ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を決定することより成る、補元類ゾロリフニリンのアミツノ酸配列をコードするＣＤＮＡ分子を同定する方法を与える。

さらに別の実施態様において本発明は、哺乳類ゾロリフニリンより成る細胞を含まない組成物を与える。

図面の説明図１は哺乳類プロリフニリンのＣＤＮＡ　（及びそれにコードされると予想されるアミノ酸配列）のヌクレオチド配列と、そのシグナル又はリーダー配列を示す。

図２は、図１のｃＤＮＡ分子を含有するプラスミドＰＬＦ　−１の制限酵素地図である。

図３は牛プロラクチン、ネズミゾロリフエリン及び牛成長ホルモンのアミノ酸配列の比較である。

図４はネズミゾロリフエリン、牛プロラクチン及び牛成長ホルモンのシスティン残基とトリプトファン残基の位置を示す。

発明の詳細な説明プロラクチン、成長ホルモン及び胎盤性ラクトゲンより構成されることが知られているプロラクチン−成長ホルモン族の新し℃・−員が発見された。この新しい哺乳類ホルモンであるプロリフニリン（ＰＬＦ　）は、プロラクチンとかなりよく似ており、プロラクチンに特徴的ナシスティンとトリプトファン残基金基本的に同じ位置に有している。しかしプロラクチンや成長ホルモンと異なりゾロリフニリンのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ　）は、マウスのような哺乳類の下垂体前葉中では検出されておらず、ゾロリフニリン：ｎＲＮＡは、繊維芽細胞、悪性腫瘍細胞株及び胎盤組織等の、ある種の増殖又は繁殖している細胞中に見出される。哺乳類ゾロリフニリンの成熟蛋白のアミノ酸残基量の範囲はプロラクチン −成長ホルモン族の他のホルモンに一般的にみられるものと同じで約２２．０００から２３，０００であり、成熟型はグリコジル化されていることもある。

哺乳類ゾロリフニリンのアミノ酸配列と、配列の分かつているプロラクチン−成長ホルモン族の他のホルモンのアミノ酸配列は非常によく似ているが、哺乳類ゾロリフエリ／に最もよく似ている（しかし完全に同一ではない）のはプロラクチ／であろう。胎盤性ラクトゲンについて入手できるデータから、ヒト胎盤性ラクトデンは成長ホルモンに最もよく似ている。プロラクチンと成長ホルモンの種間の相同性に基づいて判断すると、第１の種のゾロリフニリンと第２の種のゾロリフニリンの相同性の程度は、第１の種と第２の種のプロラクチンの相同性にほぼ等しい。さらに第１と第２の種のプロリフエリア間の相同の程度は、第１の種のプロリフニリンとプロラクチンの相同の程度より高−ゝ。

ゾロリフニリンはプロラクチン−成長ホルモン族の一員であるため、当然プロラクチン、成長ホルモン及び胎盤性ラクトゲンの生物活性に関連した生物活性を有している。従ってゾロリフニリンは明らかに医学及び獣医学分野に関係している（例えば標的組織の細胞の成長、繁殖及び調節又は刺激）。ゾロリフニリンはまたプロラクチン−成長ホルモン族の他のホルモンにない活性を有している可能性もある。

哺乳類プロリフニリンの具体例はネズミのゾロリフニリン（ｍＰＬＦ　）である。本発明ではｍＰＬＦのコード配列を有する相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）分子が与えられる。

このｃＤＮＡ分子、及びこれがコードするアミノ酸配列を図１に示す。このＣＤＮＡ分子はプラスミドＰＬＦ　−１中にあり、このプラスミドは大腸菌ＭＭ２９４株中に存在する。この大腸菌株は１９８４年５月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（２０８５２メアリーランド州、ロックビル市、パークローンドライブ）に寄託され、受入れ番号第３９７２１号を与えられた。

ＰＬＦ　−１プラスミド（又は類似の合成オリゴヌクレオチド）のｃＤＮＡ部分の一部又は全部は、哺乳類ゾロリフニリン蛋白の発現、又は哺乳類プロリフニリンをコードする他の種のｃ　ＤＮＡを同定のためのプローブとして使用し得る。

図１に示す完全な配列はネズミのプレプロリフニリン（すなわちゾロリフニリン蛋白とそのリーダー配列）である。当業者は、密接に関連したホルモン（例えばプロラクチ／又はゾロリフニリン）の既知のリーダー配列と比較したり、又は７オンヘイジン（Ｖａｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　）、ヨーロピーアンジャーナルオブバイオケミストリ−（Ｅｕｒ、　、Ｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１３３巻、１７− ２１頁（１９８３年）に記載の経験則から、このリーダー配列の末端を決定することができる。この経験則は、最初の約２９個のコードされたアミノ酸がシグナル又はリーダー配列であることを示している。従って、この成熟ｍＰＬＦポリペプチドは、２９位のセリン残基の後のリーダー配列が切断されることにより産生されると予測できる。もちろん蛋白のいくつかのアミノ酸を添加又は欠失しても、その生物活性は実質的に影響を受けず、本発明で請求しているＤＮＡ分子にコードされているアミノ酸配列をこのように変更しても、本発明の精神から逸脱するものではな（・。この哺乳類プロリフニリンの天然型は、このｃＤＮＡ分子にコードされ発現されるポリペプチドのリーダー配列が除去される必要があり、（種によっては）１つ以上のａｓｎ−ｘ−ｓｅｒ又はａｓｎ−ｘ−ｔｈｒ領域でグリコジル化される必要がある。インビｄｅ　（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で発現するためにはリーダー配列をコードするヌクレオチド、配列を、ＤＮＡ分子から除去しなければならない。哺乳類プロリフニリンのコード配列を含有するＤＮＡ分子の発現は後述する。

このプロリフエリ／蛋白は天然状態では、妨害配列（すなわちイントロン）を有する真核生物染色体ＤＮＡの遺伝子のコード配列中にコードされている。真核細胞では、イントロンによりコードされる配列を含む蛋白を最終的に発現することなく、コード配列（エクソン）を転写及び翻訳する生化学的機構が存在するが、原核細胞にはこのような機構はない。従って本発明は哺乳類ゾロリフニリンのコード配列を含むＤＮＡ分子を与えるが、イントロンを含まない、形のＤＮＡ分子であるため、原核細胞により哺乳類ゾロリフニリンのアミノ酸配列を含有するポリペプチドに発現（すなわち転写及び翻訳）することができる。実施態様の１つではＤＮＡ分子は成熟プロリフニリンのアミノ酸配列のみをコードしている。また別の実施態様ではこのＤＮＡ分子はリーダー配列も含有している（すなわちプレゾロリフニリン）。

原核生物中で哺乳類ゾロリフニリンのアミノ酸配列を含有する蛋白を発現するＤＮＡ分子は、哺乳類ゾロリフニリンをコーｒして（・る遺伝子（例えば原核生物の遺伝子）を転写して得られるｍＲＮＡのｃ　ＤＮＡ転写体を作ることＫより産生じ得る。真核細胞の処理したｍＲＮＡはイントロンを含まないため、このｃＤＮＡ転写体は原核細胞中で発現するのに適している。ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写体コピーを作る一般的方法は当業者には公知である。

例えば米国特許第４，４４６．２３５号、４，４４０，８５９号、４．４３３．１４０号、４，４３１．７４０号、４，３７０．４１７号、４．３６３．８７７号を参照。プラスミドＰＬＦ　−１中でｍＰＬＦのｃＤＮＡ転写体を作る方法を以下に詳細に記載する。

ＰＬＦ　−１中のＣＤＮＡ分子の断片は、他の種から哺乳類プロリ７工ＩＪ　７　ｔ−単離するのに使用できる貴重なプローブである。例えば米国特許第４，４４６，２３５号及び英国特許明細書Ｇ　Ｂ　２，２１５，４０９号を参照。他の哺乳類ゾロリフニリンの相同配列も使用できる。ｍＲＮＡの起源として哺乳類の最初の種の適当な増殖及び／又は繁殖細胞が使用される。最初の種の細胞の起源としては、例えばヒト、牛、馬、羊、又は豚でもよく、適当な細胞としては胎盤組織、繊維芽細胞株、又は悪性腫瘍細胞株がある。単離したｍＲＮＡはインビトロ（１ｎｖｉｔｒｏ　）でｃＤＮＡ分子に転写され、これを適当なベクター（例えばプラスミド）中にクローン化させてｃＤＮＡライブラリーを作る。次に２番目の種のＰＬＦのｃＤＮＡコード配列（例えばｍＰＬＦｃＤＮＡ　）に相同の配列を用いて、ライブラリーの可能性のあるｃ　ＤＮＡを同定する。プローブとのハイブリダイゼーションにより検出されるｃ　ＤＮＡのヌクレオチド配列は決定され、アミノ酸配列が予測できる。

ある特定のｃ　ＤＮＡ分子から予測されるアミノ酸配列に基づき、当業者はゾロリフニリンをコードしている分子を容易に同定できる。まず最初に当業者は、分子量とプロラクチン−成長ホルモン族のホルモンに対する一般的なアミノ酸配列の相同性から、その族のホルモンをコードして（・るｃＤＮＡ分子を同定する。

例えばミラーとエバーハルト（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ　）、エンドクリンレビュ−（Ｋｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、　）第４巻、９７−１３０頁（１９８３年）参照。次にアミノ酸配列の特徴から２番目の種のゾロリフニリンをコードしているｃＤＮＡ分子が容易に同定できる。ゾロリフニリンアミノ酸配列は成長ホルモンよりプロラクチンの方により相同性が高く、他のゾロリフニリンに最もよく似ている。例えば１番目の種のゾロリフニリン配列は、１番目又は２番目の種のプロラクチン配列に対するよりも、２番目の種（例えばネズミ）のゾロリフニリン配列九より相同性が高いであろう。このゾロリフニリン蛋白は、ネズミのゾロリフニリンやネズミのプロラクチン中に見出される蛋白と基本的に同じ位置にシスティン残基も見出されるであろう。また１番目の種のプロリフニリンは、他のゾロリフニリンやプロラクチンと基本的に同じ位置にトリノトフ乙／残基を有している可能性が高い。しかしながらネズミのプロラクチンに見られるようにトリプトファンの数は異なるかも知れない。成熟ホルモン量が十分であれば、このホルモンをさらに性状解析するために、プロリフニリン−プロラクチン−成長ホルモン−胎盤性ラクトダン族と生物活性を比較することが好ましい。最後にｍＲＮＡの細胞起源を考える。すなわちゾロリフニリンｍＲＮＡは一般的に増殖又は繁殖細胞又は組織中に見出される。

当業者は容易に前記の比較が可能である。例えばコウモ）　（ｘｏｈｍｏｔｏ　）　ラ、ヨーロビーアンシャーナルオプバイオケミストリ−（Ｐ２ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１３８巻、２２７−２３７頁（１９８４年）を参照。

本発明のｃ　ＤＮＡ分子は原核生物又は真核生物中でインビボ（ｉｎ　ｖＬｖｏ　）で発現させることが可能である。

真核生物のコード配列を含むｃＤＮＡ分子を原核生物中で発現させる方法は公知である。例えば、米国特許第４，４４０．８５９号；４．４３６．８１５号；４．４３１，７４０号：４．４３１．７３９号；　４，４２８，９４１号；　４．４２５，４３７号；４．４１８．１４９号；４，４１１．９９４号；　４．３６６．２４６号；及び４，３４２．８３２号を参照。又英国特許明細書Ｇ　Ｂ　２，１２１．０５４号；　Ｇ　Ｂ　２．ＯＤ　８，１２３号：Ｇ　Ｂ　２．００７．６７号；　Ｇ　Ｂ　２，００７，６７５号；及びヨーロッパ特許明細書筒１０３，３９５号を参照。

哺乳類のリーダー配列の欠如しているａＤＮＡ分子は、原核生物の制御領域（すなわちプロモーター、オペレーター等）により調節される位置で、原核生物発現ベクター（例えばプラスミド又はバクテリオファージ）中に挿入することが好ましく、又コード配列の開始コドンはりボゾーム結合配列から正しい距離にあることが好ましい。原核生物のリーダー配列は、蛋白の細胞外輸送を促進し、蛋白を蛋白分、５４酵素から保護するのに好ましい。例えば米国特許第４，４３１，７３９号４，４２５．４３７号を参照。無数の原核生物発現ベクター（例えばプラスミドＰλ８）が知られている。例えばリード（Ｒｅｅｄ　）、メンツズインエンデイモロゾー（Ｍ８ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）第１００巻、１９１−１９６頁（１９８３年）を参照。

適当な発現ベクターの選択は、当該分野の技術の範囲内にある。原核生物から回収される蛋白は生物活性のあるプロリフニリンとするためインビトロ（ｉｎ　ＶｉｔｒＯ）で処理〔すなわち、（もし存在する場合は）リーダー配列の切断、そして（もし適切な場合は）グリコジル化〕する必要がある。

本発明により与えられるｃ　ＤＮＡ分子は原核細胞中での発現に特に適しているが、リーダー配列の切断とグリコジル化だめの酵素を含有する真核細胞中でｃ　ＤＮＡ分子を発現させることも有効である。真核細胞中で外来性ＤＮＡを発現させる方法は当該分野において公知である。例えば、酵母中で蛋白をコードする外来性ＤＮＡを発現する方法は公知である。例えば、米国特許第４．４４６．２３５号、４，４４３．５３９号、４，４３０．４２８号を参照。又例えばヨーロッパ特許明細書簡１０３．４０９号、１００，５６１号、０９６．４９１号を参照。真核細胞は又、目的の蛋白をコードする外来性ｃＤＮＡ　（例えばＰＬＦ　）や、選択可能な表現型をコードする２番目の外来性ＤＮＡ分子（例えば単純ヘルペスキナーゼ遺伝子）と共に形質転換することも可能である。例えば米国特許第４，３９９．２１６号参照。もう１つの方法は真核生物のウィルスベクター〔例えば猿ウィルス４０（ＳＶ４０）又は牛パピローマウィルス〕を用いて、一過性に感染させるか又は真核細胞を形質転換させて蛋白を発現させることである。例えば米国特許第４．４４２，２０５号及び第４，４１９，４４６号を参照。又「真核生物ウィルスベクターＪ　（ＥｕｃａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　）　Ｃコールドスプリングハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　）研究所〕；バブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ　）ら、プロシーデイングズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第７８巻、７３９８頁（１９８１年）を参照。

本発明により与えられるＤＮＡ分子は、噴孔頌ゾロリフニリンをコードする真核生物染色体又はｒツムＤＮＡを単離するのに用いられるプローブ源として使用できる。このＤＮＡ分子のレトロウィルスベクターへの挿入は、イントロンを含まないｃＤＮＡ様のプロリフニリンをコードする断片を作るのに使用し得る。例えばシモトウノとチミン（Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ　＆　Ｔｅｍ１ｎ　）、ネーチャー第２９９巻、２６５−２６８頁（１９８２年）ｆ：参照。このイントロンを含まないＤＮＡ分子は上記の原核生物又は真核生物発現ベクター中で使用し得る。

あるいはこの単離したデノムＤＮＡは、真核細胞により成熟プロリフニリンに転写及び翻訳され得る外来性又は新規ＤＮＡ断片を含む真核細胞を産生させるために、真核生物ベクターを用いて又は用いないで真核細胞を形質転換させるのに直接使用し得る。形質転換とは、任意の公知の方法（例えばウィルスベクター、酵母プラスミド、ＣａＣｌ２共沈法、又は微量注入法）により新しいＤＮＡを導入して受容細胞の遺伝子型を変化させることと定義される。例えば米国特許第４，４４６，２３５号を参照。この細胞は、２番目の種のゾロリフニリンＤＮＡ又は同じ種のプロリフニリン遺伝子の追加コーーを用いて形質転換される。もし細胞が培養可能な細胞株（例えば繊維芽細胞又は悪性腫瘍細胞）由来の時は、形質転換した細胞はクローン的に形質転換した細胞株に拡張される。

原核細胞を用いてゾロリフニリンを発現しようが又は真核細胞を用いてゾロリフニリンを発現しようが、可溶性の、細胞を含まない（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　）　（すなわち細胞又は組織に結合していない）型のゾロリフニリンの回収は、当該技術分野に含まれる。このゾロリフニリンの細胞を含まない組成物は当筬分野の公知の方法とより実質的に精製及び／又は濃縮されるか、又は粗調製物として残される。

本発明の方法を実施するには組み換えＤＮＡ技術を応用する必要があるが、この技術は当該分野の範囲内にある。例えば分子クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニラボラトリーマニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）　（＝Ｚ−ルドスプリングハーバー（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　）研究所、マニアテイス、フリッチ及びサンプルーフ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔａｃｈ　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　）編、１９８２年〕；リンず− とナサンズ（Ｌｉｎｚｅｒ　＆　Ｎａｔｈａｎｓ　）、プロシーデイングズオプナショナルアカデミーオプサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第８０巻、４２７１−４２７５頁（１９８３年）；リンデーとナサンズ（Ｌｉｎｚｅｒ　＆　Ｎａｔｈａｎｓ　）、「ガン細胞Ｉ」：形質転換した表現型（Ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　）１１１ −１１５頁〔コールドスプリング／・−バー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）研究所、１９８４年〕を参照。これら及びその他の文献を本特許中に参考のため記載しである。

以下に示す本発明の具体的な実施態様は例示のためであり、決して本発明を限定するものではない。

鳥骨髄芽球ウィルス逆転写酵素と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（これらはそれぞれジエイビアド（ｙ、　Ｂｅａｒｄ　）とピーイングルンド（Ｐ、　Ｅｎｇｌｕｎｄ　）より供与された）を除く全ての酵素は市販品を購入した。精製された力価の明らかな血漿坂由来成長因子（ＰＤＧＦ　）はイーレインズ（Ｅ、　Ｒａ１ｎｅｓ　）とアールロス（Ｒ，Ｒｏｓｓ　）からの贈り物である（１６）。

細胞培養ＢＡＬＢ　／　ｃ３Ｔ３　Ｃトリｏ　（Ｔ＋ｏｄａｒｏ　）ら、ジャーナルオブセルバイオロゾー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　）第１７巻、２９９−３１３頁（１９６３年）〕細胞と０３Ｈ１０Ｔ１／２〔レジンコツ（Ｒｅｚｉｎｋｏｆｆ　）ら、キャンサーリサーチ（ＣａｎＣ，Ｒｅｓ、　）第３３巻、６２６１頁（１９７３年）〕細胞を、ペニシリン（１０単位／ｍｅ）、ストレプトマイシン（１０単位／ｒｎｅ）、グルタミｙ　（２ｍＭ　）　、及び牛胎児血清を１０係に補強したアールの塩（１！：ａｒｍ’５ｓａ１ｔｓ　）　Ｃギブコ（ＧＩＢＣＯ社）・〕を含むイーグル最小基本培地（ＭＥＭ　−１０）中で増殖させた。細胞をコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ　）になるまで培養し、０．５％牛脂児血清を含む最小基本培地（ＭＫＭ　−０，５）又は２％牛脂児血清を含む最小基本培地（ＭＥＭ　−２）を添加し、細胞を低血清中で少なくとも２日間維持して休止培養液を得た。休止細胞に、２０％牛脂児血清を含む最小基本培地（ＭＥＭ　−２０）を添加するか、最終濃度が１１ｍ９７ｍ１ＫなるようにＰＤＧＦを直接培地に加えるか、又はＣｓ（’１で分離した５０ゾラ一ク形成単位／ＩａＤＩＬＤ濃度ＬＤ　ＭＥＭ　−０，５中の猿ウィルス４０（ＳＶ４０）で感染させて、休止細胞を刺激した。ＭＫＭ　−１０及びＭＥＭ　−２で増殖している形質転換したＢＡＬＢ　／　Ｃ３Ｔ　３細胞株そ、れぞれＳＶＢ　ｉ　Ｑ　−ｉとＳＶＢ　１０−２を７エーベマウント（Ｐｈｏｅｂｅ　Ｍｏｕｎｔｓ　）によりフォーカス（ｆｏｃｕｓ　）として選択した。クレプス（Ｋｒｅｂｓ　）腹水ガン細胞をＢＡＬＢ　／　ｃマウスの腹腔中で増殖させ、接種１０日後に採取した。

ＲＮＡの精製注射１０日後にＢＡＬＢ　／　ｃマウスの腹腔からクレブス腹水がン細胞〔アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ｃｕｌｕｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）より〕を分離した。ＢＡＬＢ　／　ｃ３Ｔ３細胞やＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞と同じくこれらの細胞をグアニジニウムチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　）溶液中で溶解させ〔チャーブウィン（ＣｈｉｒｇＷｉｎ　）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１８巻、５２９４−５２９９頁（１９７９年）〕、ＲＮＡ　ｔ−ＣｓＣｌクッションでペレットにした〔グリシン（Ｇ１１ｓｉｎ　）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１３巻、２６３３−２６３７頁（１９７４年）〕。３Ｔ３細胞ＲＮＡは又、ｉ　ｏ　ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４／　Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１／　２．５　ｍＭ　ＭｇＣ！１２．０．５％ノニデット（Ｎｏｎ１ｄｅｔ　）　Ｐ　−４０中で溶解させた細胞の細胞質画分から調製し、Ｑ、５　％　ＮａＤｏａｓｏ、の存在下で１００μｆｉ／ｍｌのプロテイナーゼにで消化した。

オリゴ（ａＴ）−セルロースに対する２サイクルの結合によりポリ（Ａ）”ＲＮＡを選択した〔アビブとレーダー（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ　）、プロシーデイングズオプナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第６９巻、１４０８−１４１２頁２本鎖ｃＤＮＡ　ｔ −約２０μＩのポリ（Ａ）”Ｒｘｔａから合成〔ウイツケンズ（Ｗｉｃｋｓｎｓ　）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ−（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ！ｈｅｍ、　）第２５３巻、２４Ｂ５−２４９５頁（１９７８年）〕し、Ｇ及びＣホモポリマーテール〔ロイチョイヅーリ−（ｕｏｙｃｈｏｕａｈｕｒｙ）ら、ヌクレイツクアシッドリサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、）第３巻、１０１−１１６頁（１９７６年）；オオツカ（０ｔｓｕｋａ　）、ジーン（Ｇｏｎｅ　）第１３巻、３３９−３４６頁（１９８１年）〕により、プラスミドｐＫＰ　４３　Ｃケーペデン（Ｋ、　ｐｅｄｅｎ）により作成され供与されたＩ）ＢＲ３２２の９６７塩基対（ｂｐ　）欠失突然変異株〕の独特のＰｓｔ　Ｉ部位に挿入した。アニーリングしたベクターｃ　ＤＮＡを用いてコンビｐ７ト（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　）な大腸菌ＭＭ２９４株細胞を形質転換させ〔メセルソンとニアｙ（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｙｕａｎ　）、ネーチャー第２１７巻、１１１０ −１１１４頁（１９６８年）〕テトラサイクリン耐性とした〔レーダーバーブとコーエン（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ　）　、ジャーナルオプバクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）９６穴のマイクロタイタートレイ中で４μｍ！／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬブロス（ｂｒｏｔｈ　）中で各コ、ロニーを増殖させ、レプリカツールを用いてフィルター〔ゾーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　）、ニューイングラフ　’ｊ”　ニューフレアー（Ｎｅｗ　ＦＡｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）　］に移した。フィルター上でコロニーを増殖させ、プラスミドＤＮＡ　ｔ−１２５０μ９７ｍｌのクロラムフェニコールをふくむＬ寒天平版中で増やした〔フレウェル（Ｃｌｅｗｅｌｌ　）、ジャーナルオプバクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　萬１１０巻、６６７−６７６頁（１９７２年）〕。細胞を０．５　Ｍ　ＮａＯＨで溶解し、フィルターを１．０　Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４、及び０．５　Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４／　１．５　Ｍ　ＮａＣ１で洗滌した〔グルンシュタインとホッグネス（Ｇｒｕｎｓｔｓｉｎ　ａｎｄＨｏｇｎｅ日θ）、プロシーデイングズオプナショナルアカデミーオブサイエ／シーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、米国、第７２巻、３９６１−３９６５頁（１９７５年）〕。

文献〔ペデン（Ｐｅｄｅｎ　）ら、セル（Ｃｅ１ｌ　）第３１巻、７１−８０頁（１９８２年）〕記載通り忙ベーキング（ｂａｋｉｎｇ　）　Ｌインキュベートした後、フィルターを６８°Ｃで４８−７２時間、１　Ｘ　Ｉ　Ｑ’　ｄｐｍ／ｍ／のｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた。ＭＫＭ−０，５に６か間維持したコンフルエントな細胞、又はＭＥＭ　−１０中で増えていたコンフルエントに近い培養細胞の細胞質性ポリ（Ａ）”ＲＮＡから、３２ｐ−標識ｃ　ＤＮＡプローブを約５　ｘ　１０’　ｄｐｍ／μｙ　になるように合成した。フィルターを洗滌し〔ペデン（Ｐｅｄｅｎ　）ら、前出、１９８２年）、オートラジオグラフィーを行った（ラスキーとミルズ（Ｌａａｋｅｙ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｓ　）、工フイービーエスレターズ（ＦＰ２ＢＳ　Ｌｅｔｔ、　）第８２巻、３１４−３１６頁（１９７７年）〕。

高密度コロニーハイブリダイゼーション６μｊｉ／ｍｅのテトラサイクリンを含有する寒天子、板中のニトロセルロースフィルター上でｃＤＮＡライブラリ−を増殖させ、ハナハンとメセルノン（ＨａＨａｈａｎｎａｎｄ　Ｍｓｓｅｌｓｏｎ　）の方法〔ゾーン（ｏｅｎｅ　）第１０巻、６３−６７頁（１９８０年）〕に従し・レプリカフィルターを調製した。高密度スクリーニングでは、各８８朋Ｘ８８龍のフィルターは約５０．００　［１コロニーを有していた。このレプリカフィルター上の細菌のコロニーを溶解しく同上）、文献〔ペデン（Ｐｅｄｅｎ　）ら、セル（Ｃ１ｅｌｌ　）第３１巻、７１−８０頁（１９８２年）〕記載の方法に従（・ハイブリダイゼーションする前にフィルターをベーキングしインキュベートした。

１　Ｍ　ＮａＣ１、５０ｍＭ　ト　リ　ス　−　ＨＣＩ　、　ｐＨ７，４、５ｍＭＥＤＴＡ、Ｄ−５％　ＮａＤＯ＋１６１０ａと０．２係牛血清アルブミン、０．２係フアイコール、０．２係ポリビニルピロリドン〔デンハル）　（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）　、バイオケミストリーアンドバイオフィジックスリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅａ、　Ｏｏｍｍｕｎ、　）第２３巻、６４１−６５２頁（１９６６年）〕、変性大腸菌ＤＮＡ、及びＩ　Ｘ　１０’　ｄｐｍ　／ｍｌのキナ−、ゼ標識オリコ９ヌクレオチドを含む溶液中で、６７℃で１２−１８時間ノ・イブリダイゼーションを行った。フィルターをＱ、９　Ｍ　Ｎａ１ｌ　／　０．０９　Ｍクエン酸ナトリウムで液を数回取り替えて０℃で合計１時間洗滌し、次に同じ組成の新鮮な溶液で３７℃で１０分間の洗滌を２回行った〔ウオレス（Ｗａ’１ｌａｃｅ　）ら、ヌクレイツクアシツツリサーチ（ＮｕＣ１８１ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第９巻、８７９− ８９４頁（１９８１年）〕。乾燥後フィルターをＸ線フィルムに感光させた。ハイブリダイゼーション領域を取り出し、低密度で同じ方法を用いて再びスクリーニングした。最後にコロニーｔ−ｉつずつマイクロウェルにとり、同じ方法でスクリーニングした。

ドントブロットハイプリダイゼーションＢａｍ　ＨＸ制限酵素で線状化したプラスミドＤＮＡを１００℃で１５分間、０．１ＭのＮａＯＨ中で加熱して変性させた。各試料を等量の４５ｍＭ酢酸すｌ−ＩＪウム、ｐＨ４，８，２，５Ｍ　ＮａＣ１で中和し、直ちにプロリティックマニフオールド〔ベセスダリラーチラざラドリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）を用いて直チニニトロセルロースフィルター上ニスーットシタ。

このドツトスポットをコロニーのスクリーニングで述べたのと同じ方法で処理した。ノ・イブリダイゼーションの程度はまずオートラジオグラフィーで次に液体シンチレーション計測で解析した。

ＤＮＡの調製組み換えプラスミドＤＮＡを小さい規模で調製する〔ホルムズとキグレイ（Ｈｏｌｍｅｓ　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ　）、アナリテイカルバイオケミストリ−（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第１１４巻、１９３−１９７頁（１９８１年））か、又はｃｅｃ１／臭化エチジウム遠心分離で精製した（ペデン（ｐｅｄｅｎ　）ら、１９８２年、前出〕。臭化エチジウムはインブタノールで抽出し、Ｃｓ０１は透析又はエタノール沈殿で除去した。ラットのプロラクチンｃＤＮＡりｏ　−ンＰＲＬ　−２Ｃグビンズ（Ｇｕｂｂｉｎｓ　）ら、ヌクレイツクアシツヅリサーチ（Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第６巻、９１５−９３０頁（１９７９年）；グビンズ（Ｇｕｂｂ工ｎｓ　）ら、ジャーナルオプバイオロジカルケミス　ト　リ　−　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　第　２５５　巻、　８６５５−８６６２頁（１９８０年）〕は〕アールマウラー　Ｒ。

Ｍａｕｒｅｒ　）より頂いた。ＢＡＬＢ　／　ｃ肝ＤＮＡはケーペデン（Ｋ、　Ｐｅｄｅｎ　）に頂いた。鶏α−チュプリン（ｔｕｂｕｌｉｎ　）ｃ　ＤＮＡクローン〔クリーブランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　）ら、セル（Ｃｅ１ｌ　）第２０巻、９５−１０５頁（１９８０年）〕はディークリーブランド（Ｄ、　ｃｌｓｖｅｌａｎａ　）博士より頂いた。

合成オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ３３　［］　Ａ　ＤＮＡシンセサイデーで合成し、最終生成物は高速液体クロマトグラフィーで精製した。オリゴヌクレオチドはＴ４ポリメラーゼキナーゼとガンマ−３２ｐ　−ＡＴＰで標識した。

ＲＮＡフィルターハイブリダイゼーション変性した全細胞ＲＮＡはホルムアルデヒド寒天デルで電気泳動〔レーラツハ（Ｌｅｈｒａｃｈ　）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１６巻、４７４３頁（１９７７年）；ゴウルドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　）、プロンーデイングズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第７７巻、５７９４頁（１９８０年）〕シ、ニトロセルロースに移した〔トーツス（Ｔｈｏｍａ８　）、プロシーデイングズオプナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第７７巻、５２０１頁（１９８０年）〕。Ｂ８０で２時間真空下でベーキングした後、フィルターを４２℃で３時間ホルムアミド緩衝液中でプレノ・イプリダイゼーションし〔フェラス（ＦｘｌＯｕ８　）ら、プロシーデイングズオプナショナルアカデミーオプサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　）第７９巻、３０８２頁（１９８２年）〕、次に１０　ｔ４７ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５　μｇ１ｍｌ　ｔＲＮＡ、及び１　２Ｘ１０８ｄｐｍ／μ ｌにニックトランスレーション〔リグビー（Ｒｌｇｂｙ　）ら、ジャーナルオブモレキュラーバイオロゾー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）第１１３巻、２３７頁（１９７７年）〕シたＩ　Ｘ　１０’　ｄｐｍ／ｍ／の組み換えプラスミドＤＮＡを含むホルムアミド緩衝液でハイブリダイゼーションさせた。３６−４８時間後にノ〜イブリダイゼーションを止め、フィルターを洗滌した（　）　？　ス（Ｔｈｏｍａｓ　）、１９８０年、前出〕。

マウスのデノムＤＮＡ　’ｉ制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ工で消化シ、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させてから、１％寒天ケ９ルで電気泳動した。ＤＮＡ　’ｉ　ニトロセルロースに移し〔？ずン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）、ジャーナルオブバイオロジカルケミス）　リ−（Ｊ、　Ｂ１１１゜Ｃｈｅｍ、　）第９８巻、５０３−５１７頁（１’　９７５年）〕、ベーキングした後、コロニーハイブリダイゼーションのところで記載した様に処理した、ただし、大腸菌ＤＮＡの代りにサケ精子ＤＮＡを使用し、ｃ　ＤＮＡやオリゴヌクレオチ団の代りＫ　５　Ｘ　１０８ｄｐｍ／μｙにニックトランスレーション〔リグビー（、Ｒｌｇｂｙ　）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ−（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ａｈθｍ、）第１１６巻、２３７−２５１頁（１９７７年）〕シたｃＤＮａクローンを使用した。ラットプロラクチンクローンＰＲＬ　−２を用いて６０℃ で６０時間ノ・イブリダイゼーションを行った：フィルターを６７℃で６０時間マウスプロリフニリンクローンでノ・イブリダイゼーションした。フィルターをそれぞれ６０℃又は６７℃で洗滌〔ペデン（Ｐｅｄｅｎ　）ら、セル（Ｃ！ｅ１１）第３１巻、７１−８０頁（１９８２年）〕シ、次にオートラジオグラフィーをして感光させた。

ＤＮＡ配列解析制限酵素による切断で残った５′張出し部分をふさいでｃＤＮＡクローンを、大腸菌フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片とアルファー３２ｐ−デオキシヌクレオシドで標識した。Ｐｓｔｌ　３’張出し部分をアルファー３２ｐ−コルディセビン３リン酸とターミナルトランスフェラーゼで標識した〔）とニーエン（Ｔｕ　ａｎｄ　Ｃｏｈａｎ　）、ゾーン（Ｇｅｎｅ　）第１０巻、１７７−１８３頁（１９８０年）〕。

一端を標識した断片をポリアクリルアミドデルから単離し、マキサムとギルバートの方法〔メンツズインエンヂイモｅｌジー（Ｍｅｔｈ、　：ｇｎＺ７ｍＯ１，）第６５巻、４９９−５６０頁（１９８０年）〕で配列を決定した。

切断生成物を８壬又は２０係ポリアクリルアミド−尿素デルで分解〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）　ラ、エフイーピー　ｘ　スＬ／　ターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　）第８７巻、１０７−１１０頁（１９７８年）〕シ、デルをオートランオフ６２フ２［］　μｉの１Ｑ　［１　ｍＭ　ＫＣＩ中１０μＩのクレブス腹水ガンポリ（Ａ）”ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせた。この混合液を７５℃で５分加熱し、次に４２℃で１５分、３７℃で１５分、２３℃で１０分加熱し、５　［］　ｍＭ　）リ　ス　ー　ＨＣｌ　、　ｐＨ８．３（４２　℃　）　、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、ｉＱｍＭジチオスレイトール、各々１ｍＭの４種のデオキシヌクレオシド３リン酸、５　０　０　Ｕ／ｍｌのＲＮａｓ　ｉｎ〔プロメガ−バイオチック（　Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｌｅｃ　）　〕、そして３０Ｕの逆転写酵素〔ライフサイエンス（　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　）　］　ｆ加えた。６７ ℃で１０分インキュベートし、次に４２℃で２時間インキュベートした。フェノール／クロロホルムで抽出した後、水層をポリアクリルアミドデルにのせ、電気泳動した。伸張したノライマーバンドを未固定の湿ったデルでオートラジオグラフィーして、このｃＤＮＡを溶出し配列を決定した〔マキサムとギルバート（　Ｍａｘａｍ　ａｎｄＧｉｌ’ｏｅｒｔ　）、メノツズインエンデイモロジ−（　Ｍ８ｔｈ。

ＥｎＺ７ｍＯ１．、　）第６５巻、４９９−５６０頁（１９８０年）〕。

〕ハイブリッドー選択翻訳ｏ　Ｕ　７　：ｒ−リフ　ｃＤＮＡクローン（２０μ，１ｉｔ）ｉＫｃｏＲ工で線状化し、０，ｉ　Ｎ　ＮａＯＨで変性させ、等量の４５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、２．５　Ｍ　ＮａＣ１で中和し、ニトロセルロース上にスピットした。ベーキングした後フィルターを洗滌し、１■のクレプス腹水ガン全細胞ＲＮＡ　Ｃ基本的Ｋ「モレクラ−クローニング：ラボラトリ−マニュアル」（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：ＬａｂＯｒａｔＯｒ７　Ｍａｎｕａｌ” ）、３２９−３４１頁、マニアテイス（　Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら編、１９８２年〕とノーイブリダイゼーションさせた。ノ・イブリダイゼーション混合液〔５０チホルムアルデヒド中、２Ｑ　ｍＭピペス（　Ｐｉｐｅｓ　）　、ｐＨ　６．４、０．２　％　ＮａＤＯｄＳＯ４・、４　［Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ！］−　）　］を７０℃で１０分間加熱し、次に５０℃で一晩インキユベートした。フィルターを洗滌後、結合したＲＮＡを溶出し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた（同上）。このＲＮＡを兎の網状赤血球で溶解物中で翻訳し、生成物を５Ｄｆ９ポリアクリルアミドデル電気泳動〔リームリ（　Ｌａ５ｍｍ１ｉ　）、ネーチャー第２２７巻１．５８０ー６８５頁（１９７０年）〕で分離した。ゲルを感光する前にエンハンス（　Ｅｎｈａｎｃｅ　）　Ｃニュー４７７２７２社（　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　、Ｎｕｃｌｅａｒ　）　３で処理した。

コンぎニーター解析ヌクレオチ団配列を、ウィルパーとりノブマン（　Ｗｉｌｂｕｒ　ａ．ｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　）　Ｃナショナルアカデミーオプサイエンシーズ（　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　）第８０巻、７２６−７３０頁（１９８３年）〕の計算法を用いてロサンゼルスデータバンク中の配列と比較した。

哺乳類細胞トランスフェクション（ＤＮＡｇ染）ＰＬＦ　−　１コ一ｒ配列のカルボキシ末端にＢａｍ　Ｈ工’）ンカーを結合して変化させた。次にアミン末端コード領域に阻ｎｄ−［［’Ｊンカーを結合して変化させた。ｐＢＲ３２２中でクローン化した猿ウィルス４　０　（Ｆ３Ｖ１１０）の後の領域のＨｌｎｄ　− 　Ｉ［１とＢａｎ　ＨＩ間に、このＤＮＡを挿入した。次にプラスミドＤＮＡをＢａｍ　Ｉ（Ｉで切断し、５ｖ４０部分を再環状化して５ｖ４０ゲノム（ｖｐ１遺伝子の代りにｍＰＬＦｃＤＮＡが入っている）を作った。

猿の細胞をＳ　Ｖ　４　０−　ＰＬＦＤＮＡ、及び未変性の前部のないヘルパー５Ｖ４Ｑと共にトランスフェクションさせた。混合したウィルスの保存物はトランスフェクションした細胞溶解物由来であり，他の猿の細胞を感染させてゾロリフニリン蛋白を発現するのに使用した。

ＭＥＭ　−　２　０による刺激の１２時間後ｉＣ　ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３組織培養細胞から、全細胞ＲＮＡを調製した。〔３Ｈ〕チミジンのトリクロロ酢酸不溶性物質の取込みが示すように、この時間はＤＮＡ合成開始の時間に相当する。

（ＤＮＡ合成の最大の時間は血清添加１６−１８時間後である）。ボ’Ｊ　（Ａ）”ＲＮＡ画分を鋳型として用いて２末鎖ｃＤＮＡを合成し、これをプラスミド１）ＫＦ　４５のβラクタマーゼ遺伝子に挿入した。この組み換え分子をコンビタントな大腸菌に接種し、約Ｉ　Ｘ　１０６個の形質転換体のｃＤＮＡライブラリーを作成した。

成長関連クローンのスクリーニング９６−六マイクロタイタートレイ中で各アンピシリン感受性コロニーを、液体培養で一晩増殖させた。レプリカフィルターを調製し、フィルター上でコロニーを樹立し、クコラムフェニコールの存在下でフィルターをインキュベートしてプラスミドＤＮＡ配列を増やした。各細菌中のシラスミドＤＮＡを変性させ、フィルター上に固定し、休止して（・るか、又は増殖しているＢＡＬＢ　／　Ｃ３Ｔ３細胞の細胞質性ポリ（Ａ）　”ＲＮＡのｃＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションの程度はオートラジオグラフィーで測定した。増殖細胞ＲＮＡからのプローブに優先的にノ・イブリダイゼーションするコロニーを選んでさらに解析した。

この最初の実験でスクリーニングした３、５００個のコロニーの内約９５係が排除された。どのコロニーも休止細胞プローブに対して一貫して大きなハイブリダイゼーション度合いを示さなかった。

暫定的に増殖細胞−特異性配列を有するクローンと、コロニーハイブリダイセ゛ −ジョンに特異性が認められなかったいくつかの対照クローンから、ＤＮＡを調製した。組み換えＤＮＡをひとつずつ調製し、２個１組でニトロセルロースフィルターに添加し、休止細胞及び増殖細胞特異プローブとノ・イブリダイゼーションさせた。

これらのフィルターをオートラジオグラフィーすると、増殖細胞ＲＮＡに対して優先的にノ・イプリダイゼーションする１３個のクローンが検出された。これらのクローンは最初にスクリーニングしたライブラリーの配列の約０．５％に相当する。この１３個の各クローンのノ・イブリダイゼーションの特異性の差を、ＣｓＣ！ｌ−精製ＤＮＡドツトプロットを用いて定量した。変性ＤＮＡをニトロセルロース上にスピットし、フィルターを休止Ｍ胞及び増殖細胞特異性ｃＤＮＡプローブにノ・イブリダイゼーションさせた。各ドツトのｃｐｍを液体シンチレーションカウンター中で測定し、ベクターのみの対応するｃｐｍを差し引いて、ハイブリダイゼーションの程度をめた。その結果明らかにクローン化ＤＮＡは、血清に対する応答及び量が異なるｍＲＮＡに由来していた。

ＲＮＡ産生の血清刺激相対的ノ・イブリダイゼーションが最大であった各８個のクローンを、静止細胞中、及び血清刺激後種々の時間における対応するＲＮｉの濃度を測定するためのプローブとして用いた。ＭＫＭ　−２中に維持したフンフルエンスに達した細胞、及び６−３６時間ＭＥＭ　−２０を与えて刺激した培養物から、全細胞ＲＮＡを調製した。

ＲＮＡをホルムアルデヒド／寒天ゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移しニックトランスレーションしたクローン化ＤＮＡと反応させた。クローン１８Ａ２．２８Ｈ６，３２Ａ４では、刺激したＢＡＬＥ　／　ｃ　３Ｔ３培養細胞と非増殖ＢＡＬＢ／ｃ　３’ｒ３培養細胞中に存在する対応するＲＮＡ０間に有意の差があった。１８Ａ２は約０．７キロ塩基対（ｋｂ）の１本のＲＮＡとハイブリダイゼーションし、２８Ｈ６はｉ　ｋｂのＲＮＡのほとんど及び少量のそれより分子量の大きいＲＮＡを検出し、３２Ａ４は数個のＲＮＡとハイブリダイゼーションした。別のｃＤＮＡクローン（３１Ｇ８）を用いた対照ハイブリダイゼーションでは、コロニー及びドツトプロット解析でハイプリダイゼーショ／に差は認められなかった。

種々のＲＮＡに対するハイブリダイゼーションの強さから、２８Ｈ６，３２Ａ４、及び３　ｉ　Ｇ　８ＲＮＡは１８Ａ２ＲＮＡよりたくさんあると考えられる。

各電気泳動レーンをデンシトメータでトレースして、ある時間に検出されたＲＮＡの量をそのＲＮＡの最大量に対して標単化した。ＲＮＡの量は調べたＲＮＡ毎に異なっていた。１８Ａ　２　ＲＮＡは血清刺激後１２時間低濃度を維持し、その後急に増加して休止細胞時の量の少なくとも３倍になり、３６時間目まで高濃度を維持した（この急激な上昇はＤＮＡ合成の開始に対応する）。これに対して、２８Ｈ６プローブにハイブリダイゼーションしたｉ　−ｋｂＲＮＡは血清添加後１２時間まで着実に増加し、休止細胞時より少なくとも１５−２０倍の量に達した。別の実験では、２８　Ｈ６１−ｋｂ　ＲＮＡは休止細胞中では検出されず、血清刺激後３時間以内知現れた。従ってＤＮＡ合成よりも２８Ｈ６特異的ＲＮＡの増加が早かった。１２時間目の時点では又１８Ａ２ＲＮＡとは対照的に、２８Ｈ乙の量は減少した。６２Ａ４プローブはさらに複雑なパターンを示した。０．６ｋｂＲＮＡは１２時間目でピークに達し約３倍に増加した後、減・少した。

大きい３つのＲＮＡは量が変化せず、０．４−ｋｌ）　ＲＮＡの量は増加して２４時間目にピークに達した。

他の成長特異的クローンをプローブとして用いて、３２Ａ４クローンで検出されるパターンに同じＲＮＡのパターンが検出された。

又解析した全細胞ＲＮＡのボ１７　（Ａ）＋画分は、１８Ａ２．２８Ｈ６及び３２Ａ４クローンと結合した。その結果は細胞ＲＮＡで見られたものによく似ていた。しかし、高分子ｌの２８　Ｈ６ＲＮＡ及び３２　Ａ　４　０．４−　ｋｂと２．９−　ｋｂバンドはボＩＪ　（Ａ）＋画分（て検出されなかった。

休止細胞から２８　Ｈ６ＲＮＡが事実上検出されずＤＮＡ合成開始直前だこのＲＮＡが著明に増加したため、下記のＭＥＭ　−１０中で維持したＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ　３細胞から、ホホコンフルエントナ２　点（コンフルエンスの約２０％と９０％）、血清欠乏時（コフルエンスに達した後ＭＥＭ−０，５中で１日及び２日後）、及び２日間欠乏させた培養液にＸＡＥＭ　−２０を添加した後１２時間後及び２４時間後に、全細胞ＲＮＡを精製した。このＲＮＡを電気泳動し、ニトロセルＰ−スに移し、２８Ｈ６プラスミドＤＮＡとα−チュブリンｃＤＮＡクローンを混合したプローブとノ・イブリダイゼーションさせた。

２８　Ｈ６ＤＮＡ　Ｋハイブリダイゼーションするｉ　−ｋｂＲＮＡは、増殖中のほぼコンフルエントな細胞培養液中で高１度に存在していた。細胞濃度が上昇するとこの濃度が減少したが、細胞は１０％の血清を含む培地中に存在しておりまだコンフルエンスに達していなかった。上記したように飢餓培養でもこのＲＮＡ　９度は低く、一方血清刺激試料では大量に発現された。血清刺激試料では大きい４−　ｋｂの２８Ｈ６特異ＲＮＡも増加していた。α−チュブリンｉ、３− 　ｋｂＲＮＡも、高密度で血清欠乏培養よりも、低密度で活発に増殖している細胞りα−チュブリンＲＮＡの量が回復し、２０チのコンフルエンスの培養級中と同じか又はより高い濃度で存在していた。しかしこの間２８Ｈ６特異ＲＮＡの濃度変化はα−テユプリンよりも大きかった。

細胞を低濃度でＭＥＭ　−１０のプレートに広げ、翌日ＭＥＭ　−２かＭＥＭ　 −１０ｋ添加した。以後毎日全細胞ＲＮＡを調製するため、いくつかのプレートから細胞を集め、残りのプレートの培地は新鮮なＭＥＭ　−２又はＭＥＭ　−１０に取り替えた。ＭＥＭ　−２及びＭＥＭ　−１０を供給した培養液は実験の間中同じ速度で増殖及び分裂をした。約２０係、５０％、９８チ及び１００％にコンフルエントな培養液からＲＮＡ試料を採取した。

２８Ｈ６特異ＲＮＡ　（ｉ　−ｋｂと４−　ｋｂＲＮＡ共）２％血清より１０％血清で増殖している細胞中で量が多かった。しかしいずれの場合も細胞密度が増加するにつれてＲＮＡ　９度は減少した。ＭＫＭ　−１０をかえないでほぼコンフルエンスになった培養液より、新鮮なＭＥＭ−１０で刺激したコアフルエンドな培養液の方が２８Ｈ６ＲＮＡの濃度が高かった。これらの結果は、２８Ｈ６特異ＲＮＡの濃度は細胞の増殖状態又はコンフルエンスにより、そしてさらに顕著には血清濃度により変化することを示している。

規定マイトゲンが２８Ｈ乙の濃度に影響を与えたか否かを決めるため、休止細胞ｔ−８Ｖ４０又はＰＧＤＦで処理した。いずれもマウス３Ｔ３細胞の増殖を刺激することが証明された。

精製したＳＶ４０ウィルスで感染させた感染６−３６時間後（Ｐｌ）のＢＡＬＥ／Ｃ３Ｔ　３細胞の休止培養液、及び未感染の培養液、２４時間目の疑似感染培養液、そして１２時間後の血清刺激培養液からも全細胞ＲＮＡ　′ｆｒ：単離した。電気泳動及びトランスファーの後、フィルターに結合したＲＮＡを２８　Ｈｔ５　ＤＮＡと結合させた。

ＳＶ４０ｇ染により２　Ｆ３　Ｈ６ＲＮＡの濃度が増加したが、血清刺激の場合よりは少なかった。この違いの少なくとも一部は、飢１３Ｔ３細胞がＳＶ４０感染忙対して相対的に耐性があるためである。５０７°ラ一ク形成単位／細胞による感染でも半分以下の細胞はＳＶ４０大腫瘍（Ｔ）抗厘を発現した（間接免疫螢光法で測定）。

５Ｖ４Ｑ感染に対する１　−ｋｂＲＮＡ濃度の経時変化は、血清の場合と類似しており、未感染又は疑似感染細胞では最初低濃度であったものが、急激に増加して１２時間目までにピークに達し、以後減少した。

コンフルエンスに達し低濃度の血清を含む培地中で維持した細胞培養液も、精製したＰＧＤＦ　’ｆ−添加して刺激した。１１　ｎｉ／ｍｌ　（５，５ｎｇ／ｍｌは５チの牛血清によるスイス３　Ｔ　３　ＤＮＡ合成の刺激に等しい）のＰＧＤＦは、ＥＡＬＢ／　ｃ　３　Ｔ　３細胞を刺激してＤＮＡを合成させた。２つの独立した実験ではこの濃度のＰＧＤＦにより高濃度の２８　Ｈ６ＲＮＡが誘導された。ＰＧＤＦ−処理した培養液によるこのＲＮＡの産生は、ＭＥＭ　−１０を添加した培養液より多いが、ＭＫＭ　−２０で刺激した細胞より少なほぼコンフルエンスに達しＭＦＭ　−’　１０中で活発に増殖している０３Ｈ１０Ｔ１　／２）　＃胞の培養液、コンフルエンスに達してから２日後にＭＥＭ　−０，５を添加した培養液、及びＭＥＭ　−１０又はＭＫＭ　＝　２０で１２時間刺激した休止培養液から、全細胞ＲＮＡを調製した。この条件で増殖させたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞は、活発に増殖しているほぼコンフルエントな培養液中で高濃度の２８Ｈ６ＲＮＡを産生したのみでなく、休止培養液の血清刺激（刺激の程度は血清濃度に依存する）後もこのＲＮＡの濃度が上昇していた。１０Ｔ１／２細胞でも同じ結果液は、休止細胞培養液に比較して高濃度の２８Ｈ６ＲＮＡを含有しており、このＲＮＡ０量はＭＫＭ　−１０で処理した細胞よりＭＥＭ　−２０で処理した細胞でより多量に存在していた。ＢＡＬＢ　／　ｃマウスへの腹腔内投与後に急速に増殖していた別のマウス細胞株である、フレジス腹水ガン細胞からもＲＮＡを調製した。このＲＮＡ　ｔ−ｃＤＮＡクロー７２８Ｈ６と結合させることにより、高濃度のｉ　−ｋｂＲＮＡ、及び容易に検出可能な量の４−ｋｂＲＮＡが証明された。

静止している培養液に５ｖ４ｏを注入した後２８Ｈ６ＲＮＡの量が増加するという事実は、５ＶｉＱ−形質転換ＢＡＬＢ　／　ｃ　３　Ｔ　３細胞は高濃度のＲＮＡを維持できるということを示唆している。細胞株ＳＶＢ　１０−１と１０− ２の培養液を、Ｍ］ｊ：Ｍ　−２とＭＥＭ　−１０中で低細胞密度（Ｉ　Ｘ　１０３細胞／ｃＴｒＬ２）から高密度（２Ｘ１０５細胞／口２）まで増殖させた。

この２つの密度及びこのクローンで調べた。もともとＭＫＭ　−１０のフォーカスとして選択されたＳＶＢ　１０−１細胞株は、ＭＥＭ−１０’中で繁殖している時中程度の１−　ｋｂ　ＲＮＡを発現した。

この２８　Ｈ６ＲＮＡ＠度は細胞密度には依存していなかったが、同じ培地中の活発に増殖しているＢＡＬＢ　／　ｃ３Ｔ３細胞、又は血清刺激ＢＡＬＢ／ｃ　３　Ｔ　３細胞で検出される量よりはかなり少なかった。これとは対照的にＭＥＭ　−２中でほぼ同じ速度で分裂している５ｖＢ１０−１は、検出できる量の２３　Ｈ６ＲＮＡを産生しなかった。

ＭＫＭ　−２中のフォーカスとして単離されたＭＫＭ　−１０も、試験したどの細胞濃度でもＭＫＭ　−２中で検出できるだけの２　Ｆ３　Ｈ６ＲＮＡを産生しなかった；　ＭＥＭ　−１Ｑ中では最低の細胞密度できわめて低濃度の１−ｋｂＲＮＡを含有していたが、細胞密度が増加するとこの量は急速に減少した。

ヌクレオチド配列の解析では、２８　Ｈ６ＤＮＡは４２２塩基対を含有しており、ｍＲＮＡの３′個の約半分であることを示している。さらに完全なｃＤＮＡを得るため、’ｌ　８Ｈｔ５　ｃＤＮＡの５′末端から１４個のヌクレオチドの長さの配列に相当する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、もともとのｃＤＮＡライブラリーを得ることを試みた。スクリーニングした５　Ｘ　１０５個のコロニーのうち、約４００個がプローブとハイブリダイゼーションした。

従ってこのｃＤＮＡはライブラリーの少なくとも０．０８％である。２８Ｈ６゛　クローンよりさらに長いｃＤＮＡ挿入部分を有するクローンを単離し、部分的に配列を決定したが、どれも翻訳の開始コドンである予想されるメチオニンコドンまで伸張しなかった。従って最も長いＣＤＮＡ挿入部分からの５′配列である二番目の合成オリゴヌクレオチｒをプローブとしてもう一度ｃＤＮＡライブラリーを得ること会試みた。５　Ｘ　１　’０５個のコロニーの５ち２［］ａのみが１７−ヌクレオチドプローデとハイブリダイゼーションした。このうちの１つ（クローンＰＬＦ　−１（！：命名）は、翻訳開始の推定部位を越えるＣＤＮＡ挿入部分を含んで（・る。このクローンの制限酵素地図を、断片の配列と共に２図に示す。プラスミドＰＩ、Ｆ　−１は大腸菌ＭＭ２９４株（受入れ番号第３９７２１号でＡＴＣ！（！に寄託）中に含まれていた。

ヌクレオチド５で始まるＡＴＧが開始コドンであると仮定すると、図１に示すようにＰＬＦ　−１ｃＤＮＡは、アミノ酸残基２２４個の蛋白をコードする１つのオープンリーディングフレーヌ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）を有している。上記した増殖しているクレプス腹水ガン細胞から調型したゾロリフニリンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションした１７個のヌクレオチドプライマーを伸張して、さらに３７個のヌクレオチドの配列を決定した；開始コドンの推定位置を確認し、同相のメチオニンコドンはほかに見つからなかった。翻訳停止コドンであるＴＧＡはヌクレオチド６７７−６７９にあり、ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡはヌクレオチドフッ０近辺にあった。解析したその他の全てのゾロリフニリンｃＤＮＡクローンの配列は、ポリアデニル化の部位がいくぶん異なって（・たことを除いて、ＰＬＦ　−１に一致プロリフエリンがプロラクチンに関係があるということが最初にわかったのは、２８　Ｈ６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列をロスアラモスＤＮＡデータバンクに保存されている配列と比較した時である。マウス３Ｔ３細胞又はクレブス腹水ガン細胞のゾロリフニリンｍＲＮＡの長さは約ｉ　ｋｂであり、プロラクチンｍＲＮＡとほぼ同じ大きさであることもわかった〔マウラー（Ｍａｕｒｅｒ　）、ネーチャー第２９４巻、９４−９７頁（１９８１年）〕。

さらにゾロリフニリンｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによるクレブス細胞ゾロリフニリンｍＲＮＡの精製とインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）の翻訳により、みがけの分子量がプレプロラクチンとほぼ同じ２５．０００の？リペプチドが得られた〔ミラー（Ｍ１１λｅｒ　）ら、エンドクリンレビュー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｓ　Ｒｅｖ、）第４巻、９７−１３０頁（１９８３年）〕。しかし最近マウス°プロラクチンの完全なアミノ酸配列が発表され〔コラモト（ｘｏｈｏｍｏｔｏ　）ら、ヨーロビーアンジャーナルオズバイオケミストリ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、）第１３８巻、２２７−２３７頁（１９８４年）〕、マウスプロラクチ／とゾロリフニリンは構造の似た異なるホルモンであることが決定的に証明された。

ＰＬＦ　−１と牛プロラクチンｃＤＮＡのコード領域のヌクレオチド配列の相同性〔ササバージ（ＳａＦ３ａｖａｇｅ　）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ−（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈＱｎ、　）第２５７巻、６７８−６８１頁（１９８２年）〕は５５％であり、２つの蛋白のアミノ酸配列の比較に反映されている。図３でネズミプロＩＪ　７エリン（ｍＰＬＦ　）の予想されるアミノ酸配列が、牛プロラクチン（ｂＰＲＬ　）や牛成長ホルモン（１）ＧＨ）の配列と比較されており、これらはさらにプロラクチンと比較しである〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ　）ら、エンドクリンレビュー　（］ｉ：ｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、　）第４巻、９７−１３０頁（１９８３年）〕。その結果を関連した配列と比較して図１に示しである。ゾロリフニリンアミノ酸配列の解析の結果は以下の事実を示している：　（１１ｍＰＬＰとｂｐｕＬハｂｐｕＬ＋　ｂｏＨヨリ密接に関連Ｌテイル；（２）ｍＰＬＦは哺乳類の他のプロラクチン〔例えばラットプロラクチン（ｒＰＲＬ　）　）よりｂＰＲＬに対する相同性が有意に小さい；　（３）　ｍＰＬＦの最初の２９個のアミノ酸配列はｂＰＲＬのシグナルペプチドに密接に類似している；（４）このｍＰＬＦ　ＩＪ−ダー配列は、２９位のセリン残基の部分でシグナルペプチドが切断されるという経験則Ｃ７オンヘイゾン（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎａ　）、ヨーｏｆ−アンジャーナルオブパイオケミストリ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１３３巻、１７−２１頁（１９８３年）〕を満足している；（５）予想される前駆体と成熟ｍＰＬＦポリペプチドの大きさはｂＰＲＬの大きさによく似ている；（６）図４に模式的に示す成熟ｔ）ＰＲＬとｍＰＬＦ中の６個のシスティン残基と２個のトリプトファン残基の位置はほとんど完全に一致する〔これらの残基は哺乳類のプロラクチンで保存度が高い（例えばミラーとエバーノ・ルト（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｅｂｓｒｈａｒｄｔ：　）、１９８３年、前出）〕；（７）　ｍＰＬＦは配列１ｙｓ−１ｙｓ−１ｙｓ　（完全な長さのポリペプチドでは１４９−１５１位）と配列１７ｓ−１ｙ日（１７４ −１７５位と２０５−２０６位）を有し、これらはしばしばペプチドホルモンの切断部位であるとともにａ８ｎ−Ｘ−１＋ｅｒ領域（５８−６０位、７５−７７位及び８８−９０位）でもあり、グリコジル化のコンセンサスシグナルでもある〔グリココンシュデート中のバール（Ｂａｈｌ　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　）第１巻、３８５−４２２、頁（ホロウイツツとぎグマンド（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　＆Ｐｉｇｍａｎｄ　）編、１９７７年）〕。

表　１ｍＰＬＦ＋ｍＰＲＬ１、ｂＰＲＬｌ及びｂＧＨ１の関係ｍＰＬＦＸｍＰＲＬ　６２（３２％）　２１（１１％）　８３（４３％）ｍＰＬＦＸｂＰＲＬ　８２（３７壬）　２０（９％）　１０２（４６４）１０２（４６４）　５０（２２％）　２３（１０％）　７３（３２１）ｍＰＬＦＸｂＰＲＬ又はｂａＨ９９（４４％）　２０（９％）　１１９（５３％）ｂｐｔｕ、ｘｂＧａ　６０（２６％）　２４（１０％）　８４（５７％）ｂｐＲＬｘｒＰＲＬ　１３５（５９％）１９（８％）　１５４（６８％）１、　ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ　）ら、エンＶクリンレビュー（ｌｉ：ｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、　）第４巻、９７−１３０頁（１９８３年）；コラモト（ＫＯｈＯｍＯｔＯ）ら、ヨーロピーアンジャーナルオブバイオケミストリー（Ｆｉｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第１３８巻、２２７− ２３７頁（１９８４年）から採った配列。

２、関連するアミノ酸＝１ｙ８とａｒｇ　；　ａｓｐとｇｌｕ　；ａｓｎとｇｌｎ　；　ｓｅｒとｔｈｒ　；　ｖａｌ、１ｅｕと１ｌ−ｅ　。

ゾロリフニリンｃＤＮＡのヌクレオチド配列から、ｍＲＮＡの翻訳により２２４個のアミノ酸残基金倉む約２５　ｋｄの蛋白が得られることがわかる。２５　ｋｄ蛋白は、ハイブリッド選択したプロリフニリンｍＲＮＡ　ｔ−インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で翻訳して得られる主要な生成物である。プロリフニリンのアミノ酸配列は、ｂＰＲＬや他の哺乳類プロラクチンのアミノ酸配列にきわめてよく似ている。もし密接に関連したアミノ酸を含めれば、ｍＰＬＦとｂＰＲＬのアミノ酸配列の４６壬が共通であり、ｂＧＨとｂＰＲＬの共通配列は３７憾である：　ｍＰＬＦとｍＰＲＬは４３係のアミノ酸配列が共通である。特に注目に値することは６個のシスティン残基（これらがプロラクチン中でジスルフィド結合を形成している）〔プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ　）中のニアル（Ｎ１ａｌｌ　）、１−１７頁、ジャフエ（Ｊａｆｆｅ　）編、１９８１年〕の位置、及びこれまでに配列の決定されたプロリフニリンと全てのプロラクチン中の２個のトリプトファンの位置がほとんど同じであることである（ただしトリプトファンが１つのみのネズミのプロラクチンを除く）。

ゾロリフニリンの予想されるアミノ酸配列は、プロリフニリンが翻訳後にいくつかの変化を受けるかも知れないことを示唆している。アミン末端領域に、プレホルモン（プロラクチンを含む）のシグナルペプチドに似た２９個のアミノ酸より成る疎水性領域がある。

（最近プロリフニリンが分泌されているという証拠がｍらｈた’）。コンセンサスグリコジル化シクナルａａｎ−Ｘ−８８ｒはプロリフニリン中で３箇所に現れる。ラット又は牛プロラクチン中にこのシグナルは見つかラナいが、羊のプロラクチンはこのシグナルｔ−モっており、羊プロラクチンのグリコジル型が報告されている〔ルイス（Ｌｅｗｉｓ　）ら、プロシーディングズオプナショナルアカデミーオブサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第８１巻、３８５−３８９頁（１９８４年）〕。さらにゾロリフニリンは隣接するリジン残基含有する３つの領域を含有しており、これは蛋白分解部位である〔スタイナー（５ｔａｉｎθｒ）ら、アナルズニューヨークアカデミーオブサイエンシーズ（Ａｎｎａｌｓ　ＮＹ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）第３４３巻、１−１６頁（１９８０年）；ドチャーテイ（Ｄｏｃｈｓｒｔｙ　）ら、アニュアルレビューオブフイジオロジー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｈｙθｉｏ１．　）第４４巻、６２５−６３８頁（１９８２年）〕。

真真核物におけるプロリフニリンの発現Ｓ　Ｖ　４０−　ＰＬＦと５ｖ４０ヘルパークイルスの混合した保存物で感染させた猿の細胞の培養液はグリコジル化ゾロリフニリンを含有する。これらの細胞をグリコジル化を妨害する薬物で処理すると、非グリコジル化ゾロリフニリンが分泌される。

上記の具体的な実施態様は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

又上記実施態様を変更したものも当然本発明の範囲内にある。

ＦＩＧ、３手続補正書（自発）昭和６１年り月、ダ日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）哺乳類プロリフエリンのアミノ酸配列の、イントロンを含まないコード配列を含有するＤＮＡ分子。
（２）原核生物中で哺乳類プロリフエリンのアミノ酸配列を含む蛋白に転写及び翻訳され得る、コード配列を含有するＤＮＡ分子。
（３）原核生物ゲノムに含まれている請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
（４）コード配列がアミノ酸配列の発現を可能にする原核生物制御領域に関連している請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ分子。
（５）プラスミドに含まれる請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ分子。
（６）原核生物プラスミド又はバクテリオフアージベクターに含まれる請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
（７）真核生物ウイルスベクターに含まれる請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
（８）ウイルスベクターがＳＶ４０ウイルスである請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ分子。
（９）真核生物ゲノム中に含まれる請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
（１０）真核細胞が該アミノ酸配列を発現する請求の範囲第９項に記載のＤＮＡ分子。
（１１）アミノ酸配列がグリコシル型で発現される請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ分子。
（１２）特に図１に記載のプロリフエリンのアミノ酸配列のコード配列を含む請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
（１３）コード配列が基本的に図１に示したものである請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ分子。
（１４）哺乳類プロリフエリンのアミノ酸配列を含有する蛋白の生産方法において、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子をインビボで転写及び翻訳して該アミノ酸配列を含むポリペプチドにして、もしリーダー配列が存在する場合はポリペプチドからこれを除去して該蛋白を得る、上記方法。
（１５）転写及び翻訳が原核生物中で起きる請求の範囲第１４項に記載の方法。
（１６）転写及び翻訳が真核生物中で起きる請求の範囲第１４項に記載の方法。
（１７）グリコシル化蛋白をさらに含む請求の範囲第１４項に記載の方法。
（１８）転写、翻訳、リーダー配列の除去及びグリコシル化が真核生物中で起きる請求の範囲第１７項に記載の方法。
（１９）ＡＴＣＣ受入れ番号第３９７２１号で寄託されたプラスミドＰＬＦ−１に含まれる請求の範囲第１項に記載の分子。
（２０）哺乳類プロリフエリンのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子を同定する方法において：（ア）一番目の種の哺乳類の増殖又は繁殖している細胞又は胎盤組織から単離したｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライプラリーを作成し；（イ）このｃＤＮＡライプラリーから、二番目の種の哺乳類のプロリフエリンのコード配列の一部又は全てを含むＤＮＡ分子の少なくとも一部とハイブリダイゼーシヨンするｃＤＮＡクローンを選択し；（ウ）選択したｃＤＮＡクローンにコードされるアミノ酸配列を決定することより成る、上記方法。
（２１）ＤＮＡがプラスミドＰＬＦ−１からのヌクレオチド配列を有する請求の範囲第２０項に記載の方法。
（２２）哺乳類プロリフエリン蛋白の遺伝子を含み成熟した哺乳類プロリフエリンとして発現可能なＤＮＡ配列により形質転換された真核細胞。
（２３）ＤＮＡ配列が細胞と同じ種に由来する請求の範囲第２２項に記載の細胞。
（２４）形質転換した真核細胞は細胞株由来である請求の範囲第２２項に記載の細胞。
（２５）請求の範囲第２２項に記載の細胞をクローン的に拡大して形質転換細胞株にすることにより産生される細胞株。
（２６）哺乳類プロリフエリンより成る、細胞を含まない組成物。