JPS61282096A - 新規な腫瘍関連抗原 - Google Patents
新規な腫瘍関連抗原Info
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- JPS61282096A JPS61282096A JP61091954A JP9195486A JPS61282096A JP S61282096 A JPS61282096 A JP S61282096A JP 61091954 A JP61091954 A JP 61091954A JP 9195486 A JP9195486 A JP 9195486A JP S61282096 A JPS61282096 A JP S61282096A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
- A61K51/1063—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from stomach or intestines
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
本発明は抗原特に腫瘍関連抗原の特徴づけに係る。別の
観点では、このような抗原に対して特異的反応性を有す
る抗体に係る。更には、このような抗体を産生ずる方法
、該抗体の診断及び治療的用途にも係る。
観点では、このような抗原に対して特異的反応性を有す
る抗体に係る。更には、このような抗体を産生ずる方法
、該抗体の診断及び治療的用途にも係る。
（発明の背景）
ヒトの癌の診断及び治療におけるモノクローナル抗体の
潜在的役割は、最近の研究考察の集約である。特に興味
がもたれるのはイムノアッセイにおけるモノクローナル
抗体の使用であり、例えば治療の間、病気の過程をモニ
ターすることができる。更に、モノクローナル抗体がイ
ンビボで腫瘍関連抗原に結合し得ることを利用する、腫
瘍のイメージング及び治療のためのモノクローナル抗体
の潜在的使用にも興味がもたれる。
潜在的役割は、最近の研究考察の集約である。特に興味
がもたれるのはイムノアッセイにおけるモノクローナル
抗体の使用であり、例えば治療の間、病気の過程をモニ
ターすることができる。更に、モノクローナル抗体がイ
ンビボで腫瘍関連抗原に結合し得ることを利用する、腫
瘍のイメージング及び治療のためのモノクローナル抗体
の潜在的使用にも興味がもたれる。
モノクローナル抗体技術の発展により、ヒト腫瘍の抗原
の複雑性を研究し得るようになった。特に、モノクロー
ナル抗体の正確な免疫反応性により、ヒト腫瘍によって
発現された細胞表面抗原の同定と区別ができるようにな
った。そのため、このような独特の腫瘍関連抗原を特徴
づければ、癌の診断及び治療のためにモノクローナル抗
体の使用を更に有効に開発する手段が得られ、モノクロ
ーナル抗体技術の利点を最大限に活用し得る手段が得ら
れる。
の複雑性を研究し得るようになった。特に、モノクロー
ナル抗体の正確な免疫反応性により、ヒト腫瘍によって
発現された細胞表面抗原の同定と区別ができるようにな
った。そのため、このような独特の腫瘍関連抗原を特徴
づければ、癌の診断及び治療のためにモノクローナル抗
体の使用を更に有効に開発する手段が得られ、モノクロ
ーナル抗体技術の利点を最大限に活用し得る手段が得ら
れる。
今日、極く少数の腫瘍関連抗原が特徴づけられているだ
けである。更に、診断用又は予後用マーカーとして有用
な成る種の腫瘍関連抗原は、全ての患者に病気のあらゆ
る段階及び病気の発現中存在するとは限らない。従って
、独特の腫５ｒＩＡ連抗原を更に同定し且つ特徴づける
必要性がある。
けである。更に、診断用又は予後用マーカーとして有用
な成る種の腫瘍関連抗原は、全ての患者に病気のあらゆ
る段階及び病気の発現中存在するとは限らない。従って
、独特の腫５ｒＩＡ連抗原を更に同定し且つ特徴づける
必要性がある。
（発明の要約）
本発明は、ヒト組織特に正常結腸及び結腸癌に存在する
新規な抗原の発見及び特徴づけに基づくものである。本
発明は独特の腫瘍関連抗原に係り、これはモノクローナ
ル抗体ＹＣＲ０１０と反応性であることを特徴とする。
新規な抗原の発見及び特徴づけに基づくものである。本
発明は独特の腫瘍関連抗原に係り、これはモノクローナ
ル抗体ＹＣＲ０１０と反応性であることを特徴とする。
本発明に於いては、本明細書中で定義する抗原に対し特
異性をもつ抗体、及びこのような抗体を産生ずる方法が
提供される。更に、本発明は、免疫組織化学的方法及び
イムノアッセイ的方法により癌をインビトロで検出及び
診断するための上記抗体の使用にも係る。本発明は、ま
た、ヒトの癌のインビボでの診断及び治療のための上記
抗体の使用にも係っている。
異性をもつ抗体、及びこのような抗体を産生ずる方法が
提供される。更に、本発明は、免疫組織化学的方法及び
イムノアッセイ的方法により癌をインビトロで検出及び
診断するための上記抗体の使用にも係る。本発明は、ま
た、ヒトの癌のインビボでの診断及び治療のための上記
抗体の使用にも係っている。
（発明の詳細説明）
上に述べたように、本発明は新規な腫瘍関連抗原を提供
する。本発明では、この従来から特徴が明らかにされて
いない抗原の性質を解明するために、ＡＴＣＣ寄託番号
Ｉ Ｈ８８７８７のハイブリッドセルラインによって発
生することのできるモノクローナル抗体ＹＣＲ０１０を
利用する。
する。本発明では、この従来から特徴が明らかにされて
いない抗原の性質を解明するために、ＡＴＣＣ寄託番号
Ｉ Ｈ８８７８７のハイブリッドセルラインによって発
生することのできるモノクローナル抗体ＹＣＲ０１０を
利用する。
本発明抗原の物理化学的及び免疫学的性質及び特にモノ
クローナル抗体ＹＣＲ０１０に対するその反応性から、
その特徴並びに正常細胞及び腫痕細胞に存在する他の抗
原との相違が明らかとなった。本発明が提供する抗原の
同定可能な特徴及び性質は次のとおりである。
クローナル抗体ＹＣＲ０１０に対するその反応性から、
その特徴並びに正常細胞及び腫痕細胞に存在する他の抗
原との相違が明らかとなった。本発明が提供する抗原の
同定可能な特徴及び性質は次のとおりである。
ａ）抗原は正常結腸組織の膜成分及び結腸癌の粘膜であ
る。モノクローナル抗体ＹＣＲ０１０を使用する標準的
ＥＬＩＳＡ （ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ
）法によると、この抗原はヒト結腸組織から精製された
形質膜及び結腸癌の粘膜に存在する。因みに、ＹＣＲ０
１０は、他の良性組織例えば肝臓、腎臓、前立腺、胆の
う、脳及び膵臓から精製した膜とは何の反応性も示さな
い。
る。モノクローナル抗体ＹＣＲ０１０を使用する標準的
ＥＬＩＳＡ （ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ
）法によると、この抗原はヒト結腸組織から精製された
形質膜及び結腸癌の粘膜に存在する。因みに、ＹＣＲ０
１０は、他の良性組織例えば肝臓、腎臓、前立腺、胆の
う、脳及び膵臓から精製した膜とは何の反応性も示さな
い。
ｂ）標準的な免疫組織化学的方法により良性結腸及び結
腸癌に抗原が存在していることが示された。・というの
は、ＹＣＲ０１０との強い反応性がそのような組織の免
疫パーオキシダーゼ染色によって明らかにされたからで
ある。他の良性組織例えば前立腺、肺、肝臓、腎臓、脳
下垂体、皮膚及び胸には弱い反応性又は全く反応性は認
められない。
腸癌に抗原が存在していることが示された。・というの
は、ＹＣＲ０１０との強い反応性がそのような組織の免
疫パーオキシダーゼ染色によって明らかにされたからで
ある。他の良性組織例えば前立腺、肺、肝臓、腎臓、脳
下垂体、皮膚及び胸には弱い反応性又は全く反応性は認
められない。
Ｃ） ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（
ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスターンイムノプロット分
析から、この抗原は約３６．０００〜約３９．０００の
範囲内の分子量を有していることが判った。５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥ及びウェスターンイムノプロット分析の前に抗原
をプロティナーゼＫによる処理、過沃素酸ナトリウムに
よる処理で変性すると、ＹＣＲ０１０に対する抗原の反
応性は破壊される。このことは該抗原が本来糖蛋白質で
あることを示している。
ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスターンイムノプロット分
析から、この抗原は約３６．０００〜約３９．０００の
範囲内の分子量を有していることが判った。５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥ及びウェスターンイムノプロット分析の前に抗原
をプロティナーゼＫによる処理、過沃素酸ナトリウムに
よる処理で変性すると、ＹＣＲ０１０に対する抗原の反
応性は破壊される。このことは該抗原が本来糖蛋白質で
あることを示している。
ｄ） 抗原はＯ−リンクの糖蛋白質である。抗原の緩徐
なアルカリ処理及び抗原のＮ−グリカナーゼ処理から１
、抗原の本質が糖蛋白質であることが確認でき、該抗原
が０−リンクの糖蛋白質であることが明らかにされる。
なアルカリ処理及び抗原のＮ−グリカナーゼ処理から１
、抗原の本質が糖蛋白質であることが確認でき、該抗原
が０−リンクの糖蛋白質であることが明らかにされる。
ｅ）標準的な平坦ベッドの等電点電気泳動技術を用いる
抗原の等電点電気泳動によると、等電点は約５．１〜約
５，４の範囲内にある。
抗原の等電点電気泳動によると、等電点は約５．１〜約
５，４の範囲内にある。
上記を要約すると、正常ヒト組織又はヒト腫瘍組織から
選択される源に由来し得る本発明の抗原は、約３６，０
００〜３９．０００の分子量を有しかつ約５．１〜５．
４の範囲の等電点を有する○−リンクの糖蛋白質である
と特徴づけられる。さらに、本発明の腫瘍関連糖蛋白質
は正常結腸及び結腸癌によって発現される。
選択される源に由来し得る本発明の抗原は、約３６，０
００〜３９．０００の分子量を有しかつ約５．１〜５．
４の範囲の等電点を有する○−リンクの糖蛋白質である
と特徴づけられる。さらに、本発明の腫瘍関連糖蛋白質
は正常結腸及び結腸癌によって発現される。
他の腫瘍関連抗原を含む他の抗原から本発明の抗原を区
別する上で特に重要なことは、モノクローナル抗体ＹＣ
Ｒ０１０に対する特異性であり、本発明抗原の少なくと
も１つの決定基がここに特徴づけられる。更に、本発明
によって定義される抗原に対するＹＣＲ０１０の特異的
反応性を利用して：ヒト由来の他の材料から抗原を単離
しかつ精製する手段及び究極的には抗原決定基を特徴づ
ける手段が得られる。このような精製抗原及びその決定
基は、当該技術分野でよく知られいる技術を用いる診断
及び治療用のモノクローナル及びポリクローナル抗体の
製造に有用である。例えば、モノクローナル抗体を産生
ずるネズミハイブリドーマを得ることができる。その他
、抗原はウサギ、ヤギ、その他の動物の免疫反応を刺激
するために利用され、これらの動物から血清ポリクロー
ナル抗体が得られる。加えて、この抗原は、問題となる
抗体例えばモノクローナル抗体、ヒト組織、血液もしく
はその他の体液中に存在する抗体の特徴づけにも利用さ
れ得る。
別する上で特に重要なことは、モノクローナル抗体ＹＣ
Ｒ０１０に対する特異性であり、本発明抗原の少なくと
も１つの決定基がここに特徴づけられる。更に、本発明
によって定義される抗原に対するＹＣＲ０１０の特異的
反応性を利用して：ヒト由来の他の材料から抗原を単離
しかつ精製する手段及び究極的には抗原決定基を特徴づ
ける手段が得られる。このような精製抗原及びその決定
基は、当該技術分野でよく知られいる技術を用いる診断
及び治療用のモノクローナル及びポリクローナル抗体の
製造に有用である。例えば、モノクローナル抗体を産生
ずるネズミハイブリドーマを得ることができる。その他
、抗原はウサギ、ヤギ、その他の動物の免疫反応を刺激
するために利用され、これらの動物から血清ポリクロー
ナル抗体が得られる。加えて、この抗原は、問題となる
抗体例えばモノクローナル抗体、ヒト組織、血液もしく
はその他の体液中に存在する抗体の特徴づけにも利用さ
れ得る。
本発明によれば、本明細書中に記載の抗原に対して特異
性をもっているモノクローナル抗体、及び該抗体の製造
方法が提供される。好ましくはこのようなモノクローナ
ル抗体はＩＱＧクラスのものであり、本発明の腫瘍関連
糖蛋白質に対する免疫活性を有している。この免疫活性
はモノクロ−ナル抗体ＹＣＲ０１０のそれと実質的に同
じである。このようなモノクローナル抗体は、ヒトの癌
特に結腸直腸癌の検出、診断及び治療に有用である。更
に、この抗体は、本発明によって提供される抗原の単離
及び精製、更には正確な抗原決定基の特徴づけにも応用
され得る。
性をもっているモノクローナル抗体、及び該抗体の製造
方法が提供される。好ましくはこのようなモノクローナ
ル抗体はＩＱＧクラスのものであり、本発明の腫瘍関連
糖蛋白質に対する免疫活性を有している。この免疫活性
はモノクロ−ナル抗体ＹＣＲ０１０のそれと実質的に同
じである。このようなモノクローナル抗体は、ヒトの癌
特に結腸直腸癌の検出、診断及び治療に有用である。更
に、この抗体は、本発明によって提供される抗原の単離
及び精製、更には正確な抗原決定基の特徴づけにも応用
され得る。
上に記載のモノクローナル抗体は一般にＫｏｈｌｅｒと
Ｈｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６．４９
５−４９７（１９７５））に従って産生され得る。本発
明に於いてはマウスもしくは他の適当な宿主を本発明の
精製抗原又は結腸癌に由来するヒト腫瘍組織の膜フラク
ションで免疫化する。この免疫化に続いて、免疫マウス
の脾細胞と適当なマウス骨髄腫ラインからの細胞とを融
合し、ハイブリッドセルラインの混合物を得る。ハイブ
リッドセルラインを適当な培地中で培養し、その後、こ
こに特徴づけた抗原に対して特異的な反応性をもつ抗体
を産生ずるハイブリッドセルラインを選択しクローンす
る。そして産生された抗体を回収する。
Ｈｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６．４９
５−４９７（１９７５））に従って産生され得る。本発
明に於いてはマウスもしくは他の適当な宿主を本発明の
精製抗原又は結腸癌に由来するヒト腫瘍組織の膜フラク
ションで免疫化する。この免疫化に続いて、免疫マウス
の脾細胞と適当なマウス骨髄腫ラインからの細胞とを融
合し、ハイブリッドセルラインの混合物を得る。ハイブ
リッドセルラインを適当な培地中で培養し、その後、こ
こに特徴づけた抗原に対して特異的な反応性をもつ抗体
を産生ずるハイブリッドセルラインを選択しクローンす
る。そして産生された抗体を回収する。
本発明は、ヒトの癌特に結腸直腸癌のインビトロでの検
出及び診断方法を提供する。本明細書中に明らかにした
本発明の独特な腫瘍関連糖蛋白質の特徴から、免疫組織
化学的方法による患者の組織サンプルでのその検出が可
能であり、及び／又はインビトロのイムノアッセイ的方
法による患酉の流体サンプルでのその検出が可能である
。免疫組織化学的及び／又はイムノアッセイ的方法によ
り、患者の試料中の本発明腫瘍関連抗原の存在及び／又
はｎを求めることは、診断利用に有用であり、病状の進
展度の指標となり得るか又はこれと関連させることがで
きる。
出及び診断方法を提供する。本明細書中に明らかにした
本発明の独特な腫瘍関連糖蛋白質の特徴から、免疫組織
化学的方法による患者の組織サンプルでのその検出が可
能であり、及び／又はインビトロのイムノアッセイ的方
法による患酉の流体サンプルでのその検出が可能である
。免疫組織化学的及び／又はイムノアッセイ的方法によ
り、患者の試料中の本発明腫瘍関連抗原の存在及び／又
はｎを求めることは、診断利用に有用であり、病状の進
展度の指標となり得るか又はこれと関連させることがで
きる。
患者の組織試料中の抗原を検出するための免疫組織化学
的方法は当業界においてよく知られているので、詳細に
説明することを省く。簡単に言えば、本発明に於いては
、擬似癌患者から採取した組織試料を、ここに特徴づけ
した腫瘍関連糖蛋白質に対して特異性を有している抗体
好ましくはモノクローナル抗体と接触させる。特に使用
が好ましいものはモノクローナル抗体ＹＣＲ０１０であ
る。抗体が結合した部位は、その後免疫組織化学的方法
による組織試料の選択的染色で明らかにすることができ
る。
的方法は当業界においてよく知られているので、詳細に
説明することを省く。簡単に言えば、本発明に於いては
、擬似癌患者から採取した組織試料を、ここに特徴づけ
した腫瘍関連糖蛋白質に対して特異性を有している抗体
好ましくはモノクローナル抗体と接触させる。特に使用
が好ましいものはモノクローナル抗体ＹＣＲ０１０であ
る。抗体が結合した部位は、その後免疫組織化学的方法
による組織試料の選択的染色で明らかにすることができ
る。
同様に、イムノアッセイ的方法による患者の流体サンプ
ル中の抗原性物質のインビトロでの検出方法もまた当業
界によく知られているので、これについても繰り返さな
い。本発明の目的のために、患者流体サンプルを本発明
の腫瘍関連糖蛋白質に対して特異的に反応性である少な
くとも１つの抗体、好ましくはモノクローナル抗体と接
触させる。
ル中の抗原性物質のインビトロでの検出方法もまた当業
界によく知られているので、これについても繰り返さな
い。本発明の目的のために、患者流体サンプルを本発明
の腫瘍関連糖蛋白質に対して特異的に反応性である少な
くとも１つの抗体、好ましくはモノクローナル抗体と接
触させる。
サンプル成分に結合した抗体は後に測定される。
本発明抗原の存在に関する定性及び／又は定量測定は、
競合的又は非競合的イムノアッセイ法によって成し得る
。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、本発
明によって提供される抗原に対して必要な特異性を有し
ている限り適当に利用され得る。好ましくはモノクロー
ナル抗体ＹＣＲ０１０を用いる。加えて、使用するのに
好ましいイムノアッセイは二部位イムノメトリックアッ
セイである。これは、ここに特徴づけした抗原の非干渉
決定基（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔ）に結合するように選択されたモノクロー
ナル抗体を利用する。
競合的又は非競合的イムノアッセイ法によって成し得る
。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、本発
明によって提供される抗原に対して必要な特異性を有し
ている限り適当に利用され得る。好ましくはモノクロー
ナル抗体ＹＣＲ０１０を用いる。加えて、使用するのに
好ましいイムノアッセイは二部位イムノメトリックアッ
セイである。これは、ここに特徴づけした抗原の非干渉
決定基（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔ）に結合するように選択されたモノクロー
ナル抗体を利用する。
本発明は更に、癌特に結腸直腸癌のインビボでの診断及
び治療方法を提供する。本発明に於ける腫瘍の位置決め
及び検出方法は、本発明の腫瘍関連糖蛋白質に対する特
異的反応性をもつ抗体の所定の有効量を擬似癌患者に投
与し、標準的イメージング技術により抗体の移動部位を
検知することによって達成することができる。抗体好ま
しくはＹＣＲ０１０は、検知が可能となるように、患者
に薬学的に許容可能なキャリヤーと供に投与し、好まし
くはガンマ線を放出する放射性核種でラベルする。
び治療方法を提供する。本発明に於ける腫瘍の位置決め
及び検出方法は、本発明の腫瘍関連糖蛋白質に対する特
異的反応性をもつ抗体の所定の有効量を擬似癌患者に投
与し、標準的イメージング技術により抗体の移動部位を
検知することによって達成することができる。抗体好ま
しくはＹＣＲ０１０は、検知が可能となるように、患者
に薬学的に許容可能なキャリヤーと供に投与し、好まし
くはガンマ線を放出する放射性核種でラベルする。
癌治療のための本発明方法は、本発明の腫瘍関連抗原に
対し特異性を持っている抗体好ましくはモノクローナル
抗体の所定の有効量を癌患者に投与する。抗体好ましく
はＹＣＲ０１０を癌患者に薬学的に許容されるキャリヤ
ーと供に投与し、こ′の抗体と適当な治療剤例えば腫瘍
部位に到達するように選択された放射性同位元素好まし
くはベーター粒子を放出するもの、医薬、毒素又は生物
学的蛋白質と結合させる。
対し特異性を持っている抗体好ましくはモノクローナル
抗体の所定の有効量を癌患者に投与する。抗体好ましく
はＹＣＲ０１０を癌患者に薬学的に許容されるキャリヤ
ーと供に投与し、こ′の抗体と適当な治療剤例えば腫瘍
部位に到達するように選択された放射性同位元素好まし
くはベーター粒子を放出するもの、医薬、毒素又は生物
学的蛋白質と結合させる。
更に、インビボでの癌の診断及び治療において、本発明
の腫瘍関連抗原に対し特異的である抗体又はそのフラグ
メントの混合物からなる抗体調合物がある場合には腫瘍
の検出、位置決め及び治療効果を高めるために用いられ
得るということは当業者に明らかである。
の腫瘍関連抗原に対し特異的である抗体又はそのフラグ
メントの混合物からなる抗体調合物がある場合には腫瘍
の検出、位置決め及び治療効果を高めるために用いられ
得るということは当業者に明らかである。
本発明が更により良く理解されるように、次に非制限的
実施例を記載する。
実施例を記載する。
友直亘−ユ
モノクローナル族 ＹＣＲ０１０の産生結腸癌患者のリ
ンパ腺リンパ球を解凍し、１０％の牛胎児血清（ＰＢＳ
）を含むＲＰＨｌ−１６４０（バージニア州アレキサン
ドリア市のフローラボラトリーズ）中で一晩培養した。
ンパ腺リンパ球を解凍し、１０％の牛胎児血清（ＰＢＳ
）を含むＲＰＨｌ−１６４０（バージニア州アレキサン
ドリア市のフローラボラトリーズ）中で一晩培養した。
血清を含まないＰＰＨＩ−７，５％のジメチルスルフオ
キシド中で、３０Ｘ １０６個のリンパ球と３０Ｘ １
０６個のＰ３／ＨＴ（Ｐ３ｘ ６３Ａｇ８．６５３のサ
プライン）を３５％ポリエチレングリコール−１０００
を用いて融合した。９６−ウェルのプレート（マサチュ
ーセッツ州ケンブリッジ市のコースタ−）に於イテ、各
ウニ）Ｌｔ ニＲＰＨＩ−１０％ ＦＢＳ−ＨＡＴ （
１０−’ Ｈハイポキサンチン、 ４Ｘ １０’Ｈア
ミノプテリン及び１．６ｘ１０ Ｍチミジン）中１０
５個の細胞密度となるように細胞を入れた。５ｚＣｏ２
下で２週間培養を続け、その後、上澄液を１週間に一度
新鮮なＨＡＴ培地で置換した。ウェルから培養中の上澄
液を４０日自転サンプルとしてとり出し、酵素結合免疫
吸収結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＩｇの有無を確
認するテストを行った。次いで、結腸腫瘍からの膜及び
細胞質ゾルに対する特異的な反応性を有するＩＱ産生ク
ローンをＥＬＩＳＡでスクリーンした。
キシド中で、３０Ｘ １０６個のリンパ球と３０Ｘ １
０６個のＰ３／ＨＴ（Ｐ３ｘ ６３Ａｇ８．６５３のサ
プライン）を３５％ポリエチレングリコール−１０００
を用いて融合した。９６−ウェルのプレート（マサチュ
ーセッツ州ケンブリッジ市のコースタ−）に於イテ、各
ウニ）Ｌｔ ニＲＰＨＩ−１０％ ＦＢＳ−ＨＡＴ （
１０−’ Ｈハイポキサンチン、 ４Ｘ １０’Ｈア
ミノプテリン及び１．６ｘ１０ Ｍチミジン）中１０
５個の細胞密度となるように細胞を入れた。５ｚＣｏ２
下で２週間培養を続け、その後、上澄液を１週間に一度
新鮮なＨＡＴ培地で置換した。ウェルから培養中の上澄
液を４０日自転サンプルとしてとり出し、酵素結合免疫
吸収結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＩｇの有無を確
認するテストを行った。次いで、結腸腫瘍からの膜及び
細胞質ゾルに対する特異的な反応性を有するＩＱ産生ク
ローンをＥＬＩＳＡでスクリーンした。
ＹＣＲ０１０のモノクローナル抗体をさらに明らかにし
、本発明抗原の特徴づけに用いるべく選択した。
、本発明抗原の特徴づけに用いるべく選択した。
本発明の抗原を特徴づけるために、モノクローナル抗体
ＹＣＲ０１０を以下に記載の方法で用いた。
ＹＣＲ０１０を以下に記載の方法で用いた。
ヒト組織の膜及び細胞質ゾルフラクションを抗原の特徴
づけ及びモノクローナル抗体ＹＣＲ０１０の反応性をス
クリーンするために用い、次のように調整した。
づけ及びモノクローナル抗体ＹＣＲ０１０の反応性をス
クリーンするために用い、次のように調整した。
死亡後１０時間を経過していない外科的及び解剖的試料
をブロックに切断し、−８０℃に貯蔵した。
をブロックに切断し、−８０℃に貯蔵した。
ダウンスホモゲナイザ−（Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅ
ｎｉｚｅｒ）中４℃で、 ４容量の１０１！ｌＨトリス
−Ｈ（１！ Ｉ）Ｈ７，５，２ｍＨの塩化カルシウム、
２ ｍＨのフェニルメチルスルフオネイト（均一化バツ
ファ−）を用いて組織を均一化した。以後のステップは
全て４℃で行った。
ｎｉｚｅｒ）中４℃で、 ４容量の１０１！ｌＨトリス
−Ｈ（１！ Ｉ）Ｈ７，５，２ｍＨの塩化カルシウム、
２ ｍＨのフェニルメチルスルフオネイト（均一化バツ
ファ−）を用いて組織を均一化した。以後のステップは
全て４℃で行った。
ホモゲネートを５分間ｉｏｏｘｇで遠心分離し、核とも
との状態の細胞を除去した。上澄液をとり出し、１時間
１３０．０ＯＯＸ Ｏで遠心分離した。この高速遠心分
離からの上澄液をとり、細胞質ゾルフラクションとした
。ペレットを１容量の均一化バツファーに再懸濁し、１
０ｍＨのトリス−ＨＣ；１ ｐＨ７，２中の４０％／２
０％不連続サッカロース勾配にのせた。
との状態の細胞を除去した。上澄液をとり出し、１時間
１３０．０ＯＯＸ Ｏで遠心分離した。この高速遠心分
離からの上澄液をとり、細胞質ゾルフラクションとした
。ペレットを１容量の均一化バツファーに再懸濁し、１
０ｍＨのトリス−ＨＣ；１ ｐＨ７，２中の４０％／２
０％不連続サッカロース勾配にのせた。
この勾配を１７時間１３０．０００ｘ ｇで遠心分離し
た。
た。
４０％７２０％中間層にある物質をピペットでとり出し
、５倍量の均一化バッファーで希釈し６０分間２５．０
ＯＯＸ （Ｊで遠心分離した。ベレットを均一化バッフ
ァー中に再懸濁し、アリコツトし、−８０℃で貯蔵した
。
、５倍量の均一化バッファーで希釈し６０分間２５．０
ＯＯＸ （Ｊで遠心分離した。ベレットを均一化バッフ
ァー中に再懸濁し、アリコツトし、−８０℃で貯蔵した
。
膜／細胞質ゾルＥＬＩＳＡ
正常ヒト組織およヒト腫瘍組織の精ｖＪ膜及び細胞質ゾ
ルフラクションにおけるモノクローナル抗体ＹＣＲ１０
１に反応性の抗原の有無を、酵素結合免疫吸収結合アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により４９０ ｎｍの吸収を測って
決定した。
ルフラクションにおけるモノクローナル抗体ＹＣＲ１０
１に反応性の抗原の有無を、酵素結合免疫吸収結合アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により４９０ ｎｍの吸収を測って
決定した。
膜／細胞質ゾルＥＬＩＳ＾を成すために、上のようにし
て調整した１０埒／ウエルの細胞質ゾル又は２埒／ウエ
ルの膜を、平坦底部のマイクロタイタープレート（バー
ジニア州アレキサンドリア市のダイナチック社）を用い
て３７℃で一晩乾燥した。このプレートを冷たい飲料水
で３回洗った。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝サリーン、０．１
５ＨＮａＣｆｆ 、 ２０ ｍＮリン酸ナトリウムｐＨ
７，２）中２０％馬血清の５０／ｌｌｊ！を加え、次い
でハイブリドーマ上澄液５０／ｊｊ！を加えて室温下に
１時間インキュベートした。洗浄後、５ｘ馬面清−ＰＢ
Ｓで１：１０００に希釈した １００成のモノクローナ
ルなマウス抗−ヒトＩ ｇＭ−）−ＩＲＰ複合体（ウィ
ルソンとナカネの方法（１９７８年）により複合した２
３ＡＧ１１）を加えてウェルを１時間インキュベートし
た。０．１８クエン酸塩−リン酸塩バッファー１）Ｈ５
，Ｏ中で、１１１１／ｃｄの０−フェニレンジアミン１
００ｐ及び０．０３％Ｈ２０２とともに暗所で３０分間
インキュベートして結合酵素（Ｂｏｕｎｄ）を検知した
。各ウェルに５０ｉ１１のＮＨＳＯ２を加えることによ
りウェルを冷却した。ダイナチック社のＥＬＩＳＡプレ
ートリーダーで４９０ ｎｍの吸収を読み取った。
て調整した１０埒／ウエルの細胞質ゾル又は２埒／ウエ
ルの膜を、平坦底部のマイクロタイタープレート（バー
ジニア州アレキサンドリア市のダイナチック社）を用い
て３７℃で一晩乾燥した。このプレートを冷たい飲料水
で３回洗った。ＰＢＳ（リン酸塩緩衝サリーン、０．１
５ＨＮａＣｆｆ 、 ２０ ｍＮリン酸ナトリウムｐＨ
７，２）中２０％馬血清の５０／ｌｌｊ！を加え、次い
でハイブリドーマ上澄液５０／ｊｊ！を加えて室温下に
１時間インキュベートした。洗浄後、５ｘ馬面清−ＰＢ
Ｓで１：１０００に希釈した １００成のモノクローナ
ルなマウス抗−ヒトＩ ｇＭ−）−ＩＲＰ複合体（ウィ
ルソンとナカネの方法（１９７８年）により複合した２
３ＡＧ１１）を加えてウェルを１時間インキュベートし
た。０．１８クエン酸塩−リン酸塩バッファー１）Ｈ５
，Ｏ中で、１１１１／ｃｄの０−フェニレンジアミン１
００ｐ及び０．０３％Ｈ２０２とともに暗所で３０分間
インキュベートして結合酵素（Ｂｏｕｎｄ）を検知した
。各ウェルに５０ｉ１１のＮＨＳＯ２を加えることによ
りウェルを冷却した。ダイナチック社のＥＬＩＳＡプレ
ートリーダーで４９０ ｎｍの吸収を読み取った。
後記する第１表に示すように、ＹＣＲ０１０はムチン結
腸癌及θ正常結腸の膜フラクションに反応性であった。
腸癌及θ正常結腸の膜フラクションに反応性であった。
これは、ムチン結腸癌及び正常結腸膜に本発明の抗原が
存在していたことを示す。
存在していたことを示す。
ＹＣＲ０１０は正常な肺、肝臓、前立腺、胆のう、脳及
び膵臓を含むその他の組織の膜フラクションには非反応
性であった。
び膵臓を含むその他の組織の膜フラクションには非反応
性であった。
免疫組織化学的測定
正常ヒト組織及びヒト腫瘍組織におけるＹＣＲ０１０に
反応性の抗原の有無をヒト組織の免疫パーオキシダーゼ
染色（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ５ｔａｉｎ
ｉｎＯ）で確認した。
反応性の抗原の有無をヒト組織の免疫パーオキシダーゼ
染色（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ５ｔａｉｎ
ｉｎＯ）で確認した。
死亡後１０時間以内の一８０℃で貯蔵された外科的及び
解剖学的試料から得た凍結組織ブロックのセクションを
ミクロトーム／クリオスタフト上で４〜６μセクシヨン
に切断した。ガラススライド上にのせたこのセクション
を軽く空気乾燥した後アセトン中に浸漬した。Ｔａｙｌ
ｏｒ、 Ａｒｃｈ、 Ｐａｔｈｏｌ、 Ｌａｂ、 Ｈｅ
ｄ、、 １０２．１３（１９７８）に記載されティるの
と同様にして、これらのスライドを染色すべく間接的免
疫パーオキシダーゼアッセイを用いた。リン酸塩緩衝サ
リーン（ＰＢＳ）中５分間インキュベートすることによ
りセクションをひ再水和した。ＹＣＲ０１０抗体をこの
セクション上にのせ、湿気の多い室内で１時間インキュ
ベートした。抗体をＰＢＳでセクションから洗浄除去し
、次いでセクションをＰＢＳ中に５分間浸漬した。１；
５０に希釈したパーオキシダーゼ−複合ヤギ抗−ヒトＩ
ＱＭ抗体（カリフォルニア州バーリンガーメ市のタゴケ
ミカルズ社）を用いてセクションを積重ね、湿気のある
室内で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで抗体を洗
浄除去した。１１Ｉｔｇ／Ｉｄのジアミノベンジシンと
００３％Ｈ２Ｏ２を用いて発色反応を行った。
解剖学的試料から得た凍結組織ブロックのセクションを
ミクロトーム／クリオスタフト上で４〜６μセクシヨン
に切断した。ガラススライド上にのせたこのセクション
を軽く空気乾燥した後アセトン中に浸漬した。Ｔａｙｌ
ｏｒ、 Ａｒｃｈ、 Ｐａｔｈｏｌ、 Ｌａｂ、 Ｈｅ
ｄ、、 １０２．１３（１９７８）に記載されティるの
と同様にして、これらのスライドを染色すべく間接的免
疫パーオキシダーゼアッセイを用いた。リン酸塩緩衝サ
リーン（ＰＢＳ）中５分間インキュベートすることによ
りセクションをひ再水和した。ＹＣＲ０１０抗体をこの
セクション上にのせ、湿気の多い室内で１時間インキュ
ベートした。抗体をＰＢＳでセクションから洗浄除去し
、次いでセクションをＰＢＳ中に５分間浸漬した。１；
５０に希釈したパーオキシダーゼ−複合ヤギ抗−ヒトＩ
ＱＭ抗体（カリフォルニア州バーリンガーメ市のタゴケ
ミカルズ社）を用いてセクションを積重ね、湿気のある
室内で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで抗体を洗
浄除去した。１１Ｉｔｇ／Ｉｄのジアミノベンジシンと
００３％Ｈ２Ｏ２を用いて発色反応を行った。
スライドをヘマトキシリンエオシンで染色した。
後述する第■表に、ＹＣＲ０１０が、組織染色の強度測
定かられかるように、正常結腸及び結腸癌に陽性の反応
性を有しているが、例えば正常前立腺、肺、肝臓、腎臓
、膵臓、皮膚及び胸のような他の＠織に対しては弱いも
しくは全く反応性を示さないことが明らかにされでいる
。
定かられかるように、正常結腸及び結腸癌に陽性の反応
性を有しているが、例えば正常前立腺、肺、肝臓、腎臓
、膵臓、皮膚及び胸のような他の＠織に対しては弱いも
しくは全く反応性を示さないことが明らかにされでいる
。
抗原の生化学的分析
ＹＣＲ０１０によって特徴づけられる抗原の蛋白質上の
性質及び分子量を、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）、ウェスターンイムノプロッ
ト分析及び免疫染色から求めた。２５グの結腸膜蛋白質
をゲルサンプルバッファー（０，１２５ＨトＩＪ スｐ
Ｈ６，８，４％ ＳＯ３，２０％ ／ｊ ＩＪ ｔ ｏ
−ル、０．００２％ブロムフェノールブルー、５％２
−メルカプトエタノール）中に溶解し、不連続ＳＯ３−
ＰＡＧＥ（Ｌｅａｍｍｌｉ 、１９７０）法により３％
積み重ねゲルヲもつ１．５％もしくは１０％ゲル上で分
離した。Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔａ＋の方法（１９７９）に
従ってこの分離蛋白質を電気泳動的に３時間、２００
ｍ八でニトロセルロース（０，１ｍ、 ５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ）に移動させた。このニト
ロセルロースのレプリカを３％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）−ＰＢＳを用いて３０分間インキュベートし続いて
、５％スキムミルク−ｏ、 ｏｏｉ％ チメローザルー
０．１％ 抗−気泡Ａエマルジョン（ミズーリー州セン
トルーイス市のシグマケミカルカンパニー社）で１：１
に希釈したハイブリドーマ上澄液で一晩密封パウチ中で
インキュベートした。ニトロセルロースのストリップを
、ＰＢＳ−０，１％Ｔｗｅｅｎを用イ３０分間バッファ
ーを５回変えながら洗浄し、１ｄのスキムミルク試薬当
り５００，０００ ｃｐｍの Ｉ−標識ヤギ抗−ヒト
ＩＱＭ（カリフォルニア州バーリンガーメ市のタボ社）
を用いて２時間インキュベートした。ＰＢＳ−０，ＩＸ
Ｔｗｅｅｎで洗浄した優、ニトロセルロースのストリ
ップを空気乾燥し、Ｘ線フィルム（コダックＸＡＲ−５
）上に補強スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ ＤｕＰｏｎｔ
Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ）を用いて１８〜７２時
間−７０℃で露光した。
性質及び分子量を、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）、ウェスターンイムノプロッ
ト分析及び免疫染色から求めた。２５グの結腸膜蛋白質
をゲルサンプルバッファー（０，１２５ＨトＩＪ スｐ
Ｈ６，８，４％ ＳＯ３，２０％ ／ｊ ＩＪ ｔ ｏ
−ル、０．００２％ブロムフェノールブルー、５％２
−メルカプトエタノール）中に溶解し、不連続ＳＯ３−
ＰＡＧＥ（Ｌｅａｍｍｌｉ 、１９７０）法により３％
積み重ねゲルヲもつ１．５％もしくは１０％ゲル上で分
離した。Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔａ＋の方法（１９７９）に
従ってこの分離蛋白質を電気泳動的に３時間、２００
ｍ八でニトロセルロース（０，１ｍ、 ５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ）に移動させた。このニト
ロセルロースのレプリカを３％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）−ＰＢＳを用いて３０分間インキュベートし続いて
、５％スキムミルク−ｏ、 ｏｏｉ％ チメローザルー
０．１％ 抗−気泡Ａエマルジョン（ミズーリー州セン
トルーイス市のシグマケミカルカンパニー社）で１：１
に希釈したハイブリドーマ上澄液で一晩密封パウチ中で
インキュベートした。ニトロセルロースのストリップを
、ＰＢＳ−０，１％Ｔｗｅｅｎを用イ３０分間バッファ
ーを５回変えながら洗浄し、１ｄのスキムミルク試薬当
り５００，０００ ｃｐｍの Ｉ−標識ヤギ抗−ヒト
ＩＱＭ（カリフォルニア州バーリンガーメ市のタボ社）
を用いて２時間インキュベートした。ＰＢＳ−０，ＩＸ
Ｔｗｅｅｎで洗浄した優、ニトロセルロースのストリ
ップを空気乾燥し、Ｘ線フィルム（コダックＸＡＲ−５
）上に補強スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ ＤｕＰｏｎｔ
Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ）を用いて１８〜７２時
間−７０℃で露光した。
抗原の性質を更に明らかにするため、上のようにして調
整した膜を、５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスターンイムノ
プロット分析にかける前に以下の処理に付した。
整した膜を、５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスターンイムノ
プロット分析にかける前に以下の処理に付した。
ａ）メタノール：膜懸濁液を５容量のメタノールととも
に４℃で１時間インキュベートし、マイクロヒュージし
、沈澱物をエタノールで２回洗った。
に４℃で１時間インキュベートし、マイクロヒュージし
、沈澱物をエタノールで２回洗った。
沈澱物を５Ｏ８−ＰＡＧＥ用のゲルサンプルバッファー
中に溶解した。
中に溶解した。
ｂ）過沃素酸ナトリウム：膜を２０ｍＨの過沃素酸ナト
リウム中４℃で１時間インキュベートした。
リウム中４℃で１時間インキュベートした。
Ｃ）ノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）
：膜懸濁液を酢酸でｐ１１５〜６に調整し、１０ｍ
Ｕのノイラミニダーゼ（１６０単位／／Ｉｔｇ、ミズー
リー州セントルーイス市シグマケミカルカンパニー社）
を用いて３７℃ １時間インキュベートした。
：膜懸濁液を酢酸でｐ１１５〜６に調整し、１０ｍ
Ｕのノイラミニダーゼ（１６０単位／／Ｉｔｇ、ミズー
リー州セントルーイス市シグマケミカルカンパニー社）
を用いて３７℃ １時間インキュベートした。
ｄ）プロティナーゼに：膜懸濁液を１．２５１１１ｇ／
＋！ｅのプロティナーゼＫ（２０単位／■、ベーリンガ
ーマンハイム）を用いて３７℃１時間インキュベートし
た。 全ての反応をゲルサンプルバッファーを添加して
停止させた。
＋！ｅのプロティナーゼＫ（２０単位／■、ベーリンガ
ーマンハイム）を用いて３７℃１時間インキュベートし
た。 全ての反応をゲルサンプルバッファーを添加して
停止させた。
５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスターンイムノプロット分析
から抗原の分子量は約３６．０００〜３９，０００の範
囲内にあることが決定された。抗原を化学及び酵素変性
し、続いて５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスターンイムノプ
ロット分析を行えば、抗原が糖蛋白質の性質を持ってい
ることが明らかとなった。特に、ＹＣＲ０１０に対する
抗原の反応性は、上記したように過沃素酸ナトリウムの
みならず、ブロティナーゼにで抗原を処理した場合にも
破壊的であることが示された。ＹＣＲ０１０に対する抗
原の反応性喪失はその他の変性には認められなかった。
から抗原の分子量は約３６．０００〜３９，０００の範
囲内にあることが決定された。抗原を化学及び酵素変性
し、続いて５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスターンイムノプ
ロット分析を行えば、抗原が糖蛋白質の性質を持ってい
ることが明らかとなった。特に、ＹＣＲ０１０に対する
抗原の反応性は、上記したように過沃素酸ナトリウムの
みならず、ブロティナーゼにで抗原を処理した場合にも
破壊的であることが示された。ＹＣＲ０１０に対する抗
原の反応性喪失はその他の変性には認められなかった。
Ｏ−リンクの糖蛋白質の決定
抗原の性質をさらに特徴づけるべく、緩徐なアルカリ及
びＮ−グリカナーゼ処理すると、Ｏ−リンクの糖蛋白質
であることが判った。
びＮ−グリカナーゼ処理すると、Ｏ−リンクの糖蛋白質
であることが判った。
緩徐なアルカリ処理：
膜を０．１規定のＮａＯＨで一晩室温下に処理し、ＰＢ
Ｓで透析し、１００．０ＯＯＸ ｇ Ｔ： ３０分間エ
アーヒュージした。ペレットを５Ｏ８−ＰＡＧＥ及びウ
ェスターンイムノプロット用ゲルサンプルバッファーに
溶解した。上澄液をニトロセルロース上にスポットし乾
燥し、続いてウェスターンプロット分析のように免疫染
色した。
Ｓで透析し、１００．０ＯＯＸ ｇ Ｔ： ３０分間エ
アーヒュージした。ペレットを５Ｏ８−ＰＡＧＥ及びウ
ェスターンイムノプロット用ゲルサンプルバッファーに
溶解した。上澄液をニトロセルロース上にスポットし乾
燥し、続いてウェスターンプロット分析のように免疫染
色した。
Ｎ−グリカナーゼ処理：
２５埒ノ膜プロテインを０．５％ ５Ｏ３−０，１Ｍ
Ｂ−メ／Ｌ。
Ｂ−メ／Ｌ。
カプトエタノールの存在下で沸騰し、同容量の０、２Ｈ
リン酸ナトリウムｐＨ８，６−１０ｍＨＥＤ丁Ａ−１％
ＮＰ４０を用いて希釈し、１単位のＮ−グリカナーゼ（
２Ｇ０単位／ｄ、マサチューセッツ州ボストン市ジエン
ブイムコーボレイション）を用いて３０℃−晩インキユ
ベートした。サンプルを５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスタ
ーンイムノプロット分析用ゲルサンプルバッファーに溶
解した。
リン酸ナトリウムｐＨ８，６−１０ｍＨＥＤ丁Ａ−１％
ＮＰ４０を用いて希釈し、１単位のＮ−グリカナーゼ（
２Ｇ０単位／ｄ、マサチューセッツ州ボストン市ジエン
ブイムコーボレイション）を用いて３０℃−晩インキユ
ベートした。サンプルを５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びウェスタ
ーンイムノプロット分析用ゲルサンプルバッファーに溶
解した。
等電点電気泳動
ＹＣＲ０１０で特徴づけられる抗原の電気泳動を、以下
に記載する方法により、ポリアクリルアミドゲル上で標
準的平坦ベッドの等電点電気泳動技術を用いて行った。
に記載する方法により、ポリアクリルアミドゲル上で標
準的平坦ベッドの等電点電気泳動技術を用いて行った。
音波処理（加熱システム、ウルトラソニックインコーボ
レイション、モデルト３７５）を用い６Ｈ尿素−〇、５
％ＮＰ４０−０．０５Ｘ ＳＯ３中で膜の抽出を行い、
次いでＰ Ａ’ＧプレートＩ）８３．５〜９．５（ＬＫ
Ｂｌ上に於いて １〜１７４時間５℃に工水平等電点電
気泳動にかけた。このときの出力は指示に従って３０Ｗ
、５０ｍＡ及び１５００ Ｖとし、電気泳動後、分離蛋
白質をトリスーバツファーサリーン（ＰＢＳ、０．０２
Ｍ トリス−０，１５ＨＮａＣＲｐＨ８，０）中で一晩
ニトロセルロースに移動させ、ウェスターンプロット分
析のように免疫染色し目視判定できるようにした。
レイション、モデルト３７５）を用い６Ｈ尿素−〇、５
％ＮＰ４０−０．０５Ｘ ＳＯ３中で膜の抽出を行い、
次いでＰ Ａ’ＧプレートＩ）８３．５〜９．５（ＬＫ
Ｂｌ上に於いて １〜１７４時間５℃に工水平等電点電
気泳動にかけた。このときの出力は指示に従って３０Ｗ
、５０ｍＡ及び１５００ Ｖとし、電気泳動後、分離蛋
白質をトリスーバツファーサリーン（ＰＢＳ、０．０２
Ｍ トリス−０，１５ＨＮａＣＲｐＨ８，０）中で一晩
ニトロセルロースに移動させ、ウェスターンプロット分
析のように免疫染色し目視判定できるようにした。
このようにして行った抗原の等電点電気泳動から、その
等電点が約５．１〜５．４の範囲内に入ることが判った
。
等電点が約５．１〜５．４の範囲内に入ることが判った
。
第 工 表
膜及び細胞質ゾル調製物に対するモノクローナル抗体Ｙ
ＣＲ０１０の反応性 膜 」Ｉ豆又に 結腸癌 ｏ、 ｏｏ ｏ、 ｏ。
ＣＲ０１０の反応性 膜 」Ｉ豆又に 結腸癌 ｏ、 ｏｏ ｏ、 ｏ。
結腸癌 ｏ、 ｏｏ ｏ、 ｏ。
ムチン結腸癌 ０．６１ ０．００良性結腸
ｏ、 ｏｏ ｏ、 ｏ。
ｏ、 ｏｏ ｏ、 ｏ。
良性結腸 １．０Ｇ０．ＯＯ
良性結腸 ０．８６ ０．００良性肺
０．００ ０．００良性肺 ｏ、
ｏｏ ｏ、 ｏ。
０．００ ０．００良性肺 ｏ、
ｏｏ ｏ、 ｏ。
良性肝臓 ０．８０ ０．３４良性腎臓
０．００ ０．１３良性前立腺 ｏ、
ｏｏ ｏ、 ｏ。
０．００ ０．１３良性前立腺 ｏ、
ｏｏ ｏ、 ｏ。
良性胆のう ｏ、ｏｏ ｏ、ｏ。
良性脳 ｏ、 ｏｏ ｏ、 ｏ。
良性膵ｉｏ、ｏｏ ｏ、ｏ。
第 ■ 表
ヒト組織上でのＹＣＲ０１０の免疫組織学的反応性組
織 陽 の数／被験体の全数結腸癌
４７８ 良性結腸 ２／４ 良性前立腺 ０／１ 良性節 ０／１ 良性肝臓 ０／１ 良性腎臓 ０／１ 良性脳下垂体 ０／１ 良性皮膚 ０／１
織 陽 の数／被験体の全数結腸癌
４７８ 良性結腸 ２／４ 良性前立腺 ０／１ 良性節 ０／１ 良性肝臓 ０／１ 良性腎臓 ０／１ 良性脳下垂体 ０／１ 良性皮膚 ０／１
Claims (29)
- （１）約３６，０００〜約３９，０００の範囲内の分子
量及び約５．１〜約５．４の範囲内の等電点を有する糖
蛋白質であることを特徴とする、正常ヒト組織又はヒト
腫瘍組織から選択された源に由来する抗原。 - （２）前記抗原がＯ−リンクの糖蛋白質である特許請求
の範囲第１項に記載の抗原。 - （３）モノクローナル抗体ＹＣＲ０１０に反応性の少な
くとも１つの抗原決定基を有することを更に特徴とする
特許請求の範囲第２項に記載の抗原。 - （４）前記モノクローナル抗体ＹＣＲ０１０に対する抗
原の反応性が、前記抗原をプロティナーゼＫ又は過沃素
酸ナトリウムで処理することにより破壊され得ることを
特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の抗原。 - （５）前記抗原が結腸直腸癌で発現される腫瘍関連抗原
である特許請求の範囲第４項に記載の抗原。 - （６）ヒトの癌の検出、診断及び治療に使用するための
モノクローナル抗体の製造方法であって、マウス又は他
の適当な宿主を、特許請求の範囲第１項〜第５項のいず
れかに記載された精製抗原又はヒト結腸癌に由来するヒ
ト腫瘍組織の膜フラクションで免疫化し、この免疫化し
たマウス又は他の適当な宿主の脾細胞を適当なマウス骨
髄腫細胞と融合してハイブリッドセルラインの混合物を
得、適当な培地中でこのハイブリッドセルラインを培養
し、特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の
抗原に対して特異的反応性を有する抗体を産生するハイ
ブリッドセルラインを選択してクローンし、このように
して産生されるモノクローナル抗体を回収することを特
徴とする前記モノクローナル抗体の製造方法。 - （７）特許請求の範囲第６項に記載の方法で製造された
モノクローナル抗体。 - （８）前記抗体がＩｇＧ抗体である特許請求の範囲第７
項に記載のモノクローナル抗体。 - （９）前記抗体がＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．ＨＢ８７８７のハ
イブリッドセルラインによって発生されるＹＣＲ０１０
である特許請求の範囲第７項に記載のモノクローナル抗
体。 - （１０）腫瘍関連糖蛋白質に対して特異的反応性を有す
るＩｇＭクラスのモノクローナル抗体であって、前記糖
蛋白質が約３６，０００〜約３９，０００の範囲内の分
子量と約５．１〜約５．４の範囲内の等電点とを有し且
つ前記モノクローナル抗体と反応性であってこの反応性
は前記糖蛋白質をプロティナーゼＫ又は過沃素酸ナトリ
ウムで処理することにより破壊され得ることを特徴とす
る、前記ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体。 - （１１）前記腫瘍関連糖蛋白質が結腸直腸癌によって発
現されることを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記
載のモノクローナル抗体。 - （１２）前記抗体がＹＣＲ０１０である特許請求の範囲
第１１項に記載のモノクローナル抗体。 - （１３）疑似癌患者から採取した組織試料を、特許請求
の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の抗原に対して
特異的反応性を有する抗体と接触させ、前記抗体が結合
している前記試料上の部位を免疫組織化学的手段によっ
て決定することからなる、擬似癌患者の癌を検出及び診
断する方法。 - （１４）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
の範囲第１３項に記載の方法。 - （１５）前記抗体がＹＣＲ０１０である特許請求の範囲
第１４項に記載の方法。 - （１６）擬似癌患者から採取した流体サンプルを、特許
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の抗原に対
して特異的反応性を有する少なくとも１つの抗体と接触
させ、前記抗体の前記流体サンプルの成分への結合をイ
ムノアッセイにより決定することからなる、擬似癌患者
の癌をインビトロで検出及び診断する方法。 - （１７）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
の範囲第１６項に記載の方法。 - （１８）前記抗体がＹＣＲ０１０である特許請求の範囲
第１７項に記載の方法。 - （１９）前記イムノアッセイが二部位イムノメトリック
アッセイであり、前記抗体が前記抗原の非干渉決定基に
結合するように選択されたモノクローナル抗体であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載方法。 - （２０）特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記
載の抗原に対し特異的反応性を有する抗体の所定の有効
量を投与し、前記抗体を薬学的に許容され得るキャリヤ
ーと供に投与し且つ検出が可能となるようにラベルし、
前記抗体の移動位置を検知することからなる、擬似癌患
者の癌をインビボで検出及び診断する方法。 - （２１）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
の範囲第２０項に記載の方法。 - （２２）前記抗体がＹＣＲ０１０である特許請求の範囲
第２１項に記載の方法。 - （２３）特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記
載の抗原に対して特異的反応性を有する抗体の所定の有
効量を投与し、前記抗体を薬学的に許容され得るキャリ
ヤーと供に投与し且つ適当な治療剤と結合しておくこと
を特徴とする、癌患者の癌を治療する方法。 - （２４）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
の範囲第２３項に記載の方法。 - （２５）前記抗体がＹＣＲ０１０である特許請求の範囲
第２４項に記載の方法。 - （２６）特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記
載の抗原に対するモノクローナル抗体。 - （２７）前記抗体がヒトモノクローナル抗体である特許
請求の範囲第２６項に記載のモノクローナル抗体。 - （２８）前記抗体がネズミ抗体である特許請求の範囲第
２６項に記載のモノクローナル抗体。 - （２９）特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記
載の抗原に対するポリクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
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Family
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|---|---|---|---|
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Cited By (2)
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-
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- 1986-04-22 FI FI861691A patent/FI861691L/fi not_active Application Discontinuation
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|---|---|---|---|---|
| JPS63207396A (ja) * | 1987-02-24 | 1988-08-26 | Pola Chem Ind Inc | 腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法 |
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|---|---|
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| DK172686A (da) | 1986-10-23 |
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