JPS60502136A - 微生物によるインタ−ル−キン２の形質発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一倣生物によるインタールーキンＨ／）形質発現一本発明：ま、１９８３年９月 ｌＯ日二二出願された共同所有、共同７止涜米国持許出願第５２Ｌ９６７号の一 部継読出願である。

茸−−−一 本発明；ま、一般乙こ遺伝物質の操作に関し、更に特う二　１ンタールーキンＨ （Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　Ｈ）及びポリペプチド類の微生物による形質発現を 確実乙こする組の替えろこ有用な、特別なりＸへ：′ｉ！列の製造に関する。

インタールーキン■　（川Ｌ−１１”）、即ち、分子量約１．ｉ、０００のネ唐 タンパク質は、タンパク質即の一１重であり、リンホカイン（ｌｙｍｐｈｏｋｉ ｎｅ）と呼ば、？′１２ており、体内の免疫反応を＝ＩＩ　１３１ｆ　ｔ　；ａ 。

＋１．、−　＋＋は、あるｆｆｉ、の白面細胞、即ちレクチン　（ｌｅｃｔｉｎ 　）或いは抗ｊ京ｌ；ＩｉＩ生Ｔ　細胞（ａｎｔｉ（Ｈｅｎ−ａｃｔｉｖａｔａ ｄ　ｔ　ｃｅｌｌｓ　）　己二よって造らｎｌ、゛ノンパ球調節分子として体嵩 の免疫系己、’：　、４．Ｃで甲５Ｌ、的な（グＪ：１］を果たしている。

Ｔ細胞成長要因として一般的にか−２て３及されたものとじて５よ、ＩＬ−ｌｉ ＋が胸腺細胞（ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ　）ｍｙｔｏｇｅｎｅｓｉｓを増大シ＋〆１ ！ｉｔ！ｋ　’ｒ　♀［１１抱クローンの長期間の人騒３ｒｖ３でζ爪遅＋ｙ− ｉ−勺ｍ）の成長を刺激し、細胞佇毒性Ｔ細胞反応（ｃｙＬｏＬｏｘｉｃ、　’ ｒ−ｃｅｌｌ　ｒｅａｒＡｉｖｉｌ、ｙ）を誘発し、無シ不ズミ　（ｎｕｄｅ　 ｍｏｕｓｅ）の月甲臓沼１ｌｌｌ包の坏１養の際にプラーク形成細胞反応を誘発 し、更にガンマインクーフェＤンの産生を誘発することか報告されている。

前記ＩＬ−Ｉｆはまた、自然キラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅ ｌｌ）の活ｉ生を増大させ、免疫不全状態においてリンノ々工、トの免疫作用の 回復を媒介する。

更に、実験室シこおいて変異Ｔ　’；Ｌ！抱（Ｔ−ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｓｒｅｎ ＬｉａＬｉｏｎ）の分子持ｉ生を研究するために、梶；能的単−栄養系Ｔｌｆｉ ！ｌ胞（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｔ−ｃｅｉりの培養か 維持可能で、月つ変異７　４Ｂ胞機能の機構を解明することも可能である。

従って、ＩＬ〜　■は、前記両方の研究において７′Ｊｆｉ在的に適応可能で、 且つ局部整形（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）及び免疫不全症の処置；こち適応可能で ある。然しながら、末［肖血液リンパ球及び腫瘍細胞系から得られる純粋産生Ｉ Ｌ−ＩＩの重か限られていることは、このリンホカインの生物学的役割を研究す る上ての障害となっていた。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　、ＮａＬｕｒｅ、　３０２　 ：　３０５−３１０　（１９８３）には、ヒ１−ＩＬ−ロの相補的なりＮＡ暗号 の配列分析、クローニング、及び形質発現が記載されてδす、これは目皿病細胞 系（Ｊｕｒｋａｔ　１ｅｕｋ＋５ｍ１ａ　ｃｐＨ１ｉｎｅ　）　か５部分的に得 ろ孔るＩＬ−ＩＩ　ｍＲＮへかろ８１Ｓ］整したｃＤＮＡ集からクローニングさ 自、る。ＩＬ　丁＋は１３３　（（ＩＩのアミノｍ　′Ｊ＆基ををし、推定的１ ５．４２０の分子層をもつといわ釣。

ている。又、培養モンキーｃｏｓ　開瞼ｂ：ｕ　Ｉ　Ｌｕｒｅｔｊ　１ｎｏｎｌ （＋：ｙ　Ｃ０５ｃｅｌｌｓ　）中の＋＋、、−ＴＩのｃＤ＼Ａのクローニング の手順及び発現か記載さ湘５ている。前述の刊行物には、タンパク質を多量につ （ろため二こ不ロ丁欠である顕」ユ己こ８シするＩＬ−ＩＩの（Ｄ＼への発現力 ）未だに達成されていないことが述へら７θ、ている。

最近では、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ：；、　２ ２す一：　１４］２−１１１１５（１９８４）において、白血病細胞糸及び正常 なヒト末＋）！ｉ　ｔｍ液′、１ンパ球由来のＩＬ−Ｈ遺伝子の他のｃＤＮＱク ローンの分離か報告されている。こ鮮らの研究は、遺伝子を影夕桂濃こ挿入し、 ポリペプチド産物を精製してその生物学的活１生を分析している。

従って、無精製のものかあ多量の晴製ＩＬ−［１を製造するための方法及びｔオ 糾うこおいて顕著を萌歩−ζあ・）、゛・ンン：：　：’ｊ　・１’　：／曹ｊ 合ｉｌｌ　’ｒ才、現在一般に免疫治療研究、史には免疫学的プロセス９二δ５ するこのタンパク質の生物学的役割を研究するｆコめに用いられている。

魔−〜ヨＷ ７ド発明によｎ、ば、インタールーキン［１（”ｉＬ−Ｈ”）の選択された微生 物宿主（例えは、バクテリア、イースト、及び培養液中のは乳類の細胞）におい て、操作合成可能な遺伝子を製造できる。製造された遺伝子の好ましい形態にお いて）よ、塩基＝配列か、投入された宿主微生物、例えばＥ、ｃｏｌｉ　のコド ンの特定の形質発現性を基礎として、同しアミノ酸を特定する代替コドンから選 択された一つ或いはそれ以上のコドンを含む。

製造さｎ、た遺伝子の池の好ましい形態は、恥−兜↓し一生物中゛で直接形質発 現させるために暗号化されたポリペブチ）に巧い一：、付加アミノ酸残基を特定 する基本コ）ンがその中に存在することである（例えは、初期Ｍｅｔ　残基）。

更に′：Ａ造さお、た遺伝子の他の好ましい形態は、所望のポリペプチドを特定 する基本コドンの配列が、発現ベクターの形成を可能とする−っ或い：ｌ！それ 以上の塩基配列、或いはポリペプチド’　Ｆｌを与えろ塩基配列即ち、構造遺伝 子の片端或いはその両端上、戊いはその中間位置の選択された制限エンドヌクレ アーゼ切断部位を与える塩基配列、によって優先され、及び／或いは従わさ？Ｌ 、及び／或いは含む。

更にまた本発明によ才１己よ、−・つ或いはそれツーＦのアミノ酸残基の同−性 及び／或いは位置によって自然に発生するポリペプチドとは異なるインタールー キン■ポリペプチド頓の微生物ニーよる形質発現か操作可能な遺伝子を製造でき る（　！ｙ’ｉえは、二〇ｌｎ　、ＩＬ−■　、　：Ｐｈｅ　、丁ｆ、−１，’ 、Ｓｅｒ”’：　ＩＬ−１，、Ｓｅｒ　。

］い　ＬＬＩ　、 従って、本発明により包含されろ（（１′加頗似物：臥１１然発伴するインター ルーキンΣ■のアミノ酸配列内の、下記の変更の−っ或いＬよそれ以上の存在に よって特徴っｚノルれるインタールーキンＨの自然発生しないポリペプチド類を 含む、即ち、（３）　分子内折曲（ｉｎｔｒａｍｏｌｓｃｕｌａｒ　ｆｏｌｄｉ ｎｌＢ＞　、分子内二￥体或いはポリマー形成の部位を５えろアミノ剪残基の欠 失及び／或いは置換、 １、ｂ）　末端アミノ酸残基の欠失、 （ｃ）　アミノ酸残基の末端アミノ酸残基付加、ｆｄｉ　高酸性状態における加 水分解不安定部位を与えるアミノ酸残基欠失及び／或いは置換、 （ｅ）　アミノ酸残基のグルタミン残基にょろ置換え「）　アミノ酸残基のフェ ニルアラニン残基による置換、（ｇ）トリプ］・ファン残基の欠失及び／或いは 置換、（ｎ）　アスパラギン残基の欠失及び／′或い〉よ置換、（１）　システ ィン残基の欠失及び／或いは置換、（」）　アミノ酸残基のセリン残基による置 換、ｆｋ）　アミノ酸残基のアラニン残基によろ置換、である。

ポリペブチ）を産生ずるための本発明の実ｊＪｉ！！！：：　：＜いては、ふり 造されたＤＮＡ配列は、雑種ベクター（ｈｙｂｒｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　）を形成 するためにウィルス内或いは円形プラスミトヘクター内に挿入され、該雑種ベク ターはバクテリア（例えは、Ｅ、ｃ−ｏｌｄ、　）　２．（−ス１−細胞、或い は培養液中のは乳翅の猾胞のような微生物宿主の形質転換を行う。形質転換さ６ ．た微生物は、その後適当べ富栄養状態で育てらね２、本発明のボ°）くブチ、 物を産−十する。

本発明の他の態様及び利点シよ、以下の詳細な説明によって明白になるであろう 。

１徂左羽皿 本明細書においてＤＮＡ配列或いは遺伝子に適用したー製造された（ｍａｎｕｆ ａｃｔｕｒｅｄ）　；という用語は、ヌクレオチド塩基の配列によって全体に化 学的に合成されるか、このようにして化学的に合成された産物の生物学的複写か ら誘導された産物を示す。前記用語は、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ法或いは初期の生物学の 超厚である開始材料を含むゲノムクローニング法を除くものである。

下記の省略は本明細書においてアミノ酸を示すものである。

即ち、アラニン（Ａｌａ　）　、アルギニン（Ａｒｇ　）　、アスパラキン（Ａ ｓｎ　）　、アスパラギン酸（＋ｌｓｐ　）　、：＞スティン（Ｃｙｓ　）　グ ルタミン（Ｇｌｎ　）　、グルタミン［１（Ｇｌｌ＋　）　、り′ファン（Ｌｉ ｌｙ　）、ヒスチジン（ｔｌｉｓ　）　、イソロイシン（ｌｌｅ　）　、口・イ ンタ（［、ｅｌｌ　）　、’ファン（Ｌｙｓ　）、メチオニ７（’、ｌｔ＋Ｌ） 、）゛エニル了う二−ン（Ｐｈｅ　）　、プロリン（Ｐｒｏ　）　、セリン（Ｓ ｅｒ　）　、ｌ・レオニン（ＴＩ＋ｒ　）　、ｈリプトファン（Ｔｒｐ　）　、 チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ　）である。下記の省略１：！ヌクレオチ ド塩基を示すものである。Ｉ’！ＩＩち、Ａはアテニン、Ｇはグルタミン、Ｔは 手ミン、Ｕはウラノル、Ｃはシトシンである。

本発明の理解を容易にするために、下記の表１は、Ｄ＼・１及び２０種頬のアミ ノ酸の６４個の三組のヌクレオチ１．塩基コドン及びそれによって特定される転 写終了（゛′停止（ｓｔｏｐ）　“）機能を表にした相関関係を示１−０ ［−↓ Ｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙ　ＣＬｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　ＳむＯｐ　 ｌ＼Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏ−ｉＴ−ｒ［−−−、、、−（辷□−□ＬＩＢＩＩ 　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｔ３　ＴＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　へｒｇ　ＣＬｅｕ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａ □−Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒ−Ｂ、、　Ｇ　−−一−−１１２Ｔｈｒ　Ａ ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔ Ａ　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃ［１ｅ　Ｔ　ｈ　ｒ　Ｌ　ｙ　Ｓ　ｌ ’ｌ　ｒ　ｇ　△−−Ｍｅｔ　Ｔｈ−ｒ−−Ｊｓ−一↓ｒｔｚ　、、−、、−、 、−、−、、−−−−、−、−Ｇ　−−−−、−、、−、−１１ａｌ　Ａｈａ　 Ａｓｐ　Ｇｉｙ　ｒＧ　Ｖ、′］ｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＣＶａｌ　Ａｌ ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａ −−−Ｖａし−Ａｌａ　Ｇｊｕ−（’□　Ｇ□□−□−一本発明による構造遺伝 子の製造は、好ましくは＋９８２＃５月６０出願の共同所有、共同継続米国特許 出願第３７５．４９３号：１９８３年１１月２４日公開のＰＣＴ国際公開Ｎｏ、 　ＷＯ３３１０４０２９）　Ｙｉｔｚｈａｋ　５ｔａｂｉｎｓｋｙによる”構造 遺伝子の製造及び発現（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ＥＸＩ）ｒｅｓｓｉ ｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｇｅｎｅｓ）”　乙こ記載されている手： ｌ旧うこ基ついて実施され、該出願は手順のステ、ブを記載する目的で本明細書 中に引用じたちのである。

簡単に要約ずれは、一般的な方法；よ下記のステ、プを含りうのである。

（１）異なった、線状の、二重のＤ＼・）鎖を二つ或い（よそ４以上用きして、 それぞれ二重の鎖か１２個或いはそ礼以トの選択された相補的な塩基対の二重鎮 域を有し、更に鎖の一端に３から７個の選択された塩基の単一鎖末端配列上端、 及び／或いは鎖の他端に３から７個の選択された塩基の単一鎖末端配列下端を有 し、それぞれ二重のＤ’ｌｌＡ鎖の各単一鎖末端配列が、その他の用意された二 重のＤＮＡ鎖の少なくとも一つの単一鎖末端配列の完全な塩基補体ををするよう にし、且つ （２）　ステップ（１）において用意した各二重のＤ＼′八鎖へアニー“Ｊング （ａｎｎｅａｌｉｎｇ）及びリガティング（Ｉｉｇａｃｉｎｇ）　シて、相補的 な単一鎖末端配列を有するステップｆｌ）において用意した一つ或いは二つの異 なった二重鎖とし、それにより単一の連続する二重鎖ＤＮＡ配列を形成し、該配 列が、少なくとも２７１１Ｍ＋の選択された塩基対の二重領域を有し、咳二重領 域かステップ（１）において用意した二重のＤＮＡ鎖の筆−鎖末端配列の相補的 結合によって少なくとも３（ｌｌｉｌの塩基対を有し、且つ前記配列が零から二 個の単−鎖上端或いは３　ｆｔ！ｌから７個の塩基の下端末端領域を有するよう にする。

サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）好ましい一般的な方法において、少なくとも三 つの異なった二重ＤＮＡ鎖をステップ（１）で用意して、そのようにして用意し た全ての鎖を同時に単−反応混物中でアニール及びリガティングして、単一の連 続する二重Ｎｐ　Ｄ　ＩＶ　Ａ配列を形成し、該配列が少なくとも二つの隣接し ない組みを含む少なくとも４２個の選択された塩基対の二重領域を有し、該二重 領域がステップ（」）において用意した二重鎖の隼−鎖末端配列の相補的結合に よって形成された３　ｆ［ｉｉｌ或いはそれ以上の塩基対仝有するようにする。

好まししけフユニット製込方法のステップ（１）で用意５た二重のＤＮＡ鎖は、 好ましくは下記のステップを含むものである。

（ａｌ　選択さ孔た線状配列にδいて１５個或いｉよそれ以上の塩基を有する第 １及び第２の線状デオキシオ゛Ｊゴヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅ）断片を構成し、第２断片の塩基の綿状の配列か第１断片の塩基 の配列の全数を含むが、第２断片の少なくとも一端が第１！ｇＴ片を充分に相補 するのを上回る３個から７個の選択された付加的線状配列を含むのを避けるか、 或いは第１断片の末端配列に対して相補的な３個から７個の線状配列を欠失する のを避け、第２断片が塩基の付加的配列を有さないが或いは両肩において塩基の 配列を欠失するようにし、且つ ＋ｂ＋　断片間の相補的結合に有効な状態で第１断片と第２１ＪＪｉ片を結合し て綿状、二重のＤＮＡ鎖を形成する。

形成された二重鎖ＤＮＡサブユニットの塩基配列は好ましくは、投入された宿主 微生物、！１２’ｌえは、ｆ−スＮｍ胞或い、ｚ、、！、バクテリア、特にＥ、 ｃｏｌｉ−バクテリアのコドンの特定の形質発現性を基礫として、同しアミノ酸 を特定する代替コドンから選択された一つ或いはそれ以上の三つで組みのコドン を含む。

下記の実施例は、ＩＬ−Ｕ及びそのポリペプチド’ｔｌの微生物による形質発現 を暗号するＤＮＡ配列の製造における本発明の実施を示すものである。

下記の実施例は、本発明によって構造遺伝子を製造するためのオリゴヌクレオチ ド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄｅ）の合成の一般的な手頃を示している。

社潜１１ オリゴヌクレオチド配列は四つのステップ手°頃を用い、何回かの中間洗浄を行 った。ガラス濾過漏斗（ｓｉｎｔｅｒｅｄ　ｇｌａｓｓ　ｆｕｎｎｅｌ）中のポ リマー結合されたジメトキシトリチル保護ヌクレオシｌ”（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ ｔｒｉｔｙｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）は、最初に１−１ ；２分間、２％トリクロル酢酸を含むジクロルメタンを［吏用５てその５　′− 保護基（ジメトキシトリチル）を除去した。その後、ポリマーを、メタノール、 テトラヒトコツラン、及びアセトニトリルで洗浄した。洗浄したポリマーを、乾 燥し７：アセトニトリルを洗い落とし、アルゴン雰囲気中に置き、その後下記の 液化処理を実施した。テトラソール１０ｍｇを含むアセトニトリル溶液Ｑ、４ｍ ＃をポリマーを入れた反応器に加える。その後、３０ｍｇの（呆護ヌクレオノト フォスフフラミディｉ−（ｉｕｃｌｅｏｓｉｄ、：！ｐｈｏｓｐｈ（＋ｒａｍ　 ｉ　ｄ　ｉ　Ｌｅ）を含有するアセトニトリル０．４ｍ　Ｉ！を添加した。この 反応は、撹拌してで８分間反応を起こさせた。反応物を吸引により除去して、ポ リマーをア壮トニｊ”）　Ｊ゛して洗い落とＵｆ二。この後、１部の酢酸無水物 を２．６−ルナジン（ｌｕｔｉｄｉｎｅ）　（υハフに混合し、０．６１のツメ チルアミノビリノン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）をテトう しトロフランに７昆合する、二と己二よって亭倚５たノ容７夜を使用して、未反 応の５　“−５トロキンル基を力、ピンク（ｃ、、ｌｐｐｉｎｇ）　ｕた。９分 （麦、キ十ノビンクした溶液を吸引し−ζζボッマーを酸化ｌ合液（２，６−ル ナジン／）１．０／Ｔ１１ＦかＩ＋２：２に０．１Ｍ１２）乙こよ−２て二分間 、処理した。この浅、アセトニトリル及びｃ１１２ｃ１．洗浄を実施した。この ザ・イクルを再ひＣ１１，Ｃ！ユ処理においてトリクロロ酢酸を混ぜて、所望の オリゴヌクレオチＦ’　（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列が得られるま で繰り返した。最終的なオリゴヌクレオチド鎖を、室温で７５分間チオフｎノー ル、／オギサン、ト２７エチルアミン１：２：２で処理じた。その後、ンオキサ ン、メタノール及びソエチルエーテルで洗浄した後、オリゴヌクレオチドを、室 温にて濃縮アンモニアをもちいてポリマーから切った。ポリマーから溶液を他の 容器に注いた後、封入した管の中で・７コ怖アンモニア液を１６時間６０゛ｃに 加ｐ）シた。各オリゴヌクレオチド？Ｓ液を１−ブタノールによって一回宛抽出 した。該溶液を１５ン６ポリアクリルアミト（ｐｏｕｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ）７分子者の尿素電気泳動ケル（７ｍｏｌａｒ　ｕｒｅａ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ ｏｒｅｓｉｓ　ｇｅｔン乙こかけた？ｊｋ、てさた分画を分離した。下記の実施 例は、Ｉ　Ｌ　−２を暗号する構造遺伝子の製造の例であり、且つポリペプチド 順自社の構造遺伝子を用意するこ七の可能な方法である。

襲−例−−２− １１−２を暗号する構造遺伝子を−８っの部分に分けて公１２ｉしオニ。

＋１．、−２の断片ＮＯ，ｌは、ポリペプチドの了ミノ末端の最初の、旧完全ｊ 二重トンを特定するコ］ン、開始二ｌトンｒ己列（Ｎ訂残基を特定ずろ）、及び タンパク質を暗号する領域−ζあろ塩基５　゛の所≦？Ｉｏ〕゛ノポソーム接合 配列部位を含んでいろ。１１２ｉＪ伝子の断片＼０１の製造において、１０個の シオキシオ’Ｊコヌクレオチｈ（Ｈ−号Ｉから１０まで）を実施例１の手ＩＵに したがって合成した。２゛リコヌクレオチド配を、ポリアク′Ｊルアミ１ケル電 気泳動によってｌして、４　Ｔ　Ｐ及び反圧、においてＴ−４ポリヌクレオヂト キナーゼを用いて５　“末端己こδいてリン化した。標（Ｗ的な反応に２９いて は、０５ナノモル（ｎａｎｏｍｏ　ｌｅ）のＤ＼Ａ３凡倍を上回るＡＴＰ　。

及び５０ｍＭのヒトロキシエチルピペランンエタンスルホン酸（ｈｙｄｒｏｘｙ ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ　５ｔｈａｎｅ　５ｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ ）　、ｉｏｎ＋Ｍの′１ｇＣｌλ、１０ｍＶＩのジチオスレイ）−ル（ｄｉｔｈ ｉｏｔｈｒｅｉす０１）、ｐ　１＋　７　、　ｆｉ己二調整した緩衝液２５ｐ１ ！中のＴ−４キナ一セ１単位を１吏用する。反応後、キナーゼを５分間者沸して 壊した。緩衝液中のこれちの：ノン化したオリゴヌクレオチドをその後ライヶー ノヨン（］　ｉｇａ　Ｌｉｏｎ）に直接使用した。

標準緩衝液２５μρ中のオリゴヌクレオチドを短く二重鎖に結合した。各二重鎖 は、等モル量の二つの相補的な配列を結合し、混合物を空沸し、室温になるまで １７２時間徐冷することによって形成した。このように、５個の二重鎖を形成し た（二重鎖■を形成するオリゴヌクレオチド１と２、二重鎖■を形成するオリゴ ヌクレオチド３と４等）。

下記の表■は、微生物によるＩＬ−ＩＩの形質発現を暗号する遺伝子の最終的な 配置の断片Ｎｏ、１を示している。断片Ｎｏ、１の配置の内に、二重鎖■と■が 第１試験管で結合され、二重鎖■、■及び■が第２試験管で結合されている。各 試験管のａｒｐ濃度゛よ２５０ｍμにＳ周整され、Ｔ−４ＤＮＡ　リガーゼ（デ オキソオリコ′ヌクレオチド　１ナノモルに対して５単位）調整されている。一 時間後、二つの混合物を結合し、ライケーンヨン反応を室温Ｓこて６詩間実施し た。１３４塩基対をその後、ポリアクリルアミｌ−ケル電気泳動によってネｈ製 した。

−１ ル艶−逝井とユ ＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡ　ＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴ　ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴ　ＧＧＣ ＴＣＣＴＡＣＧ　ＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＴ　ＧＧＴＡＣＴＣ（：ＣＡ 　ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＩＩ　ＣＣＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡへＧＡＴＬ　− −ｍ＝、−２、□−一二−４− ■　■ ＣＴＡ２ＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡ　ＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴ ＣＴＴＧＡ　ＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧ　ＧＧＴＣＧＡＣＧＴ Ｔ　ＧＡＣＣＴＴＧＴＡＧ　ＡＣＧＡＡＧＡへＣＴ　ＧＧＡＣＧＴＴＴＡＣ６− −−−−−−−−−−−−−−−−−□１□−−−−−−−−−−−８−−−− −ＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧ　ＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡ　ＣＴＡＣＡＡＡＡ八ＣＣＣＧ ＡＴへＧＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴへＧＴＴＧＴＴ　ＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧ　ＧＧＣ ＴＴＣＧ−λヰ虹上及び肛屁□且接合末端を有する表Ｈに示された断片゛、′０ ．１を造る１３４個の塩基対を、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｐＢＲ３２２−由来のクローニ ンクヘククー、ｐＩｎｊ−ｒ−ｔｘＢ４中に挿入！、た。該ヘクターは、トリプ トファン合成酵素（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｒ、ｙｎｔｌ＋ｅＬａｓｅｌ）　（ 丘プロモーター配列、及び他のポリペプチドの構造遺伝子によってシャインクル カルノ配列（Ｓｈｉｎｅ　Ｄａｌｇａｒｎｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　まて続＜　 ：３−ｂ８　１部位３　゛を有する。ここに引用したことは、共同所釘の、共同 継続米国出願第４８３．４５１号、アルドン（八ｌ　ｔｏｎ）等、１９８３年４ 月１５日出願（ＰＣＴ　国際公開番号曽０８３１０４０５３．１９８３年１１月 ２４日発行）の“大きな構造遺伝子の製造と形質発現（Ｔｈｅ　ＭｎｕｆａｃＬ ｕｒｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｊｎ　ｏｆ　ＬａｒｇｅＳｔｒｕｃｔｕｒ ａｌ　Ｇｅｎｅｓ）”を参照のこと。プラスミドｐｌｎｔ−γ−ＬｘＢ４　は、 Ｘｂａ　’！＝及び助」丈□皿エンドヌクレアーゼによって酵素切断され、ヘタ クー中への断片Ｎｏ、ｌのライＬ鎖ＨＢＩＯＩ中に増幅のためｍ：形質転換さて した。断片をもったクローンは、断片の計算分子量を確かめるためＣニアガロー セ（ａｇａｒｏｓｅ）ケル電気泳動によって特定した。

クローニングされ造られたＤＮＡを更に特定するために、塩基対断片をプラスミ ドｐＩｎｔ−ＩＬ−２／１から除去し、単一鎖ハクテリオファージ旧３ｍｐ１０ 及びＭ１３ｍｐＨ残存形状ＤＮＡ中に旧ｎｄ　ＩＩＩ及びＸｂａ上部位で挿入し た。両方向を向いた単一鎖ファージを分離し、Ｉ　Ｌ　−２断片Ｎｏ、ｌのＤＮ Ａ配列をサンシャージテオキシ配列技術（Ｓａｎｇｅｒ　Ｄｉｄｅｏｘｙ　ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて舘かめた比−■の構造遺伝子 の断片Ｎｏ、２を、同様な方法を用いて２４種のオリゴヌクレオチド（番号１１ から３４まで）から組み立て、この断片の配列を表■に示した。

表−１ 几二」」ｕｉ虞Ｉ− ＡＧＣＴＴＡ　ＣＣＣＧＴＡＴＧＣＴ ＡＴ　ＧＧＧＣＡ’ｒＡＣＧＡ 覧−−−−−−−１２−−−− 一−−−−−下−−−−−−−−１３□−ｍ＝−−□］−−−−−−−−−−１ ５−１；ＡＣＴＴＴＣＡＡ　ＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＣ ＣＧＡ八ＣＴＧ　へ八へＡ　ＣＡ　ＣＣＴ　Ｇ　ＣＣＴＧＡＡＧＴＴＴ　ＡＡＧ ＡＴＧＴＡＣＧ　ＧＣＴＴＣＴＴＴＣＧ　ＴＴ［；ＧＣＴＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧ ＧＡＣＧ−□−−□−Ｌ□□□１４−□−−−−−−−一上□□＝−−−−−− −□□□ゴ　−　１７−−−−−−−−−−−−−−−−−了　−−−ＡＧＴＧ 丁ＣＴＧＧＡ　ＡＧＩＩＡＧＡＡＣＴＧ　ＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧ　：’＋冗ＡＡ ＧＴＴＴＴ　；１旨ＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＧへＣＣＴ　ＴＣＴＴＣＴＴＧＡ ＣＴＴＴＧＧ！’ｌわｌｃｃ　ＴＣＣＴＴＣＡＡ、口　ＴＴＴＧＧ、ＩｃｃＧＡ −−１，６−−−□し□−−−−−−−−１８−−−−−−−−一−」−−−１ ９−□ｒ−−−　２１−−−−−−−−ＣＡＡＴＣＣＡＡＧＡ　ＡＣＴＴＴＣＡ ＴＣＴ　ＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴ　ＧＡＴＣＴＧＡＴＣ，ｉ　ＧＣＡＡＣＡＴＴＡ ＡＧ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ａ　 Ｇ　Ａ　ＣＧ　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＡ　ＣＴ　ＩＧ　Ａ　ＣＴ　ｉｌ　Ｇ 　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　ｉｌ　Ａ　Ｔ　Ｔ−２０□□−□−−−−−−− −−−−−−−−２２−−−−−−□−−Ｔ２３−□−−−−□−−−−−−正 −−−−２５−一−−−−−−−−ＣＧＴＴＡＴＣＧＴＡ　ＣＴＧＧＡＡＣＴＴ Ａ　ＡＡＧＧＣＴＣＴＧＡ　ＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＡＴＧＣＡ ＡＴＡＧＣＡＴ　ＧＡＣＣＴＴＧＡＡＴ　ＴＴＣＣＧＡＧＡＣＴ　ＴＴＧＡＴＧ ＧＡＡＧ　ＴＡＣＡＣＧＣＴＴＡ−」、、−２４−、、−、、、−二−−−−一 −−−−２６−−−−−−−□２７−−−□コ□−−−−−−−−−２９−−− −一−ＡＴＧＣＡＧＡＣＧＡ　ＧＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＩＴ　Ｔ ＴＣＴＧＡＡＴＣＧ　ＴＴＧＧＡＴＣ，ＩＣ’ｒＴＡＣＧＴＣＴＧＣＴ　ＣＴＧ ＧＣＧＡＴＧＧ　ＴＡＧＣ，ＩｃｃＴＴＡ　ＡＡＧＡＣＴＴＡＧ［：　ＡＡＣＣ ＴＡＧＴＧ＝１□□」−−−２８−−−−−一−−−−−−−］−−−−−−３ ０−−−−□□１−−−−−３１−−−　■□−−−−−−　３３−−−−、、 −、−。

ｒＴＣＴＧＴＣＡＧＴ　ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧ　ＣＡＣＴＣＴＧ、Ｉｃｃ　Ｔ、 １ＡＴＡＧＧＡｌ’ｃ　ＣＴＡ、ＩＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＣＡ　ＧＧＴＡＣＴ ＡＧＴＣＧＴＧＡＧｉＴＣＴＧＧ　ＡＴＴＡＴＣＣＴＡＧ　ＧＩＩＴＴＡＴＣＡ ＧＣＴ接合末端肝劇−１及び５娼−七を有する断片Ｎｏ、　２を形成する１３４ 個の塩基対５ま、プラスミｆ”ｐｃＦｉ１４１＋ｉ中への挿入によって断片Ｎｏ 、１と結合され、それにより下記の実施例３に詳細に記載しｆコ手順て、ブラス ミＩ”　４１４　［Ｌ−２／３を造った。断片へ“ｏ、２を含むクローンは、断 片の計算分子量を確かめるためにアカローセゲル電気泳動によって特定した。ク ローニングされ、造られたＤ′＼Ａを更に特定するために、断片をプラスミ）　 ４１４１Ｌ−２／３から除去して、単一鎖ハタテリオファーシＭ１３ｍｐｌＯ及 びＭ１３ｍｐＨ残存形状ＤＮＡ中に旧ｎｄ　ＩＩ＋及びＢａｍＨ１部位で挿入し た。特定の方向にＤＮＡを挿入したクローンを分離して、ポリアクリルアミドケ ル電気泳動を用いて特定した。両方向を向いた単一鎖ファージを分離し、ＩＬ− ２断片Ｎ００２のＤＮＡ配列をサンジセーシテオキシ配列技術（Ｓａｎｇｅｒ　 Ｄｉｄｅｏｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて確かめ た。

ｐ４１４１ｆ−２／３中の二つの造られた形質発現ヘクター断片を下記の表■に 示した。

表−双 Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ｒｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　 Ｌｙｓ　Ｔｈｒ工□１□□−１□−−一−３□−−−−−下□−５−−−５’　 −ＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡ　ＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴ　ＡＡＴＡＡＡＴＡ　ＡＴＧ　 ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＡＧＣＴ（Ｔ　ＴｃＴＡＣＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣ Ｃ３’　−ＴｒＩＴｒＴ　ＧＧＴＡＣＴＣＣＣＡ　ＴｒＡＴＴＩ’ＡＴ　ＴＡＣ ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＴＧＣＴＣＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＴＴＣＴｒＴ　ＴＧ ＧＧｉｎ　ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｉｉｕ　Ｌｅｕ 　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎゞｌｅｔ　Ｉｌｅ　１．ｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ｌｉ ｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ７−□７−−□−π−□９− ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　 ＧＡＣＣ’ｆＧ、ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＡＣＧＧＴ　ＡＴＣＡＡＣ ＡＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＴＡ　ＧＡＣＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｃ ′ｒＧ　ＧＡＣＧＴＴＴＡＣＴＡＧ　ＧＡＣＴｒＧ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ｎＧ　Ｔ ＴＧＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｔ 　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ、　Ｐｒｏ　Ｌｙ ｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ□−□−１１−−Ｔ−下□□−□−１３−ＴＡＣＡＡＡ　Ａ ＡＣＣＣＧ　ＡＡＧ　Ｃｎ　ＡＣＣＣＧＴ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＴＴＣＡ ＡＡ　ＴＴＣＴＡＣＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＭ’ＱＴＧ　ＴＴＴ 　ＴＴＧ　ＧＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＴＡＣＧＡＣＴＧ：ｌ　ＡＡ Ｇ　’ＩＴＴ　ＡＡＧ　１ｌＴＧ　ＴＡＣＧＧＣＴＴＣＴｒＴ　ＩＩ；ＴＴｈｒ 　Ｇｌｕ　１．ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　１．ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｌ　Ｌｅｕ−一□−１１５−”７□−−−−１７−ＡｔＩ：　ＧＡＡ　ＣＴＧ ＡＡＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｃ ＴＧ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　Ｔｌ’１ｌＴＧＧＣ Ｔｒ　ＧＡＣｍ　ＧＴＧ　ＧＡＣＧＴＣＡＣＡ　ＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＩＴ 　ＧＡＣＴＩＴ　ＧＧＡ　ＧＡＣＣＴＣＣＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ表−■（続き） Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　 Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　 Ｉｌｅ　ＡＳＴｌ−ゴー−□　１９−□□□−〜−一一一「□−−□２１−□− −□−−−−コ八八ＣＣＴＧＧＣ７ＣＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴｒＴＣＡＴＣＴ ＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＧｉｌＴｃΔＧＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣ’ｒＴＧ ＧＡＣＣＧＡＧＴＴＩＩＧＧＴｒｔ１．ＴｒＣＡＡＡＧＴＡ、ＧＡＣＧＣＡＧＧ ＴＧＣＡＣＴａＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＣＧＴＡＡＴＴＧＶａｌ　Ｉ　ｌｅ　Ｖａ ｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈ ｒ　Ｐｈｅ　Ｍ、ｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕｒ　 −−−−餡一一−−−−コ□−−−−２５−一−□□□□□−ｒ□−−−ＧＴｒ ＡＴＣＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＡＡＡＧＧＣＴ（ＴＧＡＡＡＣＴＡＣＣｍＡＴ ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＣＧｉｌＧＣ八Ａ　ＴＡＧ　ＣＡＴ　ＧＡＣ（ ＴＴ　ＧＡＡ　ＴＩＴ　ＣＣＧ　ＡＧへ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　Ｔ ＡＣＡＣＧ　ＣＴＴ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　（ＴＣＴｈｒＡｌａＴｈｒＩｌ ｅＶａｌＧｌｕＰｈｅＬｅｕＡｓｎＡｒｇＴｒｐＩｃｅＴｈｒＰｈｅＣｙｓＧｌ ｎＳｅｒ＋ＩｅｌｌｅＳｅｒ−釘−□−−−□□ローーーーーーーー器−−−ｍ □−一−３１−□ＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＴｒＴＣＴＧ八八ＴＣ ＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＴＴｒＣＴＧＴＣＡＧへへＣＡＴＣＡＴＣＡＧｃＴＧＧＣ ＧＡＴＧＧＴＡＧｆＪｃＣＡＴＡＡＡＧＡＣＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＡＧＴＧＡＡ ＡＧＡＣｉ）ＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧ−−−−−−一％−−−−−□− □−」□□□□−−−−□−□−−□＝−□−■３３ Ｔｈｒ　１．ｅｕ　Ｔｈｒ −−］−−−−−−羽−−−コ ＡＣＴＣＴＧＡＣＣＴＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧ３’ＴＧＡＧＡＣ７１ ’；ＧＡＴＩ’ＡＴＣＣＴＡＧＧＡＴｒＡＴｆＴ、ＡＧＣＴ５’表■には、ＤＮ ｉ１配列か適切に微生物による形質発現ヘクター内の正しい読み込みフレーム内 に挿入さ老、る時二二特定されるアミノ酸残基の番号配列を示している。最初の メチオニン残基（位置−１）とともに自然発生ＩＬ−Ｈの１３３　＋Ｊのアミ／ ’７連が見られる。

表中、各アミノ酸を特定するコドンが、特定された残基の名称の下に並べられて いる。ＤＮＡ配列内の区分３れた領域は、最初に形成された３４個の分離オリゴ ヌクレオチドを示してるり、又中間二重鎖を示している（例えは、■と２１．３ 及び４等）。

構造遺伝子の構成のための手順と一致する場合には、コドンの使用は、Ｇｒａｎ 　Ｌｈａｍ　等のｔ−”（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、 ８：ｒ４９−ｒ６２（１９８０）、Ｇｒａｎ　ｔｈａｍ　等の；ｆ−”（％ｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、８：１８９３−１９１２（１９８ ０）　、及びＧｒａｎｔｈａｍ　等のｉ！ｊＪ＆ｋｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９：ｒ４３−ｒ７４（１９８１）に従って、投入された発 現宿王（例えば、Ｌ匹旦）の“優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）”に基ついて選択 される。更に、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ等のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７．３ ０２６−３０３］、　（１９８２）、及びＧｒｏｓＪｅａｎ等のＧｅｎｅ、Ｉ８ ＋１９９−２０９（１９８２’ｉ　を参照のこと。

Ｍｅｔを特定するコドンに対して造られた遺伝子５　“の範囲において、一連の ２０個の塩基対が与えらｎ、る、即ち５　’　−ＡＡ　ＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴ　 へへＴＡＡＡＴへ−３１３’　−ＴＴ　ＧＧＴＡＣＴＣＣＣＡ　ＴＴＡＴＴ’ｌ ’ＡＴ−５’である。

こ孔は、強く発現するＥ、ｃｏ旦遺伝子のりホソーム結合部位領域の複製、即ち 、外部薄膜プロティン−Ｆ（“ＯＭＰ−Ｆ”）を含んでおり、これは米国特許出 願第４８３．４５１号（ＰＣＴ国際公開Ｎｏ、ＷＯ３３１０４０５３）、Ａｌｔ ｏｎ　等の）四江１に記載されている。

前記の合成リポソーム結合部位配列に対する５　゛範囲において、塩基配列が増 幅及び形質発現のためうこヘククー中己こ（借入される得るＸｂａユ接合末端を 形成する。ＩＬ−ＩＩ力ルホキノ末端のスレオニン残基のコドンに対する３　１ 範囲において、翻訳停止コドン及び錘辷土接合末端に続く全体ＢａｍＨＩ−認識 部位を生しる塩基の配列か存在する。

表■によって示される構成において興味あることは、多重の制限エンドヌクレア ーゼ認識部位であり、それは製造配列に対して一つであり、選択された発現ヘク ターによっており、即ち造られた配列の挿入の後のヘクターに対して一つであろ うことである。肛皿旦部位は勿論、断片Ｎｏ、　１及び２の接合末端の結合によ って修復される。更に、特徴的な鎖り士、は剣−し及び皿上部位は、ＩＬ−Ｈの アミノ酸残基の自然の配列の型を破壊することなしに、造られた遺伝子のタンパ ク質コード付は領域内に存在する。このような特徴的な制限部位は、本発明に従 って、例えば、下記の実施例５の実験材料のように、ＩＬ−ＩＩ類似物の構造に 大いに容易にする。

下記の実施例は、本発明のポリペプチド産物の発現を確実にするために、選択さ れた微生物宿主細胞の形質転換に用いられる１１！ＩＡ発現の標本に関する。

ＩＬ−ＩＴタンパク質のＥ、ｃｏｌｉ発現の高いレベルを持つ発現ヘクターヲ律 しさせるために、Ｅ、ｃｏ旦トリプトファン合成遺伝子プロモータの制御のもと に、表■に示したＩＬ−ＩＩ構造遺伝子を位置づけるプラスミドが構成された。

これらの操作はプラスミドｐＣＦＭ４１４の使用を含み、ごのプラスミドは共同 所有の、共同継続米国特許出願第５２Ｌ９６４　、）ＩｏｒｒｉｓＳこよる“Ｄ ＼：ヘヘクター（ＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒ）という表題の、本発明の親出願第５２ １，９６７号と同時に１９８３年９月１０日に出願した実験材料である。前記出 願の開示はここに引用することによって特に取り入れた。ｐＣＦＭ４１４は特許 商標庁の微生物寄託に関する要求に基づいて、１９８３年７月２２日にＡｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　 Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒ。

ｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２において寄託されＡＴＣＣ４ ００７６という番号がつけられている。簡単にいえば、ブラスミｌ”　ｐｃＦＭ ４１４＋；；複写制御域に温度感受性変移体を含んでいる。このヘクター己こよ る形質転換の際には、３０℃における宿主細胞培養成長はプラスミドの複写を少 数しか生しないのである。プラスミド複写数は、３４°Ｃ以上の培養温度の上昇 によって宿主細胞内において、６０倍或いはそれ以上（即ち、“ｒｕｎｓ　ａ讐 ａｙ”）増大する。３７°Ｃに先立って、プラスミド’ＤＮＡの多数の転写の機 会が存在する。

Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，４００７６を使用したヘククー構造内に含まれる特別な操作は 、下記の通りである。プラスミＦ　Ｐｉｎｔ−ＩＬ−２／１（実施例２）は制限 エンドヌクレアーゼに皿上及び肛匝旦　によって切断され、それによってＩＬ− ＩＩの断片Ｎｏ、ｌの１３４個の塩基対Ｘｂａ　１−１（ｉｎｄ　ＩＩＩ配列に よってｔａ　＜　Ｐｉｎｔ−ｒ　−ｔｘＢ４に元来存在するｊｌＪＬプロモータ を含む断片に切断される。

プラスミ）”ｐｃＦＭ４１４　は、ＥｃｏＲ±及びＸｈｏ　ｌ−によって切断さ れ、大きい断片が分離される。）ｌｉｎｄｌｍ及びＳａｌ　Ｉ接合末端、及びＰ ｉｎｔ−ＩＬ−２／１から精製されたｎプロモータと共同してＩＬ−■断片Ｎｏ 、ｌを含むＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　Ｉ［ｌ断片は、プラスミド４１４１Ｌ−２ ７３を生しさせるために、プラスミドｐｃＦＭ４１４の大きな断片の中に接合し て挿入される。プラスミＩ”＝１１４１Ｌ−２／３は、それにより回能的−（、 ！Ｌプロモークと共同して表■己こ示さ、／＋４た完全な構造遺伝子を含む。

この構造は完全な匙鮭認識部位を保持しており、相補的な影咋ユ及びハ虹り接合 末端が両認識部位を修復しない一方、ハ見１１−認識部位が接合部の両側に存在 する。ＩＬ−ｎ遺伝子及び前述の復」−プロモータはこのようにして、ＥｃｏＲ ユ及びＢａｍＨＩによって切断除去されることができ、一方遺伝子だけか■ａＩ 及び堕１」を使用することによって除去できる。この構造か、ＩＬ−■構造遺伝 子５　゛のラムダファージ由来の転写停止配列の配置、即ち、ｐＣＦＭ４１４内 の遵狡」□及びハ吐」に隣接した、“Ｔｏｏｐ”、の結果化しることは注目に値 する。

１２個の重要ではない塩基対を欠失するブラスミＩ”　４１４１Ｌ−１１２７３ の機能的な等量は、ＩＬ−ｎ断片Ｎｏ、　１及び２を一緒に結ひ、ハｍ＋によっ て産物を切断しく断片Ｎｏ、２内にＢａｍｔｌ　１部位に対して塩基３　゛を削 除すること）、その後遺伝子をＢａｍ　ｌ断片に対する刈戻」□−として、プラ スミドｐＡＤｌ＋５９の與−Ｌ−及びβ男１し切断の結果化しる大きい断片の中 に挿入することによって製造さ４゜る。プラスミドρＡＤＩＩ５９は、微生物寄 託に関する稍許商標ｆ’ｘ−の要求に基づいて、１９８３年４月１４［］に番号 ＡＴＣＣ３９３３５としてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｉｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に寄託され、１９８３年１２月２０ 日にフタパス１−条約の寄託要求に変換された。こごに引用として取り入れた、 Ｂａｎｋｓ等による１９８３年４月２５日に出願された共同所有の、共同継続米 国特許出願第４８６．０９１号に記載されているよううこ、プラスミド　ｐＡＤ Ｉ＋５９はヒト　ウロガストロン（ｈｕｍａｎ　ｕｒｏｇａｓｔｒｏｎｅ）を暗 号する構造遺伝子の製造を含んでいる。

上記中間媒体プラスミドｐｌｎｔ−ＩＬ−２の構成におけるＩＬ−ＩＩｎ断片Ｎ ｏｌの場合には、完全なウロガストロン遺伝子は最初に次の（！Ｕ−プロモータ ／レギュレータをプラスミドｐｌｎｔ−ｒ　−ｔｘＢ４内に挿入する（Ｈｉｎｄ 　ｍよりむしろ独ａｌ及びＳａｌ　ｊ−を用いて切断）。ウロガストロン遺伝子 及び前述の−（月しプロモータ／レキスレータはその後、匙」」及びＳａｌ　ｌ を用いて中間媒体プラスミドから除去され、ＥｃｏＲ，Ｉ及びＸ　ｈ　ｏ−Ｌを 用いて切断したプラスミドｐｃＦＭ４１４内に挿入される。Ｓａｌ　Ｉ認識部位 がごの構成において修復されないが、ｐｃＦＭ４１４内のＸｈｏ　＋に対するδ 、ａｍＨユ部位３１はすくにはｐＡＤＩ＋５９内には分配されない。ハ且−１− 及び知見ＵによるｐＡＤＨ５９の切断、及びＩＬ−ＩＩ断片＼′ｏ１及び２のラ イゲーンヨ：／　（Ｉｉｇａｔｉｏｎ）の旦む引□■切１折された産物（よそれ ゆえ、二つのん１接する旺哄−１部位内の間の１２個の重要でない塩基対を除い てプラスミド４１４　ＩＬ−２／３を複製するプラスミ１を住しる。

下記の実施例は本発明に従ったＩＬ−、］］の微生物による発現と二関するもの である。

実−ｈ１例−４ プラスミド４１４１Ｌ　２／３を用いて形質転換した旦ｉリセ−ＪＶ１１０３を 、３０°ｃＡＺ、ａいＴｆ７ピノリ７１００　Ｉ１ｇ／ｍ　ｅを含有するＴＥ（ １％トリプトン、０．５％イースト抽出物、及び０５％＼“ａ　’ＣＩ　）中で 育成した。培養閑か０．５Ａ６ｏｃ　の最適、２度に達し７シ二時ｊこ、温度を ３７℃まで上昇した。培養菌を温用十昇後、約３（〜１１時間遠心分＾■機を用 いて採取した。細胞を再び冷たく冷やＬＪｊＯＤ−１ｉｔｅｒ当たり６−７ｍｆ ｆの濃度において２０ｍＭ　Ｏリスｐｆ１７．５及び５０ｍゝｌ　ＮａＣｌに懸 濁した。細胞をその後、コーリンホモンしサイザー（Ｇａｕｌ□ｎ　ｈｏｍｏに ｅｎｉｚｅｒ）の通路を通して６０００ｐｓｉ　において三回溶菌（ｌｙｓｅｄ ）　した。４菌した細胞を２５分間Ｊ）ＩＯ内８５０叫こおい−で遠心分、傭し た。菌糸塊（ｐｅｌｌｅも）を再び、細胞の０Ｏ−１ｉｔｅｒ当たり２ｍ＆ｌｊ Ｏ内シこ懸濁して前と同様に再ひ同転さセた。菌糸塊をその後、占び水内に同様 な濃度において懸濁し、１４トリス、１）Ｈ７，５を最終的な１〜リス濃度１０ ｍ４を得るために添加した。その後、２０％の硫酸トデノルナ）−リウム（ｓｏ ｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ）（ＳＤＳ）を最終的な５ＤＳａ度 １％を得るために添加した。試料を室温（ＲＴ）＼いおいて静かに一時間振り、 その後、ＪＡ２０ローター中で２５分間１７．０００で回転した。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによる全ての細胞抽出物の分析結果は、適当なサイズのタンパク質であった （４１す約１５，０００ダルトン）。粗上澄みを連続して１０％フェタカルフセ ラム（ｆｅｔａｌ、　ｃａｌｆ３−３ 一６ｓｅｒｕを含有するＲＰ旧１６４０中て１０倍に希釈した。１０　−１０ま で希釈した試料を、ガ　チミジン結合分析物（ｔｙｍｉｄｉｎｅ　ｉｎｃ。

ｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）に投入した。１Ｏ−１〜１０−２までだけ希 釈した試料は、なお細胞生存可能性を許容できるほど多料のＳＯ３を含有してい た。３Ｈ−チミジン結合分析物は、核酸内へのラベル（ｌａｂｅｌ）の結合をｌ 」り定された。ＣＧｌｌｌｉｓ等１Ｕ−明すｏｌ、、１２０＋　２０２７−２０ ３２　（１９７８）　：　及びＯｐｐｅｎｈｅｉｍ等、　Ｐ、８１．Ｍａｎｕａ ｌ　ｏｆ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｊｍｍｕｎｏｌｏｐ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏ ｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ３ｙ、　Ｎ、　Ｒｏｓ−及つゝ１１ 、Ｆｒｉｅｄｍａｎ、　ｅｄｓ、　（１９７６）　〕。ＰＨＡ’ｒ二よ−２て刺 激さ、？′＋、且つ１１．−Ｉｌを外来的に添加された二週目のヒト末梢血液リ ンパ球（ＰＢＬ）培養物は、成長に対しては＋Ｌ−ＩＩに依存する（Ｍｉｅｒ等 、Ｐ−ΣΔ■ＭＳＡ）、　７７：　６１３４−６１３８（１９８０）：及びＧ１ １ｌｉｓ等、　Ｓｇｐｒａ　’、　、マうス癌特異細胞障害ｔり４細胞系（ｍｕ ｒｉｎｅ　ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ　ｃｅｌｌ　 １ｉｎｅ）　、即ちＣＴ１．　Ｌ２、もまた成長を支えるのはＩＬ−Ｉｔの添加 におおいに依存する。３１４−チミジンを、１４日目のヒトＦＢＩ。

或いはマウスＣＴＬ　Ｌ２のどちらかの核酸内に結合するためには、積極的に成 長しなければならない。もし、ＩＬ−Ｉｌ源をとちらかの細胞培養から除去すれ ば、細胞は成長を停止し究極的には一日或いは７目以内に死んでしまう。このよ う巳こ、′：１−チミソン結合分析物を使用することによって、ＩＬ−ＩＩかプ ラスミド、４１４Ｉ　Ｌ　−２／　３」匹１しか活陛であることによって生じる かどうかを決定することかできる。バクテリア的に合成じたＩＬ−ＩＩは、実際 に９Ｈ−チミジン結合分析物乙二よって測定したように、細胞によってＩＬ−Ｉ Ｉの成長を維持する。

下記の実施例は、本発明に従った＋Ｌ−Ｉｌのポ′ノベプチト類の製造に関する 。

尖罷捌づ Ａ０本発明の範囲内に属するｎ−ｎ％似供物一つのクラスは、そのなかでポリペ プチドの自然発生する形状の３個のノスチソン残基の一つが、セリン、アラニン のような他のアミノ酸残基によって置換されている。これらの類イウ物は製造さ 乙、ており、Ｃ５ｅ：’）　ＩＬ−ＩＩ、（Ｓｅｒ　）　ＩＬ−Ｈｌ及び（Ｓｅ ｒ”４１１、−■と呼ばれている。

前記の類似物は、肛皿ｌからｈ鼠ｊｌまでの距離範囲を変え、実施例１に従って 製造された下記の表■の下記のオリゴヌクレオチドを使用することによって表■ の製造された配列から容易さ乙、た。一つの塩基変更を各オリゴヌクレオチドの 下に線で記した。

各オリゴヌクレオチドは、その後Ｇｉｌｌａｍ等、　Ｇｅｎｅ、　１２：１２９ −１３７（１９８０）に従って、部位指示突然変異生成法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ ｃｔｅｄ　ｍ＋ｒＬａｇｅｎｅｓｉｓ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）て、下記の変更を 実施した。

プライマー（キナーゼ）の０．５モルを、プライマ一対鋳型（ｊｅｍｐｌａｔｅ ）のクラム分子量か１０・１（むしろ３０．１以上）になるように使用した。プ ライマー−鋳型混合物を１０分以上かけて徐ノ２に６５℃から室温まで冷却した 。Ｅ、ｃｏ旦Ｊ　Ｍ　］、０３を、ＤＮ４混合物の希釈物を用いて翻訳に使用し た。Ｋｌｅｎｏｗ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍ）の一単位を、４ 〜５時間反応に用いた。交雑を二時間、５０，０００，０００　ｃｐｍ　ｐｒｏ ｂｅとともに実施し、フィルム上に曝すことなしに、室温洗浄の後直くに高温洗 浄を１５分間実施した。洗浄温度は、三個のＣｙｓ−）Ｓｅｒ類イ以物全てに対 して６３°Ｃを用いた。

配列の後、各類似物を酵素ＲＮＡ５ｅを用いて処理５、その後フェノールで抽出 しＥ　Ｔ　ＯＩ＋沈θさせた。ＤＮＡをＨｉｎｄ［ＩＩ−及び細則りを用いて切 断し、１．２％アカロースゲル上に移シた。その後、ＩＬ−ｒｌＪル＋ｊ−Ｉｌ ｌ−Ｂａｍｌ１１　断片をＮＡ４５ペーパーを用いて分離して、敗閥１及びｆｌ 東ｌ＋！−１町−によって切Ｉ折した４１４１Ｌ−Ｉ［２／３ＤＮＡ　（実施例 ３参照）とともにライゲーションに使用し、＼Ａ＝１５ゲルを精製した。形質転 換を、■旧０３内で実施して、ハフ・フグラント（挿入していない）の２０〜３ ０倍が得られた。

コロニーを取り出し、３０℃に於いて育成し、その成約０．２のＯＤにおいて３ ７°Ｃに上胃した。巳時間後、試料をケル（０，５０１１ｍ／７）、分析物（１ ００ｍ６を遠心分離して、１％ＳＤＳ　６０ｐ　ｎ中に再び！υ濁させ、ＤＴＴ を試料の半分に添加した）、及びミニプレ、プ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）としてり出 した。

このような類似物は、自然の形状の生物学的活性を保ｆｔするものと期待される か、不適当な分子内折曲（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｆｏｌｄｉｈｇ）或 いは分子間二量体或いはポリマー形成等の増加に起因する微生物による発現シス テムから生物学的活性生の点だ２すか、分析物の中で充分活Ｉ生を維持した。’ 、Ｓｅ肘：　Ｉｉ、　１１及び、’Ｓｅｒ”：　ＩＬ−ＩＩは、自然に発生ずも 配列の活）ワの１００倍未満であった。

Ｂ、切り取った工１、−ｎｉ似供物（Ｓｔｏｐ”　：・Ｉｌ、−１１を、」７記 と同様に突然変異生成法に従って用意して、下記の２１−ｍｅｒの装造されｌこ オリゴヌクレオチドを使用した。

−ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＣＧＴ　ＴＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＴＴＣ−−表■の位置１２ １のトリプトファン残基を停止コドン、Ｈ；］ちＴＴＣに変更し、それによう】 り力、”−１アミノ酸残基欠失、持；ご、１ｒ、亡０を越えた、カルボキシ末端 において、末端アミノ醍残基欠失を有するＩＬ−ＩＩのポリペプチドＲ（ａ物を 暗号する遺伝子を漫ろのである。同し方法が、突然変異生成法の洗浄温度が５６ ℃の場合を除いて用いられた。然しなから、この切り取った類似物が完全ペプチ ドの活性の千侑未満であることを分析物は示した。

本発明に従って用！さ眉２ることのてきる他の典型的７．：１１．−■のポリペ プチド類似物は、生物学的活性の継続を増大することが可能であり（トリプトフ ァン残基、たとえば（Ｐｈｅ］■１、−　■の削除によって）、或い・１よｊ故 生物仁二、上る発現システムから生物学的活１生形状の点乙こおいて更乙こ容易 うこ分離可能である（加水分解的に不安定である、即ち不安定な酸、残基の配列 、Ａｓｎ　、　Ｇｌｙ　、例えはＣＧｉｎ”）　Ｉｆ、−ＩＩのｉ’ｉｌｆ　ｌ ｆｔによって〕。

最初に述へた典型的な類似物は、ｋし辷から５−失し−し部位までをオリゴヌク レオチド、’（ｏ、２９及び３０の変更とともに再合成するこ〆辷よって、表■ の製造された配列から用意できろ。しのためにＩは、フェニルアラニン特定コド ン、−ｒ’ｒｃ−を残基ＡＡＧ− Ｎｏ、　１２１においてトリプトファン特定コドンと置換する。二番目に述へた 灯イツ物は、鎧虹辷から■皿旦まての遺伝子配列を置き換えることによって構成 できる。その置き換えたものは１、クルタミン特定コドン−ＣＡＡ−を残基局２ ６においてアスＧＴＴ− パラギン特定コドンの代わりに与えるために、そのなかにオリゴスクレオチドＮ ０．７及び８か変更されている。

下記の実施例は、前述のＩＬ−ＩＩ暗号コドンに先行するＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇ ａｒｎｏ配列のデザインの変更を示すものである。

大詣割」 表ＴＶ、ｓｕ肛しに示したＩＬ−ＩＩ遺伝子は、開始コドン−ＡＴＧ−に優先す る下記のヌクレオチドの配列を含む。即ち、５　’　−ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧＴ 　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＴＡ−３’最初の９個の塩基配列は、その中に５ｈｉｎｅ　 Ｄｅ１ｇａｒｎｏ配列、或い１ま゛リポソーム結合部位を含む。叩ち、配列の蔑 りの部分、リポソーム結合部位と暗号づけ配列の間のスペーサー（ｓｐａｃｅｒ ）として働く。

５ｈｉｎｅ　Ｄｅ１ｇａｒｎｏ配列のＩＬ−ＩＩ遺伝子の発現レベルに及はす効 果を研究するために、次の３このリポソーム結合部位がデザインされ合成された 。

５ｈｉｎｅ　Ｄｅｌ　ａｒｎｏ　並匹肛（ａｔ　’ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　Ａ ＡＴ　ＡＡＡ　ＴＡ（ｂｌ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＴＡｉ ｃｌ　Ｃ代Ａ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＴＡこれら９３個の新しいリ ポソーム結合部位を準備するために、下記の断片が表■の断片ｌと２と置き換え ろために実施例１ｓｕｐの手順に従って合成された。

肌用番号 ｌａ　５　’　−ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＪＣＣＡＡＧ　ＡＧＧ　Ｇ’「Ａ　 ＡＴＡ　ＡＡＴ−３’２ａ　５　’　−ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　へＣ ＣＣＴＣＴＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ−３’ｌｂ　５　’　−ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＡ Ａ　ＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　、へＴＩＩＡへＴ−３′２ｂ　５　’　− ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＣＣＴＣＣＡＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ−３’ １、ｃ　５　’　−ＣＴＡ　ＧへＡ　ＡＡＡ　ＡＣＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　 ＡＴＡ　ＡＡＴ−３’２ｃ　５　’　−ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＣ ＣＴＣＣＴＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ−３’これろの断片はアニール及び表■の、靭 犯及、の実施！？＋Ｉ　２のように断片３と４とにリガティングされ、その後、 表■に示された元の断片を置換して新しいＸｂａｌ−３ａｃｌ断片を得るために 、エンドヌクレアーゼ酵素Ｓａｃ　Ｉ−によって切断した。

配列Ｃを含む新しいヘクターが上記実施例に記載のように構成され、ＩＬ−ｎ産 生において２倍の増加かめられた。

重工における直接発現に通した、製造されたＩＬ−Ｕ遺伝子の構成を示している 。製造された遺伝子は、容易にとりわシナ、イースト好性コドンを使用してイー スト細胞内の直接発現に良く適合した方法で構成できる。更に、Ｂｉｔｔｅｒに よる１９８３年・１月２２日出願の共同所有、共同継続米国特許出願番号４８７ ，７５３”イーストからの外因性ポリペプチドの分ｍ　（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｅｘｔ＋ｇｅｎｏｕｓＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｆｒｏｍ　Ｙｅａｓｔ） ”の方法は、培養培地の中へのポリペプチドの分泌とともにイースト発現を確実 にすることが可能である。この場合、ＩＬ−ＩＩポリペプチド特定コドンに対し てメチオニン確、開始、ＡＴＧコドン５　°を与えることは不必要である。

本発明の産生物及び／或いはそｎに対する抗体は、適当に°゛標識づけ（ｔａｇ ｇｅｄ）”することが可能て、１クリえば、放射線ラベルに９ つけ（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ　１ｅｄ）　（例えば、■を使って）した３￥素或 い＝　’Ｊ光ラうベづけすることができる。

それにより、液体試料中乙こ前述の産生物及び／或いシよ抗体の存在の、定性的 及び／或いは定量的な測定のための分析物に有用な試薬剤及び／或いは特徴的な テストキ・ノドを提供する。これらの抗体は、一つ或いはそれ以上の動物種（例 えは、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒト等）の接種から、或いは羊−クローン（ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体原から得ることができる。これらの試薬剤１よ、単独で 或いは適当な基質、例えはガラス或いはプラスチ７・り粒子或いは玉（ｂｅａｄ ）との併用で使用可能である。

本発明の実施においては多数の修正及び変更か、工述の例証的な実施例において 、当業者にとっては可能であろ・う。その結果として、本発明は添付の請求の範 囲己こよってのみ甲定されるものと解釈ずへきである。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　インタールーキン■ポリペプチドの選択された宿主微生物内におしする合成 を燥作することか可能な製造された遺伝子。 ２、請求の範囲第１項に記載の製造された遺伝子で、塩基配列が、投入された宿 主微生物内のコドンの優先的な発現性をもとにして、同しアミノ酸を特定する代 替えコドンから選択された一つ或いはそれ以」二のコドンを含むもの。 ３　請求の範囲第１項に記載の製造された遺伝子で、塩基配列が、シり旦内のコ ドンの優先的な発現性をもとにして、同しアミノ酸を特定する代替えコドンから 選択された一つ或い）よそれ以上のコドンを含むもの。 ４　請求の範囲第１項に記載のインタール−キン■を特定する製造さｒ、た遺伝 子で、塩基配列か下記の、５　’　−ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＡＧＣＴＣＴ　 ＴＣＴ　ＡＣ’ｒ　Ａ札　Ａ、’、Ａ　ＡＣＣ３’　−ＣＧＡ　ＧＧへ　ＴＧＣ ＴＣＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＴＴＣＴ１’Ｔ　ＴＧＧｆ：ｌ）Ｇ　ＣＴＧ 　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＡＣＣ１’Ｇ 　ＣＡ）　、ｌＴＧ　ＡＴ（ｌｌＴＣＧＡＣＧＴＴ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＴＡ　Ｇ １１ＣＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｃ’ｌ’Ｃ；　ＧＡＣＧＴＴ　Ｔ、ＩＣ１’ＡＧＣＴＧ 　ＡＡＣＧＧＴ　ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣ・ＩＡＡ　ＡＡＣ（１’、Ｇ　、Ｘ ）ＸＧ　Ｃｒ’Ｕ　ＡＣＣＣＧＴＧＡＣＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＴＴＧ　ＴＴ Ｇ　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＣＡＡＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＡＣＴ　ＴＴＣへへへ　ｒＴｃ　ＴＡＣＡＴＧ　ＣＣＧ　へへＧＡへへ　 ［；ＣＡ　ＩＩｃｃ　１′；へ、）ｒＡＣＧＡＣＴＧＡ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＡＡ Ｇ　ＡＴＧ　ＴＡＣＧＧＣＴＴＣ’ｌ’ＴＴ　ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＣＴＴＣＴＣ， ＡＡＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＣへＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｃ ＴＧ　へ：ＩＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧＧＡＣＴＴＴ　［；ＴＧ　ＧＡＣＧＴＣ、ＩＣ Ａ　ＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＡＣｒＴｒ　ＧＧＡ　ＧＩｃＧＡＧ　Ｇ ＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴ、Ｉ　ＡＡＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＣ、，１ｉ１ら 　ＬＩＣｒＴＴ　ＣＡＴ　ＣＴＧＣＴＣＣＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＧＡ ＣＣＧＡ　ＧＴｒ　ＡＧＧ　ｒＴｃ　ＩＴＣＡＡＡ　ＧｒＡ　Ｇ、ＩｃＣＧＴ　 ＣＣＡ　ＣＧＴ　ＧへＴ　ＣＴＧ　ＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡ’ＴＴ　Ａｉ’ｔＣＧ ＴＴ　１ｌＴｃ　ＧＴＡ　ＣＴＧＧＣＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＡ Ｇ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＴＡＡ　ＴＴＧ　Ｃ，ＸＡ　ＴＡＧ　ＣＡＴ　ＧＡＣＧＡ Ａ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＧＧＣＴＣＴ　ＧＡＡ　１ｌｃＴ　ＡＣＣＴＴＣＡＴＧ　 ＴＧＣＧＡＩ　ＴＡＴ　ＧＣ，ＩＣＴＴ　ＧへＡ　ＴＴＴ　ＣＣＧ　ＡＧＡ　Ｃ ＴＴ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　Ｔ、ｌＣ八ＣＧ　ＣＴＴ　八１’Ａ　ＣＧＴＧ ＡＣＧＡＧ　ＡＣＣＧＣＴ　ＡＣＣへＴＣＧＴＧ　にＡへ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　へ ・為Ｔ　ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＴＧ　ＣＴＣＴＧＧ　ＣＧＡ　ＴＧＧ　ＴＡ Ｇ　ＣＡＣＣＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＣＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＣＣＴ、１Ｇ八ＣＴ　Ｔ ＴＣＴＧＴ　ＣＡＧ　ＴＣＣＡＴＣ、ＩＴＣ届ＣＡＣＴ　ＣＴＣＡＣＣ−３’Ｔ ＧＡ　ＡＡＧ　、ＩＣＡ　ＧＴＣＡ［；Ｇ　ＴＡＧ　ＴｌＩＧ　ＴＣＧ　Ｔ［ｉ Ａ　ＧＡＣＴＧＧ　１１’−５’を含むもの。 ５　請求の範囲第１項に記載の製造ｉご孔た遺伝子て、インタールーキン■を特 定する塩基コドンが、合成さｙｌ、たポリペプチド内に各々付加の開始及び／或 いは（ギ止アミノ酸分［与疋ずイ〕、開始及Ｉ′）／或いは停止コ１ンを含むも の。 ６　請求の範囲第５項に記載の遺伝子て、前）木のイ」加のアミノ酸を特定する 開始コドンが、開始メチオニン残長を特定する：１１ンであるもの。 ７、請求の範囲第１項に記載の製造さｄ、た遺伝子で、インタールーキンＵを特 定するコドンが、１１限エンドヌクレアーゼ酵素切断のための認識部位を与えろ 塩基配列部を含む塩基配列に先行、及び／或いは続く、及び／或いは含む・もの 。 ８、請求の範囲第１項に記載の製造さｎた遺伝子て、・インタールーキン■を特 定するコドンが、リポソーム結合のための部位を′う、えろ塩基配列部を含む塩 基配列によって優先されろもの。 ９、請求の範囲第８項に記載の製造された遺伝子で、前述のリポソーム結合部位 が、配列５“−Ｃ面ＧＧＡ　ＧＧＴ−３’によって特定されるもの。 １０、一つ或いはそれ以上のアミノ酸の同一性、及び／或いは位置の点から異な っているインタールーキン■ポリペプチド頓（ＩＩ物の、選択された宿主微生物 内における合成を操作することが可能な製造された遺伝子。 １１、請求の範囲第１０項に記載の製造された遺伝子で、塩基配列が、投入され た宿主微生物内のコドンの優先的な発現性をもとにして、同しアミノ酸を特定す る代替えコドンから選択された一つ或いはそれ以上のコドンを含むもの。 １２゜請求の範囲第１１項に記載の製造された遺伝子で、塩基配列が、旦匹立ｌ 内のコドンの優先的な発現性をもとにして、同し２アミノ酸を特定する代替えコ ［・ンから選択された一つ或いはそ力７以上のコドンを含むもの。 １３　請求の範囲第１０項６こ記載の製造された遺伝子、及び（Ｇｌｎ”３ｎ− ｎ、（Ｐｂｅ　Ｅ　ＩＬ−Ｉｌ、〔ｓｅｒ’）　ｌ　Ｌ　−、Ｕ、Ｊｌａ　、　 ｉｌ、−■、Ｃ３ｅｒ力ＩＬ−ＩＴ、ＣＡＩａ”）　ＩＬ−ＩＩ、（Ｓｅｒ”］ 　ＩＬ−Ｉ□、及び’、Ａｌａ’”’５１Ｌ−１１から成るグループから選択さ れたインタールーキン■ポリペプチド類似物を特定するもの。 １４、請求の範囲第１０項に記載の製造された遺伝子で、インタールーキン■ポ リペプチド’Ｎ（ｌｕ物を特定する塩基コドンが、合成されたポリペプチド内に 各々付加の開始及び／或いは停止アミノ酸を特定する、開始及び／或いは停止コ ドンを含むもの。 １５　請求の範囲第１０項に記載の製造さり、　ｔ、＝遺伝子で、・インタール ーキン■を特定する塩基二２）−ンか、１〕＼）配列の：Ｎ’ｌ　ｌ”ｉｔエン トヌクレアーゼ切断のための認識部位を与えろ塩２．′：配列部を含む塩基配列 に先行、及び／或いは続くもの。 １６、請求の範囲第１０項に記載の製造さり、　ｔｓ遺伝子で、インタールーキ ン■を特定するコドンか、リポソーム結合のための部位を与える塩基配列部を含 む塩基配列によって１交先されろもの。 １７、請求の範囲第１０項に記載の製造された遺伝子で、前述のりホソーム結合 部位か、配列５“−Ｃ・ＩＡ　ＧＧＡ　ＧＧＴ−３”によって特定されるもの。 １８、　ＩＬ−Ｉ＋ポリペプチド類似供物い）よ、−・っ或いはそ力、以上のア ミノ酸の同一性、及び／或いは位置の点から異なっている＋Ｌ−Ｕポリペプチド 類似物の、選択された宿主微生物内に８しする合成を操作することか可能な装造 された遺伝子を含む生物学的に機能的なりＮＡ微微生物形質転換ツククー１９、 　Ｉｉ、−ｒｌポリペプチド或いは、一つ或いはそイし以よ、のアミノ酸の同一 性、及び／或いは位置の点から異なっているＩＬ−ＩＩポリペプチド類似物の、 選択された宿主微生物内にδｊＪろ合成を操作することが可能な製造さ４．た遺 伝子を含む・＼フタ−によって形質転換された微生物。 ２０、インタールーキン■ポリペプチドを製造する方法で、インタールーキン■ ポリペプチドの選択された宿主微生物内における合成を操作可能な製造された遺 伝子を含む、生物学的Ｃご機能的なりＮＡによって形質転換された微生物を適当 な富栄養状態で培養し、それにより前述の微生物が前述の遺伝子を発現しインタ ールーキン■ポリペプチドを産生ずる。 」−１微生物である。 ２２　インタールーキン■ポリペプチド頓峨物を製造する方法で、一つ或い：ま それ以りのアミノ酸の同−開、及び／或い１よ位置の点から異なっているインタ ールーキン■ポリペブチｌ”ＩＮ似供物選択された宿主微生物内におシする合成 を操作可能な製造された遺伝子を含む、生物学的に機能的なりＮＡ　’こよって 形質転換された微生物を適当な富栄養状態で培養し、それにより前述の微生物が 前述の遺伝子を発現しインタールーキン１■ポリペブヂトを産生ずる。 ２３、請求の範囲第２２項に記載の方法で、培養した微生物かＥ、ｃ。 打機生物である。 ２４　インタールーキン■ポリペプチドの選択された宿主微生物内における合成 を操作可能な製造された遺伝子の１故生物内りこおける発現のポリペプチド産生 物。 ２５　一つ或いはそれ以上のアミノ酸の同一性、及び／或いは位置の点から異な っているインタールーギン■ポリペブチ１１ｐ似物の選択６ｚ１．た宿主微生物 内にろコＪる・１ち一成を際作可能ム・８造さ２＋、た遺伝子の微生物内２こお ける発現のポリペプチド産生物。 １２、 特許請求の範囲第２５項に記載の産生物で、＋Ｇｌｎ　ｙ　Ｉｔ、−ｎ、ＩＰｈ ｅ”’）　ＩＬ−１１、ＦＳｅｒ’＋　ＩＬ−ＩＩ、ＣＡ１．４””）　ＩＬ− ＩＩ　、、（Ｓｅａ”）ＩＬ−ＩＴ　、〔八ｌａ　〕ＩＩ、−■、ｊｓｅｒ”Ｍ 　Ｉｌ、−１１、及び　〔八ｌａ”ｊ　１１−　■から成るグループから選択さ れるもの。 ２７、インタールーキン■ポリペブチＩの選択さ札た宿主微生物内における合成 を操作可能な或いは、一つ或いはそれ以上のアミノ酸の同一性、及び／或いは位 置の点から異なっているインタールーキン■ポリペプチド邦供物の選択さ才１． た宿主微生物内における合成を操作可能な放射線ラベルつ）すされた製造された 試薬剤。 ２８、インタールーキン■ポリペブチ１の」ツ択さｎ、た宿主微生物内にぢシす る合成を操作可能な製造さｎ、た遺伝子の微生物内における発現の或いは、一つ 或いはそ乙以上のアミノ酸の同一性、及び／或いは位置の点から異なっているイ ンタールーキン■ポリペプチド類イシ物の選択された宿主微生物内にお２する合 成を操作可能な製造された遺伝子の微生物内シこおシする発現の放射線ラベルづ シナされたポリペプチド産生物を含む試薬剤。 ２９、請求の範囲第２７項に記載の試薬剤で、前述の放射線ラベル！−！ が■であるもの。 ３０、インタールーキン■ポリペプチドの選択さ、？′Ｌ定宿玉倣生物内におけ る合成を操作可能な製造され定遺伝子の微生物内におシする発現の或いは、一つ 或いはそ２１．以上のアミノ酸の同一姓、及び／或いは位置の点から異なってい るインク−ルーキン■ポリペプチド類似物の選択された宿主微生物内に３ける合 成を操作可能な製造きれた遺伝子の微生物内乙ごおシする発現のポリペプチド帝 生物二二対して標庶つ：すＬ背こ抗体を舎り表面をプラスチック玉で被覆した試 薬剤。 ３１、微生物的に合成され、生物学的に活性を有するタンパク質産生物で、該タ ンパク質彦生物か一つ或いはそれ以上のアミノ酸残基の同−性或いは位置の点て 、及び−っ或いはそ／ｊ、星上の生物学的及び薬学的陛質の点て自然発生ずるイ ンタールーキン■と異なっているが、自然発生ずるインタールーキンＨの他のｉ 主室を保育するもの。 ３２、非自然発生インタールーキンＨのポリペプチドＩＩ　％供物で、自然発生 ずるインタールーキン■のアミノ酸配列の下記の変更の一つ或いはそれ以上の存 在によって特徴つけられるもの、 （ａ）　分子内折曲或いは、分子内二量体或いはポリマー形成の部位を与えるア ミノ酸残基の欠失及び／或い）よ置換、（ｂ）　末端アミノ酸残基の欠失、 （Ｃ１アミノ酸残基の末端アミノ酸残基付加、ｆｄｌ　高酸性状態における加水 分解不安定部位を与えるアミノ酸残基欠失及び／或いは置換、 ｆｅ）　アミノ酸残基のクルタミン残基による置換、ｊ（ｌ　アミノ酸残基のフ ェニルアラニン残基による置換、（ｇ）トリプトファン残基の欠失及び／或いは 置換、ｆｈ）　アスパラギン残基の欠失及び／或いは置換、（ｉ）　ンステイン 残基の欠失及び／或いは置換、（」）　アミノ酸残基のセリン残基による置換、 及び（ｋ）　アミノ酸残基のアラニン残基による置換。 ３３、請求の範囲第３２項に記載のポリペプチドで、自然発生するインタールキ ン■のアミノ酸配列内の下記の変更の一つ或いはそれ以上によって特徴づけられ る、 ｉｉＩ　Ａｒｇ”％こ続く全ての残基の欠失、及び（ｊｌ　Ｍｅｔの添加。 ３４　請求の範囲第３３項に記載のポリペプチドで、ｆａｉ　（Ｇｌｎ２′〕Ｉ Ｌ−ＩＩ、 （ｂｌ　（Ｐｈｅ　、ｔＬ−ＩＩ、 ｆ」ｌ　（ａｌから（１）までの結合、及び（１（ｊ目ｅ　Ｌ−”Ｊの形成 から構成されるグループから選択されるもの。