JPH0223828B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、電気泳動用媒体材料に関するもので
あり、さらに詳しくは、特にDNAの塩基配列決
定操作において用いられる水性ゲル電気泳動用媒
体材料として適した電気泳動用媒体材料に関する
ものである。 ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。 ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
のような単量体を触媒の存在下にてＮ，N′−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官能性の架
橋剤を用い架橋重合させることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際
して通常、尿素あるいはホルムアミドのような変
性剤を含有させる。 上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸
素の影響により反応を阻害されるため、ゲル膜は
酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この
理由から、現在では一般に、ポリアクリルアミド
ゲル膜は２枚のガラス板で形成されたセル（一定
の空間、たとえば0.3mm〜１mmを有する）の中に
ゲル形成液を注入させ、酸素を遮断した状態で架
橋重合させてゲル膜を形成させている。 この方法は２枚のガラス板の間でゲル膜を形成
するために、取り扱い性が悪く、かつ量産化が困
難であるといつた大きな欠点を有している。 以上のようにして形成したポリアクリルアミド
ゲル膜を用いる電気泳動は、たとえば、次のよう
にして実施される。 ポリアクリルアミドゲル膜は、ガラス板に挟ん
だままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行
なつたのち、サンプルスロツトに試料（マキサ
ム・ギルバート分解した ³²Pラベル化DNA）を
一定量注入し、電気泳動を行なう。そして、一定
時間（例、約６時間〜12時間）の電気泳動を行な
つた後、片面のガラス板を注意深く除去し、ポリ
塩化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイル
ムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグ
ラフイー処理を行なう。すなわち、ゲル膜を被覆
しているフイルムの上にＸ線フイルム、増感紙を
順次のせて、低温（たとえば、−80℃）で一定時
間（たとえば、約10〜20時間）露光を行なう。そ
して露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、DNA
の分離泳動パターンを読みとることにより、
DNAの塩基配列を決定することができる。 オートラジオグラフイー処理は以上のように長
時間を必要とするため、その迅速化が望まれ、更
に読みとりの高分解能化も望まれている。 高分解能化を達成する手段としては、オートラ
ジオグラフイー処理に際してゲル膜を乾燥状態と
する方法が知られている。すなわち、電気泳動終
了後にゲル膜を10％酢酸水溶液中に浸漬して、
DNAを固定化しつつ尿素などの変性剤を除去す
る。ガラス板とゲル膜の接着力は極めて弱いか、
または実質的に接着力がないため、この浸漬工程
において、ゲル膜はガラス板から剥離し、液中に
浮遊する。このゲル膜は注意深く取出し、濾紙上
にのせた後、減圧下で乾燥することにより濾紙上
に固定する。このようにして乾燥したゲル膜を使
つてオートラジオグラフイー処理を実施した場合
には分解能が大きく上昇する。しかし、上記のよ
うなゲル膜の分離および乾燥工程は、ゲル膜が極
めてもろいため、高度の熟練と注意を必要とし、
また、実際にこの工程においてゲル膜の破損が発
生することも多い。 そこで本発明の目的は、湿潤状態でのゲル膜と
支持体との接着性を高く（接着力を大きく）する
ための接着層形成用の塗布液を提供し、さらにゲ
ル膜の脱尿素処理後の乾燥工程においても、支持
体から剥離しないゲル膜を提供することにある。 本発明者は、以上のような従来使用されている
電気泳動用媒体材料の欠点の克服を目的として鋭
意研究を行なつた結果、本発明に到達した。 本発明は、 [] 支持体層； [] 特定の一般式により表わされる構成繰返し
単位を有するポリマーを含有する接着層； および、 [] アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存
在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
水性ゲル、および変性剤として尿素またはホル
ムアミドを含む電気泳動用媒体層、 が順次積層されてなる三層構造を含むDNAの塩
基配列決定用電気泳動用媒体材料にある。 本発明の電気泳動用媒体材料は上記のように支
持体層と電気泳動用媒体層とを特定の接着層によ
り接合してなる三層構造を含むものであり、前述
の電気泳動用媒体層（ゲル膜）の乾燥工程におけ
る各種の操作によつても、その三層構造が分離し
にくいため、電気泳動用媒体層の破損が発生する
ことは殆どなく、また濾紙などを使用する必要が
ない。 さらに、本発明の電気泳動用媒体材料は、水平
に置いた支持体の上に接着層を形成し、次いで電
気泳動用媒体層をその上に形成する方法によつて
も製造することが可能であるため、電気泳動用媒
体材料の量産化にも大きく寄与するものである。 次に本発明を詳しく説明する。 本発明の電気泳動用媒体材料の支持体として
は、ガラス板、紙あるいは各種のプラスチツク製
シートなどを用いることができるが、本発明によ
る利点を生かすためには、支持体としてプラスチ
ツク製シートを用いることが好ましい。このプラ
スチツク製シートとしては、任意のプラスチツク
から形成したものを用いることができるが、特に
ポリエチレンテレフタフタレートから形成された
シートを用いることが好ましい。 本発明において支持体の上には接着層が形成さ
れる。 接着層は、下記の一般式(1)または(2)のいずれか
により表わされる構成繰返し単位を有するポリマ
ーを含有する層である。 一般式(1) ［一般式(1)において、 R¹¹は水素原子または１から６個の炭素原子を
有するアルキル基である； Q¹は−COO−、

【式】または６から 10個の炭素原子を有するアリーレン基、 L¹は、−COO−あるいは

【式】の結合の いずれかを少なくとも１個含み、かつ３から15個
の炭素原子を有する二価の基、または、 −Ｏ−、

【式】−CO−、−SO−、−SO₂−、 −SO₃−、

【式】

【式】ある いは

【式】の結合のいずれかを少なくと も１個含み、かつ１から12個の炭素原子を有する
二価の基である（ただしR¹¹は前述と同義であ
る）； R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹のいずれ
かである（ただし、X¹は求核基により置換され
る基、あるいは塩基によつてHX¹の形で脱離し
うる基を表わす）； x¹とy¹はモル百分率を表わし、x¹とy¹はそれぞ
れ０〜99と１〜100（好ましくは、50〜95と５〜
50）の値をとり、x¹＋y¹は90以上（好ましくは95
以上、最も好ましくは100）である］； 上記の一般式(1)において、 R¹¹の例にはメチル基、エチル基、ブチル基、
ｎ−ヘキシル基が含まれる。 Q¹の例には次のような基が含まれる。−COO
−、−CONH−、

【式】

【式】

【式】 【式】

【式】

【式】 L¹の例には次のような基が含まれる。なお、
これらの二価の基の一般式(1)における結合の方向
は、Q¹とSO₂との結合が可能なかぎり、いずれの
方向をもとることができる。

【表】

【表】 R¹²は前記のように、−CH＝CH₂あるいは−
CH₂CH₂X¹のいずれかであるが、この−X¹の例
には、次のような基が含まれる。 ハロゲン原子（塩素、臭素など）；ヒドロキシ
ル基；アルキルスルホニルオキシ（例、メチルス
ルホニルオキシ

【式】エチルスルホニ ルオキシ、プロピルスルホニルオキシなど）；ア
リールスルホニルオキシ（例、フエニルスルホニ
ルオキシ

【式】ｐ−トリルスルホ ニルオキシなど）；アルキルカルボニルオキシ
（例、アセトキシ、プロピオニルオキシ、トリフ
ルオロメチルカルボニルオキシ、ジクロロメチル
カルボニルオキシなど）。 従つて、R¹²の例には、次のような基が含まれ
る。

【表】 一般式(2) ［一般式(2)において、 R²¹は水素原子または１から６個の炭素原子を
有するアルキル基である； R²²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X²である
（ただし、X²は求核基によつて置換されうる基、
または塩基によつてHX²の形で脱離しうる基を
表わす）； L²は、１から６個の炭素原子を有するアルキ
レン基（例、メチレン、エチレン、イソブチレ
ン）、６から12個の炭素原子を有するアリーレン
基（例、フエニレン、トリレン、ナフタレン）、−
COZ²−で表わされる基、および−COZ²R²³−で
表わされる基（ただし、R²³は１から６個の炭素
原子を有するアルキレン基、あるいは６から12個
の炭素原子を有するアリーレン基であり、そして
Z²は酸素原子あるいはNHである）から選ばれる
二価の基である； x²とy²はモル百分率を表わし、x²とy²はそれぞ
れ10〜95と５〜90（好ましくは、50〜95と５〜50）
の値をとり、x²＋y²は90以上（好ましくは95以
上、最も好ましくは100）である］； なお、上記一般式(2)のR²¹およびR²²の例には、
それぞれ前記一般式(1)のR¹¹およびR¹²と同じ例
が含まれる。 以下に、上記の一般式(1)乃至(3)のいずれかによ
り表わされる構成繰返し単位を有するポリマーの
合成に用いることができる代表的なビニルスルホ
ニル基あるいはその前駆体となる官能基を有する
エチレン性不飽和モノマーの合成法を具体的に示
す。 合成例 １ ２−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロ
ピオニルオキシ］エチルアクリレートの合成 反応容器にテトラヒドロフラン600ml、ヒドロ
キシエチルアクリレート45.8ｇ、３−（２−クロ
ロエチルスルホニル）プロピオン酸クロリド72ｇ
を加え、氷水により冷却しながら、５℃以下で、
ピリジン31.2ｇをテトラヒドロフラン100mlに溶
解したものを1.75時間で滴下した。その後室温で
２時間撹拌を続け、反応試料を2.5の氷水中に
注ぎ込み、クロロホルム300mlにより４回抽出し
た。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥後、濃縮
して、２−［３−（２−クロロエチルスルホニル）
プロピオニルオキシ］エチルアクリレート87ｇを
得た。（収率88％） 合成例 ２ Ｎ−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロ
パンアミドメチル］アクリルアミドの合成 ２の反応容器に蒸留水1400ml、亜硫酸ナトリ
ウム244ｇ、炭酸水素ナトリウム220ｇを加え、撹
拌して溶解させた後、氷水により冷却しながら約
５℃で、クロロエタンスルホニルクロリド260ｇ
を1.5時間で滴下した。その後49％硫酸160ｇを約
15分で滴下し、５℃で１時間ほど撹拌を続けて、
析出した結晶を濾過した後、結晶を400mlの蒸留
水で洗浄し、濾液と洗浄液とを一緒にして３の
反応容器に入れた。この中にメチレンビスアクリ
ルアミド246ｇを蒸溜水480ml、エタノール1480ml
に溶解させたものを、氷冷しながら約５℃で、30
分間で滴下した後、全体を冷蔵庫に５日間放置し
て反応を完結させた。析出した結晶を濾取した
後、冷却した蒸留水800mlで洗浄し、2000の50
％エタノール水溶液から再結晶して、219ｇのモ
ノマーを得た。収率は49％であつた。（分析結果、
Ｈ：5.17、Ｃ：37.90、Ｎ：9.48、Cl：12.58） 合成例 ３ （［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロパ
ンアミド］メチル）スチレンの合成 反応容器にテトラヒドロフラン100ml、ビニル
ベンジルアミン20.1ｇ、トリエチルアミン16.7
ｇ、ヒドロキノン0.1ｇを入れ、氷水により冷却
しながらβ−クロロエチルスルホニルプロピオン
酸クロリド36.1ｇを200mlのテトラヒドロフラン
に溶解させたものを30分で滴下した。その後室温
で一夜放置し、反応試料を濃硫酸16.5ｇを氷水
1.5で希釈した溶液中に注ぎ込み、生成する沈
澱を濾取した。この沈澱をエタノール200ml、水
200mlの混合溶媒から再結晶することにより、
26.8ｇの（［３−（２−クロロエチルスルホニル）
プロパンアミド］メチル）スチレンを得た。収率
は57％であつた。（分析結果、Ｈ：5.74、Ｃ：53.
.47、Ｎ：4.83、Cl：10.99、Ｓ：10.49） 合成例 ４ １−［２−（４−ビニルフエニルスルホニル）エ
チルスルホニル］−３−（２−クロロエチル）ス
ルホニル−２−プロパノールの合成 反応容器に１，３−ビス（２−クロロエチル）
スルホニル−２−プロパノール157ｇ（特開昭53
−57257明細書に開示の方法により合成された化
合物）、メタノール１、蒸留水１を加え、46
℃に加熱しながらビニルベンゼンスルフイン酸カ
リウム52ｇをメタノール100mlと蒸留水100mlに溶
解させたものを１時間で滴下した。その後46℃に
保つたまま5.5時間撹拌を続け、生成する沈澱を
濾取して55ｇの１−［２−（４−ビニルフエニルス
ルホニル）エチルスルホニル］−３−（２−クロロ
エチル）スルホニル−２−プロパノールを得た。
収率は49％であつた。（分析結果、Ｈ：4.67、
Ｃ：39.89、Ｓ：21.43） 本発明の接着層の形成用のポリマーとして好ま
しいものとしては、次に示す構成繰返し単位を有
するポリマーを挙げることができる。 ここで、括弧外の数字はモル百分率を表わし、
Ｒは下記の置換基を示す。

【表】

【表】 次に、上記のポリマーのうちでも特に好ましい
ポリマーであるＰ−１、Ｐ−２およびＰ−５の合
成例を示す。 合成例 ５ ポリ−２−［３−（ビニルスルホニル）プロピオ
ニルオキシ］エチルアクリレート−コ−アクリ
ルアミド（Ｐ−１）の合成 反応容器にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド60
ml、２−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プ
ロピオニルオキシ］エチルアクリレート14.5ｇ、
アクリルアミド32.6ｇを入れ、窒素ガスで脱気後
60℃に加熱して、２，2′−アゾビス（２，４−ジ
メチルバレロニトリル）［CAS Registry No.
4419−11−８］0.40ｇを加え、２時間加熱、撹拌
を続けた。その後さらに２，2′−アゾビス（２，
４−ジメチルバレロニトリル）0.20ｇを加え、２
時間加熱、撹拌を続けた後、５℃に冷却して炭酸
ナトリウム12ｇとトリエチルアミン4.9ｇを加え、
１時間撹拌を行なつた。さらに室温で１時間撹拌
を続けた後、反応試料をセルロースチユーブに入
れて２日間透析し、凍結乾燥によつて43ｇの白色
ポリマーを得た（収率95％）。 得られたポリマーのビニルスルホニル含量は
1.0×10^-3当量／ｇであつた。 合成例 ６ ポリ−Ｎ−（［３−（ビニルスルホニル）プロパ
ンアミド］メチル）アクリルアミド−コ−アク
リルアミド（Ｐ−２）の合成 200mlの反応容器に、合成例２のモノマー5.65
ｇ、アクリルアミド12.8ｇ、50％メタノール水溶
液80mlを加え、撹拌しながら60℃に加熱し、２，
2′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）0.1ｇを加え、さらに30分後にも同じものを
0.1ｇ加えて１時間加熱、撹拌を続けた。その後、
氷水により約10℃に冷却して、トリエチルアミン
2.5ｇを80mlのメタノールに溶解させたものを加
え、１時間撹拌を続けてから、反応試料を撹拌し
ながら１のアセトンに注ぎ込み、生成した沈澱
を濾取して、15.9ｇのＰ−２を得た（収率90％）。 得られたポリマーのスルホニル含量は0.95×
10^-3当量／ｇであつた。 合成例 ７ ポリ−Ｎ−（［３−（２−クロロエチルスルホニ
ル）プロパンアミド］メチル）アクリルアミド
−コ−アクリルアミド（Ｐ−５）の合成 500mlの反応容器に、合成例２のモノマー10.3
ｇ、アクリルアミド15.6ｇ、50％メタノール水溶
液160mlを加え、撹拌しながら60℃に加熱し、２，
2′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）0.2ｇを加え、さらに30分後にも同じものを
0.2ｇ加えて、１時間加熱、撹拌を続けた。反応
試料をセルロースチユーブに入れて２日間透析
し、凍結乾燥によつて23ｇの白色ポリマー（収率
90％）を得た。 このポリマーのクロロエチルスルホニル含量は
1.0×10^-3当量／ｇであつた。 接着層は前述のコポリマーからなる層で、公知
の方法により支持体の表面に設けることができ
る。前述のコポリマーのうち水溶性または親水性
のものを用いる場合には、それの水溶液または、
水を主成分とする水−有機溶媒混合溶媒溶液を、
公知の方法により支持体の上に塗布、乾燥して接
着層を形成する。前述のコポリマーのうち疎水性
で水不溶性のものを用いる場合には、それの有機
溶媒溶液または、有機溶媒を主成分とする有機溶
媒−水混合溶媒溶液を、公知の方法により支持体
の上に塗布、乾燥して接着層を形成する。 用いることができる有機溶媒の具体例として、
アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；
メタノール、エタノールなどのアルコール類；
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ジメチルスルホ
キシド；ジメチルエーテル、ジオキサンなどのエ
ーテル類などを挙げることができる。 乾燥後の接着層の厚さは、約0.1μｍから約3μ
ｍ、好ましくは約0.2μｍから約2μｍの範囲であ
る。 次に電気泳動用媒体層（以下において、ポリア
クリルアミドゲル膜という）について説明する。 ポリアクリルアミドゲル膜の製造に際して、ア
クリルアミド系化合物と架橋剤とは、水溶液また
は水分散液として水中に溶解または分散させてお
き、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した
水性ゲル媒体を形成する。本明細書においては、
特にことわらない限り、（水中に）溶解と（水中
に）分散の両者を含めて単に（水中に）溶解とい
い、水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶液
という。また、溶媒または分散媒として、所望に
より加えられる有機溶媒と水との混合物をも包含
する。 本発明に用いることができるアクリルアミド系
化合物としては、アクリルアミド、Ｎ−メチルア
クリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミド系
化合物が挙げられ、これらの化合物は単独で、あ
るいは二種以上を併用して用いることができる。
そして、これらのアクリルアミド系化合物のうち
ではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリ
ルアミドと他のアクリルアミド系化合物の一種以
上の併用も好ましい。 架橋剤としては「Electrophoresis」1981、２、
220−228等に記載の公知の化合物（一種または二
種以上の組合せ）を用いることができる。架橋剤
の具体例としては、Ｎ，N′−メチレンビスアク
リルアミド（BIS）；Ｎ，N′−プロピレンビスア
クリルアミド（PBA）；ジアクリルアミドジメチ
ルエーテル（DAE）；１，２−ジアクリルアミド
エチレングリコール（DEG）；エチレンウレアビ
スアクリルアミド（EUB）；エチレンジアクリレ
ート（EDA）；Ｎ，N′−ジアリルタータルジアミ
ド（Ｎ，N′−diallyltartardiamide：DATD）；
Ｎ，N′−ビスアクリリルシスタミン（Ｎ，N′−
bisacrylylcystamine、BAC）等の二官能性化合
物が挙げられる。架橋剤は、単量体と架橋剤の総
重量に対して約２重量％から約30重量％が用いら
れ、特に約３重量％から約10重量％が好ましく用
いられる。 なお、ゲル濃度はゲル100ml中に含まれる単量
体と架橋剤の総グラム数で示し、一般にＴ％で表
示する。 ポリアクリルアミドゲル膜の形成時に共存させ
られる変性剤としては尿素またはホルムアミドが
用いられ、これらのうちで尿素が特に好ましく用
いられる。これらのうちで尿素が好ましく用いら
れる。変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性
ゲルの容積100mlに対して、約40ｇから約60ｇの
範囲で用いられる。また尿素を用いる場合には、
単量体と架橋剤とを含む水性ゲル媒体１に対し
約６モル（約360ｇ）から飽和溶解量まで、好ま
しくは約７モル（約420ｇ）から飽和溶解量まで
の範囲で用いることができる。 本発明のゲル媒体にはPH緩衝剤を含有させるこ
とができる。緩衝剤としては、PH8.0から9.0、好
ましくはPH8.2から8.3の範囲内のPH値に緩衝でき
る緩衝剤であれば、いずれをも用いることができ
る。用いうる緩衝剤としては、日本化学会編『化
学便覧 基礎編』（東京、丸善(株)1966年発行）
1312−1320ページ； 『Data for Biochemical Research』（R.M.C.
Dawson et al編 第２版、Oxford at the
Clarendon Press、1969年発行）476−508ペー
ジ； 『Biochemistry』、５、467（1966）； 『Analytical Biochemistry』104、300−310
（1980）等の刊行物に記載の緩衝剤があげられる。
そして、その具体例としてはトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（Tris）、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−
ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸のNa塩ま
たはＫ塩等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−N′−３−プロパンスルホン酸のNa塩または
Ｋ塩等、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル］−３−アミノプロパンスルホン酸のNa塩また
はＫ塩および、これらのいずれかと必要により組
合せられる酸、アルカリまたは塩等をあげること
ができる。特に好ましい緩衝剤の例としては、
Tris、ホウ酸およびEDTA・2Na塩の組合せ
（PH8.2）がある。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、さらに
水溶性の合成高分子化合物を添加することが好ま
しい。この合成高分子化合物は、単量体と架橋剤
の総重量に対して２重量％から100重量％の範囲
で用いられ、好ましくは５重量％から50重量％の
範囲で用いられる。 上記の水溶性の合成高分子化合物の分子量とし
ては、１万から100万の範囲が好ましい。 水溶性合成高分子の好ましい例としては、付加
重合型または縮重合型の、水溶性ポリマーを用い
ることができる。付加重合型ポリマーの具体例と
しては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、ポリアクリルアミド等の非イオン性水溶
性ポリマーが挙げられる。また縮重合型ポリマー
の具体例としてポエチレングリコール、ポリプロ
ピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリアル
キレングリコール等が挙げられる。なかでもポリ
エチレングリコール、ポリアクリルアミドが特に
好ましい。このポリマーを添加することにより、
湿潤ゲル膜は可塑的となり、もろさが改良され
る。また乾燥ゲル膜の状態でも、可塑化効果はさ
らに有効に作用し、ひびわれ等のもろさが改良さ
れる。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜は更にアガ
ロースを含有することが好ましい。アガロース
は、種類として特に制限はなく、低電気浸透性、
中電気浸透性、高電気浸透性アガロースのいずれ
をも用いることができる。用いることのできるア
ガロースの例としては、特開昭55−5730号、特開
昭55−110946号、特表昭57−502098号等の公報に
開示されているアガロース等を用いることもでき
る。アガロースの添加量は単量体と架橋剤を含む
ゲル組成液の容積（100ml）に対して、約0.2ｇか
ら約２ｇの範囲、好ましくは、約0.3ｇから約1.2
ｇの範囲から選ばれる。アガロースを含有させた
組成においては、溶液温度を変化させることによ
り、適当な溶液粘度にコントロールすることが可
能となる。 本発明の電気泳動用媒体層は、上記のようにア
クリルアミドに代表される単量体、二官能性のア
リル（allyl）化合物またはアクリル化合物（架
橋剤）、水溶性ポリマー、およびアガロースを実
質的に均一な水溶液中で単量体と架橋剤とをラジ
カル架橋重合させて得られるものであり、単量体
と架橋剤から形成された三次元架橋重合体に水溶
性ポリマーとアガロースが実質的に分散されて、
後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合体とからみ
あつている構造を有すると推定される。 上記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の
不存在下で過酸化物の存在および／または紫外線
照射等の公知の方法により発生させることができ
る。更に該反応は加熱および紫外線照射により加
速することもできる。 ラジカル架橋重合用触媒としては、
「Electrophoresis」1981、２、213−219、同
1981、２、220−228；青木、永井編「最新電気泳
動法」（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジ
カル重合開始剤のうちから適宜選択して用いるこ
とができる。好ましいラジカル重合開始剤の具体
例としては、β−ジメチルアミノプロピオニトリ
ル（DMAPN）−ペルオクソ二硫酸アンモニウム
混合物、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED）−ペルオクソ二硫酸アン
モニウム混合物、TEMED−リボフラビン混合
物、TEMED−リボフラビン−過酸化水素混合物
と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル
重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重
量に対して約0.3重量％から約５重量％、そして
好ましくは約0.5重量％から約３重量％の範囲で
ある。 本発明のゲル媒体には、必要に応じて抗酸化剤
を含有させることができる。抗酸化剤としては、
ゲル電気泳動媒体に配合しうることが知られてい
る種々の化合物を用いることができる。抗酸化剤
の具体例としては、ジチオスレイトール、２−メ
ルカプトエタノールを挙げることができる。 その他の添加剤としては湿潤剤があり、本発明
のゲル媒体にゲルセリン、エチレングリコール等
のポリオール化合物を含有させることもできる。
ポリオール化合物の含有量は、ゲル媒体の容積
100mlに対して、約５ｇから約40ｇの範囲から選
ばれる。このうちではグリセリンが特に好まし
い。湿潤剤を配合することによりゲル媒体の保存
時の極端な水分の蒸発による乾燥を防ぐことが可
能となり、また極端な乾燥を起因するもろさの発
生を防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル媒体の物性が
改善されるとの利点がある。 本発明のゲル媒体を層または膜として用いる場
合には、平滑な親水性表面を有する電気絶縁性支
持体の上にゲル形成液を公知の方法により塗布し
て設けたのちにゲル形成液を架橋重合させること
によりゲル層またはゲル膜に成形することができ
る。 支持体については前述したが、さらに具体的に
は、ガラス板、親水性ポリマーまたは公知の表面
処理により表面を親水化したポリマー（例、ポリ
エチレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポ
リカルボネート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデ
ン・塩化ビニルコポリマー、ポリメチルメタアク
リレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、セル
ロースアセテート類、セルロースアセテートプロ
ピオネート等）のフイルム、板またはシート等の
成形物をあげることができる。これらのポリマー
成形物の表面を親水化するための処理としては、
紫外線照射、グロー放電処理、コロナ放電処理、
火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチング、電
解エツチング等の公知の方法を適用することがで
きる。 ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成後の上をさらにカバーフイル
ム、シートまたは板などでおおうことができる。
この目的に使用されるカバーフイルム、シート、
または板としては前記支持体と同様な素材からな
るものを用いることができる。 本発明の電気泳動用媒体材料を用いることによ
り、たとえば、従来DNAの塩基配列決定におい
て必要とされていた複雑な乾燥工程が簡略化さ
れ、支持体上にゲル膜をのせたままで、電気泳
動、乾燥、さらにオートラジオグラフイー処理が
可能となるなどの利点がある。 以下に本発明の実施例を記載するが、これらは
本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 １ 紫外線照射処理により表面を親水性にしたポリ
エチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）上に約0.5μｍの厚み（固形分）になるように
第１表記載のポリマーを塗布し、約110℃で乾燥
して接着層を形成した。

【表】

【表】 まず、PETシート（支持体）と接着層との間
の接着性をクロスカツト法により評価した。その
結果、試料番号３、４および５（本発明に従う試
料）は接着性が良好であつたが、試料番号１およ
び２（比較試料）については、かなりの部分でシ
ートと接着層間に剥離がみられた。 支持体上に設けられた各接着層の上に、アクリ
ルアミド11.87ｇ、BIS0.63ｇ、尿素42ｇ、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン［CAS
Registry No.77−86−１］1.08ｇ、ホウ酸0.55ｇ
およびEDTA・2Na塩93mgを含有する100mlの溶
液に重合開始剤として過硫酸アンモニウム（５重
量％）1.3ml、TEMED33μを加えたものを0.5
mmの厚みで成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を
得た。 得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体
間の接着性を評価した。その結果、試料番号３、
４および５（本発明に従う試料）を接着層とした
ものは、接着性が優れていたが、試料番号１およ
び２（比較試料）は接着性が劣つていた。 実施例 ２ 実施例１の第１表と同じポリマーを用いて接着
層が形成されたPETシートを作成し、この接着
層の上にアクリルアミド11.87ｇ、尿素42ｇ、
BIS0.63ｇ、アガロース1600（和光純薬(株)製）0.3
ｇ、ポリアクリルアミド2.5ｇ、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン1.08ｇ、ホウ酸0.55
ｇ、およべEDTA・2Na塩93mgからなる100mlの
溶液に重合開始剤として過硫酸アンモニウム（５
重量％）1.3ml、TEMED33μを加えたものを
0.5mmの厚みで成形し、ポリアクリルアミドゲル
膜を得た。 このゲル膜を使用して、 ³²P−DNAをマキサ
ム・ギルバード分解した試料について電気泳動に
かけ、DNA塩基配列決定の実験を行なつた。電
気泳動後にゲル膜を、脱尿素とDNA固定のため
に、10％酢酸水溶液中に１時間浸漬した。このゲ
ル膜を乾燥し、次いでオートラジオグラフイー処
理を常法にしたがつて行なつた。 10％酢酸水溶液中にゲル膜を浸漬した時の支持
体とゲル膜の接着状態を観察した。 試料番号１（比較試料）のゲル膜は支持体から
完全に剥離し、また、試料番号２（比較試料）に
ついては、ゲル膜は一部支持体に接着した部分が
あるものの、その大部分は支持体から剥離してい
た。 一方、試料番号３〜５（本発明に従うもの）に
ついては、ゲル膜はいずれも支持体上に完全に接
着していた。更にゲル膜を乾燥させた後、それと
支持体との間の接着状態を観察した。ゲル膜はい
ずれも支持体によく接着していた。またオートグ
ラフイー処理した後も各試料は接着性に問題はな
く良好な結果を示した。 実施例 ３ 実施例２と同様にしてPETシート上にポリア
クリルアミドゲル膜を形成した。このゲル膜を支
持体ごと裁断加工したのち、ゲル膜の切口を観察
したところ、試料番号１〜２（比較試料）につい
てはゲル膜の剥離が一部観察されたのに対して、
試料番号３〜５（本発明）についてはいずれも裁
断口の接着性は良好で、支持体ごと裁断加工でき
ることがわかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の各層が順次積層されてなる三層構造を
   含むDNAの塩基配列決定用電気泳動用媒体材
   料： [] 支持体層； [] 一般式(1)または(2)のいずれかにより表わさ
   れる構成繰返し単位を有するポリマーを含有す
   る接着層； 一般式(1) ［一般式(1)において、 R¹¹は水素原子または１から６個の炭素原子
   を有するアルキル基である； Q¹は−COO−、【式】または６か ら10個の炭素原子を有するアリーレン基、 L¹は、−COO−あるいは【式】の結合 のいずれかを少なくとも１個含み、かつ３から
   15個の炭素原子を有する二価の基、または、 −Ｏ−、【式】−CO−、−SO−、−SO₂ −、−SO₃−、【式】【式】 あるいは【式】の結合のいずれかを少 なくとも１個含み、かつ１から12個の炭素原子
   を有する二価の基である（ただしR¹¹は前述と
   同義である）； R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹のいず
   れかである（ただし、X¹は求核基により置換
   される基、あるいは塩基によつてHX¹の形で
   脱離しうる基を表わす）； x¹とy¹はモル百分率を表わし、x¹とy¹はそれ
   ぞれ、０〜99と１〜100の値をとり、x¹＋y¹は
   90以上である］； 一般式(2) ［一般式(2)において、 R²²水素原子または１から６個の炭素原子を
   有するアルキル基である； R²²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X²である
   （ただし、X²は求核基によつて置換されうる
   基、または塩基によつてHX²の形で脱離しう
   る基を表わす）； L²は、１から６個の炭素原子を有するアル
   キレン基、６から12個の炭素原子を有するアリ
   ーレン基、−COZ²−で表わされる基、および−
   COZ²R²³−で表わされる基（ただし、R²³は１
   から６個の炭素原子を有するアルキレン基、あ
   るいは６から12個の炭素原子を有するアリーレ
   ン基であり、そしてZ²は酸素原子あるいはNH
   である）から選ばれる二価の基である； x²とy²はモル百分率を表わし、x²とy²はそれ
   ぞれ、10〜95と５〜90の値をとり、x²＋y²は90
   以上である］； [] アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存
   在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
   水性ゲル、および変性剤として尿素またはホル
   ムアミドを含む電気泳動用媒体層。 ２ 電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーお
   よびアガロースを含むことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の電気泳動用媒体材料。 ３ 支持体層がプラスチツクシートからなること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載の電気泳動用媒体材料。 ４ プラスチツクシートがポリエチレンテレフタ
   レートからなることを特徴とする特許請求の範囲
   第３項記載の電気泳動用媒体材料。 ５ 接着層が、一般式(1)の構成繰返し単位を有す
   るポリマーを含有するものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の電気泳動用媒体材
   料。