JPS61296257A - 電気泳動用媒体材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、電気泳動用媒体材料に関するものであり、さ
らに詳しくは、特にＤＮＡの塩基配列決定操作に用いる
のに適した電気泳動用媒体材料に関するものである。

［発明の背景］ ボストラベル法に基づ＜ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列決定
法においては、ポリアクリルアミドゲル膜を用いたスラ
ブ電気泳動操作が必須の操作となっている。特に近年に
おいて遺伝子関連の研究が進むにつれて、ＤＮＡ塩基配
列決定の操作の迅速化が急務となっている。

ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミドのような
単量体を触媒の存在下にてＮ、Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミドのような二官能性の架橋剤を用い架橋重合さ
せることにより得られる。

なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際して通
常は、尿素あるいはホルムアミドのような変性剤を含有
させる。

上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸素の影響
により反応が阻害されるため、ポリアクリルアミドゲル
膜は酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この理
由から、現在では一般に、ポリアクリルアミドゲル膜は
２枚のガラス板で形成されたセル（一定の空間、たとえ
ば約０．３〜１ｍｍを有する）の中にゲル形成液を注入
させ。

酸素を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を形成させ
ている。

この方法は二枚のガラス板の間でゲル膜を形成するため
に、取り扱い性が悪く、かつゲル膜の量産化が困難であ
るといった大きな欠点を有している。

以上のようにして形成したポリアクリルアミドゲル膜を
用いる電気泳動操作は、たとえば、次のようにして実施
される。

ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に挟んだままの状
態で垂直に立てられ、前電気泳動を行なったのち、ゲル
膜上端部に設けられたサンプルスロットに試料（たとえ
ば、マキサム・ギルバート分解した２２　ｐラベル化Ｄ
ＮＡ）を一定量注入し、次いで電気泳動を行なう。そし
て一定時間（例。

約６時間〜１２時間）の電気泳動を行なった後、片面の
ガラス板を注意深く除去し、その露出面をポリ塩化ビニ
リデンフィルムなどの合成樹脂製フィルムでゲル膜を覆
い、これを用いてオートラジオグラフィー処理を行なう
。

すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被覆しているフ
ィルムの上にＸ線フィルム、増感スクリーンを順次のせ
て、低温（たとえば、−８０℃）で一定時間（たとえば
、約１０〜２０時間）露光を行なう。そして露光終了後
、Ｘ線フィルムを現像し、ＤＮＡの分離泳動パターンを
読みとることからなるオートラジオグラフィー処理によ
り、ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

オートラジオグラフィー処理は以上のように長時間を必
要とするため、その迅速化が望まれ、更に読みとりの高
分解能化も望まれている。

従来のアクリルアミドゲル膜を用いた電気泳動媒体材料
は上記のようにガラス板を用いるたメニ取り扱い性に問
題があり、しばしばガラスを割ったりして実験を失敗す
ることがある。更に、オートラジオグラフィーに際し、
上記のように片面のガラスを除く必要があり、この時に
ゲル膜を破損したりする事もあり、この操作は非常に熟
練を必要とする。したがって、この様な欠点を改良した
取り扱い性の良好なポリアクリルアミドゲル膜の開発が
熱望されている。

［発明の要旨］ 本発明の目的は、ガラス板の代りにプラスチックフィル
ム（あるいはシート）を支持体として用い、かつ支持体
と電気泳動用媒体層（ポリアクリルアミドゲル膜）との
間の接着性が向丘した電気泳動媒体材料を提供すること
にある。

本発明の他の目的は、高分解能な分離性能を示す電気泳
動媒体材料を提供することにある。

本発明の第一の態様は、下記の各層が順次積層されてな
る電気泳動用媒体材料： ［Ｉ］プラスチック支持体層； ［１１ｊスルフイン酸基含有ポリマーを含有する接着層
； ＣＩ［１］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、
および変性剤として少なぐとも１個のカルバモイル基を
もつ化合物を含む電気泳動用媒体層；および ［ＴＶ］プラスチックカバーフィルム層；からなる。

ただし１本発明においては、上記のスルフィン酸基含有
ポリマーを含有する接着層は、支持体層と電気泳動用媒
体層との間の代りに電気泳動用媒体層とカバーフィルム
層との間にあってもよく（本発明の第二の態様）、ある
いは支持体層と電気泳動用媒体層との間および電気泳動
用媒体層とカバーフィルム層との間の双方に設けられて
いてもよい（本発明の第三の態様）。

本発明が提供する電気泳動用媒体材料は前述の電気泳動
後の電気泳動用媒体層の乾燥工程における各種の操作に
よってもその複合層構造が分離しにくいため、電気泳動
用媒体層の破損が発生することは殆どないとの利点があ
る。

さらに１本発明の電気泳動用媒体材料は、水平に置いた
プラスチック支持体またはプラスチックカバーフィルム
の北に接着層を形成し、次いで電気泳動用媒体層をその
上に形成し、さらに電気泳動用媒体層の上に、所望によ
り同様の接着層を設けたのち、カバーフィルムまたは支
持体を付設する方法によって製造することが可能である
ため、電気泳動用媒体材料の量産化にも大きく寄与する
ものである。

［発明の詳細な記述］ まず、本発明の第一の態様および第三の態様について説
明する。

本発明の電気泳動用媒体材料の支持体は、プラスチック
製シート（あるいはフィルム）である。

このプラスチック製シートとしては任意のプラスチック
から形成したものを用いることができる。

好ましいプラスチックシートの例としては、親水性ポリ
マーまたは公知の表面処理により表面を現水化したポリ
マー（例、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノー
ルＡのポリカルボネート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリ
デン・塩化ビニルコポリマー、ポリメチルメタアクリレ
ート、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセ
テート類、セルロースアセテートプロピオネート等）の
フィルム、板またはシート等の成形物をあげることがで
きる。特にポリエチレンテレフタレートから形成された
シートを用いることが好ましい。

これらのポリマー成形物の表面を親水化するための処理
のためには、紫外線照射、グロー放電処理、コロナ放電
処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチング、電
解エツチング等の公知の方法を適用することができる。

支持体は一般に厚さが、約５０ルｍ〜約５００μｍ、好
ましくは約７０ｇｍ〜約３００ｇｍのものが用いられる
。

本発明においてプラスチック製支持体の上にはスルフィ
ン酸基含有ポリマーを含有する接着層が設けられる。

本発明において用いられるスルフィン酸基含有ポリマー
は特に制限はないが、具体例としては、下記一般式ＣＩ
）によ〜って表されるくり返し単位を有するポリマーを
挙げることができる。

ただし上記一般式（Ｉ）において、 ［Ｒは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基（例、メチ
ル基、エチル基）、またはハロゲン原子（例、塩素、臭
素）であり、 Ｍは水素原子、アルカリ金属原子（例、ナトリウム、カ
リウム）、アルカリ出金属原子（例、カルシウム、マグ
ネシウム）または有機塩基（例トリエチルアミン）であ
り、ｍはｏ、ｉまたは２であり、そして、 ｎは１または２である］ さらに、本発明に用いられるポリマーの例としては、下
記一般式（■）によって表される千ツマ−を重合して得
られるホモポリマー（すなわち−般式（Ｉ）によって表
されるくり返し単位だけからなるポリマー）、一般式（
ｎ）で表されるモノマーと他の付加重合性不飽和結合を
少なくとも１つ有するモノマーとを重合して得られるコ
ポリマー及び重合後に側鎖にスルフィン酸基を導入して
得られるポリマーおよびそれらポリマーの誘導体等も挙
げることができる。

ただし上記一般式（ＩＩ）において、 ［Ｒは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基（例、メチ
ル基、エチル基）、またはハロゲン原子（例、塩素、臭
素）であり、 Ｍは水素原子、アルカリ金属原子（例、ナトリウム、カ
リウム）、アルカリ上金属原子（例、カルシウム、マグ
ネシウム）ま、たは有機塩基（例トリエチルアミン）で
あり、ｍはＯｌｌまたは２であり、そして、 ｎは１または２である］ 一般式（ＩＩ）によって表されるモノマーの具体例とし
ては、 等を挙げることができる。これらのうちで特に好ましい
モノマーは（Ａ）の化合物である。モノ？−（Ａ）はケ
ミストリー・レターズ（ＣｈｅｍｉｓＬｒｙＬｅｔｔｅ
ｒｓ　ｐｐ　４１９−４２０　（１９７Ｂ）に記載の合
成法に従い合成することができるが、必ずしもこの合成
法に限定されるものではない、他のモノマーの合成も基
本的には対応するスルホン酸塩化物を合成しさえすれば
、そのあと上記ケミストリー・レターズ（Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）と同様の方法もしくは亜硫酸
ナトリウム等の還元剤で還元し、必要に応じてビニル化
すればよい。

またポリスチレン等のポリマーを出発原料としてポリマ
ー反応を用いて「上記方法」で一般式（Ｉ）のくり返し
単位を有するポリマーを得てもよい。

一般式（ＩＩ　）で表されるモノマーと共重合させるこ
とのできる千ツマ−としては、付加重合性不飽和結合を
少なくとも１個有するモノマーならば一般に使用するこ
とができる。上記付加重合性不飽和化合物としては、 アリル化合物、 アリルエステル類（例えば、酢酸アリル、カプロン酸ア
リルなど〕、 ビニルエーテル類（例えば、メチルビニルニーチル、ブ
チルビニルエーテル、ヘキシルビニルエーテル、デシル
ビニルエーテル、エチルヘキシルビニルエーテル、メト
キシエチルビニルエーテル、クロルエチルビニルエーテ
ル、■−メチルー２．２−ジメチルプロピルビニルエー
テル、２−エチルブチルエーテル、ヒドロキシエチルビ
ニルエーテル、ジメチルアミノエチルビニルエーテル、
ブチルアミノエチルビニルエーテル、ビニルトリルエー
テル、ビニルクロルフェニルエーテル、ビニル２．４−
ジクロルフェニルエーテル、ビニルナフチルエーテルな
ど）、 ビニルエステル類（例えば、ビニルアセテート、ビニル
プロピオネート、ビニルブチレート、ビニルイソブチレ
ート、ビニルジメチルプロピオネート、ビニルエチルプ
レート、ビニルエチルプレ−ト、ビニルジクロルアセテ
ート、ビニルメトキシアセテート、ビニルフェニルアセ
テート、ビニルアセトアセテート、ビニル−β−フェニ
ルフチレート、ビニルシクロヘキシルカルボキシレート
、安息香酸ビニル、サリチル酸ビニル、クロル安息香酸
など）、 ビニル異部環化合物（例えば、Ｎ−ビニルオキサゾリド
ン、Ｎ−ビニルイミダソール、Ｎ−ビニルピロリドン、
Ｎ−ビニルカルバゾール、ビニルチオフェン、Ｎ−ビニ
ルカルバゾール、ビニルチオフェン、Ｎ−ビニルエチル
アセトアミドなど）、 スチレン類（例えば、スチレン、メチルスチレン、ジメ
チルスチレン、エチルスチレン、イソプロピルスチレン
、ブチルスチレン、ヘキシルスチレ、ジメトキシスチレ
ン クロロメチルスチレン、トリフルオロメチルスチレン、
アセトキシメチルスチレン、メトキシスチレン、４−メ
トキシ−３メチルスチレン、ジメトキシスチレン、クロ
ロスチレン、ジメトキシスチレン、トリクンソスチレン
、ブロモスチレン、ヨードスチレン、フルオロスチレン
、２−ブロモ−４−トリフルオロメチルスチレン、ビニ
ル安息香酸メチルエステルなど）、 クロトン酸類（例えば、クロトン酸、クロトン酸アミド
、クロトン酸エステル、クロトン酸ブチルなど）、 オレフィン類（例えば、ジシクロペンタジェン、エチレ
ン、プロピレン、１−ブテン、ｌ−ペンテン、１−ヘキ
セン、４−メチル−１−ペンテン、１−ヘプテン、１−
オクテン、５．５−ジメチル−１−オクテン、４−メチ
ル−１−ヘキセン、５−メチル−１−ヘキセン、４−メ
チル−１−ヘプテン−５−メチル−１−ヘプテンなど）
、イタコン酸類（例えば、イタコン酸、イタコン酸メチ
ルなど）、 ソルビン酸、桂皮酸、ソルビン酸メチル、シトラコン酸
、クロロアクリル酸、メサコン酸、マレイン酸、フマー
ル酸、エタクリル酸、 ハロゲン化オレフィン類（例えば、塩化ビニル、塩化ビ
ニリデンなど）、 アクリル酸類（例えば、アクリル酸、アクリル酸メチル
など）、 メタクリル酸類（例えば、メタクリル酸、メタクリル酸
メチルなど）、そして、 アクリルアミド類等を挙げることができる。

これらの付加重合性不飽和化合物のうちでは、特にスチ
レン類、ビニル異部環化合物類、ビニルエーテル類、ビ
ニルエステル類およびオレフィン類が好ましい。

本発明で使用できるポリマーは一般式ＣＩ）で表わされ
るくり返し中位をすくなくとも０．０１モル％含む必要
があり、好ましくは０．１モル％以上、更に好ましくは
１モル％以上含む必要がある。

本発明に使用することができるポリマーの化合物の具体
例を以下のＰ−１からＰ−１４に示す。

なお組成比は全てモル比で示しである。

−←ＣＨ２−ＣＨラ−１− Ｘ／Ｙ＝８０／２０　　　　（Ｐ−３）ｘ　／　ｙ　＝
　５０　／　５０　　　（Ｐ　−４）ｘ　／　Ｙ　＝　
５０　／　５０　　　（Ｐ　−５）ＳＯ□　Ｎａ ｘ　／　ｙ　＝　　５　０　／　５　０　　　　（Ｐ　
−６）ＳＯ２Ｎａ　　　　　　　　　５Ｏ２Ｋｘ　／　
Ｙ　＝　７５　／　２５　　　（Ｐ　−７）０２Ｎａ ｘ　／　ｙ　＝　７０　／　３　０　　　（Ｐ　−８）
ＳＯ□　Ｎａ ｘ　／　ｙ　／　ｚ　＝　５０　／　２０　／　３０　
　　（Ｐ　−９）Ｓｏ　　２　Ｎａ ｘ　／　ｙ　＝６０　／　４０　　　（Ｐ　−１０）ｘ
／ｙ＝８０／２０　　　（Ｐ−１１）ＳＯ２Ｎａ ｘ　／　ｙ　＝　８　０　／　２０　　　（Ｐ　−１２
）Ｓｏ　　２　Ｎａ ｘ　／　ｙ　＝　５　／　９５　　　（Ｐ　−１３）ｘ
／ｙ＝１０／９０　　　（Ｐ−１４）本発明においてス
ルフィン酸基含有ポリマーと共に被膜形成能を有するポ
リマーを併用しても良い。併用できるポリマーとしては
、特に制限はなく、水溶性のポリマーあるいは水不溶性
のポリマーを用いることができる。好ましく用いられる
ポリマーの例としては、セルロースおよびニトロセルロ
ース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロースなどのセル
ロース誘導体、デキストラン、アガロース、ポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコールエステル（例、ポリ酢
酸ビニル）、ポリアクリル酸エステル（例、ポリ（ヒド
ロキシエチルアクリレート））、プルラン、およびプル
ラン誘導体等を挙げることができる。

上記接着層の厚さは約０．１〜３０ｇｍ、好ましくは約
０．２〜１５ｐｍの範囲である。

上記の接着層の下側−（支持体側）には更にポリマ一層
を設けることができる。ポリマ一層としては上記接着層
のバインダーポリマーからなる薄膜層（厚さ０．１〜３
ｐｍ）が好ましい。

次に電気泳動用媒体層（以下において、ゲル媒体層、ポ
リアクリルアミドゲル膜あるいは単にゲル膜ともいう）
について説明する。

ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド系化合物
と架橋剤とを、水溶液または水分散液として水中に溶解
または分散させてゲル形成液を調製したのち、液中で両
者を架橋重合させて架橋重合した水性ゲル膜として形成
することにより得ることができる０本明細書においては
、特にことわらない限り、（水中に）溶解と（水中に）
分散の両者を含めて単に（水中に）溶解といい、水溶液
と水分散液の両者を含めて単に水溶液という。また、溶
媒または分散媒として、所望により加えられる有機溶媒
と水の混合物をも包含する。

ポリアクリルアミドゲル膜の形成に用いることができる
アクリルアミド系化合物としては、アクリルアミド、Ｎ
−メチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルア
ミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、ジア
セトンアクリルアミド等のアクリルアミド系化合物やメ
タクリルアミドの様なメタクリルアミド系化合物が挙げ
られ、これらの化合物は単独で、あるいは二種以上を併
用して用いることができる。これらのアクリルアミド系
化合物のうちではアクリルアミドが最も好ましく、また
アクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物あるいは
メタクリルアミド系化合物の一種以上の併用も好ましい
。

架橋剤としては、「エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　Ｊ　１９８１．２．２１３−
２２８等に記載の公知の化合物（一種または二種以北の
組合せ）を用いることができる。架橋剤の例としては、
二官能性化合物および三官能性化合物を挙げることがで
きる。二官能性化合物の例としては、Ｎ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）。

Ｎ、Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド（ＰＢＡ）；
ジ（アクリルアミドジメチル）エーテル（ＤＡＥ）；　
１．２−ジアクリルアミドエチレングリコール（ＤＥＣ
）；エチレンウレアビスアクリルアミド（ＥＵＢ）；エ
チレンジアクリレート（ＥＤＡ）；　Ｎ　、Ｎ　’−ジ
アリルタータルジアミド　　（Ｎ、Ｎ’−ｄｉａｌｌｙ
ｌｔａｒｔａｒｄｉａｍｉｄｅ　　　：　　Ｄ　　Ａ　
　Ｔ　　Ｄ　　）　　　；およヒＮ　、　Ｎ　’−ビス
アクリリルシスタミン（Ｎ。

Ｎ’−ｂｉｓａｃｒｙｌｙｌｃｙｓｔａｍｉｎｅ、　Ｂ
　Ａ　Ｃ）等を挙げることができる。三官能性架橋剤の
例としては、１゜３．５．−）リアクリロイルへキサヒ
ドロ−３−トリアジン、トリアリルシアヌレート、トリ
アリルイソシアヌレート＋を挙げることができる。なか
でも、三官能性等架橋剤を用いた場合には特に電気泳動
用媒体層と接着層との間の高い接着が実現される。

架橋剤の量は、単量体と架橋剤の総重量に対して約０．
１ｗｔ％から約３０ｗｔ％、好ましくは約０．５ｗｔ％
から約１０ｗｔ％の範囲で用いることができる。

ゲル濃度としては、ニスφヘジャーテン（Ｓ。

Ｈｊｅｒｔｅｎ）　：　　ｒアーク・へイオケム会バイ
オフィズ（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、）　Ｊ　１　（補遺）。

＋４７（１９６２）に記載の定義に従って表示して、単
量体、架橋剤および水からなるゲル膜の容積に対して、
単量体と架橋剤の量が約３　ｗ　／　ｖ％から約３０　
ｗ　／　ｖ％の範囲で好ましく用いられる。

ポリアクリルアミドゲル膜に含有させる変性剤としては
、少なくとも１個のカルバモイル基を持つ化合物を挙げ
ることができ、その具体例としては、尿素、ホルムアミ
ド等が挙げられる。これらのうちで尿素が特に好ましく
用いられる。変性剤の清は単量体と架橋剤とを含む水性
ゲルの容積に対し、約４０　ｗ　ｔ　／　ｖ％から約６
０　ｗ　ｔ　／　Ｖ％の範囲で用いられる。尿素を用い
る場合には、単量体と架橋剤とを含む水性ゲル１文に対
し約６モル（約３６０　ｇ）から飽和溶解量まで、好ま
しくは約７モル（約４２０ｇ）から飽和溶解量までの範
囲で用いることができる。

ポリアクリルアミドゲル膜には水溶性ポリマーを含有さ
せることができる。

水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮重合型の
水溶性ポリマニを用いることができる。

付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等
の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。縮重合型ポ
リマーの具体例としてポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリアルキレ
ングリコールが挙げられる。水溶性ポリマーの分子量は
、約１万から約１００万の範囲のものが好ましい。これ
らの水溶性ポリマーのうちでは、ポリエチレングリコー
ル、ポリアクリルアミドが特に好ましい。

水溶性ポリマーは、ｓ量体と架橋剤の合計重量に対して
約１ｗｔ％から約１００ｗｔ％の範囲、好ましくは約２
ｗｔ％から約５０ｗｔ％の範囲で用いられる。水溶性ポ
リマーを添加することにより、ポリアクリルアミドゲル
膜は可塑性を有するようになるため、裁断加工時に壊れ
ることがなくなり、またゲル膜は乾燥時にも可塑性を有
するようになり、もろさが改良され壊れにくくなるとの
利点がある。また、水溶性ポリマーの分子量および添加
量を選択することにより、ゲル膜の粘度をコントロール
することもできる。

ポリアクリルアミドゲル膜にはアガロースを含有させる
ことができる。アガロースは公知のアガロースであれば
特に制限はなく、低電気浸透性、中電気浸透性、高電気
浸透性アガロースのいずれをも用いることができる。用
いることのできるアガロースの例としては特開昭５５−
５７３０号、特開昭５５−１１０９４６号および特開昭
５７−５０２０９８号等の公報に開示されているアガロ
ース等がある。

アガロースの添加量は、単量体と架橋剤とを含むゲル組
成液の容積に対して約０　、１　ｗ／　ｖ％から約２　
ｗ　／　ｖ％、好ましくは約０．３ｗ／ｖ％から約１．
２ｗ／ｖ％の割合で用いられる。ゲル膜にアガロースを
添加することにより、ゲル形成用溶液温度を変化させる
ことにより、適当な溶液粘度にコントロールすることが
可能となり、その流動性を止めることができ、またゲル
膜を成形する時には成形しやすくなるとの利点がある。

ポリアクリルアミドゲル膜にはｐＨ緩衝剤を含有させる
ことができる。緩衝剤としては、ｐ、　Ｈ８，０から１
０．０、好ましくはｐＨ８，０から９．０の範囲内のｐ
Ｈ値に緩衝できる緩衝剤であれば、いずれをも用いるこ
とができる。用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「
化学便覧　基礎編１　（東京、丸善■１８６６年発行）
　＋３１２−１３２０頁；ｒデータ・フォア・バイオケ
ミカル・リサーチ（Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｓ
ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　Ｊ　（アール”　エ
ム１１　シ＠　ドーソン外（Ｒ，Ｍ、　Ｃ，Ｄａｓｓｓ
ｏｎ　ｅｔａｌ）１ｊＡ７ＰＪ２版、　０ｘｆｏｒｄ　
ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄａｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９
Ｅｔ９年発行）　４７ｆｉ−５０８ページ；「バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｊ　、し
４Ｂ？（１９６Ｂ）　； ｒアナリティ力ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｊ　１０４
．３００−３１０（１９８０）等の刊行物に記載の緩衝
剤があげられる。

そして、その具体例としてはトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタ７　（Ｔｒｉｓ）　　［ＣＡＳＲｅｇｉｓ
ｔｒｙＮｏ７７−８８−１１　、　Ｎ　、　Ｎ−ビス（
２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）　、
　Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−
ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸のＮａ塩またはに
塩等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３
−プロパンスルホン酸のＮａ塩またはに塩等、Ｎ−［ト
リス（ヒドロキシメチル）メチルクー３−アミノプロパ
ンスルホン酸のＮａ塩またはに塩および、これらのいず
れかと必要により組合せられる酸、アルカリまたは塩等
をあげることができる。

特に好ましい緩衝剤の例としてはＴｒｉｓ、ホウ酸およ
びＥＤＴＡ−２Ｎａ塩の組合せ（ｐＨ８，３）がある。

ポリアクリルアミドゲル膜には、必要に応じて抗酸化剤
などの他の添加剤を含有させることができる。抗酸化剤
としては、ゲル膜に配合しうることが知られている種々
の化合物を用いることができる。抗酸化剤の具体例とし
てはジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールが
挙げられる。　本発明においてポリアクリルアミドゲル
膜はアクリルアミドに代表される単量体、二官能性のア
リル（ａｌｌｙｌ　）化合物またはアクリル化合物（架
橋剤）、水溶性ポリマー、およびアガロースを実質的に
均一に溶解させた水溶液中で単量体と架橋剤とをラジカ
ル架橋重合させて得られるものであり、単量体と架橋剤
から形成された三次元架橋重合体に水溶性ポリマーとア
ガロースが実質的に分散されて、後二者のポリマー鎖が
三次元架橋重合体とからみあっている構造を有すると推
定され、この構造が特徴をなすゲル媒体である。

上記のラジカル架橋重合反応は１分子状酸素の不存在下
で過酸化物の存在および／または紫外線照射等の公知の
方法により発生させることができる。この反応を加熱お
よび紫外線照射により加速することもできる。

ラジカル架橋重合用触媒としては、「エレクトロフォレ
シス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　Ｊ　１９８
１．２゜２１３−２１９．同１９８１．２．２２０−２
２８　；青水、永井編［最新電気泳動法Ｊ　　（１９７
３年発行）等に記載の公知の低温ラジカル重合開始剤の
うちから適宜選択して用いることができる。好ましいラ
ジカル重合開始剤の具体例としては、β−ジメチルアミ
ノプロピオニトリル（ＤＭＡＰＮ）−ペルオクソニ硫酸
アンモニウム混合物、Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメ
チルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）−ペルオクソニ硫
酸アンモニウム混合物、ＴＥＭＥＤ−リボフラビン混合
物、ＴＥＭＥＤ−リボフラビン−過酸化水素混合物と紫
外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル重合開始剤
の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して約０．
０１重量％から約５重量％、そして好ましくは約０．１
重１％から約３重量％の範囲である。

ポリアクリルアミドゲル膜には、必要に応じて抗酸化剤
などの他の添加剤を含有させることができる。抗酸化剤
としては、ゲル膜に配合しうろことが知られている種々
の化合物を用いることができる。抗酸化剤の具体例とし
てはジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールが
挙げられる。

その他の添加剤としては湿潤剤があり、ポリアクリルア
ミドゲル膜にはグリセリン、エチレングリコール等のポ
リオール化合物を含有させることもできる。ポリオール
化合物の含有量は、ゲル膜の容積に対して約５　ｗ　／
　ｖ％から約４０　ｗ　／　ｖ％の範囲から選ばれる。

ポリオール化合物のうちではグリセリンが特に好ましい
。湿潤剤を配合することによりゲル膜の保存時の極端な
水分の蒸発による乾燥を防ぐことが可能となり、また極
端な乾燥に起因するもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等の
ゲル膜の物性が改善されるとの利点がある。

ゲル媒体層は、平滑表面を有する支持体に設けられた前
述の接着層のＨにゲル形成液を公知の方法により塗布し
たのち、ゲル形成液を架橋重合さ゛せることにより、層
状に成形することができる。

支持体表面に塗布されたゲル形成液は、そのまま、ある
いはゲル形成液塗布層をプラスチックカバーフィルム（
シート、板状物も含む）で覆ったのち架橋重合させる。

この目的に使用されるプラスチックカバーフィルムとし
ては前記のプラスチック支持体と同様のものを用いるこ
とができる。

このプラスチックカバーフィルムの厚さは３００ｐｍ以
下であり、実用的に好ましい範囲としては約ｌＯ〜２０
０ルｍである。

以上のようにして、プラスチック支持体層、スルフィン
酸基含有ポリマーを含有する接着層、電気泳動媒体層、
およびプラスチックカバーフィルム層の四層を含む電気
泳動媒体材料を製造することができる。

なお、上記のプラスチックカバーフィルムと電気泳動媒
体層との間には、上記と同様なスルフィン酸基含有ポリ
マーを含有する接着層を設けることができる。その接着
層は、たとえば、プラスチックカバーフィルムの片面（
電気泳動媒体層に接触させる側の面）に予め接着層を、
前記の支持体への接着層の付設と同様な方法で付設して
おき、これを電気泳動媒体層の表面に重ねる方法などに
より形成することができる。

また、本発明の第二の態様は、プラスチック支持体層、
電気泳動媒体層、スルフィン酸基含有ポリマーを含有す
る接着層、およびプラスチックカバーフィルム層の四層
を含む電気泳動媒体、材料からなるものである。この四
層構造は、たとえば、前記の第一の態様の電気泳動媒体
材料の製造法において、支持体層をカバーフィルム層に
、そしてカバーフィルム層を支持体層に置き換えた方法
、すなわち、まずカバーフィルム層にスルフィン酸基含
有ポリマーを含有する接着層を形成したのち、その上に
ゲル形成液を塗布し、次いでゲル化後にその上に支持体
を付設する方法により製造することができる。

あるいは、本発明の第二の態様の電気泳動用媒体材料は
、まず支持体の表面に直接、あるいは所望により本発明
で規定した接着層以外の接着層を付設したのち、ゲル形
成液を塗布し、次いでゲル化後にその上にスルフィン酸
基含有ポリマーを含有する接着層を有するカバーフィル
ムを付設する方法によっても製造することができる。

本発明の電気泳動用媒体材料は、前述の諸文献等に記載
の公知の方法に従って、水平型および垂直型平板電気泳
動法、ディスク電気泳動泳動法等のいずれにも用いるこ
とができる。

本発明の電気泳動媒体材料は、特にプラスチッり製シー
ト（支持体あるいはカバーフィルム）と電気泳動用媒体
層との間の接着に顕著な有効性を示す特定の接着層を付
設したため、その製造工程、あるいは電気泳動工程およ
びそれに附随する工程において、そして乾燥時および湿
潤時のいずれの時でも、各層の分離が発生しにくいとの
顕著な利点がある。またその接着層が高い接着性を示す
ことから、各層間の密着性も向上し、このため電気泳動
の分解能も向上する。

以下に本発明の実施例を記載するが、これらは本発明の
範囲を限定するものではない。

［実施例１］ 紫外線照射処理により表面を親水性にした厚さ１８０　
ｐｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（
支持体）上に約０．５１Ｌｍの厚み（固形分）になるよ
うに、第１表記載の接着層形成用塗布液を塗布し、約１
１０℃で乾燥してスルフィン酸基含有ポリマーを含む接
着層を形成した。

第１表　接着層形成用塗布液の組成 接着層塗布液の成分　　　　　　試料番号ポリマー（Ｐ
−２）（ｇ）　　３０　　−　　−ポリマー（Ｐ−４）
（ｇ）　　　−３０−ポリマー（Ｐ−１４）　　（ｇ）
　　　　　　−３０メタノール（ｍ交）　　　　　　４
００　４００　４００水　　　　　　（ｍ文）　　　　
　　　　　Ｅｌｏｏ　　　８００　　１３００支持体り
に設けられた各接着層の上に、アクリルアミドｌ　１．
８７ｇ、ＢＩＳ６３０ｍｇ、尿素４２ｇ、トリス（ヒド
ロキシメチル）アミンメタン［ＣＡＳ　　Ｒｅｇｉｓｔ
ｒｙ　　Ｎｏ７７−８８−１　］　１　、０８ｇ、ホウ
酸０．５５ｇおよびＥＤＴＡ・２Ｎａ塩９３　ｍ　ｇを
含有する１００ｍＭの溶液に重合開始剤としてベルオク
ソニ硫酸アンモニウム（５重量％）１．３ｍ１．ＴＥＭ
ＥＤ　３３　ｇｌを加えたものを０．５ｍｍの厚みで成
形し、ポリアクリルアミドゲル膜（試料番号１〜３）を
得た。

また、ＰＥＴシート上に接着層を付設しなかった以外は
同様にしてゲル膜を形成して比較試料とした。。

得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体間の接着
性を評価した。試料番号１〜３（本発明に従う試料）に
おける支持体とゲル膜との間の接着性は優れていたが、
一方、比較試料についてはその接着性が劣っていた。

［実施例２］ 実施例１の第１表と同じ塗布液を用いて接着層付きＰＥ
Ｔシート（支持体）を製造し、この接着層の上にアクリ
ルアミド１１．８７ｇ、ＢＩＳ６３０ｍｇ、アガロース
（低電気浸透性、ゲル化温度３６℃）０．３ｇ、ポリア
クリルアミド２．５ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン１．０８ｇ、ホウ酸０　、５５ｇ、およびＥ
ＤＴＡ−２Ｎａ塩９３　ｍ　ｇからなる１００ｍＭの溶
液に重合開始剤としてベルオクソニ硫酸アンモニウム（
５重量％）１．３ｍＪＬ、ＴＥＭＥＤ３３ｋｌを加えた
ものを０．５ｍｍの厚みで成形し、ポリアクリルアミド
ゲル膜（試料番号４〜６）を得た。

また、ＰＥＴシート上に接着層を付設しなかった以外は
同様にしてゲル膜を形成して比較試料とした。

得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体間の接着
性を評価した。試料番号４〜６（本発明に従う試料）に
おける支持体とゲル膜との間の接着性は優れていたが、
一方、比較試料についてはその接着性が劣っていた。

［実施例３］ 紫外線照射して表面を親水性にしたＰＥＴシート（支持
体）のその表面上に、アクリルアミド１１．８７ｇ、１
，３．５−トリアクリロイル−へキサヒドロ−３−トリ
アジン６３０ｍｇ、アガロース０．３ｇ、ポリアクリル
アミド２．５ｇ。

尿素４２ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミンメタン
１．０８ｇ、ホウ酸０．５５ｇおよびＥＤＴＡ２Ｎａ塩
９３ｍｇからなる１００ｍ！；Ｌ溶液に重合開始剤とし
てベルオクソニ硫酸アンモニウム（５重量％）１．３ｍ
Ｍ、ＴＥＭＥＤ３３ｇ文を加えたものを０．５ｍｍの厚
みで成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を得た。次いで
、このゲル膜に常法によりサンプル注入用のスロットを
成形した。

別に実施例１の第１表と同じ塗布液を用いて接着層つき
ＰＥＴシート（カバーフィルム）を調製して、このカバ
ーフィルムで上記のゲル膜表面を被覆し、電気泳動媒体
材料を得た。

この電気泳動媒体材料を使用し、３２　Ｐ　−Ｄ　Ｎ　
Ａをマキサム・ギルバート分解して得た試料を電気泳動
にかけ、ＤＮＡ塩基配列決定の実験を行なった。

電気泳動終了後、支持体ＰＥＴシートのみをゲル膜から
除いた。ゲル膜はいずれもカバーフィルムによく接着し
ていた。このゲル膜を１０％酢酸水溶液に浸漬し、脱尿
素したのち、ろ紙にてカバーし、これを減圧下で乾燥し
た。なお、上記の酢酸水溶液浸漬時において、カバーフ
ィルムからゲル膜がはがれる事がなかった。乾燥終了後
オートラジオグラフィー処理を常法に従って行なった・
性能はいずれも良好だった。

比較試料として、接着層のないＰＥＴフィルムをカバー
フィルムとして用い電気泳動用媒体材料を得た。この比
較試料を用いて同様の実験を行なったが、この場合は支
持体ＰＥＴシートのみを除くことができず、以後の操作
は不可衡であった。

［実施例４］ 実施例１の第１表の試料番号１の塗布液を、紫外線照射
して表面を親水性にしたＰＥＴシート（支持体）の上に
塗布して接着層を形成した。

別に、カバーフィルムとして、実施例１の第１表の試料
番号２の塗布液をＰＥＴフィルムの上に塗布して接着層
を形成したものを準備した。

上記の支持体の上に実施例３と同様にしてゲル膜を形成
し、スロットを形成し、このゲル膜の上に上記の力へ−
フイルムを被覆した。実施例３と同様に電気泳動後、脱
尿素、乾燥を行なった。これらの操作は特に支障なく行
なわれ、このことからも明らかなように、上記カバーフ
ィルムはゲル１模に高い接着力で接着していた。また、
この試料を用いてオートラジオグラフィー処理を行なっ
たところ、良好な性能を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の各層が順次積層されてなる電気泳動用媒体材
   料： ［ I ］プラスチック支持体層； ［II］スルフィン酸基含有ポリマーを含有する接着層； ［III］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下
   で架橋重合してなるポリアクリルア ミド系水性ゲル、および変性剤として少な くとも１個のカルバモイル基をもつ化合物 を含む電気泳動用媒体層；および ［IV］プラスチックカバーフィルム層。 ２、電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびア
   ガロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の電気泳動用媒体材料。 ３、変性剤が尿素またはホルムアルデヒドであることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載の
   電気泳動用媒体材料。 ４、プラスチック支持体層がポリエチレンテレフタレー
   トシートからなることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項もしくは第２項記載の電気泳動用媒体材料。 ５、スルフィン酸基含有ポリマーが下記一般式（ I ）
   によって表されるくり返し単位を有するポリマーである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２項
   記載の電気泳動用媒体材料。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ただし上記一般式（ I ）において、 ［Ｒは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、またはハ
   ロゲン原子であり、 Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土金属原子
   または有機塩基であり、 ｍは０、１または２であり、そして、 ｎは１または２である］ ６、下記の各層が順次積層されてなる電気泳動用媒体材
   料： ［ I ］プラスチック支持体層； ［II］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下で
   架橋重合してなるポリアクリルア ミド系水性ゲル、および変性剤として少な くとも１個のカルバモイル基をもつ化合物 を含む電気泳動用媒体層； ［III］スルフィン酸基含有ポリマーを含有する接着層
   ；および ［IV］プラスチックカバーフィルム層。 ７、電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびア
   ガロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲第６項
   記載の電気泳動用媒体材料。 ８、変性剤が尿素またはホルムアルデヒドであることを
   特徴とする特許請求の範囲第６項もしくは第７項記載の
   電気泳動用媒体材料。 ９、プラスチック支持体層がポリエチレンテレフタレー
   トシートからなることを特徴とする特許請求の範囲第６
   項もしくは第７項記載の電気泳動用媒体材料。 １０、スルフィン酸基含有ポリマーが下記一般式（ I
   ）によって表されるくり返し単位を有するポリマーであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項もしくは第７
   項記載の電気泳動用媒体材料。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ただし上記一般式（ I ）において、 ［Ｒは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、またはハ
   ロゲン原子であり、 Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土金属原子
   または有機塩基であり、 ｍは０、１または２であり、そして、 ｎは１または２である］ １１、下記の各層が順次積層されてなる電気泳動用媒体
   材料： ［ I ］プラスチック支持体層： ［II］スルフィン酸基含有ポリマーを含有する接着層； ［III］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下
   で架橋重合してなるポリアクリルア ミド系水性ゲル、および変性剤として少な くとも１個のカルバモイル基をもつ化合物 を含む電気泳動用媒体層； ［IV］スルフィン酸基含有ポリマーを含有する接着層；
   および ［Ｖ］プラスチックカバーフィルム層。 １２、電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーおよび
   アガロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１
   １項記載の電気泳動用媒体材料。 １３、変性剤が尿素またはホルムアルデヒドであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１１項もしくは第１２項
   記載の電気泳動用媒体材料。 １４、プラスチック支持体層がポリエチレンテレフタレ
   ートシートからなることを特徴とする特許請求の範囲第
   １１項もしくは第１２項記載の電気泳動用媒体材料。 １５、スルフィン酸基含有ポリマーが下記一般式（ I
   ）によって表されるくり返し単位を有するポリマーであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１１項もしくは第
   １２項記載の電気泳動用媒体材料。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ただし上記一般式（ I ）において、 ［Ｒは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、またはハ
   ロゲン原子であり、 Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、アルカリ土金属原子
   または有機塩基であり、 ｍは０、１または２であり、そして、 ｎは１または２である］