JPS6128398A - Ｌ−バリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は微生物を用いるＬ−バリンの製造法に関する。

従来の技術 従来、２−ケトイソ吉草酸を基質としてＬ−バリンを製
造する方法としては、２−ケトイソ吉草酸、ギ酸および
アンモラムイオンを基質とする酵素的製造法が知られて
いる。

発明が解決しようとする問題点 従来の方法においては、Ｌ−バリンの収量はまだ満足す
べきものではない。常に優れたし一バリンの製造法が求
められている。

問題点を解決するための手段 本発明によると、フマール酸及びアンモニウムイオン又
は尿素の存在下、２−ケトイソ吉草酸をＬ−バリンに変
換する能力を有する微生物を用いることにより著量のＬ
−バリンを得ることができる。

本発明に用いられる微生物としては、フマール酸及びア
ンモニウムイオン又は尿素の存在下に、２−ケトイソ吉
草酸をＬ−バリンに変換できる能力を有するエシェヒア
属、シトロバクター属、アエロモナス属、アグロバクテ
リウム属、アルカリゲネス属、アルスロバクター属、ブ
レビバクテリウム属、バチルス属、コリネバクテリウム
属、エルビニア属、エンテロバクタ−属、フラボバクテ
リウム属、クルイベラ属、ミクロコツカス属、バラコツ
カス属、シニードモナス属、サルモネラ属又はセラチア
属に属する微生物であれば、野性株。

変異株、細胞融合法あるいは遺伝子操作法その他の遺伝
子的手法で誘導される組換え株のいずれもがあげられる
。

具体的には、エシェリヒアφコ’Ｊ　（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ　）　ＡＴＣＣ９６３７，シトロバク
タ−・フロインディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒ
ｅｕｎｄｉｉ　）　ＡＴＣＣ６７５０，アエロモナス・
ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈ
ｉｌａ）＾ＴＣＣ１３１３７，アグロバタテリウム・ツ
メファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ　）　ＡＴＣＣ４４５２，アルカリゲ
ネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃ
ａｌｉｓ）　ＡＴＣＣ８７５０，アルスロバクタ−・グ
ロビホルミス（八ｒｔｈｒａｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉ
ｆｏｒｍｉｓ）　ＡＴ［［：８０１０゜ブレビバクテリ
ウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ａ＋ｒ＋＋ｒ＋ｏｎｉａｇｅｎｅｓ）八ＴＣＣ６
Ｂ７１．　　バチルス噂メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　）　ＡＴＣＣ１０７７８゜
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　）　ＡＴＣ
Ｃ１３０３２，−１−ルビニア・ヘルビコラ（［ｉｒｗ
ｉｎｉａ　　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ２１４３４
゜エンテロバクタ−・クロアカｘ　（Ｂｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ　）　ＡＴ［：Ｃ１３０４７、
フラボバクテリウム・エステｏ７ｏマチウム（Ｆｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｅｓｔｅｒ’ｏａｒｏ−ｍａ
ｔｉｃｕｍ　）　ＡＴＣＣ８０９１，クルイベラ・クリ
オクレセセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ｃｒｙｏｃｒｅｓ
ｅｎｓ）　ＡＴＣＣ１４２３７，ミクロコツカス・ルテ
ウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　’Ｉｕｔｅｕｓ　）Ａ
ＴＣＣ４６９８，バラコツカス・デニトリフィカンス（
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　
）　ＡＴＣＣ４９３６７、シュードモナス・アルギノサ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ａ
ＴＣＣ１０１４５、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　ＡＴＣ
Ｃ１９５８５、セラチア−’マル＊＊　７ス（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　ＡＴＣＣ１３８
８０等が上げられる。

これらの微生物が、フマール酸とアンモニウムイオン又
は尿素の存在下で２−ケトイソ吉草酸を効率よくＬ−バ
リンに変換することの理由の詳細は明らかではないが、
これらの微生物が、フマール酸とアンモニウムイオン又
は尿素からアミノ基共与体を生成する能力および生成し
たアミノ基供与体と２−ケトイソ吉草酸とからＬ−バリ
ンを生成する能力にすぐれていること、さらに基質を細
胞内へ取込む能力や生成したし一バリンを細胞外へ排出
する能力にすぐれていること、さらにＬ−バリンを代謝
分解する性質が弱いこと等が理由とじて考えられる。

これらの微生物を培養する培地としては、炭素源、窒素
源、無機物その他の栄養物を含むものであれば天然培地
９人工培地のいずれでもよい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース。

ソルビトール、グリセロール、しょ糖、でんぷん。

でんぷん加水分解物、糖蜜、果汁などの炭水化物。

ギ酸、酢酸、フマール酸、乳酸、グルコン酸、コハク酸
等の有機酸、エタノール、メタノール等のアルコール類
等が使用される。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩類、尿素、アミ
ン類、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、ｉ
ｌ母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消
化物などが用いられる。

無機物としては、リン酸第１カリウム、−リン酸第２カ
リウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウ
ムなどが使用される。

勿論本発明に使用する微生物が生育のた２めに特定の栄
養素を必要とする場合には、その栄養素を適量培地中に
存在させなければならないが、これらの物質は窒素源と
して例示した天然物に含まれて添加される場合には別途
加える必要はない。

２−ケトイソ吉草酸、フマール酸及びアンモニウムイオ
ン又は尿素は前記培地に最初から加えられてもよいし、
又微生物の培養途中でくわえられてもよい。

２−ケトイソ吉草酸及びフマール酸はアンモニウム塩、
ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の各種の塩
として使用される。

アンモニウムイオンは、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム１酢酸
アンモニウム、ギ酸アンモニウム。

フマール酸アンモニウム、リンゴ酸アンモニウム等の塩
類として、あるいはアンモニア水あるいはアンモニアガ
スとして供給される。

培養条件としては２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０
℃の温度で振盪・通気攪拌等の好気的条件下で、ｐＨ３
〜１０．好ましくは６〜９の範囲で１〜３日間培養する
。かくして、培養液中にＬ−バリンが生成する。

次ｉ、前記微生物の菌体を得る場合の培地組成及び培養
条件としては、前記組成の培地及び培養条件が用いられ
る。

かくして、１等られる微生物菌体はそのまま反応に使用
できるし、さらに該菌体を種々処理して得られる処理物
を反応に用いても良い。

微生物菌体としては、菌体そのもの又は菌体を含む培養
液が用いられる。

菌体処理物としては、菌体の機械的摩砕処理物。

超音波処理物、凍結乾燥処理物、溶媒処理物、酵素処理
物、乾燥処理物、界面活性剤処理物、菌体の蛋白質分画
、菌体及び菌体処理物の固定化物等が用いられる。

反応は水性液中、前記で得られる菌体もしくはその処理
物を■２−ケトイソ吉草酸　■フマール酸及び■アンモ
ニウムイオン又は尿素に作用することによって行われる
。

反応に使用する２−ケトイソ吉草酸、フマール酸及びア
ンモニウムイオンとしては前記と同じものが用いられる
。

作用条件としては、温度１０〜７０℃、好ましくは２０
〜５０℃、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９で行なう。

かくして、水性液中にＬ−バリンが生成する。

培養液又は水性液中からし一バリンを回収する方法とし
ては、常法、例えば、イオン交換樹脂法。

沈澱法、溶媒抽出法等が用いられる。

以下に実施例を示す。

実施例１ グルコース０．５　ｇ　／祿、酵母エキス０．３．ｇ／
ａ。

肉エキスＩｇ／ａ、ペプトンＩｇ／７．’ＮａＣＪ２０
．３ｇ／ａ（ｐＨ７，０）の組成の培地１σｍｌを含む
試験管に第１表に示す微生物を１エーゼ−宛接種し、２
１Ｏｒｐｍの振盪条件下′、２８℃の温度条件下で１８
時間振盪培養する。

培養終了液を試験管ごと遠心分離して集菌し、さらにｌ
　Ｑｍｌづつの０．８５％食塩溶液で２回遠沈洗浄後、
各試験管へ下記の組成の反応液Ｌ’５ｍｌづつを添加し
、４０℃の温度条件下で２４時間静置して反応させたと
ころ、各々の微生物が第１表に示す濃度のＬ−バリンを
生成した。

反応液の組成は次のとおり＝２−ケトイソ吉草酸・ナト
リウム２０　ＱｍＭ、ピリドキサールリン酸２００μＭ
、）リスバッファー１００ｍＭ（ｐＨ８，０）、７？−
ル酸アンモニウム４００ｍＭ反応液から２−ケトイソ吉
、草酸・ナトリウム。

フマール酸アンモニウムあるいはアンモニウムイオンの
いずれか１つを除いた時のし一バリンの蓄積はＯ，ｌ　
ｍｇ　７ｍ１以下であだ。

実施例２ 使用菌として、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ＡＴＣＣ６８７１を用い、反応液の組成を下記のとおり
に変えた他は実施例１と同様に実施した結果反応液中に
２．４　ｍｇ　／ｍｌのＬ−バリンが生成した。反応液
から２−ケトイソ吉草酸、フマール酸、あるいは尿素の
いずれかを除いた時のし−バリンの生成量は０．１　ｍ
ｇ／ｍｌ以下であった。

反応液の組成＝２−ケトイソ吉草酸ナトリウム２００ｍ
Ｍ、ピリドキサールリン酸２００μＭ、フマール酸ナト
リウム４００ｍＭ、尿素４００ｍＭ。

トリスバッフｙ　　２００ｍＭ（ｐＨ８，４）発明の効
果 本発明方法により著量のＬ−バリンを製造することがで
きる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 エシェリヒア属、シトロバクター属、アエロモナス属、
   アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバ
   クター属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、コリネ
   バクテリウム属、エルビニア属、エンテロバクター属、
   フラボバクテリウム属、クルイベラ属、ミクロコッカス
   属、パラコッカス属、シュードモナス属、サルモネラ属
   又はセラチア属に属し、（１）フマール酸及び（２）ア
   ンモニウムイオン又は尿素の存在下、２−ケトイソ吉草
   酸をＬ−バリンに変換する能力を有する微生物を、Ａ、
   （イ）２−ケトイソ吉草酸（ロ）フマール酸及び（ハ）
   アンモニウムイオン又は尿素の存在下に培地に培養する
   ことにより、又は Ｂ、培地に培養して得られる菌体又はその処理物及び前
   記（イ）、（ロ）及び（ハ）を含有する水性液中で反応
   させ、培養液又は水性液中にＬ−バリンを生成させ、こ
   れを採取することを特徴とするＬ−バリンの製造法。